полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора и способ их получения

Формула изобретения

1. Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора, в котором указанный полипептид связан с указанным полиэтиленгликолем, и указанный полипептид выбран из группы, состоящей из фактора роста, полученного из головного мозга (ФРГМ) и нейротрофина-3 (НТ-3).

2. Производное по п.1, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль является монометоксиполиэтиленгликолем.

3. Производное по п.1, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль присоединен к полипептиду с помощью ацильной или алкильной связи.

4. Производное по п. 1, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль имеет мол.в. от около 2 КД до около 100 кД.

5. Производное по п. 4, отличающееся тем, что полиэтиленгликоль имеет мол.в. от около 5 кД до около 50 кД.

6. Способ присоединения молекулы полиэтиленгликоля к полипептиду, выбранному из группы, состоящей из ФРГМ и НТ-3, отличающийся тем, что полиэтиленгликоль имеет единственную реакционноспособную альдегидную группу и указанный способ состоит из взаимодействия полипептида с полиэтиленгликолем в условиях восстановительного алкилирования, при, по существу, кислом рН, которое позволяет -аминогруппе на аминоконце указанного полипептида, быть реакционноспособной, благодаря чему полиэтиленгликоль присоединяется к указанной -аминогруппе и извлечения полипептида, монопэгированного по N-концевой -аминогруппе, в по существу гомогенной форме.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что восстановительное алкилирование проводят с использованием натрий цианборгидрида в качестве восстановительного агента.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что а полиэтиленгликоль имеет молекулярный вес от около 2 кД около 100 кД.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что полипептид является ФРГМ.

10. Способ по п.6, отличающийся тем, что полипептид является НТ-3.

11. Способ по п.6, отличающийся тем, что рН находится в интервале от около 3 до около 9.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что рН находится в интервале от около 3 до около 6.

13. Гомогенный препарат ФРГМ, отличающийся тем, что он монопэгирован по N-концевой -аминогруппе.

14. Гомогенный препарат НТ-3, отличающийся тем, что он монопэгирован по N-концевой -аминогруппе.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новому классу производных ФРГМ и НТ-3, в которых молекула ФРГМ и НТ-3 присоединена к водорастворимому полимеру, а также к способу получения таких производных.

Предшествующий уровень техники

Терапевтически используемые белки в настоящее время доступны в соответствующих формах и в адекватных количествах в большой степени благодаря достижениям в технологии рекомбинантной ДНК. Химические производные таких белков могут эффективно блокировать протеолитические энзимы от физических контактов с основой самого белка, предотвращая таким образом его разрушение. Дополнительные преимущества могут включать, при определенных обстоятельствах повышение стабильности и времени циркуляции терапевтических белков, а также снижение иммуногенности.

Однако необходимо отметить, что эффект от модификации определенных белков не может быть предсказан. Модификация и расщепление белка описаны в обзорной статье Focus on Growth Factors 3: 4-10, опубликованной Mediscript, Mountview Court, Frien Bamet Lane, Лондон, Англия (1992).

Полиэтиленгликоль ("ПЭГ" или "пэг") является одним из химических соединений, которое может быть использовано при получении ("пэгировании") терапевтических белковых продуктов. Например, Адаген^@, представляющий собой пэгированную аденозиндеаминазу с успехом применяется для лечения болезней, однозначно связанных с иммунодефицитом; пэгированная супероксиддисмутаза была использована в клинических испытаниях при лечении травм головы; пэгированный 7а 0-интерферон был протестирован в первой фазе клинических испытаний для лечения гепатита; пэгированный гликоцеребразид и пэгированный гемоглобин также, как было сообщено, прошли предклинические испытания. Было показано, что для некоторые белков присоединение полиэтиленгликоля защищает от протеолиза Sada и др., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991). Способы присоединения остатков определенных полиэтиленгликолей доступны. См. US, патент N 4179337 (Davis и др.) и US, патент 4002531 (Royer).

Для модификации белков были использованы другие водорастворимые полимеры, такие, как сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливиниловый пирролидон, поли-1,3-диоксалан, поли-1,3,6-триоксан, сополимеры этилена/малеинового ангидрида и полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо нерегулярные полимеры).

Что касается полиэтиленгликоля, то для его присоединения к молекулам белка было использовано большое разнообразие способов. Обычно молекулы полиэтиленгликоля присоединяются к белку через белковую реакционноспособную группу. Аминогруппы, такие, как аминогруппы лизинового остатка или N- концевые аминогруппы, являются наиболее удобными для присоединения. Например, в патенте Royer , приведенном выше, раскрывается, что для присоединения молекул полиэтиленгликоля к энзиму используют восстановительное алкилирование. В описании к Европейскому патенту 0539167, опубликованному 28 апреля 1993 г. , раскрывается, что пептиды и органические соединения со свободной аминогруппой(ами) модифицируются с помощью имидных производных ПЭГ или родственных водорастворимых органических полимеров. US, патент N 4904584 (Shaw) раскрывает модификацию лизиновых остатков белков путем присоединения молекул полиэтиленгликоля через реакционноспособные аминогруппы.

Одним из специфических терапевтических белков, которые были химически модифицированы, является фактор, стимулирующий грануляцию колоний, т.е. ФСГК(G-CSF). См.публикацию европейского патента ЕР 0401384, ЕР 0473268 и ЕР 0335423. Другим примером является пэгированный IL-6, описанный в US патенте N 5264209 (Mikayama и др.). Также в опубликованном 11 сентября 1985 г описании к европейскому патенту 0154316, сообщается о взаимодействии лимфокина с альдегидом полиэтиленгликоля.

Пэгирование белковых молекул обычно приводит к образованию смеси химически модифицированных белковых молекул. Иллюстрацией может служить следующее, белковая молекула с пятью лизиновыми остатками и одной свободной N-концевой аминогруппой, вступающая в реакцию в соответствии с приведенными выше способами, образует гетерогенную смесь, в которой некоторые из белков имеют шесть полиэтиленгликолевых остатков, некоторые пять полиэтиленгликолевых остатков, некоторые четыре, некоторые три, некоторые два, некоторые один и некоторые ноль (0). Среди молекул с несколькими остатками аминокислот остатки полиэтиленгликоля могут не присоединяться по одним и тем же положениям разных молекул. Приведенные выше способы обычно требуют наличия связывающей группы между белком и молекулой полиэтиленгликоля. Процесс, описанный Delgado и др. в "Присоединение ПЭГ к белку с использованием активации трезил хлоридом применительно к распределению иммуноаффиности клеток", Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications in Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, Нью-Йорк, NY(1989), стр. 211-213, включает использование трезил хлорида, и осуществляется без связывающей группы между полиэтиленгликолем и остатком белка. Этот способ может вызывать затруднения в случае его использования для получения терапевтических продуктов, поскольку использование трезил хлорида может привести к образованию токсичных побочных продуктов.

