способ иммунодиагностики инфекций

Формула изобретения

Способ иммунодиагностики инфекций путем определения в мазках адгезии лимфоцитами и нейтрофилами эритроцитов из специфического и неспецифического эритроцитарных диагностикумов, характеризующихся тем, что в крови больного одновременно определяют в отношении каждого вида диагностикума количество эритроцитов, адгезированных розеткообразующими лейкоцитами, и лейкоцитами, адгезировавшими 1 - 2 эритроцита, и вычисляют индекс специфической адгезии (розеткообразования) по формуле



где PO_сп - сумма эритроцитов специфического эритроцитарного диагностикума, адгезированных розеткообразующими лейкоцитами;

PO_несп - сумма эритроцитов неспецифического эритроцитарного диагностикума, адгезированных розеткообразующими лейкоцитами;

A_сп(1+2) и A_несп(1+2) - суммы адгезии эритроцитов из соответствующих специфического и неспецифического эритроцитарных диагностикумов для лейкоцитов, адгезировавших 1 - 2 эритроцита,

при величине индекса выше 1,8 и ниже 0,4 диагностируют инфекцию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и предназначено для ранней диагностики инфекций.

Известен способ иммунодиагностики инфекций путем определения адгезивной способности нейтрофилов и лимфоцитов. В этом способе производят диагностическую оценку по проценту нейтрофилов, адгезировавших бактерии возбудителя инфекции (А.И.Аутеншлюс и соавт. "Значение теста иммуноцитоприлипания в диагностике туберкулеза органов дыхания у детей и подростков". - Пробл. туб.- 1981. - с. 28-31; С.Р. Багинский и соавт. "Реакция лейкоцитов ин витро на антигены микобактерий человеческого и бычьего видов у больных туберкулезом легких". - Пробл. туб.-1985. - с. 51-54), по проценту лимфоцитов, адгезировавших к среде, содержащей специфическую субстанцию микроба (А.Н.Мац и соавт. "Неспецифическая и антигенспецифическая адгезивность циркулирующих лимфоцитов у больных дизентерией при комплексной терапии с применением тималина и индометацина". - Журн. микробиол. -1987. -N 5.- с. 67-71). Наиболее известен способ иммунодиагностики путем определения процента лимфоцитов, адгезировавших 3 и более эритроцитов из специфического эритроцитарного диагностикума и обозначаемых как розеткообращующие лимфоциты (В. М. Минаева и соавт. "Использование теста специфического розеткообразования при клещевом энцефалите с целью лабораторной диагностики". - Журн. микробиол. - 1987.- N 7. - с. 41-44; П.Н.Дерябин и соавт. ("Диагностика стафилококковой инфекции по определению антигенсвязывающих лимфоцитов". - Журн. микробиол. - 1993. - N 4. -c. 25-31).

Главным недостатком известного способа является малая чувствительность и специфичность, что выражается в отрицательных результатах исследования у части больных диагностируемой инфекцией и выявлении положительной реакции у лиц, не болеющих этой инфекцией. По материалам работы В.М.Минаевой и соавт., при определении розеткообразующих лимфоцитов (РОЛ) со специфическим эритроцитарным диагностируемом получено у больных клещевым энцефалитом 65% положительных результатов, а у доноров - 7,% и у больных ОРВИ - 30%. П.Н. Дерябин и соавт. получили 65% положительных результатов при определении специфических РОЛ у больных стафилококковой инфекцией, а при других заболеваниях исследование с тем же диагностикумом выявило положительную реакцию у 5-16% больных.

Невозможность совершенствования по параметрам чувствительности и специфичности связана с тем, что они находятся в обратной зависимости. Увеличение чувствительности способа путем снижения величины диагностического критерия повышает число положительных результатов одновременно у больных инфекцией и в контрольной группе. И наоборот, повышение величины диагностического критерия уменьшает число положительных результатов у контрольных лиц, но одновременно уменьшает возможность выявления положительной реакции у больных инфекцией.

