способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови
Классы МПК: | G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого |
Автор(ы): | Хлюстов В.Н. |
Патентообладатель(и): | Учебно-научный центр Медицинского центра при Правительстве Российской Федерации |
Приоритеты: |
подача заявки:
1997-04-15 публикация патента:
10.09.1999 |
Использование: в медицине, в частности в терапии. Проводят твердофазный иммуноферментный анализ, в котором выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой. Способ является высокоспецифичным, чувствительным и количественным.
Формула изобретения
Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови путем проведения твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии. Сущность способа в том, что в сыворотке крови определяют количество аутоантител к ЛПНП, причем в качестве связующего агента используют ЛПНП, которые выделяют от большого числа доноров в связи с наличием аллотипических различий в структуре липопротеидов и очищают от загрязняющих их циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой. Изобретение может быть также использовано для диагностики атеросклероза. Известен способ определения антилипопротеиновой активности в сыворотке крови у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями твердофазовым иммуноферментным методом [1], выбранный в качестве прототипа. Недостаток прототипа - низкая информативность, малая дифференциация и не обработанный в реализации количественный учет уровня аутоантител. В изобретении решена медико-техническая задача повышения информативности и достоверности диагностики путем количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности (ДПНП) с учетом всего их многообразия. Поставленная задача решается тем, что выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой. Способ осуществляется следующим образом. 1 этап. Выполняют иммобилизацию связывающего агента - (ЛПНП) на твердой фазе физической сорбции. 2 этап. Осуществляют комплементарное присоединение лиганда - (аутоантител к ЛПНП) из калибровочного материала или исследуемой жидкости. 3 этап. Достигают проявление образовавшегося иммунного комплекса (ЛПНП + аутоантитело) с помощью конъюгата козьих поликлональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой. 4 этап. Учитывают реакцию по экстинции раствора хромагента, изменяющего свою окраску в зависимости от количества кислорода, выделенного из перекиси водорода при разложении ее пероксидазой. Конструируют диагностикум в следующем порядке. 1. Получают связывающий агент - ЛПНП. Со станции переливания крови получают смесь плазм от как можно большего числа доноров - 40 - 105 человек. Менее 40, снижается достоверность; более 105, данные всегда стабильны. Липопротеиды выделяют путем последовательного ультрацентрифугирования в титановом роторе T - 45, например в ультрацентрифуге Вес ап "рпо" 12 - 65В. ЛПНП флотируют в плотности бромистого натрия 1,05 г/мл. Полученный препарат ЛПНП подвергают гель-хроматографии на колонке с сефарозой 6В Cl. Фракции второго пика объединяют и концентрируют, например, на ячейке "А соп" на фильтре ХМ 300 до минимального объема, затем разбавляют веронал - мединаловым буферным раствором до концентрации 2 мг/мл и проводят препаративный электрофорез в блоке 1% агарозы при силе тока 150 мА. Полоску агарозы с ЛПНП вырезают и подвергают электроэлюированию в стандарном для данной процедуре приборе. Препарат ЛПНП вновь концентрируют в ячейке для ультрафильтрации. Очищенный таким образом препарат ЛПНП не содержит ЦИК и сохраняет свои нативные свойства. Проверку на чистоту осуществляют диск-электрофорезом в ПААГ и иммуноэлектрофорезом с антисыворотками, преципитирующими все человеческие белки и иммуноглобулины. Предложенный препарат дает только одну полосу в диск-электрофорезе при окраске на липопротеиды и белки и одну линию преципитации при иммунофорезе против антисыворотки, преципитирующей все человеческие белки в зоне ЛПНП. 2. Выделяют аутоантитела к ЛПНП. На основе полученного иммунохимически чистого препарата ЛПНП и СпВ - сефарозы 4В синтезируют иммуносорбент. Смесь человеческих сывороток от 6300 доноров пропускают через колонку с иммуносорбентом, из расчета 100,0 мл на 1 г носителя. Колонку тщательно отмывают от несвязавшихся сывороточных белков и элюируют аффинные аутоантитела к ЛПНП. В препарате аутоантител определяют количество и состав иммуноглобулинов, а также количество белка легких цепей иммуноглобулинов, одинаковых для всех классов. 3. Готовят конъюгат к легким цепям иммуноглобулинов. Из иммуноглобулинов человека выделяют легкие цепи и проводят иммунизацию лабораторных животных. Антитела к легким цепям конъюгируют с пероксидазой корня хрена периодатным окислением. 4. Перед употреблением готовят субстратную смесь из 0,05% раствора ортофенилендиамина и 0,02% раствора перекиси водорода в 0,05 М имидазол-цитратном буферном растворе pH 5,5. 5. Твердая фаза. В качестве твердой фазы выбирают полистероловые плоскодонные планшеты, например, 8 х 12 лунок отечественные "Медполимер" или зарубежных фирм: "Нунк", "Линбро", "Титертек" и др. Для конструирования тест-системы подбирают следующие параметры:1. Концентрацию связывающего агента 10
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137023/183.gif)
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137023/183.gif)
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137014/177.gif)
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137023/183.gif)
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137014/177.gif)
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137014/177.gif)
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137014/177.gif)
![способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови, патент № 2137134](/images/patents/334/2137014/177.gif)
1. Szondy E., Mezey Z., Antilipoprotein activity in sera and circulation imminne compolexces. Abstz. Intern. Sump. Aterosclerotis, 1982. W. Berlin, P. 536 - 543.
Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого