производные тетрациклина

Формула изобретения

1. Производные тетрациклина общей формулы I

X-Y-Z,

где X представляет одновалентную группу общей формулы II



где R₁ представляет водород или гидроксил;

R₂ представляет водород или гидроксил;

R₃ представляет метил;

R₄ представляет водород;

Y представляет двухвалентную или трехвалентную группу общей формулы III, IV, V или VI



где Х" представляет собой простую связь, -O - или NН;





(2)-(CH₂NH)_mCH₂CH₂-W- (3)

где m равно 0 или 1;

W представляет -О-, -ОСН₂-, простую связь или -CC-; причем, когда m равно 0, W представляет -OCH₂-;

Z представляет одновалентную группу, образованную удалением атома водорода или гидроксильной группы в соединении общей формулы VII



где представляет НО- или O=;

представляет атом водорода или метил;

представляет атом водорода, фенил или замещенный фенил;

представляет метил или этил;

представляет гидроксил, кетогруппу или ацетил;

представляет водород, гидроксил, метил, этинил или пропинил или и совместно образуют группу =O;

представляет водород, гидроксил, или и вместе соединяются с атомом кислорода 2,2-диоксипропильной группы;

символ обозначает простую или двойную связь,

причем группы формул III - IV присоединяются во 2 положение, 3 положение, 6 положение, 7 положение или 17 положение, или по фенильной группе, присоединенной в II положении группы Z, причем (1) формулы II и (2) формул III - VI связаны непосpeдcтвeннo и (3) группы формул III-VI связаны непосредственно c любой группой формулы VII.

2. Соединение по п. 1, в котором одновалентная группа формулы II является одновалентной группой тетрациклинового соединения, где R₁ представляет водород, R₂ представляет гидроксил, R₃ представляет метил, а R₄ представляет водород.

3. Соединение по п. 1, в котором одновалентная группа формулы II является одновалентной группой террамицина, где R₁ представляет гидроксил, R₂ представляет гидроксил, R₃ представляет метил, R₄ представляет водород.

4. Соединение по п. 1, в котором одновалентная группа формулы II является одновалентной группой деокситетрациклина, где R₁ представляет гидроксил, R₂ представляет водород, R₃ представляет метил и R₄ представляет водород.

5. Соединение по любому из пп.1-4, в котором одновалентная группа формулы VI является одновалентной группой эстрона, где и совместно образуют группу =O и представляет водород.

6. Соединение по любому из пп.1-4, в котором одновалентная группа формулы VI является одновалентной группой эстрадиола, где представляет гидроксил, представляет водород и представляет водород.

7. Соединение по любому из пп. 1-4, в котором одновалентная группа формулы VI является одновалентной группой эстроалкинола, где представляет гидроксил, представляет этинил, представляет водород.

8. Соединение по любому из пп. 1-4, в котором одновалентная группа формулы VI является одновалентной группой эстриола, где представляет гидроксил, представляет водород и представляет гидроксил.

Приоритет по пунктам:

25.03.93 по пп. 1-8;

29.12.93 по пп. 1-8 уточнение признаков.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к соединениям, выполняющим новые функции ингибиторов костной резобции/промоторов остеогенеза.

Нормальная регенерация костей характеризуется равновесием между костной резорбцией и остеогенезом, и в случае преобладания костной резорбции происходит растворение и уменьшение костных компонентов, что ведет к костным заболеваниям, например, остеопорозу. Известно, что половые гормоны, например, экстроген, способны подавлять костную резорбцию, вследствие чего применяются в Европе и Америке для профилактики и лечения остеопороза. Тем не менее, до настоящего времени не подтверждено, что такие гормоны концентрируются в костях, и не следует недооценивать возможность онкогеннеза в результате введения одних только таких гормонов.

С другой стороны, антибиотики тетрациклинового типа обладают способностью концентрироваться в костях, но при этом не способны ни ингибировать костную резорбцию, ни способствовать образованию костного вещества. И только в описании патента США N 4925833 указано, что тетрациклин промотирует синтез костных белков в опытах на клеточном уровне. Хотя синтез костных белков и необходим для остеогенеза, одного только синтеза костных белков мало для остеогенеза.

И до настоящего времени не известны вещества, способные промотировать остеогенез, и которые могут быть использованы в качестве профилактических и лечебных средств при костных заболеваниях.

Соответственно, целью настоящего изобретения является создание средства для лечения костных заболеваний, ингибирующего костную резорбцию и способствующего остеогенезу, предпочтительно синергически, и способного концентрироваться в костях.

Создателями настоящего изобретения проведены разнообразные исследования, направленные на решение вышеуказанных проблем, и в ходе этих исследований было обнаружено, что соединения, полученные ковалентным связыванием антибиотиков тетрациклинового типа и гормонов стероидного типа, например, экстрогена, с применением связующего соединения, промотируют остеогенез, помимо способности ингибировать костную резорбцию, а способны накапливаться в костях, которые являются предметом настоящего изобретения.

