производные фактора ингибирования липогенеза и их получение
Классы МПК: | C12N15/24 интерлейкины C07K14/54 интерлейкины (ИЛ) C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона |
Автор(ы): | Кендзи Миядаи (JP), Итиро Кавасима (JP), Дзун Охсуми (JP), Йо Такигути (JP), Ясухиро Ито (JP) |
Патентообладатель(и): | Санкио Компани Лимитед (JP) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1993-04-16 публикация патента:
27.09.1999 |
Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Полипептид, являющийся производным фактора, ингибирующего липогенез у человека, получают рекомбинантным способом или расщеплением трипсином. У данного полипептида отсутствуют от 1 до 9 N-концевых аминокислот. Получают вектор экспрессии, содержащий AGIF. Данным вектором трансформируют хозяйские клетки. культивируют хозяйские клетки в условиях, разрешающих экспрессию указанного производного AGIF. Выделяют указанное экспрессируемое производное AGIF из культуры. Слитый белок содержит АGIF с делецией от 1 до 9 аминокислот N-конца, слит с белком, связующим мальтозу. Конструируют вектор экспрессии, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую слитый белок. Трансформируют соответствующие хозяйские клетки указанным вектором. Культивируют хозяйские клетки в условиях, разрешающих экспрессию указанного слитого белка. Обрабатывают культуру ферментом, способным расщеплять экспрессируемый слитый белок в специфическом сайте. Выделяют целевой продукт из культуры. Изобретение позволяет получить ингибитор дифференциации адипоцитов, а также новые полипептиды, имеющие активность зрелого АGIF. 6 с. и 6 з.п.ф-лы, 6 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42
Формула изобретения
1. Полипептид, являющийся производным фактора, ингибирующего липогенез у человека AGIF, в котором отсутствуют от 1 до 9 N-концевых аминокислот, полученный рекомбинантным способом. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислоты 3 - 178 до аминокислот 10 - 178 последовательности SEQ ID N 2. 3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что имеет последовательность SEQ ID N 8. 4. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что в нем N-концевая кислота представляет собой метионин или N-формилметионин. 5. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, представляющий производное фактора, ингибирующего липогенез у человека, в котором отсутствуют от 1 до 9 N-концевых аминокислот. 6. Нуклеотидная последовательность по п.5, отличающаяся тем, что кодирует полипептид, содержащий аминокислоты с 3 по 178 до аминокислот с 10 по 178 последовательности SEQ ID N 2. 7. Нуклеотидная последовательность по п.5, отличающаяся тем, что включает нуклеотиды 87 - 614 до нуклеотидов 108 - 614 последовательности SEQ ID N 1. 8. Нуклеотидная последовательность по п.5, отличающаяся тем, что имеет последовательность SEQ ID N 7. 9. Способ получения полипептида по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что получают вектор экспрессии, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую производное AGIF, трансфицируют соответствующие хозяйские клетки указанным вектором, культивируют указанные хозяйские клетки в условиях, разрешающих экспрессию указанного производного AGIF, и выделяют указанное экспрессируемое производное AGIF из культуры. 10. Полипептид, представляющий производное фактора, ингибирующего липогенез у человека, у которого отсутствуют 9 аминокислот N-конца, получаемый расщеплением трипсином. 11. Слитый белок, содержащий AGIF с делецией от 1 до 9 аминокислот, N-конца, слитый с белком, связующим мальтозу. 12. Способ получения слитого белка по п. 11, отличающийся тем, что конструируют вектор экспрессии, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую слитый белок, представляющий производное AGIF, слитое со связывающим мальтозу протеином (МВР), трансформируют соответствующие хозяйские клетки указанным вектором, культивируют указанные хозяйские клетки в условиях, разрешающих экспрессию указанного слитого белка, и обрабатывают культуру ферментом, способным расщеплять экспрессируемый слитый белок в специфическом сайте, и выделяют целевой продукт из культуры.Описание изобретения к патенту