Chamow и др., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) описали модификацию CD-4 иммуноадгезина с помощью монометоксиполиэтиленгликоль ("МеПЭГгликоль") альдегида путем восстановительного алкилирования. Авторы сообщили, что связывающая способность in vitro модифицированного CD4 IgG (к белку гр 120) снижается со скоростью, коррелируемой степенью МеПЭГирования.

Фактор роста, полученный их головного мозга, ФРГМ (Brain derived growth factor, ФРГМ) и нейротрофин-3 (NT-3, HT-3) являются известными полипептидами, принадлежащими к известному классу нейротрофических факторов, называемых нейротрофинами, которые включают фактор роста нерва, ФРН (NGF). Эти факторы промотируют сохранение и поддержание функций нейронов и являются наиболее приемлемыми для терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний. Barde и др. , Neuron 2: 1525-1534 (1989); Snider и др. Cell 77: 627-638 (1994). Способы идентификации и рекомбинатного получения этих факторов были описаны в патентной литературе; см. US, патент N 5169762 (Gray и др.) для ФРН, US, патент N 5180820 (Barde и др.) и 5229500 (Barde и др.) для ФРГМ, a WO 91/03569 для НТ-3.

Сущность изобретения

Вкратце одним из аспектов настоящего изобретения является получение ФРГМ и НТ-3 производных, в которых ФРГМ или НТ-3 полипептидные остатки присоединяются к водорастворимым полимерам.

В особенности настоящее изобретение включает производные ФРГМ и НТ-3, в соответствии с которым полипептиды взаимодействуют с реакционноспособными (т. е. "активированными") водорастворимыми полимерами таким образом, чтобы присоединить полимер к полипептиду. Такое присоединение может быть осуществлено с помощью реакций, обсужденных здесь, а именно, с помощью ацилирования или алкилирования. Ацилирование или алкилирование с использованием полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера может быть проведено при условиях, при которых в основном образуются моно- или полипроизводные. Полиприсоединение обычно включает присоединение полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера к -аминогруппе лизинового остатка полипептида и может дополнительно включать присоединение полимера к N-концевому остатку полипептида. Моноприсоединение предпочтительно включает присоединение полимера к -аминогруппе N-концевого остатка ФРГМ или НТ-3 полипептидного остатка, обеспечивая при этом селективное присоединение водорастворимого полимера именно к N-концу полипептида. Это приводит к получению, по существу, гомогенных полимер/ФРГМ или полимер/НТ-3 конъюгатных молекул, также, как (если используется полиэтиленгликоль) к получению пэгированных ФРГМ или НТ-3 молекул, имеющим непосредственно присоединенные остатки полиэтиленгликоля к ФРГМ или НТ-3.

Производные ФРГМ и НТ-3 в соответствии с настоящим изобретением являются наиболее полезными для тех же целей, для которых, как известно, полезны трофические факторы ФРГМ и НТ-3, в частности для промотирования сохранения и поддержания нейронов in vitro и in vivo, а также, в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения нейродегенеративных болезней человека, таких, как болезнь Паркинсона, амиотрофильный латеральный склероз (ALS), болезнь Хантингтона (Huntington), ретинальной дегенерации, периферического нервного заболевания, болезни Алзхеймера (Alzheimer), а также других. Как показано в некоторых из примеров, приведенных ниже, присоединение, проводимое в соответствии с настоящим изобретением, может также приводить к усилению способности молекул мигрировать через ткань мозга, что облегчает подачу их к терапевтическим целям, находящимся внутри мозга.

Другим аспектом изобретения, который также детально раскрыт ниже, является обеспечение способа получения производных ФРГМ и НТ-3 в соответствии со способами, приведенными выше, в которых водорастворимые полимеры, в особенности полиэтиленгликоль, присоединяются к N-концевой - аминогруппе полипептида (ФРГМ или НТ-3), для образования гомогенной популяции производных молекул, т.е. конъюгатов этих полипептидов с полимером.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 : приведен пример ацилирования ФРГМ или НТ-3 с использованием N-гидроксисукцинимидил (NHS) активных эфиров монометоксиполиэтиленгликоль альдегидов с образованием полипэгированного продукта. На этой фигуре k обозначает число МПЭГ молекул, реагирующих с молекулой ФРГМ или НТ-3, n обозначает степень полимеризации МПЭГ, использованных в реакции (где n = 2000 для МПЭГ, имеющего молекулярный вес 100 кД и n=40 для МПЭГ, имеющего молекулярный вес 2 kD), и m обозначает общее число первичных аминогрупп в ФРГМ или НТ-3 молекуле.

Фигура 2 : приведен пример неспецифического восстановительного алкилирования ФРГМ (или НТ-3) с использованием монометоксиполиэтиленгликоль активных альдегидов с получением полипэгированного продукта. На этой фигуре k, m, и n имеют указанные выше обозначения.

Фигура 3 : приведен пример направленного восстановительного алкилирования ФРГМ или НТ-3 по -аминогруппе на N-конце в полипептиде, с использованием монометоксиполиэтиленгликоль активного альдегида с образованием, по существу, монопэгированного продукта (на N-концевой группе).

Фигура 4: изображена иммуногистохимия ацетилхолинтрансферазы (АХТ) аксотомизированных лицевых мотонейронов на модели животного in vivo при потере функции периферального нерва. Yan и др. , J.Neurosci. 14(9) :5281-5291 (1994). Рассекают правые лицевые нервы взрослых женских особей крыс, после чего животным вводят подкожно каждый день в течение семи дней следующее: Фосфатно-буферный раствор PBS(A), непэгированный ФРГМ в дозе 5 миллиграмм на килограмм живого веса, мг/кг (В), пэгированный по N-концу ФРГМ в дозе 0,3 мг/кг (C), или регулярный пэгированный ФРГМ в дозе 0,3 мг/кг (D). В случае PBS-обработанных крыс аксотомия приводит к сильному снижению АХТ иммунореактивности поврежденного лицевого ядра. (часть A лицевое нервное ядро на правой стороне). В противоположность, обработка как непэгированным ФРГМ, так и пэгированным ФРГМ (части B.C.D) ослабляет вызванное повреждением снижение АХТ иммунореактивности. Введены следующие обозначения: FN, лицевое ядро, ру, пиримидальный след, Sp5 -центральное ядро тригеминальной мышцы. Масштабная отметка (часть D) соответствует 1 мм.