Соответственно, в настоящем изобретении предлагаются промоторы остеогенеза/ингибиторы костной резорбции, имеющие общую формулу (I):

X-Y-Z

(где X представляет одновалентную группу следующей формулы (II):



(где R₁ представляет водород или гидроксил, R₂ представляет водород или гидроксил, R₃ представляет водород или метил и R₄ представляет водород, галоген или диметиламиногруппу);

Y представляет двухвалентную или трехвалентную группу следующих формул (III), (IV) или (V):





(где n = 0 - 4 и X представляет прямую связь -O- или -NH-);

Z представляет одновалентную группу, образованную удалением водорода или гидроксила из соединения следующей формулы (VI):



(где R"₁ представляет HO- или O=; R"₂ представляет атом водорода или метил; R"₃ представляет атом водорода, фенил или замещенный фенил; R"₄ представляет метил или этил; R"₅ представляет гидроксил, кетогруппу или ацетил; R"₆ представляет водород, гидроксил, метил, этинил или пропинил, или R"₅ и R"₆ совместно образуют группу =O; R"₇ представляет водород, гидроксил или =O, или R"₆ и R"₇ вместе присоединены к кислородам 2,2-диоксипропильной группы и символом обозначена простая или двойная связь), причем присоединение этой группы происходит в 2-положение, 3-положение, 4-положение, 6-положение, 7-положение или 17-положение, или по фенильной группе, присоединенной в 11-положении, связь (1) в формуле (II) и связь (2) в формулах (III) - (V) непосредственно соединены, связь (3) в формулах (III) - (V) и любая связь в вышеуказанных положениях формулы (VI) непосредственно соединены).

В вышеуказанной формуле (II) галоген представлен, например: хлором, фтором, бромом или йодом, предпочтительно хлором.

Краткие пояснения к диаграммам

На фиг. 1 приведена фотография, иллюстрирующая результаты эксперимента N 3.

На фиг. 2 приведена фотография, иллюстрирующая результаты эксперимента N 3.

На фиг. 3 приведена фотография, иллюстрирующая результаты эксперимента N 3.

На фиг. 1-3 приведены результаты одного и того же эксперимента, повторенного трижды.

Предпочтительными примерами одновалентной группы формулы (II), являющейся фрагментом соединения формулы (I) в качестве активного компонента фармацевтического препарата изобретения, включают:

Формулу (II-1):

Одновалентная группа тетрациклина, представленная формулой (II-I) (где (в формуле (II)) R₁ - водород, R₂ - гидроксил, R₃ - метил и R₄ - водород):



Формулу (II-2):

Одновалентная группа террамицина, представленная формулой (II-2) (где (в формуле (II)) R₁ - гидроксил, R₂ - гидроксил, R₃ - метил и R₄ - метил):



Формулу (II-3):

Одновалентная группа хлортетрациклина, представленная формулой (II-3) (где (в формуле (II)) R₁ - водород, R₂ - гидроксил, R₃ - метил и R₄ - хлор):



Формулу (II-4):

Одновалентная группа дезокситетрациклина, представленная формулой (II-4) (где (в формуле (II)) R₁ - гидроксил, R₂ - водород, R₃ - метил и R₄ - водород):



Формулу (II-5):

Одновалентная группа аминотетрациклина, представленная формулой (II-5) (где (в формуле (II)) R₁ - водород, R₂ - водород, R₃ - водород и R₄ - диметиламиногруппа):



Предпочтительные примеры одновалентных групп соединения формулы (VI), являющихся фрагментами соединений формулы (I) в качестве активных компонентов фармацевтических препаратов настоящего изобретения, включают следующее.

Формулу (VI-1):

Одновалентная группа эстрона представлена формулой (VI-1) (где (в формуле (VI)) R"₅ и R"₆ совместно образуют группу =O и R"₇ - водород):



Формулу (VI-2):

Одновалентная группа эстрадиола представлена формулой (VI-2) (где (в формуле (VI)) R"₅ - гидроксил, R"₆ - водород и R"₇ - водород):



Формулу (VI-3):

Одновалентная группа эстроалкинола представлена формулой (VI-3) (где (в формуле (VI)) R"₅ - гидроксил, R"₆ - этинил и R"₇ - водород):



Формулу (VI-4):

Одновалентная группа эстриола представлена формулой (VI-4) (где (в формуле (VI)) R"₅ - гидроксил, R"₆ - водород и R"₇ - гидроксил):



Соединительная группа в соединениях вышеприведенных формул (VI) - (VI-4) может находиться в 3-положении, 6-положении или 17-положении.

Соединения формулы (VI) могут быть также представлены одновалентными группами, полученными удалением водорода или гидроксильной группы в следующих соединениях:



















Соответственно активный компонент фармацевтического препарата настоящего изобретения может быть обозначен следующим шифром; например:

/II-1/-/III/-(3) /V-1/ (цифрой в скобках () указано положение связующей группы в группе формулы /VI-1/. Возможные варианты таких сочетаний представлены таблицей А (см.в конце описания).

Сами соединения, охарактеризованные выше, могут быть получены известными способами. К примеру, связующее соединение формул (III-V) вначале соединяют со стероидным соединением формулы (VI) и полученный продукт присоединения соединяют с соединением тетрациклинового ряда.

Присоединение связующего соединения формул (III) - (V) в 3-положении стероидного соединения формулы (VI) осуществляют, например, согласно следующей схеме реакции:



Кроме того, соединение, в котором R"₅ - гидроксил и R"₆ - водород или этинил, может быть получено, например, следующей реакцией:



Для присоединения связующего соединения формул (III) - (V) в 6-положении стероидного соединения формулы (VI) вначале в 6-положение стероидного соединения вводят группу =O, после чего проводят следующую реакцию:



Затем к продукту реакции связующего соединения со стероидным соединением может быть присоединено тетрациклиновое соединение путем связывания N-атома связующего соединения с N-атомом амидной группы тетрациклинового соединения с помощью формальдегида.