Настоящее изобретение относится к новым производным действующего начала (фактора), ингибирующего липогенез (AGIF), также, как и к способам их получения и к их применению. Оно относится также к применению некоторых известных производных AGIF. AGIF представляет собой протеин, который, как было показано, ингибирует дифференциацию предадипоцитов в адипоциты. Протеин, который иначе известен как интерлейкин 11 (IL- 11), выделен из стромальной клетки линии KM-102, которая получена из костного мозга человека (Последовательность ID N 4, Kawashima et al. , FEBS Letters, 283 (1991) 13-16). Показано, что выделенный протеин ингибирует дифференциацию предадипоцитной клетки линии H-I/A, которая получена из костного мозга мыши, в адипоциты. Заявка по договору о патентной кооперации (РСТ) ВОИС 92/13955, опубликованная позднее самой ранней даты приоритета настоящей заявки, описывает слитый протеин между тиоредоксином и производным IL-11 (AGIF), в котором происходит делеция N-концевого остатка пролина IL-11. В этой заявке не обсуждается ни производное AGIF само по себе, ни активность этого соединения. Известно, что все гемопоэтические клетки (т.е. клетки, вовлеченные в образование крови), например, эритроциты, нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы, тромбоциты и лимфоциты, образуются из материнских клеток в костном мозге путем дифференциации, известной также как гемопоэз. Эти материнские клетки обычно более известны как полипотентные стволовые клетки. Известно, что гемопоэз и пролиферация полипотентных стволовых клеток регулируются различными гемопоэтическими факторами, а также взаимодействием от клетки к клетке (cell-to-cell) со стромальными клетками костного мозга. Примерами таких гемопоэтических факторов являются колониестимулирующие факторы, например, гранулоцит-макрофаговый колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофаговый колониестимулирующий фактор (M-CSF) и гранулоцитный колониестимулирующий фактор (G-CSF). Гемопоэз обычно происходит в "гемопоэтической микросреде", как описано в Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol. 3 (1987) 423-441. Известно, что предадипоциты имеют поддерживающую функцию в гемопоэтической микросреде, но когда они дифференцируют в адипоциты, эта поддерживающая функция теряется [Hiroaki Kodama "SOSHIKI BAIYO (Tissue Culture)", 12 (1986) 191-195). Это демонстрируется с использованием мышиных предадипоцитных клеток линии PA 6. Эта клеточная линия способна поддерживать гемопоэз, но эта поддерживающая функция ослабевает, когда клетки PA6 дифференцируют в адипоциты (Kodama et al., Cell. Physiol., 118, (1984) 233-240). Также известно, что культивированные клетки PA6 вместе с клетками костного мозга мыши, т.е. с полипотентными стволовыми клетками, будут приводить в результате к образованию колоний бластных клеток, колоний мегакариоцитов и колоний макрофагов (Hiroaki Kodama, "JIKKEN IGAKU (Eхperimental Medicine)", (1987) 826-830). Считают, что если AGIF выделен из клеток костного мозга человека, такой протеин воздействует непосредственно на предадипоциты костного мозга, ингибируя их дифференциацию и позволяя таким образом предадипоцитам поддерживать гемопоэз полипотентных стволовых клеток костного мозга. Кроме того, эксперименты показали, что предадипоцитные клетки линии H-I/A, которые получают из костного мозга, образуют колониестимулирующий фактор (GSF) - известный гемопоэтический фактор. Количество CSF, образованного предадипоцитами, уменьшается, когда они дифференцируют в адипоциты (Nakamura et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179 (1985) 283-287). Поэтому предполагается, что благодаря ингибированию дифференциации предадипоцитов в адипоциты, AGIF допускает расширенное образование CSF предадипоцитами, за счет чего промотируется гемопоэз полипотентных стволовых клеток (Ohsumi et al., FEBS Letters, 288, (1991) 13-16). Возрастание гемопоэза стволовых клеток действительно дает в результате возрастание образования клеточных элементов в крови. Поэтому ожидается, что ингибитор липогенеза будет иметь практическое значение при лечении состояний, в которых снижается число кровяных клеток, по любой причине. Примеры таких состояний включают цитопению (т.е. уменьшение клеточных элементов в крови или в других тканях, возникающее при каком-либо заболевании) и анемию. Кроме того, ингибирование липогенеза будет приводить в результате к уменьшению числа адипоцитов, или жировых клеток, поэтому предполагается, что ингибиторы липогенеза будут иметь значение для лечения таких состояний, как ожирение. Принимая во внимание преимущества, которые достигаются благодаря ингибированию дифференциации предадипоцитов в адипоциты, существует необходимость в дальнейших разработках таких ингибиторов липогенеза. Краткое изложение сущности изобретенияСледовательно, целью настоящего изобретения является предложить ингибитор дифференциации адипоцитов. В частности, целью настоящего изобретения является предложить полипептиды, имеющие активность зрелого AGIF. Настоящее изобретение предлагает в качестве новых соединений человеческий полипептид, выбранный из группы, состоящей из производного фактора, ингибирующего липогенез человека, в котором недостает от 2 до 9 N-концевых аминокислот, его функционально эквивалентных производных и его предшественников. Изобретение также предлагает фармацевтическую композицию для лечения или профилактики цитопении, или для лечения или профилактики паталогического ожирения, и эта композиция содержит эффективное количество соединения, противодействующего цитопении или паталогическому ожирению, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, и упомянутое противодействующее цитопении или паталогическому ожирению соединение представляет собой человеческий полипептид, выбираемый из группы, состоящей из производного фактора, ингибирующего липогенез человека, в котором недостает от 1 до 9 N-концевых аминокислот, его функционально эквивалентных производных и его предшественников. Изобретение также предлагает способ лечения или профилактики цитопении, или лечения паталогического ожирения у млекопитающего, которое может быть человеком, и этот способ включает введение эффективного количества соединения, противодействующего цитопении или патологическому ожирению, упомянутому млекопитающему, и упомянутое соединение, противодействующее цитопении или паталогическому ожирению, представляет собой человеческий полипептид, выбираемый из группы, состоящей из производного фактора, ингибирующего липогенез человека, в котором недостает от 1 до 9 N-концевых аминокислот, его функционально эквивалентных производных и его предшественников. Настоящее изобретение также предлагает нуклеотидные последовательности, кодирующие эти полипептиды, векторы, включающие такие нуклеотидные последовательности, и клетки-хозяев, трансформированные такими нуклеотидными последовательностями или векторами, а также способы получения таких полипептидов. Такие варианты осуществления изобретения подробнее описаны далее. Краткое описание рисунков
При дальнейшем описании настоящего изобретения при необходимости будут делаться ссылки на прилагаемые рисунки. На фиг. 1 показаны результаты вестерн-блоттирования ограниченного расщепления (переваривания) трипсином завершенной формы AGIF. Фиг. 2 демонстрирует биологическую активность супернатанта культуры клеток COS-I, обработанных трипсином. Фиг. 3 представляет схему получения плазмиды M13 mp19 (20-2)















Полипептиды настоящего изобретения предпочтительно выбирают из группы, состоящей из полипептидов, содержащих аминокислоты 3-178 и до аминокислот 10-178 с последовательность ID N 2 (см. в конце текста описания) их эквивалентов, мутантов и вариантов, их предшественников и их производных. В качестве иллюстрации вышесказанного настоящее изобретение предлагает производные AGIF, причем в каждом производном недостает специфических аминокислот N-концевой зрелой формы AGIF. Из представленной выше последовательности можно видеть, что настоящее изобретение предлагает производные AGIF, имеющие последовательности, включающие аминокислоты с номерами с 3 по 178, с 4 по 178, с 5 по 178, с 6 по 178, с 7 по 178, с 8 по 178, с 9 по 178 и с 10 по 178 вышеприведенной последовательности, а также их эквиваленты, мутанты, производные и варианты, и их предшественников. Полипептиды настоящего изобретения, таким образом, содержат в своей активной форме от 169 до 176 аминокислотных остатков. Полипептиды настоящего изобретения имеют приблизительную молекулярную массу в области от 22000 до 23000 дальтон, при измерении с помощью электрофореза в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель в условиях восстановления. Настоящее изобретение предлагает производные AGIF, как описано выше, а также их функционально эквивалентные производные и их предшественников. Использованные здесь термины "функционально эквивалентные производные" и "эквиваленты" означают любое производное AGIF настоящего изобретения, в котором одна или более аминокислот из последовательности модифицированы либо искусственно, либо естественным путем, и в котором модифицированный полипептид еще сохраняет по крайней мере значительную часть биологической активности немодифицированного производного. Биологическая активность полипептидов настоящего изобретения подробнее описана далее. Коротко, такая биологическая активность включает одно или все из следующих положений: способность подавлять активность липопротеина липазы адипоцитов, способность индуцировать образование колониестимулирующего фактора предадипоцитами, способность промотировать образование антител B-клетками, способность промотировать образование колоний мегакариоцитов и тромбоцитов и способность уменьшать Go-фазу гемопоэтических стволовых клеток. Вообще, следует принять во внимание, что активность любого данного протеина зависит от некоторых сохранившихся участков молекулы, пока другие участки имеют небольшое значение, связанное с их конкретной последовательностью, и может быть совершенно или полностью избыточной. Соответственно, настоящее изобретение включает также любые варианты или мутанты с последовательностью производного AGIF, которые еще сохраняют достаточную активность AGIF-типа. Такие варианты и мутанты включают, например, делеции, присоединения, вставки, инверсии, дупликации и типа замещения (например, замещение одного гидрофильного остатка на другой, за исключением, как правило, того случая, когда остаток является сильно гидрофильным или сильно гидрофобным). Небольшие изменения обычно будут иметь небольшое действие на активность, тем не менее, они являются существенной частью молекулы и могут представлять побочный продукт генетического воздействия. Примеры таких небольших изменений включают генерацию дополнительных сайтов рестрикции, как желательных. Следует принять во внимание, что кодирующая последовательность для полипептидов настоящего изобретения может быть модифицирована любым желательным способом, при условии, что при этом отсутствует вредное воздействие на активность образующегося полипептида. Местные мутации и другие изменения могут быть осуществлены, например, для того, чтобы содействовать генетической манипуляции, путем добавления или делеции сайтов рестрикции, или иным способом, чтобы увеличить или модифицировать молекулу. Например, уже известно, что во многих полипептидах остатки цистеина могут быть превращены в остатки серина без существенной потери активности. Это продемонстрировано по отношению к интерлейкину 2 (IL - 2) в Wang et al., Science 224 (1984) 1431-1433. Варианты производных AGIF настоящего изобретения включают встречающиеся в природе производные AGIF, которые разделяют последовательность зрелого AGIF при нехватке от 2 до 9 N-концевых остатков аминокислот, но которые, как ожидается, разнятся с ними до некоторой степени в пределах широкой совокупности. В рамках этого определения лежат аллельные вариации и пептиды других видов, показывающие подобный тип активности и имеющие родственную последовательность. Предшественники AGIF производных настоящего изобретения включают, например, предшественников, имеющих N-концевые заместители, а также слитые белки. N-концевые заместители, предпочтительно, выбираются таким образом, чтобы быть расщепленными, разложившимися или удаленными иными способами до или по достижении места назначения (мишени) в теле. Такие заместители могут самопроизвольно разлагаться или расщепляться в телесной среде, например, вследствие изменения pH или концентрации ионов и т.д., или они могут быть активно расщеплены при воздействии, например, ферментов или до, или после введения. Подходящие N-концевые заместители включают лидирующие последовательности и группы, такие как сложноэфирные, а также остатки метионина или формилметионина. Заместители, такие как лидирующие последовательности, а также слитые белки, в основном будут представлять собой побочные продукты любой системы экспрессии, использованной для получения производного AGIF. Такие лидирующие последовательности или слитые белки будут нормально расщепляться в системе экспрессии, но, альтернативно, они могут расщепляться в теле, например, в месте назначения. Такие последовательности имеют склонность обслуживать не конкретную функцию, касающуюся активности производных AGIF, но скорее имеют склонность быть преимущественно вовлеченными в экспрессию полипептида. В настоящем изобретении, где используется лидирующая последовательность, может оказаться подходящим использование лидирующей последовательности, встречающейся в природе, например, такой, которая иллюстрируется аминокислотами с номерами с -21 до 0 в вышеупомянутой последовательности (последовательность ID N 2). Однако, может быть использована любая подходящая последовательность, особенно если она разработана для данной системы экспрессии. Производное AGIF настоящего изобретения может быть получено в виде слитого белка, что желательно, и обычно в качестве вспомогательного средства в экспрессии полипептида. Такие слитые белки обычно расщепляются в системе экспрессии или самопроизвольно, или после добавления, например, подходящего фермента, что приводит в результате к образованию производного AGIF. Выбор партнера для слияния не существеннен для настоящего изобретения, но имеется некоторая тенденция к зависимости его от выбора системы экспрессии. Так, для экспрессии в некоторых прокариотических клетках, таких как Е. coli, что далее дается в качестве примера, может оказаться подходящим использование протеина, связывающего мальтозу, или его производного, в качестве партнера для слияния с производным AGIF настоящего изобретения. Предпочтительным полипептидом настоящего изобретения является полипептид, представленный последовательностью ID N 7 (см. в конце текста описания), а также его эквиваленты, мутанты, варианты и его предшественники, как упоминалось выше. Настоящее изобретение также предлагает нуклеотидные последовательности, кодирующие все или часть производных AGIF настоящего изобретения. Такие последовательности могут быть либо ДНК, либо РНК, и они могут быть получены стандартными техническими приемами, например, путем обратной инженерии полипептидной последовательности, как предлагается здесь; путем химического синтеза с применением триэфирфосфитного метода (Hunkapiller et al. Nature 310 (1984) 105-111) или путем синтеза кДНК, с применением фермента обратной транскриптазы, из матрицы РНК, полученной из клеток, экспрессирующих зрелый AGIF, с последующей селекцией и амплификацией кДНК полимеразной пенной реакции (PCR), с использованием затравок для смысловых и антисмысловых цепей (нитей), полученных с применением кДНК-последовательности. Последовательность кДНК зрелого AGIF описана в литературе (Kawashima et al. FEBS Letters 283 (1991) 199-202). Специалист в этой области техники должен уметь использовать эту опубликованную кДНК последовательность, например, при получении олигонуклеотидных затравок для использования в полимеразной цепной реакции, для того, чтобы получить последовательности, подходящие для применения в настоящем изобретении. Следует принять во внимание, что любая данная, полученная обратной инженерией последовательность, не будет обязательно хорошо гибридизировать, или вообще, с любой данной комплементарной последовательностью, полученной обратной инженерией из того же самого пептида, благодаря вырождению (дегенерации) генетического кода. Это является фактором, распространенным в расчетах специалистов, и вырождение любой данной последовательности зачастую является настолько широким, что крайне затрудняет синтез даже короткой комплементарной олигонуклеотидной последовательности, чтобы она служила в качестве пробы для олигонуклеотидной последовательности, встречающейся в природе. Вырождение кода является таковым, что, например, могут существовать четыре, или больше, возможных кодонов для часто встречающихся аминокислот. Соответственно, поэтому, можно видеть, что число возможных кодирующих последовательностей для любого данного пептида может возрастать экспоненциально с числом остатков в этом пептиде. По существу, следует принять во внимание, что число возможных кодирующих последовательностей для производных AGIF настоящего изобретения может быть очень большим, и мало возможностей для выбора между последовательностями. Однако, может возникнуть необходимость принять в расчет некоторые факторы, которые могут воздействовать на выбор кодирующей последовательности, например, выбор системы экспрессии и частоты использования кодона этой системой. Также может быть желательным сбалансировать содержание G+C последовательности, соответствующей интересующей системе экспрессии. Отбор кодонов при конструировании нуклеотидной последовательности может быть осуществлен, до некоторой степени, произвольно, и подходящие кодоны могут быть отобраны с использованием стандартных методов, таких, как методы, описанные в Grantham et al., Nucleic Acids ReS. 9 (1981) r43 - r47. Внимание должно быть уделено, например, частоте использования кодонов в конкретном хозяине. Предпочтительную кодирующую последовательность выбирают из группы, состоящей из нуклеотидов с номерами 87-614 до нуклеотидов с номерами 108-614 последовательности lD N 1 (см. в конце текста описания), а также из их мутантов, вариантов и комплементарных последовательностей. Настоящее изобретение, следовательно, включает нуклеотидные последовательности, которые включают нуклеотиды с числами 87-614, 90-614, 93-614, 96-614, 99-614, 102-614, 105-614 и 108-614 вышеупомянутой последовательности. Термины "мутант" и "вариант", использованные выше, имеют те же значения, которые они имеют в связи с пептидной последовательностью mutatis mutandis. Изменение нуклеотидов в выбранных кодирующих последовательностях может быть осуществлено с использованием стандартных технических приемов, таких, например, как сайтовый