фиксированный на носителе фермент и способ его получения

Формула изобретения

1. Фиксированный на носителе фермент, выбранный из группы, состоящей из пенициллин-G-амидазы (Е.С. 3.5.1.11), глутарил-7-АСА-ацилазы и оксидазы D-аминокислоты (Е. С. 1.4.3.3), ковалентно связанный на материале-носителе на основе полиорганосилоксана с функциональными аминогруппами.

2. Фиксированный на носителе фермент по п.1, отличающийся тем, что он ковалентно связан на материале-носителе через диальдегид.

3. Фиксированный на носителе фермент по п.1 или 2, отличающийся тем, что массовое соотношение фермента к материалу-носителю находится в пределах 1-300 мг протеина на 1 г влажного носителя.

4. Фиксированный на носителе фермент по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что материал-носитель является частицеобразным и имеет средний диаметр частиц 0,01-3 мм.

5. Фиксированный на носителе фермент по п.4, отличающийся тем, что средний размер частиц материала-носителя составляет 0,1-04 мм.

6. Фиксированный на носителе фермент по п.4 или 5, отличающийся тем, что материал-носитель, по существу, шарообразный.

7. Фиксированный на носителе фермент по одному из пп.1-6, отличающийся тем, что массовое соотношение пенициллин-6-амидазы к материалу-носителю составляет 2-200 мг протеина на 1 г влажного носителя.

8. Фиксированный на носителе фермент по п.7, отличающийся тем, что массовое соотношение пенициллин-G-амидазы к материалу-носителю составляет 40-80 мг протеина на 1 г влажного носителя.

9. Фиксированный на носителе фермент по п.7 или 8, отличающийся тем, что удельная активность составляет 100-300 U на 1 г влажного носителя.

10. Фиксированный на носителе фермент по одному из пп.1-6, отличающийся тем, что массовое соотношение глутарил-7-АСА-ацилазы к материалу-носителю составляет 10-110 мг протеина на 1 г влажного носителя.

11. Фиксированный на носителе фермент по п.10, отличающийся тем, что массовое соотношение глутарил-7-АСА-ацилазы к материалу-носителю составляет 20-70 мг протеина на 1 г влажного носителя.

12. Фиксированный на носителе фермент по п.10 или 11, отличающийся тем, что удельная активность составляет 100-200 U на 1 г влажного носителя.

13. Фиксированный на носителе фермент по одному из пп.1-6, отличающийся тем, что массовое соотношение оксидазы D-аминокислоты к материалу-носителю составляет 5-25 мг протеина на 1 г влажного носителя.

14. Фиксированный на носителе фермент по п.13, отличающийся тем, что массовое соотношение оксидазы D-аминокислоты составляет 8-15 мг протеина на 1 г влажного носителя.

15. Фиксированный на носителе фермент по п.13 или 14, отличающийся тем, что удельная активность составляет 100-200 U на 1 г влажного носителя.

16. Способ получения фиксированного на носителе фермента, выбранного из группы, состоящей из пенициллин-G-амидазы (Е.С. 3.5.1.11), глутарил-7-АСА-ацилазы и оксидазы D-аминокислоты (Е.С. 1.4.3.3.), заключающийся в том, что фермент ковалентно связывают на материале-носителе на основе полиорганосилоксана с функциональными аминогруппами.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что ковалентную связь на материале-носителе осуществляют через диальдегид.

18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что массовое соотношение фермента к материалу-носителю устанавливают от 1 до 300 мг протеина на 1 г влажного носителя.

19. Способ по любому из пп.16-18, отличающийся тем, что используют материал-носитель со средним диаметром частиц 0,01-3 мм.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что используют материал-носитель со средним размером частиц 0,1-0,4 мм.

21. Способ по п.19 или 20, отличающийся тем, что используют шарообразный материал-носитель.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фиксированным на носителе ферментам, выбранным из группы, состоящей из пенициллин-G-амидазы, глутарил-7-АСА-ацилазы и оксидазы D-аминокислоты, к применению этих ферментов при ферментативной реакции синтеза, а также к способу улучшения объемной активности и стабильности этих фиксированных на носителе ферментов.