Другой недостаток способа заключается в нестандартизованности методики определения РОЛ и в отсутствии унифицированного количественного критерия специфической реакции. Каждый автор в соответствии с особенностями применяемой методики и видом инфекции выводит свой диагностический критерий, отличающийся даже при диагностике одной инфекции разными исследователями. Так, по материалам работы П.Н.Дерябина и соавт. "Диагностическое значение определения антигенсвязывающих лимфоцитов" (Клин. лаб. диагностика.- 1992. - N 11. -с. 4-10), содержание специфических РОЛ при разных инфекциях колеблется от 2 до 34%.

Один из недостатков способа состоит в невозможности использования в начальной стадии инфекционного заболевания коммерческих антигенных диагностикумов, поскольку выявляемое с их помощью иммунное розеткообразование возникает спустя значительное время после начала инфекции. Поэтому для ранней диагностики используют ЭД, которые сенсибилизируют сложными по составу субстратами микробов (фильтраты бактериальных взвесей, экстракты бактерий). Однако изготовленные таким образом ЭД не имеют стабильных характеристик. Известен другой путь изготовления нужного диагностикума, основанный на образовании комплекса Ат и Аг (В.М.Минаева Л.П. Быкова и соавт. "Использование теста специфического розеткообразования при клещевом энцефалите с целью лабораторной диагностики". - Журн. микробиол. - 1987. -N 7-с. 41-44). В этом способе к противоэнцефалитному иммуноглобулиновому ЭД присоединяют Аг вируса клещевого энцефалита. Определение специфических РОЛ с этим диагностикумом позволяет определить реакцию до начала иммунного синтеза и наиболее эффективно на 1-3-й день заболевания. Параметры изготовления такого диагностикума постоянны, что определяет стабильность его свойств. Этот диагностикум используется только при клещевом энцефалите. Возможности применения подобных диагностикумов для исследования специфического розеткообразования лимфоцитов при других инфекциях не изучены.

Известный способ отличается значительной трудоемкостью. Перед проведением диагностического исследования необходимо сформировать значительную в количественном отношении контрольную группу здоровых людей и больных заболеваниями для определения доверительных границ показателя. Исследование включает в себя также этапы выделения лимфоцитов из лейкоцитарной взвеси, их отмывание от плазмы, стандартизацию количественного содержания лейкоцитов во взвеси.

Изобретение направлено на решение задачи повышения чувствительности, специфичности, унификации диагностической оценки реакции и уменьшения трудоемкости способа.

Решение задачи достигается тем, что у больного одновременно определяют адгезию эритроцитов из специфического и неспецифического диагностикума, подсчитывают суммы адгезированных объектов каждого вида розеткообразующими клетками и клетками с адгезией 1-2-х объектов и вычисляют индекс специфической адгезии, для чего величину отношения сумм адгезии специфического и неспецифического объектов розеткообразующими лейкоцитами делят на величину отношения сумм адгезии этих объектов лейкоцитами с низким уровнем адгезии, при величине индекса выше 1,8 и ниже 0,4 диагностируют инфекцию.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве объектов адгезии используют коммерческие антигенные и антительных эритроцитарные диагностикумы (ЭД) для РПГА, а при их отсутствии применяют любой известный способ сенсибилизации антигеном (Аг) или антителом (Ат) формализованных или танизированных эритроцитов (Э). Оптимальный размер Э составляет 2-3 мкм. Для исследования применяют два вида диагностикумов. При определении иммунной реакции используют антигенные ЭД, а для выявления реакции в начальном периоде инфекции - ЭД, содержащие комплекс Ат и Аг.

При приготовлении взвеси специфического антигенного ЭД его дважды отмывают в физрастворе хлористого натра или в буферном растворе, густую взвесь диагностикума в физрастворе отстаивают в течение 15-20 мин для осаждения конгломератов клеток. Верхнюю часть взвеси отсасывают и в камере Горяева определяют содержание эритроцитов и разводят их взвесь до концентрации 80-100 млн./мл.