специфический мутагенез. Такая техника, которая описана в Mark et al., P.N.A.S. 81 (1984) 5662-5666, включает использование праймера (затравки), составленного из синтезированных олигонуклеотидов, кодирующих желательное изменение. Следует принять во внимание, что, пока мутант или вариант пептидной последовательности всегда будут отражаться в кодирующей нуклеотидной последовательности, обратный процесс не является обязательно истинным. Соответственно, может появиться возможность для нуклеотидной последовательности стать существенно измененной (например, как описано выше при рассмотрении дегенерации генетического кода) без воздействия на пептидную последовательность каким-либо путем. Вообще, известно, что такой полиморфизм демонстрируют гены эукариотов например, как это иллюстрируется геном интерферона (Nishi et al., J. Biochem. 97 (1985) 153-159). Полиморфизм может также существовать в зависимости от типа клетки, из которой происходит РНК. Такие мутанты и варианты входят в объем изобретения. Настоящее изобретение также предлагает нуклеотидные последовательности, которые гибридизируют с последовательностью ID N 1, и предпочтительно такие последовательности должны показывать 50% избыток, предпочтительнее - 70%, и наиболее предпочтительно - 80%, гомологии с последовательностью, упомянутой выше. Нуклеотидные последовательности настоящего изобретения предпочтительно, представляют собой последовательности ДНК. Такие последовательности могут использоваться одни, например, в качестве проб, но, как правило, предпочтительно, чтобы они образовывали часть системы экспрессии. Таким образом, предпочтительно, чтобы последовательность ДНК составляла часть вектора, подходящего для системы экспрессии. Природа векторов для применения в соответствии с настоящим изобретением не является существенной для изобретения. Вообще, для специалистов вопрос о подходящих векторах, векторах экспрессии и их строении ясен. Подходящие векторы экспрессии могут основываться на фагах или плазмидах, которые обычно являются специфическими хозяевами, хотя они часто могут быть сделаны для других хозяев. Другие подходящие векторы включают космиды и ретровирусы и любые другие носители, которые могут или не могут являться специфическими для данной системы. Регулирующие последовательности, такие как распознающие, стимуляторы, операторы, индукторы, терминаторы и другие последовательности, существенные и/или пригодные для регулировки или экспрессии, будут ясны для специалистов, и могут связываться с последовательностью природного AGIF или с используемым вектором или могут образовываться из любого другого подходящего источника. Векторы могут быть модифицированы или сделаны любым подходящим способом. Особенно подходящей нуклеотидной последовательностью, кодирующей производное AGIF настоящего изобретения, является последовательность ID N 7 а (см. в конце текста описания) и ее мутанты, варианты и комплементарные последовательности, например, такие, как определено выше. Настоящее изобретение также предлагает способ получения полипептида, о котором упоминалось выше, и этот способ включает получение носителя экспрессии, содержащего последовательность ДНК, кодирующую производное AGIF, как упоминалось выше, трансфекцию соответствующей клетки-хозяина с упомянутым вектором, выращивание упомянутой клетки-хозяина в условиях, в которых возможна экспрессия упомянутого производного AGIF, необязательную обработку культуры ферментом, способным расщеплять экспрессированное производное AGIF в специфическом сайте, и выделение упомянутого экспрессированного производного AGIF из культуры. Этот способ позволяет получать требуемое производное AG1F в промышленном масштабе, достигая как высокого выхода, так и высокой чистоты. Вообще, существует ряд способов, которые можно использовать для получения пептида и нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения встречающийся в природе пептид может быть получен обычным способом и переварен (расщеплен) для удаления желаемого числа аминокислот из N-концов. Такое переваривание может быть облегчено изменением нуклеотидной последовательности, чтобы создать сайт, такой как термо- или хладонеустойчивый, например, или распознаваемый остаток или последовательность в кодированном пептиде, где может быть осуществлено, например, химическое расщепление или ферментное расщепление. Подходящие пептидазы хорошо известны специалистам, и в иных случаях подходящим является использование трипсина. Одним из подходящих способов получения полипептидов настоящего изобретения является получение ДНК, кодирующей зрелую форму AGIF, с использованием способов, описанных в литературе [Kawashima et al., FEBS. Letters 283 (1991 199-202)] . На эту ДНК затем воздействуют такими техническими приемами, как мутагенез in vitro, для того, чтобы достичь последовательности ДНК, кодирующей желаемый полипептид, т.