Фигура 5 : изображена кривая зависимости от дозы, полученная при обработке испытуемых животных с помощью непэгированного ФРГМ и пэгированного ФРГМ в тех же моделях аксотомизированных лицевых мотонейронов, которые изображены на фигуре 4. Животные получали ежедневную подкожную инъекцию (s.c.) только растворитель (), непэгированный ФРГМ (), N-концевой пэгированный ФРГМ () или нерегулярный пэгированный ФРГМ () в дозах, отражающих период в семь дней. Значения представлены как средние SEM (n=4). Полученные результаты анализируют с помощью ANOVA, с последующим t тестом Диннетта (Dunnett). ^*, p<0,05; ^**, p, 0,01, ФРГМ обработки в сравнении с растворителем.

Фигура 6: изображена диаграмма, отражающая проникновение непэгированного ФРГМ ("NAT-ФРГМ") или пэгированного ФРГМ ("ПЭГ-ФРГМ") в мозг живых крыс после одноразовой инъекции в центр правого неостриатума. Двадцать часов спустя животные были усыплены обработкой 4%-ным параформальдегидом. Мозги были удалены, рассечены и помечены специальным антителом для ФРГМ с использованием процесса, описанного Yan и др. в Soc. Neurosci. Abs. 20: 1306(1994). Общий объем проникновения ФРГМ в ткань мозга подсчитывали по интеграции всех ФРГМ иммунореактивных тканевых секций. Значения представлены как средние SEM (n=4). Результаты анализируют с помощью Student t теста. ^*, p<0,0001.SEM (n=4). Результаты анализируют с помощью Student t теста. ^*, p<0,0001. для частей A и C и 200 для частей B и D.

Детальное описание изобретения

Рассматриваются для использования в сфере применения настоящего изобретения ФРГМ и НТ-3 природной (т.е. существующей в природе) последовательности, также, как их фрагменты, предшественники и полипептидные молекулы, представляющие одну или более аминокислотных заместителей, исключений или добавок, полученных из природных последовательностей, которые проявляют биологические свойства аналогично молекулам с природной последовательностью, например, химеры, аналоги и тому подобное. Таким образом, если здесь не будет оговорено особо, под терминами"ФРГМ" и "НТ-3" подразумевают полипептиды любой из оговоренных выше форм.

Способы, которые известны для получения ФРГМ и НТ-3, относятся, в частности, к рекомбинатных способам, которые являются наиболее типичными для получения их в больших количествах. Наиболее применительные процессы, описанные в научной и патентной литературе, включают такие, которые упоминались ранее в патентах Соединенных Штатов 5180820 и 5229500, а также в опубликованном описании PCT WO 91/03569. Особенно предпочтительны для использования на практике в соответствии с настоящим изобретением ФРГМ и НТ-3 природной последовательности аналогично выделенным рекомбинатно в прокариотических и эукариотических клетках, включая рекомбинатные полипептидные продукты, по выделенным из нуклеотидных последовательностей человека ("r-ЧФРГМ " и "r-ЧНТ-3"), включая выделяемые в бактериальных клетках, содержащих N-концевые остатки метионина (например, "r-metФРГМ" и "r-metHT-3"). Примерами таких полипептидов являются такие, которые имеют последовательность, показанную в SEQ ID N: 1 ("r-Ч-ФРГМ"), SEQ ID N:2 ("r-metЧ-ФРГМ"), SEQ ID N: 3 ("r-Ч-НТ-3") и SEQ ID N: 4 ("r-met4-HT-3").

Пэгирование ФРГМ и НТ-3 может быть осуществлено с помощью любой реакции пэгирования, известной в этой области. См., например; Focus on Growth Factors 3(2): 4-10 (1992); ЕР 0154316; ЕР 0401384 и другие публикации, упомянутые здесь и относящиеся к пэгированию. Предпочтительно, пэгирование проводят путем реакции ацилирования или алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Эти предпочтительные способы для присоединения с помощью полиэтиленгликоля обсуждены ниже в деталях.

Ацилирование

Пэгирование путем ацилирования обычно включает взаимодействие активного эфирного производного полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ФРГМ и НТ-3 полипептидом. Фактически любая реакционноспособная молекула ПЭГ может быть использована для пэгирования этих полипептидов. Предпочтительным активным ПЭГ эфиром является ПЭГ, этерифицированный N- гидроксисукцинимидом ("NHS"). В понятие "ацилирование" здесь включают, но не ограничивают их, следующие типы связывающих групп между ФРГМ или НТ-3 и водорастворимыми полимерами, такими, как ПЭГ: амидные, карбоматные, уретановые и тому подобное; см. Bioconjugate Chem. 5: 133-140(1994). Условия реакции могут быть выбраны в соответствии с известными в этой области или усовершенствованы, однако необходимо избегать таких условий, как температура, растворитель и pH, которые будут инактивировать модифицируемые ФРГМ и НТ-3 образования. Условия реакции, которые обычно применяют, будут описаны ниже. Типичная реакция с NHS эфиром монометокси-ПЭГ зафиксирована на фигуре 6.

Пэгирование с помощью ацилирования обычно приводит к образованию пэгированного ФРГМ или НТ-3 продукта, в котором -аминогруппы лизина пэгируется через ацильную связывающую группу. Предпочтительной связывающей группой будет амидная группа. Также предпочтительно, что полученный продукт будет, по существу, (например, 95%) моно, ди- или трипэгированным. Однако некоторые продукты с высокой степенью пэгирования (вплоть до максимального числа - аминогрупп лизина ФРГМ и НТ-3 плюс одна - аминогруппа на N-конце ФРГМ и НТ-3) будут, как правило, образовываться в количестве, которое определяется специфическими условиями реакции, которые используют. В случае необходимости более очищенный пэгированный продукт может быть выделен из смеси, содержащей непрореагировавшие соединения с использованием стандартных методов очистки, включающих среди других диализ, высаливание, ультрафильтрацию, неионную хроматографию, гельфильтрацию, хроматографию и электрофорез.

Алкилирование

Пэгирование путем алкилирования обычно включает взаимодействие альдегидного производного ПЭГ с полипептидом, таким, как ФРГМ или НТ-3 в присутствии восстанавливающего агента. Пэгирование путем алкилирования может также приводить к полипэгированным ФРГМ и НТ-3. Типичный пример восстановительного алкилирования с образованием полипэгированного продукта приведен на фигуре 7. Кроме того, возможно в данном процессе создать такие условия, как перечисленные выше, которые приведут к преимущественному пэгированию только по - аминогруппе на N-конце ФРГМ или НТ-3 полипептида (например, монопэгированным продуктам). Типичный пример восстановительного алкилирования ФРГМ и НТ-3 с образованием монопэгированного продукта приведен на фигуре 8. В любом из случаев как монопэгирования, так и полипэгирования, ПЭГ группы предпочтительно присоединяются к полипептиду через группу -CH₂-NH-. Учитывая, что данная группа имеет остаток -CH₂-, этот тип связи в данном описании определен как связь "алкил".

Присоединение путем восстановительного алкилирования для получения монопэгированного продукта основано на различной реакционноспособности различных типов первичных аминогрупп (лизина и, в противоположность N- концевой группы), способных к замещению в ФРГМ или НТ-3. Реакция проводится при pH (см. ниже), которая позволяет использовать различные значения рКа - аминогрупп лизиновых остатков и соответственно N-концевой аминогруппы полипептида. Такой селективно протекающий процесс присоединения водорастворимого полимера, который содержит такую реакционноспособную группу, как альдегидная, к полипептиду возможно контролировать. Конъюгация с полимером предпочтительно протекает по N-концу полипептида и при этом практически не затрагивает никакие другие реакционноспособные группы, например такие, как боковые аминогруппы лизина. Одним из важных аспектов настоящего изобретения является обеспечение, по существу, гомогенного получения монополимер/ФРГМ или монополимер/НТ-3 конъюгатных молекул, обозначенных ФРГМ или НТ-3, к которым молекула полимера был присоединена, по существу, (т.е. 90%) строго локализовано. Более характерно, в случае использования полиэтиленгликоля настоящее изобретение также обеспечивает получение пэгированного ФРГМ или НТ-3 возможно при отсутствии антигенных связывающих групп, при этом молекула полиэтиленгликоля непосредственно присоединяется к ФРГМ или НТ-3 полипептиду.

Таким образом, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к пэгированным ФРГМ и НТ-3, в которых ПЭГ группа(ы) присоединена (присоединены) через ацильные или алкильные связывающие группы. Как уже было обсуждено выше, такие продукты могут быть как монопэгированными, так и полипэгированными (например, содержащими 2-6, предпочтительно 2-5, ПЭГ группы). ПЭГ группы обычно присоединяются к полипептиду по - и/или - аминогруппе цепи полипептида, но также предполагается, что ПЭГ группы могут быть присоединены к любой аминогруппе полипептидной структуры, которая достаточно реакционноспособна, чтобы к ней могла быть присоединена ПЭГ группа при соответствующих условиях реакции.

Молекулы полимера, которые используют как при присоединении алкилированием, так и ацилированием, могут быть выбраны среди водорастворимых полимеров или их смесей. Выбранный полимер должен быть растворим в воде, так чтобы полипептид, к которому он присоединяется, не выпадал в осадок в водной среде, а именно физиологической среде. Выбранный полимер должен быть модифицирован и иметь одну реакционноспособную группу, такую, как активную эфирную группу для процесса ацилирования или альдегидную группу для процесса алкилирования, предпочтительно, такие группы, при которых можно контролировать степень полимеризации, что обеспечивается настоящим способом. Предпочтительным реакционноспособным ПЭГ альдегидом является пропиональдегид, который является устойчивым в воде соединением, или его моно C₁-C₁₀ алкокси или арилоксипроизводные. (см. US, патент 5252714). Полимер может быть прямым или разветвленным. Предпочтительно для терапевтического использования полученного конечного продукта, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Водорастворимые полимеры могут быть выбраны из группы, состоящей, например, из полиэтиленгликоля (например, монометоксиполиэтиленгликоля), декстрана, поли-(N-винилпирролидона), гомополимеров пропиленгликоля, сополимеров оксида полипропилена/оксида этилена, полиоксиэтилированных полиолов (например, глицерина) и поливиниловых спиртов. Для реакций ацилирования выбранные полимеры должны иметь единственную реакционноспособную эфирную группу. Для используемого по изобретению восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь единственную альдегидную группу. Обычно водорастворимый полимер не выбирают из природных углеводных остатков, поскольку их обычно получают более удобным способом, а именно с помощью рекомбинатной системы экспрессии животных. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть как прямым, так и разветвленным.

Наиболее предпочтительным водорастворимым полимером в соответствии с настоящим изобретением является полиэтиленгликоль. Под определением полиэтиленгликоль в данном случае подразумевают любую форму ПЭГ, которую использовали для присоединения к другим белкам, а именно MOHO-(C₁-C₁₀) алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоля.

Обычно присоединение может быть осуществлено при любых подходящих условиях, используемых в случае реакции биологически активного соединения с активизированной водорастворимой молекулой полимера. Способы получения пэгированных ФРГМ или НТ-3 обычно включают следующие стадии: а) взаимодействие ФРГМ или НТ-3 полипептида с полиэтиленгликолем (реакционноспособное эфирное или альдегидное производное ПЭГ) в условиях, при которых ФРГМ или НТ-3 оказываются присоединенными к одной или нескольким ПЭГ группам, и b) получение целевого продукта. Обычно оптимальные условия проведения процесса ацилирования от случая к случаю определяют исходя из известных параметров, а также желаемого результата. Например, чем больше соотношение ПЭГ : белок, тем выше процент полипэгированного продукта.

В соответствии с настоящим изобретением способ восстановительного алкилирования, приводящий к, по существу, гомогенной популяции монополимер/полипептид конъюгатных молекул обычно включает стадии: а) взаимодействия ФРГМ или НТ-3 полипептида с реакционноспособной ПЭГ молекулой в условиях восстановительного алкилирования, при pH, подходящей для осуществления селективной модификации -аминогруппы на аминоконце полипептида и b) получение целевого продукта.

Для получения в основном гомогенной популяции монополимер/ФРГМ или монополимер/НТ-3 конъюгатных молекул восстановительное алкилирование проводят при таких условиях, которые позволяют провести селективное присоединение водорастворимого остатка полимера к N-концу полипептида. Такие условия проведения реакции обычно предусматривают различия в значениях рКа для -аминогрупп лизина и концевой -аминогруппой (рКа определяется значением pH, при котором 50% аминогрупп протонированы и 50% - нет). Кроме того, pH влияет на соотношение полимера к полипептиду, которое должно быть использовано. Обычно, если значение pH низкое, необходим больший избыток полимера по отношению к полипептиду (т.е., чем менее реакционноспособна N-концевая -аминогруппа, тем больше требуется полимера для достижения оптимальных условий). Если значение pH высокое, соотношение полимер:полипептид, которое требуется, не должно быть высоким (например, чем более реакционноспособные группы доступны, тем менее молекул полимера требуется). Для выполнения целей в соответствии с настоящим изобретением значение pH обычно находится в интервале от 3-9, предпочтительно, 3-6.