Фармацевтические препараты настоящего изобретения могут быть приготовлены в дозированной форме для перорального или парентерального введения, например: внутривенным вливанием, чрезкожной инъекцией, внутримышечной инъекцией, внутрибрюшинной инъекцией и т.д. Эффективная ежедневная доза для человека равна 0.2 - 200 мг при пероральном введении и 0.1 - 100 мг при парентеральном введении. Соединения настоящего изобретения характеризуются чрезвычайно низкой токсичностью, и значение ЛД₅₀ соединения I, полученного в примере 1, например, для мышей составляет 143 мг/кг.

Фармацевтические препараты настоящего изобретения могут быть получены в виде обычных форм, определяемых путем введения. В случае перорального введения фармацевтический препарат может иметь вид, например: капсулы, таблетки, гранулы, порошка, жидкого препарата и т.д. Такие формы получают обычным путем. Жидкие препараты могут быть получены, например, растворением или суспендированием активного компонента настоящего изобретения в приемлемой среде, например, водном буферном растворе и т.п. Порошковый препарат может быть приготовлен смешиванием активного компонента с порошкообразным наполнителем таким, как крахмал, например, кукурузный крахмал и/или сахарид, например, лактоза.

Таблетки могут быть получены смешиванием активного компонента с наполнителем, например, вышеуказанным наполнителем и связующим средством, например, крахмальной пастой и прессованием смеси в таблетирующей машине. Гранулы могут быть приготовлены смешиванием активного компонента с наполнителем, связующим средством и т.д., разбавлением смеси с жидкостью, например: водой и/или глицерином, просеиванием полученного продукта через сито с его гранулированием и высушиванием полученных гранул. Капсулы могут быть приготовлены капсулированием вышеописанных порошка или гранул в капсулы соответствующего размера.

Парентеральные дозированные формы могут быть получены растворением или суспендированием активного компонента в физиологическом солевом растворе или буферном солевом, таком, как, например, фосфатный буферный раствор. Парентеральные дозированные формы могут представлять высушенные вымораживанием продукты, которые перед употреблением необходимо растворить или суспендировать, и добавками для сушки вымораживанием могут служить сахарид, например, лактоза или обычные добавки для сушки вымораживанием.

Примеры

Далее приводятся конкретные примеры соединений настоящего изобретения. Однако, объем изобретения в целом не ограничен только этими примерами.

Пример синтеза 1

Синтез 1-1

3-хлорэтокси-17-оксиэстра-1,3,5(10)-триена (соединение 1-1)

К толуольному раствору, полученному смешиванием 27.1 г эстрона, 22.2 г 3-хлорэтокси-17-оксиэстра-1,3,5(10)-триена и небольшого количества триэтиланилинхлорида, добавляют раствор NaOH. После установления pH 10 реакцию продолжают 4 часа и растворитель испаряют. Перекристаллизацией твердого остатка из спирта получают соединение (1-1, R₇ = H), выход 79%

Т.пл. 86 - 88^oC.

Элементный анализ: C 72.4, H 4.3, Cl 10.71.

Синтез 1-2

N-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил]-пиперазина (соединение 1-2)

Смесь 7.8 г вышеописанного соединения (1-1), 46.6 г безводного пиперазина и 120 мл диметилформамида (ДМФА) нагревают 5 часов при 80 - 100^oC. После удаления ДМФА испарением и перекристаллизации полученного твердого остатка из спирта и ацетона получают белое кристаллическое соединение (VI), выход 85%.

Т.пл. 140 - 142^oC.

Элементный анализ: C 75.2, H 9.2, N 7.4.

Синтез 1-3

N-4-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил] -пиперазин-1- метилтетрациклина (соединение 1-3)

Смесь 3.8 г вышеописанного соединения (1-2), 0.03 г метаформальдегида и 15 мл изопропанола нагревают 2 часа при 40^oC. После добавления 3.5 г тетрациклина смесь перемешивают 5 часов. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и промывают изопропанолом и этиловом эфиром. В результате получают соединение (1-3) в виде твердого желтого вещества (R₁ = R₄ = H, R₂ = OH, R₃ = CH₃), выход 95%.

Т.пл. 160^oC (разл.).

Элементный анализ: C 67.21, H 7.12, N 6.67.

Пример синтеза 2

Синтез 2-1

N-[17 -Гидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил]пиперазин (соединение 2-1)

В метиловом спирте растворяют 3.8 г соединения (1-2) примера 1. После добавления 0.5 г боргидрата калия в щелочных условиях реакционную смесь нагревают с перемешиванием 3 часа. Реакционную смесь нейтрализуют кислотой и метиловый спирт испаряют. Перекристаллизацией полученного твердого остатка из спирта получают белые кристаллы (соединение 2-1, R₇ = H), выход 91%.

Т.пл. 141 - 142^oC.

Элементный анализ: C 75.21, H 9.23, N 7.14.

2-2

Синтез N-4-[17 -гидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-3- оксиэтил]пиперазин-1-метилентетрациклина (соединение 2-2)

Смесь 3.84 г вышеописанного соединения (2-1), 0.03 г метаформальдегида и 20 мл изопропанола нагревают 2 часа при 40^oC. После добавления 3.5 г тетрациклина реакционную смесь перемешивают 5 часов. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и промывают изопропанолом и этиловым эфиром. В результате получают бледно-желтое твердое вещество (соединение 2-2) (R₁ = R₄ = H, R₂ = OH, R₃ = CH₃), выход 95%.

Т.пл. 165^oC (разл.).

Элементный анализ: C 67.3, H 7.34, N 6.54.