Фиксация биологически активных веществ, например, ферментов, на твердых материалах-носителях возможна путем множества методов и описана во многих монографиях и публикациях (см, например, "Characterization of Immobilized Biocatalysts" Buch-holz К. (редактор издания), DECHEMA Monographas N 1724-1731, т. 84 (1979); "Protein Immobilization - Fundamentals and Applications" Тaylor R. F. (редактор издания). Marcel Dekker Inc. (1991)). Наряду со способами нековалентной иммобилизации, как, например, адсорбция, включение, микроинкапсуляция, хелатирование и агрегация, для промышленных применений имеют успех в особенности методы ковалентной фиксации.

В качестве материалов-носителей для фиксации биологически активных веществ известны как органические, так и неорганические материалы на синтетической и природной основе. Ковалентную фиксацию протеинов на носителях осуществляют в общем путем реакции сочетания протеинов через реакционноспособные боковые цепи их аминокислот с носителем. Как правило, для этой цели требуется химическая активация носителя и/или протеина. Химизм сочетания при этом, смотря по обстоятельствам, определяется родoм протеина, а также используемой матрицей-носителем. На основании довольно значительных различий во вторичных, третичных и четвертичных структурах протеинов в принципе непредсказуема пригодность специфических материалов-носителей для специфических ферментов.

Для большинства коммерческих применений с целью фиксации биологически активных веществ имеют успех органические материалы-носители, в которые могут быть введены множество реакционноспособных групп. Примерами их являются природные полимеры, как например, полисахаридные производные и структурные протеины, а также синтетические макромолекулярные вещества на основе полистирола или полиакрилата. Эти органические материалы-носители активируются путем общераспространенных химических способов или уже содержат реакционноспособные группы, которые допускают соединения с иммобилизируемым протеином. Эти органические материалы-носители, однако обладают еще некоторыми недостатками, которые ограничивают их применимость. Так, природные полисахаридные производные часто чувствительны по отношению к микробному разрушению (целлюлоза), обладают неблагоприятными свойствами в отношении частиц (целлюлоза, волокна различной длины), а также обладают плохими механическими и/или в отношении набухания свойствами.

Синтетические материалы, как правило, нечувствительны по отношению к воздействию микробов, однако они имеют другие недостатки. Материалы-носители на основе полиакриламида, которые чаще всего используют при протеин-мономер-соиммобилизации, построены из потенциально канцерогенных мономеров (акриламид) и проявляют сильное набухание в водных системах. Полиакрилаты, полиметакрилаты, гидроксиалкилметакрилаты, а также полиметакриламиды можно получать путем полимеризации соответствующих мономеров вместе с пригодными агентами сшивки, и отчасти они имеются в продаже. В частности, благодаря применению глицидильных производных при сополимеризациях или в случае дополнительных модификаций с помощью этих веществ можно получать уже активированные носители (например, Eupergit, Biosynth.). Эти материалы-носители имеют относительно сильное набухание и при иммобилизации ферментов часто достигаются только незначительные объемные активности, вследствие чего применение этих материалов-носителей при ферментативных реакциях синтеза менее пригодно.

Неорганические носители обладают во много раз более благоприятными механическими свойствами, термостабильностью, устойчивостью к органическим растворителям и к воздействию микробов, чем органические носители. Примерами неорганических носителей являются минералы, например, бентонит, аттапульгит, диатомовые земли. Они часто имеют широкое распределение пор по размеру. Непористые материалы, такие как металлы или оксиды металлов, как правило, обладают только незначительными поверхностями связывания и поэтому в общем непригодны для иммобилизации биологических веществ. Правда, можно изготовлять стекло с регулируемыми порами (CPG) с определенными размерами пор и поверхностями связывания, однако оно нестабильно уже при умеренных щелочных условиях (pH > 8). Все до сих пор упомянутые неорганические материалы, помимо того, непосредственно перед реакцией сочетания должны быть пригодным образом предварительно обработаны и переведены в активированное производное. На основании инертной природы носителей эта дериватизация часто относительно затруднительная. Для этой цели чаще всего осуществляют нанесение покрытия на носитель путем обработки силаном. Тогда иммобилизируемый протеин после функционализации носителя в общем ковалентно связывается с 3-аминопропилэтоксисиланом. Таким образом получают, однако, только незначительные выходa по сцеплению протеина.