Другим важным условием является молекулярный вес полимера. Обычно, чем выше молекулярный вес полимера, тем меньшее число молекул полимера может быть присоединено к полипептиду. Одновременно должна приниматься во внимание при оптимизации условий процесса разветвленность полимера. Обычно, чем выше молекулярный вес (или чем больше разветвленность), тем выше соотношение полимер: полипептид. Обычно для реакции пэгирования, рассматриваемой здесь, предпочтительно использовать полимер со средним молекулярным весом, составляющим от около 2кД до около 100 1 кД (определение "около" обозначает 1 кД). Более предпочтителен средний молекулярный вес от около 5 кД до около 50 кД, и особенно, от около 12 кД до около 25 кД. Соотношение водорастворимого полимера и ФРГМ или НТ-3 будет обычно находиться в интервале от 1:1 до 100: 1, предпочтительно, (для полипэгирования) от 1:1 до 20:1 и (для монопэгирования) от 1:1 до 5:1.

Используя условия, оговоренные выше, восстановительное алкилирование в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает селективное присоединение полимера либо к ФРГМ, либо к НТ-3 полипептидной цепи белка, имеющей - аминогруппу на аминоконце, а также обеспечивает, по существу, гомогенное получение конъюгата монополимер/полипептидный белок. Термин "монополимер/полипептидный конъюгат" используют здесь для обозначения композиции, состоящей из одной молекулы полимера, присоединенной к ФРГМ или НТ-3 молекуле. Монополимер/полипептидный конъюгат будет иметь молекулу полимера, локализованную на N-конце, но не на лизиновых боковых группах. Получение будет проходить предпочтительно с выходом более чем 80% конъюгата монополимер/полипептид, предпочтительно, более чем 90% конъюгата монополимер/полипептид, и некоторым остатком непрореагировавших молекул (например, полипептидов, не присоединившихся к полимеру). Примеры, приведенные ниже, обеспечивают получение конъюгата монополимер/полипептид с выходом по крайней мере около 90%, при этом непрореагировавший полипептид составляет около 10%. Конъюгат монополимер/полипептид является биологически активным.

Для предложенного здесь восстановительного алкилирования, восстановитель должен быть устойчивый в водном растворе и, предпочтительно, должен обладать способностью восстанавливать только основания Шиффа, образующиеся на начальном этапе процесса восстановительного алкилирования. Предпочтительные восстановители могут быть выбраны из группы, состоящей из натрий боргидрида, натрий цианоборгидрида, диметиламинборана, триметиламинборана или пиридинборана. Особенно предпочтительным восстанавливающим агентом является натрий цианоборгидрид.

Другие параметры реакции, такие, как растворитель, реакционное время, температура, и т.д., также, как способы очистки продуктов, могут быть определены от случая к случаю, основываясь на опубликованной информации, касающейся процессов взаимодействия белков с водорастворимыми полимерами (см. приведенные здесь публикации). Типичные детали процесса отражены в примерах, приведенных ниже.

Возможно выбрать путь приготовления смеси полимер/полипептидного конъюгата ацилированием и/или алкилированием, при этом преимущество, которое обеспечивается настоящим изобретением, заключается в том, что возможно подобрать пропорцию монополимер/полипептидного конъюгата, которая будет содержаться в смеси. Так, при желании, возможно приготовить смесь различных полипептидов с различным числом присоединенных молекул полимера (например, ди-, три-/тетра-, и т.д.) и смешать с конъюгатным монополимер/полипептидным продуктом, полученным с использованием данных способов, и иметь, таким образом, смесь с предопределенной пропорцией мономер/полипептидного конъюгата.

Как было отмечено, полимер/полипептидные конъюгаты в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для тех же целей, для которых используются ФРГМ и НТ-3. Ранее было показано, что эти полипептиды могут быть эффективными, например, в качестве трофических факторов, которые промотируют сохранение и поддержание нейронов in vitro, делая пригодным изучение и использование нейронов в исследованиях. Такие клетки обычно бывает затруднительно сохранять живыми в культуре. Нейтроны же, с той же самой биологической активностью позволяют использовать эти факторы для нейрологических исследований in vivo на животных и являются потенциальными терапевтическими агентами для лечения нейродегенеративных заболеваний, которые связаны с потерей нейронной функции.

Для терапевтических целей из полимер/полипептидных конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены лекарственные средства и введены с любым биосовместимым фармацевтическим носителем, включая, но не ограничивая и такие, как физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу и воду. Количество ФРГМ/полимерного или НТ-3/полимерного конъюгата, которое будет эффективно при лечении определенного нарушения или состояния, будет зависеть от природы нарушения или состояния и может быть определено с помощью стандартной клинической техники. По возможности, желательно определить кривую зависимости от дозы фармацевтической композиции по изобретению вначале in vitro, например, как в ФРГМ и НТ-3 системах для количественного определения биологической активности, описанных в литературе, а затем на полезных моделях животных, прежде чем проводить тесты на человеке. Способы введения будут включать подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, легочный и оральный. Кроме того, может возникнуть потребность во введении фармацевтической композиции в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая интравентрикулярную или подоболочечную инъекцию. Далее, может возникнуть потребность во введении фармацевтической композиции локально на участок, который нуждается в обработке. Это возможно осуществить, например, с помощью локальной инфузии во время операции, инъекции, через катетер, или с использованием имплантата из пористого, непористого, желатинового, волокнистого или пленочного материала.

Экспериментальная часть

В последующем тексте описано получение некоторых ФРГМ и НТ-3 производных в соответствии с настоящим изобретением, а также их физические и биологические свойства. Эти примеры приведены для более полной характеристики изобретения, но не ограничивают его. В этих примерах используют человеческие ФРГМ и НТ-3, полученные рекомбинантно в E. coli (например, r-met ЧФРГМ и r-met ЧHT-3), если иное не оговорено специально.

Пример 1

Получение моноМПЭГ(6kД-ФРГМ конъюгата с присоединением по N-конпевой -аминогруппе (ам)

К охлажденному (4^oC) перемешиваемому раствору r-met-ЧФРГМ (2,5 мг/мл) в 100 мМ фосфате натрия, pH 4,0, содержащему 20 мМ NaCNBH₃, прибавляют 2-х кратный молярный избыток активированного метоксиполиэтиленгликоль (МПЭГ) альдегида, имеющего средний молекулярный вес 6000 дальтон (т.е. 6 кД).

Степень модификации белка в процессе реакции анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superose 6HR 10/30 (Pharmacia), при элюировании со скоростью потока 0,4 мл/мин с помощью 100 мМ натрий фосфата, pH 6,9, содержащего 0,5 NaCl. Через десять часов анализ с помощью эксклюзионной хроматографии показал, что все полипептиды (которые существуют в растворе в виде димеров) были в значительной степени превращены в две возможные формы N-концевых пэгированных производных: МПЭГ конъюгированных по одной или обеим N-концевым группам димера ФРГМ.