Пример синтеза 3

Синтез N-4-[17 -гидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил]-1- пиперазин-1-метилен(окситетрациклина) (соединение 3-1)

Смесь 3.8 г соединения примера 2 (2-1), 0.03 г метаформальдегида и 20 мл изопропанола нагревают 2 часа при 40^oC. После добавления 3.5 г тетрамицина реакционную смесь перемешивают 5 часов. По окончании реакции и обработки по методике примера 1-3 получают бледно-желтое твердое вещество (соединение 3) (R₁ = R₂ = OH, R₃ = CH₃, R₄ = H), выход 93%.

Т.пл. 171^oC (разл.).

Элементный анализ: C 65.62, H 7.1, N 6.67.

Пример синтеза 4

4-1

Синтез бис-N,N-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил]амина (соединение 4-1)

К смеси 3.6 г мастагенхлорида, 12 г эстрона, 4 г триэтиланилина, воды и толуола добавляют при перемешивании раствор NaOH. После перемешивания смеси 5 часов растворитель испаряют. Перекристаллизацией твердого остатка из спирта получают целевое соединение, выход 72%.

Т.пл. 256 - 259^oC.

Элементный анализ: C 78.5, H 8.6, N 2.31.

4-2

Синтез бис-N, N-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3- оксиэтил]аминометилентетрациклина (соединение 4-2)

Смесь 6.1 г вышеописанного соединения (4-1), 0.03 г метаформальдегида и 20 мл изопропанола нагревают 2 часа при 40^oC. После добавления 3.5 г тетрациклина реакционную смесь перемешивают 8 часов. По окончании реакции получают бледно-желтое твердое вещество (соединение 4-2) (R₁ = R₄ = H, R₂ = OH, R₃ = CH₃), выход 68%.

Т.пл. 183^oC (разл.).

Элементный анализ: C 71.1, H 7.21, N 3.89.

Строение соединения представлено следующими молекулярными формулами:





Пример синтеза 5

5-1

Синтез бис-N, N-[17 -гидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил]амина (соединение 5-1)

К 6.1 г вышеописанного соединения (4-1) добавляют метиловый спирт и после прибавления в щелочных условиях 0.5 г боргидрата калия реакционную смесь перемешивают 5 часов. Затем реакционную смесь нейтрализуют кислотой и метиловый спирт испаряют. Твердый остаток очищают в растворе ацетона и в растворе спирта. Эстрон-17-кетогруппу в соединении (4-1) восстанавливают в -17 -гидроксигруппу. С выходом 82% получено белое вещество.

Т.пл. 193 - 197^oC.

Элементный анализ: C 78.41, H 8.51, N 2.33.

5-2.

Синтез бис-N, N-[17 -гидроксиэстра-1,3,5(10)триен-3- оксиэтил]аминометилентетрациклина (соединение 5-2)

Смесь 5.4 г соединения (5-1), описанного выше, 0.03 г метаформальдегида и 20 мл изопропанола перемешивают 2 часа при 40^oC. После добавления 3.5 г тетрациклина реакционную смесь перемешивают 8 часов. По окончании реакции получено бледно-желтое твердое вещество (соединение 5-2) (R₁ = R₄ = H, R₂ = OH, R₃ = CH₃), выделенное в тех же условиях, что и в примере 1-3, выход 94%

Т.пл. 171^oC (разл.).

Элементный анализ: C 71.02, H 7.02, N 3.98.

Строение соединения представлено следующей молекулярной формулой:



Пример синтеза 6

6-1.

Синтез бис-N, N-[17 -гидрокси-17 / -этинилэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил]амина (соединение 6-1)

В смеси 100 мл тетрагидрофурана и 1 г гидроксида калия растворяют 6.1 г соединения (4-1) примера 4 и через смесь при интенсивном перемешивании при 0^oC пропускают газообразный ацетилен до полного завершения реакции. Добавлением кислоты реакционную смесь нейтрализуют до pH 4 и растворитель испаряют. Продукт реакции промывают водой и сушат. Последующей перекристаллизацией из спирта и хлороформа получено белое твердое соединение (6-1), выход 78%.

Т.пл. 201 - 205^oC.

Элементный анализ: C 79.21, H 8.58, N 2.18.

Строение соединения соответствует следующей молекулярной формуле:



6-2.

Смесь 6.6 г вышеописанного соединения (6-1), и 0.03 г метаформальдегида и 20 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC. Затем добавляют 3.4 г тетрациклина и реакционную смесь перемешивают 8 часов. По окончании реакции обработкой по методике примера 1-3 с выходом 93% получают бледно-желтое твердое вещество (соединение 6-2), т.е. бис-N,N-[17 -гидрокси-17 -этинилэстра-1,3,5(10)триен-3-оксиэтил] аминометилентетрациклин (R₁ = R₄ = H, R₂ = OH, R₃ = CH₃).

Т.пл. 178^oC (разл.).

Элементный анализ: C 72.1, H 7.12, N 3.9.

Строение соединения соответствует следующей молекулярной формуле:



Пример синтеза 7

7-1.

Синтез N-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил] -N-метиламина (соединение 7-1)

К толуольному раствору 2.7 г эстрона, 1 г хлорэтилметиламина и небольшого количества триэтиланилина добавляют раствор гидроксида натрия. После установления pH 10 реакционную смесь выдерживают 4 часа. Затем растворитель испаряют и перекристаллизацией твердого остатка из спирта получают соединение (7-1, R₇ = H), выход 71%.

Т.пл. 262 - 266^oC.

Элементный анализ: C 75.24, H 9.41, N 4.28.

7-2.