Использование полисилоксанов с органическими функциональными группами в качестве носителей ферментов известно (см. например, Poster N 518 и 519, DECHEMA-Tagung der Biotechnologen, 1992: Poster 5.218, DECHEMA.-Jahrestagung der Biotechnologen, 1993). Там описывается, что полисилоксаны с органическими функциональными группами, в частности полисилоксаны с амино-функциональными группами, могут быть использованы в качестве материалов-носителей для иммобилизации ферментов инвертазы, лактазы и глюкозаоксидазы. Для этих ферментов описывается высокая емкость и эффективность связывания, а также повышенная стабильность. Повышение объемной активности иммобилизированных ферментов по сравнению с другими материалами-носителями не раскрыто.

Ферменты пенициллин-G-амидаза, глутарил-7-ACA-ацилаза и оксидаза D-аминокислоты применяют для промышленного получения модифицированных антибиотиков на основе пенициллина и цефалоспорина. Оксидаза D-аминокислоты и глутарил-7-АСА-ацилаза катализируют двухстадийное ферментативное превращение цефалоспорина-C или его производных и солей в 7-амино-цефалоспорановую кислоту (7-ACA) или ее производные (см., например, европейский патент EP-B-0 211 033; европейский патент EP-A-0 409 521). Пенициллин-G-амидаза катализирует синтез цефалотина из 7-АСА и тиенилуксусной кислоты.

При осуществлении этих вышеуказанных реакций в промышленном масштабе чаще всего указанные ферменты применяют в иммобилизированной форме. В европейском патенте EP-B-0 211 033, например, описывается концентрирование оксидазы D-аминокислоты из микроорганизма Trigonopsis variabilis и иммобилизация этого фермента на CNBr-активированной сефарозе, причем достигается объемная активность 7 U/мл материала-носителя.

В европейском патенте EP-A-0 492 495 раскрывается иммобилизация оксидазы D-аминокислоты на сополимеризате, который состоит в основном из винилацетатных звеньев и/или звеньев винилового спирта и звеньев агента сшивки. Получают объемную активность 32 U/г влажного носителя. Иммобилизированный фермент стабилен в течение 6 месяцев при температуре 30^oC. При применении другиx твердых носителей (активированная с помощью BrCN сефароза, винилсефароза и Eupergit) достигают меньших объемных активностей и стабильностей.

В европейском патенте EP-A-0 496 993 описывается иммобилизация оксидазы D-аминокислоты из Rhodotorula gracilis и глутарил-7-ACA-ацилазы из Acinetobacter species, которая продуцируется в трансформированных клетках E. coli, на ряде твердых носителей, например, на сильно основных полистирольных смолах с четвертичной аминной функциональностью, например, амберлит IFA900; на слабоосновных полистирольных смолах с первичной аминной функциональностью, например, Duolite А365; на поликонденсированных фенолформальдегидных смолах со средней основностью со вторичными и третичными аминными функциональностями, например, Duolite A568 или Duolite А7. Для оксидазы D-аминокислоты описывается объемная активность вплоть до максимально 75 U/г влажного носителя (функционализированный эпоксидом Eupergit C). Для глутарил-7-АСА-ацилазы описывается максимальная объемная активность 41 U/г влажного носителя (функционализированный эпоксидом Eupergit C).