Используемый в качестве неспецифического антигенный ЭД предварительно окрашивают анилиновой краской красного или черного цвета. Для этой цели можно использовать красители для окраски бытовых тканей. Насыщенный раствор краски в физрастворе выдерживают в течение суток при температуре 37^oC и центрифугируют для осаждения нерастворившихся частиц краски. В ампулу с сухим ЭД вносят 2-3 мл краски. Жидкий ЭД смешивают с краской в равных объемах. Смесь подогревают при 50-60^o в течение 1-2 мин и помещают в термостат при температуре 37^o на 3-5 сут. Взвесь окрашенных Э отмывают от избытка краски до полного просветления надосадочной жидкости. Концентрированную взвесь Э отстаивают и разводят ее до концентрации клеток 100 млн./мл.

Из приготовленных таким путем антигенных ЭД готовят диагностикумы с комплексом Ат и Аг. Для этого антигенный ЭД смешивают в равных объемах с гомологичной иммунной сывороткой активностью в РПГА 8-16 гемагглютинирующих единиц (ГЕ), выдерживают при комнатной температуре в течение часа, периодически встряхивая, дважды отмывают физраствором и взвесь с концентрацией Э 100 млн./мл смешивают с равным объемом раствора гомологичного бактериального полисахарида (ПСХ) , липополисахарида (ЛПС), надосадочной жидкостью бактериальных растворов диагностикумов, раствором вирусного Аг. Активность этих растворов в РТПГА с соответствующей иммунной сывороткой составляет 4-5 антигенных единиц (АЕ). Смесь выдерживают в течение одного часа, трижды отмывают физраствором и готовят взвесь ЭД, как это описано в отношении антигенных ЭД. Концентрация Э во взвеси специфического ЭД составляет 80-100 млн. и неспецифического ЭД - 100 млн./мл.

При наличии антительного (иммуноглобулинового) ЭД осуществляют только одну операцию присоединения к нему специфической субстанции микроба.

В комплексных ЭД связана большая часть антигенных детерминант, а кнаружи ориентированы неантигенные детерминанты, ответственные за наведение специфической реакции в начальном периоде инфекции.

Приготовленные ЭД можно хранить в холодильнике в жидком состоянии не менее трех месяцев, но необходимо контролировать качество взвесей, избегая образования конгломератов эритроцитов. При наличии последнего взвеси Э подвергают переосаждению.

Непосредственно перед проведением диагностического исследования взвеси специфического и неспецифического ЭД с одинаковой структурой поверхностных детерминант смешивают в соотношении 1:1.

Кровь больного в объеме 0,3 - 0,4 мл смешивают с раствором глюгицира в соотношении 4:1 или с раствором гепарина из расчета 10 МЕ/мл, отстаивают ее 30-40 мин при комнатной температуре и отсасывает плазму с лейкоцитами, не опасаясь небольшой примеси Э. В камере Горяева определяют концентрацию лейкоцитов. При малом их содержании лейкоциты концентрируют путем дополнительного отстаивания или кратковременного центрифугирования лейкоцитарной взвеси. Взвесь лейкоцитов в объеме 10 мкл вносят в лунку микропланшета для РГА или в микропробирку, смешивают с равным объемом смеси взвесей специфического и неспецифического ЭД и выдерживают при комнатной температуре 5-15 мин. При исследовании адгезивной способности нейтрофилов предпочтительнее короткая экспозиция, чтобы избежать поглощения объектов, которое ухудшает оценку адгезии. С помощью специального устройства, позволяющего получить на одном предметном стекле серию ровных маленьких мазков размером 18 х 3,5 -4 мм (В.Н. Каплин, Е.И.Самоделкин. "Устройство для изготовления мазков. - А.с. N 1292732. - Бюлл. изобр.- 1987. - N 8), изготовляют мазок. При отсутствии устройства мазок изготовляют известным способом. При микроскопировании мазка его площадь условно делят на три части и в каждой из них учитывают по трети от числа определяемых лейкоцитов. Оценивают адгезивную способность 100 изолированно расположенных лейкоцитов (лимфоцитов или нейтрофилов), учитывая одновременно количество адгезированных каждой клеткой специфических объектов, имеющих в мазке светло-голубую или светло-серую окраску, и неспецифических объектов, окрашенных в черный или темно-красный цвет. Из подсчета исключают лейкоциты, лишенные адгезивной активности. Лейкоциты распределяют на две группы. В группу розеткообразующих включают лейкоциты с адгезией трех и более объектов одного вида. Другую группу образуют лейкоциты с адгезией одного-двух объектов. Для каждой группы подсчитывают отдельно суммы специфического и неспецифического объектов и вычисляют индекс специфической адгезии (ИСА) делением величины отношения сумм адгезированных специфических и неспецифических объектов розеткообразующими лейкоцитами на величину отношения соответствующих сумм адгезии лейкоцитами с низким уровнем адгезии. Контрольная величина индекса составляет 0,4 - 1,8. Выход величины индекса за эти пределы указывает на специфическую реакцию. В зависимости от уровня адгезивной активности лейкоцитов применяют дополнительные варианты расчета ИСА. Если много лейкоцитов с адгезией 4-х и более специфических объектов и сумма адгезии последних больше соответствующей суммы у лейкоцитов 3-х объектов, последние исключают из числа розеткообразующих клеток. При отсутствии розеткообразующих лейкоцитов в отношении специфического объекта или малом их количестве в группу розеткообразующих переводят лейкоциты, адгезировавшие по два объекта. В этом варианте в знаменатель расчета ИСА вводят величину отношения суммы лейкоцитов, адгезировавших по одному специфическому объекту и с нулевой активностью в отношении неспецифического объекта к сумме лейкоцитов с адгезией одного неспецифического объекта и с нулевой активностью в отношении специфического объекта. В обоих дополнительных вариантах расчета ИСА его контрольная величина остается неизменной - 0,4 - 1,8.