Смесь 3.3 г вышеописанного соединения (7-1), 0.03 г метаформальдегида и 20 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC и затем добавляют 3.5 г тетрациклина. Реакционную смесь перемешивают 8 часов. По окончании реакции обработкой по методике примера 1-3 с выходом 90% получают бледно-желтое твердое вещество (соединение 7-2), т.е. N-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил] -N-метиламинометилентетрациклин (R₁ = R₄ = H, R₂ = OH, R₃ = CH₃).

Т.пл. 190^oC (разл.).

Элементный анализ: C 68.8, H 7.72, N 3.62.

Строение соединения соответствует следующей молекулярной формуле:



Пример синтеза 8

8-1.

Синтез N-[3,17 -дигидроксиэстра-1,3,5(10)триен-6- аминоэтил]пиперазина (соединение 8-1)

120 мл тетрагидрофурана растворяют 5.2 г соединения (8-0) и к раствору добавляют 3.2 г аминоэтилпиперазина. Реакционную смесь перемешивают 2 часа, ТГФ удаляют испарением и к остатку добавляют 100 метилового спирта и 2.8 г муравьиной кислоты. Перемешивание реакционной смеси продолжают еще 3 часа. Метиловый спирт удаляют испарением и перекристаллизацией из спирта получают соединение 8-1.

Т.пл. 172 - 177^oC.

8-2.

Синтез N-4-(3,17 -дигидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-6- аминоэтил)пиперазин-1-метилентетрациклина (соединение 8-2)

Смесь 4.1 г вышеописанного соединения (8-1), 0.03 г метаформальдегида и 20 мл изопропанола нагревают 2 часа при 50^oC. После добавления 3.5 г тетрациклина реакционную смесь перемешивают 5 часов. По окончании реакции продукт реакции фильтруют, промывают изопропанолом и этиловым эфиром и после сушки в вакууме с выходом 81.2% получают бледно-желтое твердое вещество (соединение 8-2) с температурой плавления 167^oC (разл.).

Соединение (8-0) получено следующим образом:

1. Получение 17 -эстроалкинола

В метиловом спирте растворяют 4 г эстрона и к раствору при 30^oC по каплям прибавляют смесь 0.8 г боргидрата калия, 1.76 г гидроксида натрия и 8.8 мл воды. Реакционную смесь выдерживают 2 часа, нейтрализуют до нейтральной реакции разбавленной уксусной кислотой и затем разбавляют водой. Образовавшееся твердое вещество отфильтровывают, промывают водой и сушат. Перекристаллизацией продукта из водного спирта с выходом 97.2% получают белые кристаллы с температурой плавления 173 - 174^oC.

2. Получение диацетата 17 -эстроалкинола

Раствор 10 г 17 -эстроалкинола в пиритеине смешивают с 35 мл уксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивают один час и переносят в ледяную воду с образованием твердого вещества. Образовавшийся осадок фильтруют, сушат и перекристаллизацией продукта реакции из абсолютного спирта с выходом 97% получают белые кристаллы с температурой плавления 126 - 128^oC.

3. Получение диацетата 6-карбонил-17 -эстроалкинола (Соединение (XII))

В бензоле растворяют 5 г диацетата 17 -эстроалкинола, при охлаждении по каплям прибавляют 0.45 трехокиси хрома и полученную смесь растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл уксусной кислоты и 30 мл бензола. По окончании реакции смесь перемешивают еще некоторое время и затем переносят в воду. Продукт реакции экстрагируют этиловым эфиром, промывают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и водой, сушат, концентрируют и последующей очисткой на силикагеле получают целевое соединение, выход 40%, температура плавления 173 - 175^oC.

Пример синтеза 9

Синтез N-4-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил] -1-пиперазин-1-метилендоксициклина HCl (соединение 9)

Смесь 2.2 г соединения (1-2), 0.2 г полиформальдегида и 100 мл изопропанола перемешивают 1.5 часа с нагреванием при 60^oC, после чего добавляют 3 г гидрохлорида доксициклина. Затем реакционную смесь перемешивают еще 2.5 часа при 60^oC. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают, промывают изопропанолом и этиловым эфиром и после сушки получают бледно-желтое вещество (соединение 9) с температурой плавления 172^oC (разл.), выход 87%.

Пример синтеза 10

Синтез N-4-[17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил] пиперазин-1- метилен(окситетрациклина) (соединение 10)

Смесь 0.91 г соединения (1-2), 80 мг полиформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают с перемешиванием 2 часа при 60^oC. После добавления 1 г террамицина реакционную смесь перемешивают еще 3 часа при 60^oC. Продукт реакции отфильтровывают, промывают изопропанолом и этиловым эфиром и после сушки с выходом 89% получают бледно-желтое твердое вещество с температурой плавления 175^oC (разл.).

Пример синтеза 11

Синтез N-4-[17-гидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-этоксиэтил]- пиперазин-1-метилентетрациклина (соединение 11)

Смесь 4.1 г N-(17-гидроксиэстрон-1,3,5(10)-триен-3-оксиэтил)пиперазина, 0.5 г полиформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC с перемешиванием. После добавления 4 г тетрациклина реакционную смесь выдерживают 3 часа при 40 - 45^oC. Продукт реакции отфильтровывают и промыванием изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 68.6% получают бледно-желтое твердое вещество (соединение 11) с температурой плавления 154^oC (разл.).