В WO-90/12110 раскрывается иммобилизация оксидазы D-аминокислоты и глутарил-7-АСА-ацилазы на комбинированном материале диоксид кремния - поливинилхлорид в листовой форме, который может быть дериватизирован с помощью полиэтиленимина и глутарового альдегида. Повышение объемной активности благодаря этому роду иммобилизации по сравнению с другими носителями не описывается.

В литературных источниках - Wood и др. (J.Biotech. 13 (1990), 305-314) и Cobbs и др. (Biotechnology Techniques, т. 4, N 1 (1990), 5-10) описывается иммобилизация оксидазы D -аминокислоты на твердом носителе с помощью трифункционального азиридина. Повышение объемной активности благодаря этому роду иммобилизации по сравнению с другими носителями не описывается,

В литературном источнике - Szwajcer-Dey и др. (Appl. Biochem. Biotech., 27 (1991), 239-250) описывается иммобилизация оксидазы D-аминокислоты из Trigonopsis variabilis на частицах оксидов металлов и на активированной с помощью BrCN сефарозе. Описывается иммобилизация 23 мг оксидазы D-аминокислоты на 1 г влажной сефарозы. Повышение объемной активности путем применения частиц оксидов металлов в качестве носителя не раскрывается.

В основу настоящего изобретения, таким образом, положена задача, состоящая в том, чтобы получить новые, фиксированные на носителе ферменты, выбранные из группы, состоящей из пенициллин-G-амидазы, глутарил-7-АСА-ацилазы и оксидазы D-аминокислоты, которые по сравнений с известными фиксированными на носителе ферментами обладают более высокой объемной активностью и/или стабильностью. Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить единую систему-носитель для трех вышеуказанных ферментов, благодаря чему значительно упрощается одновременное использование этих ферментов в реакторах для ферментативного синтеза.

Поставленная в изобретении задача решается благодаря получению нанесенного на носитель фермента, выбранного из группы, состоящей из пенициллин-G-амидазы (E.C. 3.5.1.11), глутарил-7- АСА-ацилазы и оксидазы D-аминокислоты (E. C. 1.4.3.3), который за счет ковалентной связи фиксирован на материале-носителе на основе органосилоксанового полимера c функциональными амино-группами.

Понятие "органосилоксановый полимер с функциональными амино-группами" согласно настоящему изобретению охватывает полимерные соединения, в которых атомы кремния и в случае необходимости атомы титана, циркония и/или алюминия связаны через атомы кислорода, а свободные валентности этих атомов металлов насыщены органическими остатками, которые содержат активируемые амино-группы. Амино-группами предпочтительно являются первичные амино-группы. Такого рода органосилоксаны с функциональными аминогруппами имеются в продаже, например, выпускаются фирмой ДЕГУССА АГ, Франкфурт, ФРГ под названием DELOXAN . Состав и получение предпочтительных полиорганосилоксанов с функциональными амино-группами описывается, например, в выкладках ФРГ NN DE-OS 31 20 214, DE-OS 38 37 418, DE-OS 39 25 359 и DE-OS 39 25 360, на которые настоящим делается ссылка.

Примерами пригодных функциональных амино-групп в органосилоксановых полимерах являются, например, -NH₂, -RNH₂, -NH-R-NH₂ или -R-(NH-R")_n-NH₂, причем R и R" независимо друг от друга могут обозначать линейную или разветвленную алкиленовую группу с 1-10 C-атомами, циклоалкиленовую группу с 5-8 C-атомами или линейную или разветвленную алкиленовую группу, которая содержит циклогексиленовое или фениленовое звено. Особенно предпочтительными примерами функциональных амино-групп являются -NH₂, -NH(CH₂)₂-NH₂, -(CH₂)₃-NH₂ или -(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-NH -(CH₂)₂-NH₂.