Реакционную смесь разбавляют в общей сложности в пять раз стерилизованной водой и помещают на ионообменную колонку HiLoad 16/10 S Sephorose HP (Pharmacia), заполненную 20 мМ буферным раствором фосфата натрия, pH 7,5. Реакционную смесь загружают в колонку со скоростью потока 1 мл/мин, при этом непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют с помощью трех колоночных объемов того же буфера. Линейный пятисотминутный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,5, содержащий 0,75 М NaCl, используют для элюирования двух форм N-концевых пэгированных ФРГМ димера. Фракции, содержащие МПЭГ-ФРГМ производные, собирают, концентрируют и фильтруют в стерильных условиях.

Пример 2

Получение моноМПЭГ(20 kД)-ФРГМ конъюгата с боковым присоединением по N-концпевой -аминогруппе(ам)

Повторяют процесс по примеру 1 за исключением того, что используют метоксиполиэтиленгликоль(МПЭГ) альдегид с молекулярным весом 20.000 дальтон (20 kД) и pH 5,0.

Пример 3

Получение полиМПЭПГ(6kД)-ФРГМ конъюгатов путем восстановительного алкилирования с помощью МПЭГ альдегидов

К охлажденному (4^oC) перемешиваемому раствору r-met ЧФРГМ (10 мг/мл) в 100 мМ BICINE, pH 8, содержащем 20 мМ NaCNBH₃, прибавляют 4-х кратный молярный избыток метоксиполиэтиленгликоль (МПЭГ)активированного альдегида, имеющего средний молекулярный вес 6 кД.

Степень модификации белка в процессе реакции анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superose 6HR 10/30 (Pharmacia), при элюировании при 0,4 мл/мин, с помощью 100 мМ фосфата натрия, pH 6,9, содержащего 0,5 М NaCl Через десять часов анализ с помощью эксклюзивной хроматографии показал, что все полипептиды были модифицированы с помощью МПЭГ.

Реакционную смесь затем разбавляют пятикратным количеством стерилизованной воды, pH доводят до 7 (используя фосфорную кислоту), и смесь помещают на ионообменную колонку HiLoad 16/10 S Sepharose HP (Pharmacia), заполненную 20 мМ натрий фосфатным буфером, pH 7,5. Реакционную смесь загружают на колонку при скорости потока 1 мл/мин и непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют с помощью 3-х колоночных объемов того же буфера. Линейный пятисотминутный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,5, содержащий 0,75 NaCl, используют для элюирования МПЭГ-ФРГМ конъюгатов. Фракции, содержащие МПЭГ-ФРГМ конъюгаты, собирают, концентрируют и фильтруют в стерильных условиях.

Пример 4

Получение полиМПЭГ(6kД)-ФРГМ коньюгатов путем восстановительного ацилирования с помощью МПЭГ альдегидов

Повторяют процесс по примеру 3, за исключением того, что используют шестикратный молярный избыток МПЭГ альдегида.

Пример 5

Получение полиМПЭГ(6 kД)-ФРГМ конъюгатов путем ацилирования с помощью активированных МПЭГ производных

К охлажденному (4^oC) перемешиваемому раствору r-metЧФРГМ (6 мг/мл) в 0,1 М BICINE буфере, pH 8, прибавляют четырехкратный молярный избыток сукцинимидилового эфира карбоксиметил МПЭГ со средним молекулярным весом 6 кДа. Полимер растворяют при легком перемешивании и реакцию выдерживают при той же температуре.

Степень модификации белка в процессе реакции анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superose 6HR 10/30 (Phaimatia), при элюировании при 0,4 мл/мин, с помощью 100 мМ фосфата натрия, pH 6,9, содержащего 0,5 М NaCl Через три часа эксклюзионная хроматография показывает, что все ФРГМ димеры были модифицированы с помощью МПЭГ.

Реакционную смесь разбавляют четырехкратным количеством стерилизованной воды и pH смеси доводят до 7 (используя 0,5 М фосфорной кислоты). Этот раствор подают на HiLoad 16/10 S Sepharose HP ионообъемную колонку (Pharmacia), заполненную 20 мМ натрий фосфатным буфером, pH 7,5. Непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют с помощью трех колоночных объемов того же самого буфера. Линейный пятьсот-минутный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,5, содержащий 0,75 М NaCI, был использован для элюирования МПЭГ-ФРГМ конъюгатов. Фракции, содержащие МПЭГ-ФРГМ конъюгаты, собирают, концентрируют и фильтруют в стерильных условиях.

Пример 6

Получение полиМПЭПГ(6 кД)-ФРГМ конъюгатов ацилированием с помощью активированных МПЭГпроизводных

Повторяют процесс по примеру 5, за исключением того, что используют эквивалентное, моль на моль, соотношение реагентов.

Пример 7

Получение полиМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгатов ацилированием МПЭГ с помощью активированных производных

Повторяют процесс по примеру 5, за исключением того, что используют МПЭГ сукцинимидилпропионат со средним молекулярным весом 20 кД и шестикратный молярный избыток МПЭГ по отношению к чФРГМ димеру.

Пример 8

Получение моноМПЭГ(20 кД)-НТ-З конъюгата с присоединением по N-концевой -аминогруппе

К охлажденному (4^oC) перемешиваемому раствору r-metЧHT-3 (4,77 мг/мл) в 20 мМ ацетате натрия, pH 4,0, содержащему 150 мМ NaCl и 20 мМ NaCNBH₃, добавляют трехкратный молярный избыток активированного МПЭГ со средним молекулярным весом 20 кД.

Степень модификации белка во время процесса анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием Superose 6HR 10/30 колонки (Pharmacia), при элюировании при скорости потока 0,4 мл/мин с помощью 10 мМ натрий фосфата, pH 7,1, содержащего 150 мМ NaCl. Через десять часов эксклюзионная хроматография показала, что весь белок (находящийся в растворе в виде димера) был превращен в две возможные формы N-концевых пэгированных производных: МПЭГ конъюгированных по одной или по обоим N-концевым группам НТ-3 димера.

Реакционную смесь разбавляют в общей сложности в пять раз 20мМ фосфатом натрия, pH 7, и подают на ионообменную колонку HiLoad 16/10S Sepharose HP (Pharmacia), заполненную 20 мМ натрий фосфатным буфером, pH 7,1. Реакционную смесь загружают в колонку при скорости потока 1 мл/мин и непрореагировавший МПЭГ альдегид элюируют тремя объемами колонки того же буфера. Линейный градиент от 0% до 100% 20 мМ натрий фосфата, pH 7,1, содержащего 0,4 М NaCl, используют для элюирования двух форм пэгированного по N-концу НТ-3 димера. Фракции, содержащие МПЭГ-НТ-3 производные, собирают, концентрируют и стерильно фильтруют.