Пример синтеза 12

Синтез 17-гидроксиандрост-4-ен-3-оксиэтилметилентетрациклина



Смесь 3.3 г 3-аминоэтокси-17-гидроксиандрост-4-ена, 0.3 г метаформальдегида и 40 мл изопропанола нагревают 4 часа при 60^oC. После добавления 4.5 г тетрациклина реакционную смесь перемешивают 5 часов. Продукт реакции отфильтровывают и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 92% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 66.78, H 7.41, N 5.38.

Пример синтеза 13

Синтез 17-гидроксиандрост-4-ен-3-он-6-метилен(оксиэтиламинометилен) тетрациклина



Смесь 3.6 г 6-аминоэтоксиметилен-17-гидроксиандрост-4-ен-3-она, 0.3 г метаформальдегида, 4.5 г тетрациклина и 30 мл ацетона перемешивают 24 часа в темноте при комнатной температуре. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания ацетоном и этиловым эфиром с выходом 86% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 67.9, H 7.67, N 5.18.

Пример синтеза 14

Синтез 17-гидроксиандростан-3-(оксиэтиламинометилен)тетрациклина



Смесь 3.35 г 3-аминоэтокси-17-гидроксиандростана, 0.3 г метаформальдегида, 4.5 г тетрациклина и 30 мл ацетона перемешивают 30 часов в темноте при комнатной температуре. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания ацетоном и этиловым эфиром с выходом 85% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 66.61, H 7.69, N 5.4.

Пример синтеза 15

Синтез 17 -гидрокси-18-метил-19-норандрост-4-ен-3-он-17 -(бутиниленаминометилен)тетрациклина



Смесь 3.7 г 17 -аминоэтилэтинил-17 -гидрокси-18-метил-19-норандрост-4-ен-3-она, 0.3 г метаформальдегида и 30 мл изопропанола нагревают 4 часа при 60^oC. После добавления 4.5 г тетрациклина реакционную смесь перемешивают 6 часов. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 85% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 68.51, H 7.11, N 5.17.

Пример синтеза 16

Синтез 16 , 17 -дигидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-(оксиэтиламинометилен)тетрациклина



Смесь 3.3 г 3-аминоэтокси-16 , 17 / -дигидроксиэстра-1,3,5(10)-триена, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 2 часа при 80^oC и затем охлаждают до 40^oC. После добавления 4.5 г тетрациклина реакционную смесь выдерживают 6 часов. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 85% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 65.48, H 6.82, N 5.13.

Пример синтеза 17

Синтез 18-метил-17-оксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-(оксиэтиламинометилен)тетрациклина



Смесь 3.3 г 3-аминоэтокси-18-метилэстра-1,3,5(10)-триена, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола выдерживают 48 часов в темноте при 30^oC. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 82% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 67.45, H 6.86, N 5.27.

Пример синтеза 18

Синтез 17 -гидроксипрегна-4-ен-20-он-3-(оксиэтиламинометилен) тетрациклина



Смесь 3.8 г 3-аминоэтокси-17 -гидроксипрегн-4-ен-20-она, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC. Реакционную смесь охлаждают до 40^oC и добавляют 4.5 г тетрациклина. Затем реакционную смесь выдерживают 5 часов при 60^oC. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания ацетоном и этиловым эфиром с выходом 87% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 66.52, H 7.37, N 5.01.

Пример синтеза 19

Синтез прегна-5-ен-20-он-3-(оксиэтиламинометилен)тетрациклина



Смесь 3.6 г 3-аминоэтоксипрегна-5-ен-20-она, 0.6 г метаформальдегида и 40 мл изопропанола нагревают 2 часа при 80^oC. Реакционную смесь охлаждают до 40^oC, добавляют 4.5 г тетрациклина и выдерживают 6 часов при 40^oC. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 93% получают твердое вещество.

Элементный анализ: C 67.7, H 7.36, N 5.05.

Пример синтеза 20

17-Гидроксиандрост-1,4-диен-3-(оксиэтиламинометилен)доксициклин



Смесь 3.3 г 3-аминоэтокси-17 -гидроксиандрост-1,4-диена, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 2 часа при 80^oC. Реакционную смесь охлаждают до 40^oC, добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и выдерживают 4 часа. По окончании реакции промыванием продукта реакции изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 89% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 67.23, H 7.25, N 5.28.

Пример синтеза 21

Синтез 17 -метил-17 -гидроксиандрост-4-ен-3-он-6-(метиленоксиэтиламинометилен)доксициклина



Смесь 3.8 г 6-аминоэтоксиметилен-17 -метил-17 -гидроксиандрост-4-ен-3-она, 0.3 г метаформальдегида и 25 мл изопропанола нагревают 4 часа при 60^oC. Затем реакционную смесь охлаждают до 40^oC, добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и выдерживают 8 часов. По окончании реакции промыванием продукта реакции изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 86% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 63.72, H 7.02, N 5.13.

Пример синтеза 22

Синтез 17 -метил-17 -гидроксиандрост-3-он-2-(оксиэтиламинометилен)доксициклина



Смесь 3.6 г 2-аминоэтокси-17 -метил-17 -гидроксиандростан-3-она, 0.3 г метаформальдегида и 30 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC, а затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь дополнительно выдерживают. По окончании реакции промыванием продукта реакции изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 91% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 65.91, H 7.51, N 5.07.

Пример синтеза 23

Синтез 17 -метил-17 -гидрокси-19-норандрост-4-ен-3-он-6-(метиленоксиэтиламино)доксициклина



Смесь 3.7 г 6-аминоэтоксиметилен-17 -метил-17 -гидрокси-19-норандрост-4-ен-3-она, 0,3 г метаформальдегида и 50 мл ацетона выдерживают 2 часа при 30^oC, затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь выдерживают еще 30 часов. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и промыванием изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 87% и получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 63.64, H 7.03, N 5.18.