Вид и соответственно форма содержащего функциональные амино-группы материала-носителя сам по себе может быть любым (любой). Однако предпочтительные частицеобразные материалы-носители c пригодным размером частиц, которые, с одной стороны, обладают высокой удельной поверхностью и, с другой стороны, делают возможной хорошую манипулируемоcть с ними. Предпочтительная средняя область диаметров частиц составляет 0,01-3 мм. Предпочтительно материал-носитель является по существу шарообразным (сферическим). Приготовление шарообразных органосилоксановых полимеров с функциональными амино-группами описывается в вышеуказанных выкладках ФРГ NN DE-OS 39 25 359 и DE-OS 39 25 360, на которые настоящим делается ссылка. Средний размер частиц носителя предпочтительно составляет 0,05-1 мм и особенно предпочтителен средний размер частиц 0,1-0,4 мм. Для пенициллин-G-амидазы предпочтительнее всего средний размер частиц 0,1-0,3 мм, а для глутарил-7-АСА-ацилазы и оксидазы D-аминокислоты предпочтительнее всего средний размер частиц 0,2-0,4 мм.

Емкость (то есть число амино-групп) используемого для фиксации ферментов носителя с функциональными амино-группами предпочтительно составляет 0,5-5 мг-экв./г носителя, особенно предпочтительно 1-4 мг-экв./г носителя.

Для фиксации ферментов на носителе с функциональными аминогруппами можно применять разные, известные из уровня техники методы. Эти методы включают в общем активирование находящихся на носителе амино-групп с помощью активирующего реагента. Активированные группы на носителе затем могут реагировать с реакционноспособными группами фермента, в частности с амино-группами в боковой цепи. Таким образом получаются фиксированные на носителе ферменты, которые неожиданным образом обладают повышенной по сравнению с другими материалами-носителями объемной активностью.

Путем реакции с тиофосгеном или 1,4-фенилдиизотиоцианатом амино-группа носителя может быть переведена в реакционноспособную изотиоцианатную группу. За счет реакции носителя с диангидридами (например, ангидрид янтарной кислоты) могут быть введены карбоксильные функции, которые можно переводить в реакционноспособные хлорангидриды и сложные эфиры кислот (например, сложный N-гидроксисукцинимидо-эфир). Далее активирование амино-группы на носителе можно осуществлять за счет реакции с хлортриазинами (например, как цианурхлорид). Следующим примером активирования является реакция первичных амино-групп на носителе с 4-нитробензоилхлоридом и диазотирование ароматической амино-группы и/или переведение в соответствующий гидразин. Также путем реакции с бис-эпоксидами (например, простой 1,4-бутандиол-диглицидиловый эфир) или эпихлоргидрином могут быть активированы амино-группы путем введения реакционноспособных эпоксидных групп. Подробности такого и других методов описываются, например, в "Covalent and Coordination Immobilization of Proteins, Cabral J. M. S., Kennedy J. F. in "Protein Immobilization, Fundamentals and Application (под ред. Taylor R.F.), Marcel Dekker Inc., 1991.

Однако активирование амино-групп на носителе предпочтительно осуществляют путем взаимодействия с диальдегидами (например, как глутаровый диальдегид). Этот метод можно особенно легко осуществлять также в водной среде. Таким образом, можно избежать применения токсичных соединений и органических растворителей,

После активирования амино-групп на носителе осуществляют фиксацию фермента путем контактирования активированного носителя с ферментом в пригодных условиях. Затем могут быть насыщены непрореагировавшие реакционноспособные группы носителя. В случае активированного альдегидом носителя насыщение можно осуществлять, например, с помощью этаноламина.

Одной формой осуществления настоящего изобретения является фиксированная на носителе пенициллин-G-амидаза. Пенициллин-G-амидаза представляет собой фермент, который получают из множества различных видов бактерий и некоторых грибов и дрожжей, предпочтительно из E. coli. Предпочтительно массовое соотношение пенициллин-G-амидазы к материалу-носителю находится в пределах 2-200 мг протеина на 1 г влажного носителя, особенно предпочтительно в пределах 40-80 мг протеина на 1 г влажного носителя. В случае предлагаемой согласно изобретению иммобилизации пенициллин-G-амидазы на содержащих функциональные амино-группы органосилоксановых полимеров можно достигать, например, удельных объемных активностей в области более чем 100 U/г влажного носителя и, в частности, более чем 125 U/г влажного носителя. Предпочтительно удельная объемная активность находится в пределах 100-300 U/г влажного носителя и особенно предпочтительно - в пределах 125-275 U/г влажного носителя. Единица измерения "U" для пенициллин-G-амидазы определяется как количество фермента, которое гидролизует 1 мкмоль пенициллина-G в минусу при стандартных условиях (5% пенициллина-G; 0,6 ммоль/л калийфосфатного буфера, pH = 8,0; 28^oC).