Пример 1. Диагностика клещевого энцефалита.

Для проведения диагностического исследования изготовлен специфический ЭД, содержащий комплекс Ат и Аг. 1%-ную взвесь противоэнцефалитного иммуноглобулинового ЭД Томского НИИВС смешали с раствором вируса клещевого энцефалита для РТГА активностью в РПГА с иммуноглобулиновым ЭД 5 АЕ. После часовой экспозиции и отмывания приготовлена взвесь с содержанием Э 100 млн./мл. Неспецифический комплексный ЭД приготовлен из антигенного ЭД из шигелл Зонне СПбНИИВС. Предварительно окрашенный ЭД смешали с гомологичной иммунной сывороткой, разведенной до активности в РПГА 16 ГЕ. После экспозиции и отмывания ЭД смешан с надосадочной жидкостью бактериального диагностикума из шигелл Зонне ТашНИИВС активностью в РТПГА 4 АЕ. После экспозиции и отмывания приготовлена взвесь с содержанием Э 100 млн./мл.

От трех больных детей с подозрением на клещевой энцефалит, заболевших 2-5 дней назад, получена взвесь лейкоцитов. В планшете для РГА она смешана со смесью взвесей специфического и неспецифического ЭД. После 5- и 15-минутной экспозиции сделаны мазки на одном предметном стекле. Результаты исследования адгезивной способности нейтрофилов после 5-минутной экспозиции представлены в табл. 1. Для сравнения представлены результаты исследования, проведенного у детей с другими инфекционными заболеваниями и в другие дни, и у донора. Исследование у контрольных лиц проведено по аналогичной методике.

Пример расчета индекса у больного клещевым энцефалитом N 1:

Индекс = 64/9/70/64 = 6,5.

У всех больных клещевым энцефалитом выявлена отчетливая специфическая реакция на вирус клещевого энцефалита. Одновременно проведенные серологические реакции дали отрицательный результат. Серологическое подтверждение диагноза было получено только при исследовании парных сывороток спустя две недели после первого исследования. У больного N 1 диагноз клещевого энцефалита был подтвержден положительным результатом вирусологического исследования. Исследование у контрольных лиц дало ясный отрицательный результат и подтвердило обоснованность выбора контрольной величины диагностического критерия в форме ИСА. В таблице обращает на себя внимание независимость величины ИСА от величины адгезии специфического объекта розеткообразующими нейтрофилами и невозможность отличить по этому показателю больных клещевым энцефалитом и лиц контрольной группы.