Дополнительное количество МПЭГ-ФРГМ или МПЭГ-НТ-3 конъюгатов может быть получено модификацией ФРГМ или НТ-3 с помощью МПЭГ альдегидов различного среднего молекулярного веса, например, находящегося в интервале от 5 кД до 50 кД, с использованием тех же методов. Гомогенность полученных пэгированных ФРГМ или НТ-3 конъюгатов определяют с помощью Натрий Додецил Сульфат Полиакриламидного Гелевого Электрофореза (SDS-PAGE), с использованием 10-20% или 4-20% заранее приготовленного градиентного геля (Интеграционные Разделительные Системы). Для определения эффективного размера (гидродинамический радиус) каждого из МПЭГ-ФРГМ или МПЭГ-НТ-3 продукта используют гельфильтрационную колонку Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia). Белки определяют с помощью УФ-поглощения при 280 нм. BIO-RAD гельфильтрационные стандарты служат как сферические белковые маркеры молекулярного веса. Молекулярные веса конъюгатов определяют путем равновесной седиментации в аналитической ультрацентрифуге и с помощью масс-спекторометрического анализа с матричной лазерной десорбцией. Структура каждого из N-концевого МПЭГ-ФРГМ или МПЭГ-НТ-3 конъюгата определяется с использованием стандартных методов определения последовательностей N-концевых белков и пептидов.

Биологическую активность in vitro МПЭГ-ФРГМ конъюгатов, полученных в примерах 1-7, определяют с помощью их воздействия на 3-(4,5-диметилтиазол-2- ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)2Н-тетразолиевую внутреннюю соль, поглощенную PC12/pcDneo-trkB#18 клетками. Эти результаты, также, как основные параметры реакции, использованные при получении конъюгатов, суммированы в Таблице 1.

Пример 9

Оценка биологической активности in vivo МоноПЭГ(20кД)-ФРГМ конъюгата на мотонейронах взрослых крыс

Ранее было показано, что ФРГМ предохраняет развитие мотонейронов от природносуществующей и вызываемой аксотомией гибели клетки; Yan и др. Nature 360: 753-755 (1992); Oppenheim и др. , Nature 360: 755-757 (1992); и Sendtner и др. , Nature 360: 757-759 (1992). Также было продемонстрировано, что аксотомированные взрослые мотонейроны отзываются на экзогенный ФРГМ, и в особенности то, что ФРГМ, применяемый в различных вариантах введения, смягчает аксотомно вызываемое снижение иммунореактивности ацетилхолинтрансферазы (АХТ) в лицевых мотонейронах взрослых крыс; Yan и др. J.Neurosci. 14(9): 5281-5291(1994). Снижение активности АХТ отражает потерю функции мотонейронов, поскольку АХТ является жизненно необходимым нейромедиатором, продуцируемым мотонейронам. Таким образом, эти исследования отражают, что ФРГМ является важным потенциальным терапевтическим агентом при заболеваниях взрослых мотонейронов. В настоящем исследовании определена биологическая активность N-концевого пэгированного и нерегулярного пэгированного продукта ФРГМ (см. примеры 1 и 3) in vivo в отношении поврежденных взрослых мотонейронов.

Методы

A. Хирургическая операция и обработка животных. Взрослые особи женского пола крыс Sprague-Dawley (всего 52 крысы по n=4 в каждой группе) были анестезированы с помощью смеси (43 мг/мл кетамина гидрохлорида, 8,6 мг/мл ксилазина и 1,43 мг/мл асепромазина) при дозе 0,7 мл/кг живого веса. Правый лицевой нерв рассекали около шилососцевидного отверстия. Животных подвергали подкожному введению один раз в день в течение семи дней, начиная со дня операции (0 день). Вводили следующие дозы: 0,1, 0,3, 1,0 и 5,0 мг на кг живого веса непэгированного ФРГМ, N-концевого моноМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата или нерегулярного полиПЭГ-ФРГМ конъюгата, каждый в PBS. Одну группу крыс обрабатывали только с помощью PBS в качестве контроля. Вес тела животных определяли ежедневно.

B. АХТ имунногистохимия. Крысы были усыплены с помощью сверхдозы анестизии и перфузированы транскардиально с помощью PBS, а затем с помощью 4%-ного параформальдегида в ОД М буфере фосфата натрия, pH 7,2. Удаляли стволы мозга, криопротектировали с помощью 30% сахарозы в PBS и замораживали, и с помощью скользящего блока микротома делали 80 мкм последовательные коронарные срезы из лицевой ядерной области. Затем срезы обрабатывали для иммуногистохимии моноклональными мышиными антителами против АХТ (асциды 1:500, Chemison, Temecula.CA) с последующим добавлением по 2 мг/мл вторичного биотинилированного лошадиного противомышиного антитела с использованием ABC метода (Vector Laboratories, Buriingame, CA), описанного Yan и Johnson в J. Neurosci.8(9): 3481-3498(1988).

C. Количественная оценка иммуногистохимических срезов. Анализатор изображения Quantimet 520 (Leica.Inc., Deerfield, IL), соединенный с микроскопом Nicon-FXA, используют для количественной оценки относительной интенсивности окрашивания АХТ. Для того, чтобы получить высоко контрастное изображение ядерной лицевой области в гистологических срезах, используют 510 нм узко-полосный фильтр (Oriel Corp., Stratford, CT), с Nicon-Plan Apochromatic 2-х кратным объективом. Относительную интенсивность АХТ иммунореактивности определяют по полученной средней интенсивности серой шкалы для каждого рассмотренного ядра за вычетом окраски фона смежного АХТ негативного серого вещества. Для количественной обработки в отношении каждого животного используют три или четыре среза, содержащих лицевые ядра. Поскольку обработка ФРГМ не влияет на АХТ иммуноокрашивание неповрежденных лицевых ядер, данные были представлены в виде отношения относительной оптической плотности поврежденных ядер к плотности неповрежденных лицевых ядер в одних и тех же срезах. Данные были статически обработаны с помощью ANOVA, с последующим Dunnett t тестом.

D. Результаты. Аксотомия взрослых крыс приводит к быстрому и воспроизводимому снижению АХТ иммунореактивности в мотонейронах; Lams и др., Brain Res. 475:401-406(1988) и Armstrong и др. J.Comp.Neurol. 304: 596-607 (1991). Для оценки эффективности непэгированного ФРГМ и пэгированного ФРГМ на взрослые мотонейроны был использован метод рассечения лицевого нерва, описанный выше, который позволяет изучить влияние этих полипептидов на экспрессию АХТ в мотонейронах.

Семь дней спустя, после того, как был рассечен правый лицевой нерв, практически исчезает АХТ иммунореактивность в поврежденных лицевых ядрах, подвергшихся PBS обработке (фигура 4, часть A, лицевое ядро на правой стороне). Подкожная обработка с помощью природного ФРГМ (5 мг/кг, фигура 4, часть B), N-концевого моноМПЭГ-ФРГМ конъюгата (0,3 мг/кг, фигура 4, часть C), и нерегулярного полиМПЭГ-ФРГМ конъюгата (0,3 мг/кт. фигура 4, часть D) значительно смягчает вызванное повреждением снижение иммунореактивности АХТ. Для того, чтобы количественно оценить это явление, были измерены средние оптические плотности как поврежденных, так и неповрежденных лицевых ядер в АХТ имммуноокрашенных срезах. Все природные N-концевые моноМПЭГ-ФРГМ конъюгаты и нерегулярные полиМПЭГ-ФРГМ конъюгаты снижали уменьшение вызванной повреждением иммунореактивности АХТ в варианте, в зависимой от дозы модели. (Фигура 5). Природный ФРГМ при дозе 5 мг/кг показал значительное ослабление вызванной повреждением иммунореактивности АХТ по сравнению с контрольным растворителем (p<0,01). Обработка либо N-концевым моноМПЭГ- ФРГМ конъюгатом, либо нерегулярным полиМПЭГ-ФРГМ конъюгатом приводит к значительному улучшению по сравнению с контрольным раствором в каждой тестовой дозе и над природным ФРГМ при более низких близких пробах (p<0,01). Как установлено, обработка пэгированным ФРГМ сдвигает кривую зависимости от дозы влево на примерно двадцать единиц над природным ФРГМ (фигура 5), отражая усиление действенности пэгированного ФРГМ на поврежденные мотонейроны.

Пример 10

Количественная оценка биологической активности in vitro N-концевого МоноМПЭГ-НТ-3 конъюгата в эмбрионной СКГ цыплят

Были измерены сравнительные биологические активности непэгированных НТ-3 и N-концевых моноМПЭГ (20 кД)-НТ-3 конъюгатов при использовании спинных корневых ганглий (СКГ) из эмбрионов цыплят, описанных Lindsay и др., Dev. Biol. 112: 319-328 (1985). Вкратце, пять эмбрионных (Е8) спинных корневых ганглий цыплят, помещенные в ячейку, культивируют как экплантаты в коллагеновом матриксе с 2 мл среды F14, содержащей 5% нормальной сыворотки крови лошади. Эффективность нейротрофического фактора (как непэгированного, так и пэгированного) был определен визуально с помощью фазового микроскопа и оценен по 0-5-ти бальной шкале (0 - нет роста нейритов, 5 - максимальный рост нейритов).

Результаты, сведенные в таблицу 2, представленную ниже, показывают, что пэгированный НТ-3 не испытывает потерю активности по сравнению с непэгированным НТ-3, при этом удивительный результат был получен при проведении эксперимента in vitro с другими пэгированными белками, который выявил значительное снижение биоактивности.

Пример 11

Дальнейшая оценка биологической активности in vivo N-концевого МоноПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата во взрослых крысах

Прохождение через ткань мозга

1. Стриарная одноразовая инъекция

Один микролитр непэгированного ФРГМ или N-концевого моноПЭГ (20 кД)- ФРГМ конъюгата (1 мг/мл в растворе фосфатного буфера) вводят с помощью инъекции in vivo в центр правого неостриатума мозга взрослых женских особей крыс (n= 4) в течение 18-20 часов. Двадцатью часами позже животных усыпляли с помощью сверхдозы анестизии и перфузировали транскардиально с помощью PBS, с последующей обработкой 4%-ным параформальдегида в 0,1 М буфере фосфата натрия, pH 7,2. Головной мозг удаляют, криопротектируют с помощью 30%-ной сахарозы в PBS, замораживают, и с помощью скользящего блока микротома, делают 60 мкм последовательных коронарных срезов. Срезы обрабатывают для иммуногистохимии с помощью 1 мкм/мл анти-ФРГМ антитела кролика с последующим добавлением по 2 мкм/мл вторичного биотинилированного анти-ФРГМ антитела козы с использованием ABC метода, описанного выше. Очень сильное окрашивание было отмечено на стороне стриатума, в которую вводили инъекцию как непэгированного, так и пэгированного ФРГМ образцов. Пэгированный ФРГМ, как было определено, диффундировал в большую по площади область ткани, чем непэгированный ФРГМ, в около в 2,4 раз большую, как видно на Фигуре б. Только несколько нейронов в субстанции nigra, которые были позитивно мечены (не показано).

2. Стриарная семидневная инфузия

Взрослые женские особи крыс (n=4) ежедневно получали инфузию 12 mг либо непэгированного ФРГМ, либо N-концевого моноМПЭГ(20 кД)-ФРГМ конъюгата в неостриатум в течение периода в семь дней. Проникновение обеих форм ФРГМ была даже лучше во время этого исследования, чем во время введения одноразовой инъекции, запись о которой приведена выше. Пэгированный ФРГМ диффузировал в значительной большую область, чем природный ФРГМ, примерно в 6,1 кратное количество, как это видно на фигуре 7. Значительно большее количество нейронов в субстанции nigra compacta (SNC) и в брюшной наружной области (БНО) были положительно мечены после инфузии с помощью пэгированного ФРГМ (Фигура 8, части С и D), затем с помощью непэгированного ФРГМ (Фигура 8, части А и В ). Под более высоким воздействием ФРГМ-иммунореактивность была замечена и внутри перикарии, которая отражает, что ФРГМ была обратно транспортирована из нервного окончания в тело клетки. Позитивное окрашивание, отмеченное в средней вентральной части субстанции nigra reticulata ("SNR") находилось в нейрофиле и не было связано ни с каким телом клетки. Окрашивание происходило благодаря неспецифической диффузии вместо рецептр-медиаторному обратному транспортированию; J. Comp. Neurol & 313: 680-692 (1991).

Эти результаты имеют большое значение.

Как правило, как было установлено, после паренхимального введения в мозг животных ФРГМ диффундирует через мозговую ткань в незначительной степени. Настоящие исследования показали значительное улучшение возможности распространения таких диффузии в случае, когда применяют пэгированный ФРГМ, который обладает потенциально большей терапевтической эффективностью по крайней мере в случае указанных форм введения.