Другая форма осуществления настоящего изобретения относится к фиксированной на носителе глутарил-7-АСА-ацилазе. Глутарил-7-АСА- ацилазу получают, например, из Acinetobacter spp. или из клеток E. coli, трансформированных геном глутарил-7-АСА-ацилазы (см. европейский патент EP-A-0 496 993). В случае фиксированной на носителе глутарил-7-АСА-ацилазы массовое соотношение фермента к материалу-носителю предпочтительно находится в области 10-110 мг протеина на 1 г влажного носителя, особенно предпочтительно - в пределах 20-70 мг протеина на 1 г влажного носителя. Удельная объемная активность иммобилизированной согласно изобретению глутарил-7-АСА-ацилазы может составлять более чем 100 U/г влажного носителя, в частности более 125 U/г влажного носителя. Предпочтительно удельная объемная активность фиксированной на носителе глутарил-7-АСА-ацилазы находится в пределах 100-250 U/г влажного носителя, особенно предпочтительно - в интервале 125-200 U/г влажного носителя. Единица измерения "U" для глутарил-7-АСА- ацилазы определяется как количество фермента, которое гидролизует 1 мкмоль 7-(4-карбоксибутанамидо)-цефалоcпорановой кислоты (глутарил-7-АСА) в минуту в стандартных условиях (2% GI-7-АСА; 5 ммоль/л калийфосфатного буфера, pH > 8,0; 37^oC.

Еще одна следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к фиксированной на носителе оксидазе D-аминокислоты. Массовое соотношение фиксированной на носителе оксидазы D-аминокислоты к материалу-носителю предпочтительно находится в пределах 5-25 мг протеина на 1 г влажного носителя, особенно предпочтительно в интервале 8-15 мг протеина на 1 г влажного носителя. Удельная объемная активность оксидазы D-аминокислоты в случае предлагаемой в изобретении иммобилизации может составлять 100 U/г влажного носителя или более, в частности 125 U/г влажного носителя или более. Предпочтительно удельная объемная активность находится в пределах 100-200 U/г, особенно предпочтительно в интервале 125-175 U/г влажного носителя. Единица измерения "U" для оксидазы D-аминокислоты в этой связи определяется как цефалоспорин-С-(Ceph-C)- единица. Ceph-С-активность определяют в присутствии системы катализа /O₂/H₂O₂. Образовавшиеся количества продуктов (- кетоадипинил-7-аминоцефалоспорановая кислота и глутарил-7-аминоцефалоспорановая кислота) количественно определяют после разделения реакционного раствора с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Активность I U соответствует образованию 1 мкмоль продуктов в минуту при 25^oC при стандартных условиях (1,3 kU каталазы; O₂-насыщеннный раствор; 0,007% H₂O₂).

В случае необходимости оксидаза D-аминокислоты также может быть соиммобилизирована с каталазой (E.C. 1.11.1.6). В этом случае в общем применяют 50 U -100 U каталазы на U (Ceph-C-U) оксидазы D-аминокислоты. Иммобилизацию каталазы осуществляют соответственно вышеописанным методикам. Активность I U каталазы соответствует количеству фермента, которое гидролизует 1 мкмоль H₂O₂ в минусу при стандартных условиях (25 ммоль/л калийфосфатного буфера, pH = 7,0; 0,018% H₂O₂).