Одновременное определение адгезивной активности лимфоцитов при 15-минутной экспозиции (табл. 2) подтвердило наличие специфической реакции на вирус клещевого энцефалита. Примечательны также близкие индивидуальные величины ИСА у нейтрофилов и лимфоцитов. Как и при исследовании нейтрофилов, у лимфоцитов не обнаружено зависимости величины ИСА от величины адгезии специфического объекта РОЛ. Сопоставление этого показателя у больных и донора подтверждает неэффективность диагностической оценки по абсолютной величине адгезии.

При обследовании предлагаемым способом 14 детей, больных клеевым энцефалитом, в ранние сроки заболевания (1-6 дней) выявлена положительная реакция у всех обследованных как по показателю адгезии нейтрофилов, так и лимфоцитов. Положительные серологические реакции обнаружены в среднем на 14 дней позднее.

Пример 2. Диагностика туберкулезной инфекции.

При проведении диагностического исследования использованы два специфических эритроцитарных диагностикума - туберкулезный фосфатидный антигенный СПбНИИВС и приготовленный на него диагностикум, содержащий сложный комплекс Аг и Ат. Специфический антигенный ЭД приготовлен по обычной методике, но с концентрацией Э 50 млн./мл. Для приготовления комплексного специфического ЭД 1%-ную взвесь антигенного туберкулезного диагностикума смешали с равным объемом соответствующей иммунной сыворотки активностью в РПГА 16 ГЕ. После часовой экспозиции и отмывания взвесь Э смешали с надосадочной жидкостью центрифугата взвеси вакцины БЦЖ активностью в РТПГА 4 АЕ. Аналогичный неспецифический ЭД приготовлен из антигенного ЭД из шигелл Зонне, как в примере 1.

Результаты представлены в табл. 3.

От трех больных туберкулезом легких в активной фазе и от трех доноров получена лейкоцитарная взвесь. С каждой взвесью поставлены две пробы - одна со смесью комплексного специфического и неспецифического ЭД, а другая - с антигенным ЭД (особенность постановки последней пробы делает понятной вдвое сниженную концентрацию Э в этом диагностикуме). Экспозиция проб составила 7 мин. В мазках определили адгезивную способность нейтрофилов.

По результатам определения ИСА у всех больных туберкулезом получена положительная реакция с комплексным специфическим диагностикумом, что совпадает с активной фазой процесса и положительным результатом бактериологического исследования, свидетельствующими о наличии у больных антигемии. Определение индекса с антигенным туберкулезным диагностикумом выявило иммунную реакцию только у одного больного (N 3) и специфическую депрессию адгезии у больного N 3, связанную, вероятно, с туберкулезной аллергией. Сравнение результатов в группе больных и доноров показывает, что по величине адгезии специфического объекта розеткообразующими нейтрофилами эти группы не различаются. В то же время величина ИСА у доноров не выходит за пределы его контрольного значения.

Предлагаемым способом обследовано 37 больных туберкулезом легких в активной фазе. Из 11 больных с бактериологическим подтверждением диагноза определение ИСА с комплексным туберкулезным ЭД выявило положительную реакцию у всех больных, а при отсутствии бактериологического подтверждения у 21 из 26 (81% положительных результатов). По абсолютной величине адгезии розеткообразующими нейтрофилами превышение этого показателя в сравнении с контрольной группой получено только у одного больного (3% от числа больных). Исследование с антигенным туберкулезным диагностикумом с расчетом ИСА выявило положительную реакцию у 55% больных туберкулезом, а оценка по абсолютной величине адгезии специфического объекта оказалась совершенно неэффективной. Исследование с фосфатидным антигенным ЭД титров противотуберкулезных Ат выявило достоверное их повышение только у двух больных.

Пример 3. Исследование на модели реакции специфической адгезии лимфоцитов, индуцированной субстанцией шигелл Зонне.

Из крови доноров получена лейкоцитарная взвесь. 10 мкл взвеси смешаны с 5 мл надосадочной жидкости бактериального диагностикума из шигелл Зонне, разведенной до активности в РТПГА 0,01 АЕ/мл. В контрольных пробах такой же объем лейкоцитарной взвеси смешивали с 5 мкл физраствора. Пробы выдержаны при температуре 37^oC в течение 30 мин. В каждую пробу добавлено по 10 мкл смеси взвесей ЭД, содержащего комплекс Аг и Ат из шигелл Зонне и приготовленного как в примере 1 (специфический диагностикум), и ЭД с комплексом туберкулезного Ат и Аг, приготовленного как в примере 2 (неспецифический диагностикум). Пробы выдержаны в течение 15 мин. В мазках определена адгезивная способность лимфоцитов. Результаты серии исследований представлены в таблице 4.