Пример синтеза 24

Синтез 17 -этинил-17 -гидроксиандрост-5(10)-ен-3-он-6-(метиленоксиэтиламинометилен)доксициклина



Смесь 3.7 г 6-аминоэтоксиметилен-17 -этинил-17 -гидроксиандрост-5(10)-ен-3-она, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC, затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь нагревают еще 8 часов при 40^oC. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и промыванием изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 87% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 66.81, H 7.06, N 5.01.

Пример синтеза 25

17 -Пропилен-17 -гидрокси-11-диметиламинофениландрост- 4,9-диен-3-он-6-(метиленоксиэтиламинометилен)доксициклин



Смесь 5 г 6-аминоэтоксиметилен-11-(4"-диметиламинофенил)-17 -пропилен-17 -гидроксиандрост-4,9-диен-3-она, 0.3 г метаформальдегида и 40 мл изопропанола нагревают 2 часа при 80^oC. После охлаждения реакционной смеси до 40^oC добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь выдерживают 6 часов. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 90% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 68.76, H 6.88, N 5.72.

Пример синтеза 26

Синтез 16,17-изопропилиден-16,17-диоксиэстра-1,3,5(10)- триен-3-(оксиэтиламинометилен)доксициклина



Смесь 3.7 г 16,17-изопропилиден-16,17-диоксиэстра-1,3,5(10)-триен-3-аминоэтилового простого эфира, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC, затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь дополнительно выдерживают 8 часов. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 95% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 66.71, H 6.9, N 5.18.

Пример синтеза 27

Синтез 3,17-дигидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-17-ацетат- 7-(метиленоксиэтиламинометилен)доксициклина



Смесь 3.8 г 7-аминоэтилоксиметиленэстра-3,17-диен-17-ацетата, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 4 часа при 60^oC, затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь дополнительно выдерживают 4 часа. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и после промывания изопропанолом с выходом 88% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 65.34, H 6.68, N 4.95.

Пример синтеза 28

Синтез 17-гидроксипрегна-4-ен-20-он-3-(оксиэтиламинометилен)доксициклина



Смесь 3.7 г 3-аминоэтокси-17 -гидроксипрегна-4-ен-20-она, 0.3 г метаформальдегида и 40 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC, затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь дополнительно выдерживают 4 часа. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 92% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 66.41, H 7.4, N 5.14.

Пример синтеза 29

Синтез прегна-4-ен-3,20-дион-6-(метиленоксиэтиламинометилен)доксициклина



Смесь 3.9 г 6-аминоэтоксиметиленпрегна-4-ен-3,20-диона, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 3 часа при 60^oC, затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь дополнительно выдерживают 4 часа. По окончании реакции продукт реакции фильтруют и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 93% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 67.77, H 7.36, N 4.59.

Пример синтеза 30

Синтез 3,17-дигидроксиэстра-1,3,5(10)-триен-11-(4- феноксиэтиламино)метилендоксициклина 6

Смесь 4 г 11-(4"-аминоэтоксифенил)-3,17-дигидроксиэстра- 1,3,5(10)-триена, 0.3 г метаформальдегида и 50 мл изопропанола нагревают 2 часа при 60^oC, затем добавляют 4.5 г гидрохлорида доксициклина и реакционную смесь дополнительно выдерживают 8 часов. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 89% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 68.13, H 6.69, N 4.73.

Пример синтеза 31

Синтез 17 -гидрокси-17 -метиландростано-(3,2-c)пиразол-N-метилентетрациклина



Смесь 3.29 г 17 -гидрокси-17 - метиландростано(3,2-c)пиразола, 0.3 г метаформальдегида и 30 мл изопропанола нагревают 2 часа при 40^oC, добавляют 4.5 г тетрациклина и реакционную смесь перемешивают 6 часов. По окончании реакции продукт реакции отфильтровывают и после промывания изопропанолом и этиловым эфиром с выходом 89% получают желтое твердое вещество.

Элементный анализ: C 67.48, H 7.07, N 7.30.

Опыт 1.

Распределение соединения в организме

В соединение 1-3, полученное в примере синтеза 1-3, вводят радиоактивную метку ³H (0.34 мCi/мг) и соединение инъектируют в вену хвоста мыши в дозе 20 Ci/20 г. Мышей в группах по пять мышей в каждой умерщвляют через 1 минуту, 5 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 4 часа, 6 часов, 24 часа, 48 часов и 72 часа после инъекции и из глазницы каждой мыши отбирают 50 мкл крови. Кроме того, у каждой мыши удаляют сердце, матку, малый кишечник, кости (бедренная кость) и т.д. и 50 мг ткани (50 мкл крови) помещают в пластиковые пробирки для анализа. В пробирку кроме того помещают 0.2 мл перхлорной кислоты, 0.4 мл перекиси водорода и каплю н-октилового спирта и нагревают на водяной бане 45 минут при 75^oC. Затем отбирают 0.1 мл этой обработанной жидкости и помещают в колбу для хранения сцинцилляционного раствора, где смешивают с 5 мл 0.5% сцинцилляционного раствора. После того, как раствор становится прозрачным, его для определения cpm в образце и его радиоактивности помещают в FJ 2105 жидкостной сцинцилляционный счетчик. Отдельно определяют dpm 52 образцов, полученных в четырех группах животных (метод внешнего стандарта).

Количество лекарственного средства внутри ткани определяют следующим образом.