Оксидазу D-аминокислоты согласно изобретению получают из большого числа организмов, например E. coli, Pseudomonas spezies, Aerobacter spezies, Candida tropicalis, Penicillinium roqueforti, Aspergillus flavus и Aspergillus niger, Neurospora crassa, Nocardia, Gitrobacter, Rhodotorula и Trigonopsis variabilis. Оксидаза D-аминокислоты из Trigonopsis variabilis особенно предпочтительна. Выделение и очистка этого фермента описываются, например, в европейском патенте EP-A-0 211 033.

Следующим предметом настоящего изобретения является применение фиксированных на носителе согласно изобретению ферментов индивидуально или в комбинации по меньшей мере двух указанных ферментов при ферментативной реакции синтеза. Пенициллин-G-амидазу можно применять, например, при синтезе цефалотина из 7-АСА и тиенилуксусной кислоты. Оксидазу D-аминоксилоты и глутарил-7-АСА- ацилазу можно использовать при двухстадийном ферментативном синтезе 7-AСA из цефалоспорина С.

Фиксированные на носителе согласно изобретению ферменты отличаются от известных фиксированных на носителе ферментов повышенной объемной активностью, повышенной стабильностью и/или улучшенными механическими свойствами иммобилизата. Другим предметом настоящего изобретения является, таким образом, способ улучшения объемной активности фиксированных на носителе ферментов, выбранных из группы, состоящей из пенициллин-G-амидазы (Е.С. 3.5.1.11), глутамил-7-АСА-ацилазы и оксидазы D-аминокислоты (E.C. 1.4.3.3), который отличается тем, что фермент за счет ковалентной связи фиксируют на материале-носителе на основе органосилоксанового полимера с функциональными амино-группами.

Как уже указывалось выше, фиксацию ферментов на материале-носителе осуществляют предпочтительно через диальдегид, например, глутаровый диальдегид, однако также могут быть использованы любые другие способы, пригодные для иммобилизации протеинов на содержащих функциональные амино-группы носителях.

Неожиданно фиксированные на носителе согласно изобретению ферменты обладают высокими объемными активностями, вследствие чего в осуществляемых в промышленности реакциях синтеза достигают высоких выходов продуктов. В особенности иммобилизированные согласно изобретению ферменты пригодны в реакциях, в случае которых преобладают низкие температуры, например, 4-30^oC, и/или органические растворители, например, диметилформамид, диметилсульфоксид и т. д. Далее иммобилизированные согласно изобретению ферменты обладают улучшенными механическими свойствами по сравнению с другими материалами-носителями, например, сжимаемость и проходимость через колонну.

Настоящее изобретение далее поясняется примерами в сочетании с фиг. 1-5.

На фиг. 1 показано сравнение удельных объемных активностей пенициллин-G-амидазы, которая фиксирована на полиорганосилоксане с функциональными амино-группами или на полиметакрилате,

на фиг. 2 показано сравнение выхода продукта в случае синтеза цефалотина с помощью иммобилизированной пенициллин-G-амидазы, которая фиксирована на полиорганосилоксане с функциональными амино-группами или на полиметакрилате,

на фиг. 3 показано сравнение объемных активностей иммобилизированнной глутарил-7-АСA-ацилазы в случае разных материалов-носителей,

на фиг. 4 показано сравнение проточных свойств (в отношении количества протекающей жидкости) различных колонных материалов,

на фиг. 5 показано сравнение сжимаемости различных колонных материалов.

Примеры.

Пример 1. Получение иммобилизированной пенициллин-G-амидазы.

Полиорганосилоксаны с функциональными амино-группами в различных спецификациях выпускаются фирмой ДЕГУССА АГ. Функциональные группы отдельных веществ представлены в табл. 1 (см. табл. 1, 2 в конце описания).