Результаты исследования в контрольных пробах подтверждают обоснованность выбора контрольной величины ИСА и независимость величины индекса от величины адгезии специфического объекта РОЛ. Во всех стимулированных пробах выявлено значимое повышение ИСА. Если рассматривать исследования контрольных проб и стимулированных проб как независимые группы, то только в одном исследовании (проба N 1) величина адгезии специфического объекта РОЛ превосходит верхнюю границу этого показателя в контрольных пробах. В то же время при сопоставлении величин адгезии специфического объекта РОЛ в индивидуальных пробах повышение специфического розеткообразования обнаруживается во всех исследованиях. Расчет ИСА в стимулированных пробах подтверждает наличие этого эффекта. Таким образом, определение ИСА позволяет выявить реакцию специфической адгезии в каждом индивидуальном исследовании. Рассматриваемая реакция, наведенная взаимодействием ин витро лимфоцитов с микродозой растворимой специфической субстанцией шигелл Зонне, воспроизводит момент начала антигенемии при шигеллезной инфекции. Это дает основание утверждать возможность возникновения реакции специфической адгезии лимфоцитов в ближайший час после начала антигенемии и эффективность ранней диагностики шигеллезной инфекции предлагаемым способом.

Одним из положительных эффектов изобретения является повышение чувствительности и специфичности диагностики. Это доказывается анализом положительных результатов в примере 3. При оценке реакции по величине адгезии специфического объекта РОЛ получен только один альтернативный диагностический результат, а расчет ИСА дал положительный результат во всех стимулированных пробах. Таким образом, при оценке по альтернативному критерию предлагаемый способ в 12 раз чувствительнее известного способа. Даже если для оценки величины адгезии специфического объекта РОЛ ввести вероятностный критерий - 26 объектов, это повысит чувствительность известного способа до 50% (стимулированные пробы N 1-4, 10 и 12) при наличии одного положительного результата в контрольных пробах (проба N 1). Однако и в сравнении с таким вариантом оценки чувствительность предлагаемого способа оказывается в два раза выше.

Еще более существенной оказывается разница в чувствительности известного и предлагаемого способа при инфекциях. При туберкулезной инфекции расчет ИСА при исследовании с комплексным туберкулезным диагностикумом выявил положительную реакцию специфической адгезии нейтрофилов из 37 обследованных у 32-х (86,5%), а по абсолютной величине адгезии специфического объекта превышение верхней границы этого показателя в контрольной группе установлено только у одного больного (2,7%). Это означает, что предлагаемый способ чувствительнее известного в 32 раза. Столь же впечатляющая разница в оценке чувствительности обоих способов при клещевом энцефалите. При использовании альтернативного критерия диагностики расчет ИСА выявил положительную реакцию у всех 14 больных, а по абсолютной величине адгезии специфического объекта розеткообразующими нейтрофилами и лимфоцитами результаты оказались отрицательными.

Предлагаемый способ позволяет использовать единый унифицированный диагностический критерий в форме индекса реакции специфической адгезии. Этот критерий универсально применим для разных инфекций, меняющихся условий исследования, оценки адгезии нейтрофилов и лимфоцитов. Диагностическая величина этого критерия имеет альтернативный характер. В известном способе такой критерий отсутствует, нет даже приблизительного количественного показателя, который мог бы быть универсально применим разными исследователями даже при одной инфекции. Отсутствие альтернативного критерия приводит к тому, что при проведении диагностического исследования можно использовать только вероятную оценку реакции.

Предлагаемый способ менее трудоемок. Здесь нет необходимости в формировании контрольной группы, фракционировании лейкоцитов, стандартизации их содержания, отделении от плазмы и прочих операциях.

Практическая реализация предлагаемого способа может быть произведена немедленно на основе выпускаемых коммерческих диагностикумов для иммунодиагностики инфекций.