Количество лекарственного средства в ткани (cpm/мг) = (cpm образца) + (количество обработанной ткани (мг)).

Количество лекарственного средства в ткани (мкг/мг) = (cpm/мг образца 6) + (эффективность счетчика (E) 2.22 10 0.34 mCi/мг (удельная радиоактивность)).

Получены результаты, представленные в табл. 1-4 (см. в конце описания).

Опыт 2.

Анализ на острую токсичность

(1) Образец

Соединение 1-3 представляет собой бледно-желтый кристаллический порошок, серийный номер соединения 930 113. Раствор соединения в концентрации 50 мг/мл имеет pH 5 и представляет собой прозрачную бледно-желтую жидкость. Жидкость может быть получена в лаборатории исследования остеопороза, кафедра фармации, Уэст Чайна Юниверсити Медикал Сайэнс Скул (УЧЮМСС).

(2) Животные

В экспериментах используются здоровые мыши породы Канминг, первого класса, весом от 18 до 21 г, половина самцов и половина самок. Мыши выращиваются Экспериментальным центром при УЧЮМСС для выращивания животных.

(3) Определение полулетальной дозы (ЛД₅₀)

Подготовлено четыре-пять групп мышей, получающих дозу в равных отношениях (1 : 0.7 - 0.8) в пределах интервала ЛД 0 - 100%, выявленного в предварительных испытаниях. Лекарственное средство для перорального приема готовят суспендированием твердого соединения 1-3 в 1% CMCNa₂ с образованием суспензии. Для инъекций растворы лекарственного средства приготовлены методом разбавления с низким удельным весом путем растворения соединения 1-3 в физиологическом солевом растворе и получения растворов с различной концентрацией. Животных подвергают голоданию (но при свободном доступе к воде) и через 20 часов наугад независимо от пола и веса набирают группы по десять мышей. Лекарственное средство дают один раз в день в дозе 0.2 мл/10 г и затем животных осматривают. Мертвых животных подвергают вскрытию и любые патологические изменения отмечают невооруженным глазом.

(4) Результаты испытаний

(a) Определение на мышах максимально терпимой дозы соединения 1-3.

Предварительными испытаниями выявлена максимально терпимая доза, не ведущая к смерти. После того, как 20 мышей (10 самцов и 10 самок) получают одной дозой химическое соединение в максимальной концентрации и в максимально возможном для перорального введения количестве, животных наблюдают в течение 7 дней. В результате никаких нарушений у мышей не отмечено, как не отмечено смертельных случаев. Максимально терпимая доза (МТД) составляет >6 г/кг.

(b) После инъектирования соединения 1-3 в вену хвоста мышей получены результаты, представленные в табл. 4 (см. в конце описания).

(5) Выводы

Максимально терпимая доза (МТД) соединения 1-3 при разовом введении мыши составляет, по меньшей мере, 6 г/кг, и токсичность соединения чрезвычайно мала. Значение ЛД₅₀ при внутривенной инъекции в вену хвоста мыши составляет 143.11 мг/кг. После внутривенной инъекции активность мыши падает, затем мышь начинает прыгать, наблюдаются спазмы. Глазное яблоко выступает из глазницы и белеет, наблюдается недержание мочи и кала. Хотя основная часть отравленных мышей погибает мгновенно, та небольшая часть выживших мышей все равно погибает в течение 24 часов. Мыши, выжившие в течение 24 часов, не погибают и в течение последующих 7 дней. Никакой зависимости смертельных случаев от пола животных не отмечено, как не отмечено никаких патологических изменений после вскрытия при наблюдении невооруженным глазом. Испытания проводились при температуре 17^oC.

Опыт 3.

Исследование остеогенеза (1)

В качестве испытуемых клеток применяется инкубационная система первого поколения остеобластов, происходящих из свода черепа крыс Уистер (самки, возраст 6 месяцев). После начала инкубирования в среду один раз в день добавляют образцы лекарственного средства в дозе 10^-6 М, 10^-8 М или 10^-9 М на второй и третий день (период воспроизводства). Или же соединение 1-3 в вышеуказанном количестве добавляют в среду один раз в день в течение 4 дней (период кальцификации), начиная с седьмого дня от начала инкубирования. На четырнадцатый день от начала инкубирования клетки окрашивают по фон Коссу и проводят определение фосфатов. Области костных узлов, окрашенные в коричневый цвет, видны невооруженным глазом, и используются в качестве показателя остеогенеза. Получены результаты, представленные в табл. 5 (см. в конце описания).

На фиг. 1 - 3 показаны результаты, полученные при трехкратном повторении одной и той же вышеприведенной методики. На фотографиях буквой A указано отсутствие лекарственного средства, буква B указывает на добавление соединения в концентрации 10^-9 М, буква C - в концентрации 10^-8 М и буква D - в концентрации 10^-6 М.

Из вышеприведенных результатов очевидно, что соединение настоящего изобретения обладает промотирующим остеогенез действием.

Опыт 4.

Исследование остеогенеза (2)

В качестве испытуемых клеток использована инкубационная система первого поколения клеток костного мозга из бедренной кости крыс Уистер (самки, возраст 6 месяцев), и соединение 1-3 добавляли один раз в день в количестве 10^-8 М или 10^-6 М к среде на седьмой, девятый и одиннадцатый день от начала инкубирования (период кальцификации). Исследования проводят по методике опыта 3. Полученные результаты приведены в табл. 6 (см. в конце описания).

Как следует из приведенных в таблице результатов, соединение настоящего изобретения обладает промотирующим остеогенез действием.