К 1 г содержащего амино-группы материала-носителя PAP III добавляют 1 мл 25%-ного раствора глутарового диальдегида в 0,1 моль/л калийфосфатном буфере, pH = 7,0, и перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью пропеллерной мешалки. Обработанный гель промывают 20 мл 0,1 моль/л калийфосфатного буферного раствора, pH < 7,0. К активированному материалу-носителю добавляют 500-5000 U раствора пенициллин-G-амидазы в 10 мл 0,01 моль/л раствора фосфата калия, pH = 7,0, и суспензию перемешивают в течение 2-х часов при комнатной температуре. Избыточные реакционноспособные группы насыщают с помощью 1 мл 0,1 моль/л раствора этаноламина с pH = 9,0 путем перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре.

Затем при 4^oC промывают сначала 50 мл 0,02 моль/л калийфосфатного буфера с pH = 7,0 /1 моль/л NaCl, после этого 50 мл 0,02 моль/л калийфосфатного буфера. Определения активности раствора реакции сочетания и промывных растворов, а также иммобилизированного фермента осуществляют при условиях точно установленного значения pH в автотитраторе (5% Pen-G, 28^oC, pH =8,0, 0,6 моль/л калийфосфатный буфер). Данные по удельной активности получают в расчете на влажную массу катализатора.

На фиг. 1 в сравнительном плане представлены удельные объемные активности РАР III и полиметилакрилатных производных.

Достигаемые в случае предлагаемых согласно изобретению носителей высокие объемные активности позволяют использовать иммобилизированную пенициллин-G-амидазу (PGA) в реакциях-синтезах, при которых необходимы низкие температуры и pH-значения, а также органические растворители для получения высоких выходов продуктов. На фиг. 2 в сравнительном плане представлены одинаковые синтезы цефалотина из 7-АСА и тиенилуксусной кислоты при использовании в одинаковом объеме иммобилизированной PGA при применении иммобилизированной на РАР III и полиметилакрилате PGA.

Пример 2. Иммобилизация глутарил-7-АСА-ацилазы.

Фиксацию осуществляют аналогично иммобилизации PGA. Используют 180-250 U/г влажного материала-носителя DAP III или РАР III. Результирующие объемные активности представлены на фиг. 3 в сравнении с иммобилизацией при использовании полиметакрилата и найлона (полиамида).

Пример 3. Иммобилизация оксидазы D-аминокислоты (DAO).

Фермент перед фиксацией подвергают диализу против 20 ммоль/л KPO₄-буфера с pH = 7,0/ 1 ммоль/л дитиотреитола. На 1 г влажного материала-носителя DAP III используют 2500 U DAO (единиц D-аланина). Блокирование избыточных реакционноспособных мест осуществляют путем перемешивания в течение 1 часа с 0,1 моль/л раствором этаноламина с pH = 8,0. Промывку осуществляют 0,5 моль-л NaCl / 0,2 ммоль/л DTT /0,5 ммоль/л ЭДТК в 20 ммоль/л KPO₄, pH = 7,0. Достигают активностей > 1000 U/г влажного материала-носителя.

В табл. 2 представлены объемные активности иммобилизированной DAO при использовании разных материалов-носителей.

Пример 4. Механические свойства.

1. Проточные свойства / колонная проходимость

Фильтрационные свойства различных катализаторов на носителе Eupergit C, полиакриламидный гель, РАР III) определяют путем установления проточного объема в единицу времени при постоянном гидростатическом давлении и идентичной высоте слоя геля. Опыт повторяют дважды без предварительного снятия внутренних напряжений геля. Результат этого испытания представлен на фиг. 4. Видно, что полисилоксан с функциональными амино-группами обладает лучшими проточными свойствами, чем другие материалы-носители.

2. Сжимаемость

Сжимаемость полиорганосилоксана PAP III, а также Eupergit и полиакриламида определяют в тесте на колонный проток при использовании одинаковых объемов слоя геля и высот заполнения. На фиг. 5 представлена зависимость линейной скорости потока от гидростатического давления. Видно, что полисилоксан с функциональными амино-группами обладает лучшими свойствами в отношении сжимаемости, чем другие материалы-носители.