е., полипептид, который эквивалентен зрелому AGIF, но в котором недостает от 2 до 9 N-концевых аминокислотных остатков. Образующаяся в результате последовательность затем может быть выражена непосредственно, или, напротив, слита с другой ДНК-последовательностью, таким образом, чтобы слитый белок являлся результатом экспрессии. Затем, чтобы получить желаемый полипептид, слитый белок может быть переварен стандартным образом, например, путем использования подходящего фермента. К числу партнеров для образования слитого белка с производным AGIF настоящего изобретения относятся, например, любые полипептиды, которые включают распознаваемую для специфического энзима последовательность в C-конце. Одним из таких подходящих партнеров является протеин, связывающий мальтозу, или его производные. После образования слитого белка между протеином, связывающим мальтозу, и производным AGIF настоящего изобретения и после добавления фактора коагуляции крови Xa слитый белок расщепляют и получают в результате желаемое производное AGIP. Кодирующая ДНК для производного AGIF настоящего изобретения может быть введена в подходящий вектор, и клетки-хозяева прокариотов и эукариотов затем могут быть трансформированы с таким вектором. Используя технические приемы, стандартные для технологии построения вектора и экспрессии протеина в клетке-хозяине, ДНК, кодирующая производное AGIF, может быть выражена в клетках-хозяевах. Культуры, пригодные для получения производных AGIF настоящего изобретения, соответственно, могут быть культурами любых живых клеток и могут меняться от прокариотических систем экспрессии до эукариотических систем экспрессии. Предпочтительные прокариотические хозяева включают, например, Escherichia coli u Bacillus subtilis. Для того, чтобы выразить ген-значения в этих клетках-хозяевах, клетки-хозяева трансформируются с носителем, содержащим ДНК-последовательность, которая выражается, например, вектором плазмиды. Этот вектор обычно будет содержать репликон, который является источником репликации, произведенной из видов, имеющих совместимость с хозяином, и регуляторные последовательности. Кроме того, желательно, чтобы вектор содержал последовательность, придающую селективность характеру экспрессии, или фенотипу, трансформированных клеток. Выбор вектора и/или клетки-хозяина не является существенным для настоящего изобретения и этот выбор будет зависеть, как обсуждалось выше, от различных факторов. Вообще, мы считаем, что когда в качестве клетки-хозяина используется E. coli, широко доступная линия K12 является подходящей, в то время как в качестве векторов подходящими являются широко доступные плазмиды pBR322 и pUC. Как обсуждалось выше, часто необходимо, или по крайней мере желательно, включать различные регулирующие последовательности, когда осуществляется экспрессия протеинов, таких как производные AGIF настоящего изобретения. При использовании в качестве клетки-хозяина E. coli, подходящие промоторы включают триптофановый промотор (trp), лактозный (lac) промотор, триптофан-лактозный (tac) промотор, липопротеиновый (lpp) промотор, происходящий от бактериофага лямбда (



экспрессии протеинов в дрожжевых клетках. Предпочтительно, чтобы такие векторы также включали регуляторные последовательности. Предпочтительно для настоящего изобретения использовать промотор гена спиртовой дегидрогеназы (Bennetzen and Hall, J.Biol. Chem. 257 (1982) 3018-3025) или промотор гена кислой фосфотазы (Miyanohara et al., P.N.A.S. USA 80., (1983) 1-5). В способе настоящего изобретения особенно предпочтительно выражать полипептиды в клетках COS. Вектор, содержащий последовательность ДНК, которая выражается, в таком случае, как правило, содержит SV40 источник репликации (который дает возможность автономной репликации вектора в клетках COS), а также промотор транскрипции, сигнал окончания транскрипции и сайт стыковки (сращивания) РНК. Такие последовательности являются стандартными в технологии и должны быть известны специалистам. Вектор экспрессии может быть введен в клетки-хозяева с использованием технических приемов, которые являются стандартными в технологии. Так, например, вектор экспрессии может быть введен в клетки COS с использованием метода с диэтиламиноэтилдекстраном (DEAE - декстран), как описано в Luthman and Magnusson in Nucleic Acids Res. 11 (1983) 1295-1308, метода соосаждения фосфата кальция и ДНК, описанного в Graham and von der Ed in Virology 52 (1973) 456-457, или метода электропунктуры или электропорации, описанного в Neumann et al., in EMBO J., 1 (1982) 841-845. Подходящие технические приемы введения вектора экспрессии в клетки CHO, так, чтобы трансформированные клетки могли стабильно продуцировать производное AGIF, включает сотрансфекцию вектора, способного выражать неоген, функционирующий как устойчивый маркер G418, такой как pRSVneo (Sambrook et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manval", Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989), или pSV2-neo (Sovthern and Berg, J. Mol. Appl. Cenet., 1 (1982) 327-341), вместе с вектором экспрессии, сопровождаемым селекцией устойчивых колоний G418. В зависимости от выбранной клетки-хозяина выраженное производное AGIF будет оставаться внутри клетки или выделяться из клетки в питательную среду. Выбор среды для выращивания и условия выращивания не являются существенными для настоящего изобретения, но в большей степени зависят от выбранной клетки-хозяина. Подходящие среды хорошо известны в технике и являются очевидными для специалистов. Мы вообще считаем, что в настоящем изобретении желаемый полипептид достаточно выражается в клетках COS, когда среда представляет собой либо среду RPMI-1640, либо среду Дульбекко, модифицированную средой Игла (DMEM), к которой, при необходимости, добавляют компонент сыворотки, такой как эмбриональная коровья сыворотка (FBS). Полипептиды настоящего изобретения могут быть выделены и очищены из клеток или питательной среды с использованием какого-либо одного или сочетания различных известных методик выделения, основываясь, например, на физических и химических свойствах протеина. Специфические примеры таких методов включают обработку обычными осадителями протеина, ультрафильтрацию, различные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC), диализ или сочетания тех или иных методов. Биологическая активность
Настоящее изобретение, кроме того, предлагает также применение вышеописанных производных AGIF в качестве фармацевтических препаратов. Кроме того, настоящее изобретение предлагает новое фармацевтическое применение известного производного AGIF, которое является зрелой формой AGIF, лишенной N-концевой аминокислоты. Соответственно, настоящее изобретение предлагает применение в качестве фармацевтического препарата человеческого полипептида, выбираемого из группы, состоящей из производного фактора, ингибирующего липогенез, лишенного от 1 до 9 N-концевых аминокислот, его функционально эквивалентных производных и их предшественников. Конкретнее, настоящее изобретение предлагает применение в качестве фармацевтического препарата человеческого полипептида, выбираемого из группы, состоящей из полипептидов, содержащих аминокислоты со 2-178 по 10-178 последовательности ID N 2 а (см. в конце текста описания), а также их эквивалентов, мутантов и вариантов их предшественников и производных, как упоминалось выше,
Предпочтительные полипептиды для вышеупомянутого применения имеют одну из приведенных далее последовательностей (см. последовательности ID N 8 и ID N 6 в конце текста описания), а также их эквиваленты, мутанты, варианты, их предшественники и их производные, такие, как описано выше. Производные AGIF настоящего изобретения, и, в частности, те производные, которые упоминаются далее в качестве примеров, проявляют разного вида активность. Эти виды активности, вкратце, следующие:
1) подавление липопротеин-липазной активности адипоцитов,
2) индуцирование производства предадипоцитами колониестимулирующего фактора (CSF). 3) промотирование образования антитела клетками B,
4) промотирование образования колоний мегакариоцитов,
5) промотирование производства тромбоцитов,
6) способность уменьшать Go-фазу гемопоэтических стволовых клеток. Принимая во внимание перечисленные выше виды активности, ожидается, что производные AGIF настоящего изобретения будут иметь большое значение как лечебные средства. В частности, ожидается, что они будут иметь значение для лечения цитопений, таких как тромбоцитопения и лейкопения, для усиления функции иммунной системы, для предупреждения или облегчения состояния при ожирении, препятствующего нормальному функционированию организма, для лечения и диагностики различных анемий, таких как апластическая анемия, и других заболеваний крови, и для лечения и диагностики инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами, бактериями и паразитами. Также ожидается, что применение производных AGIF настоящего изобретения будет допускать экономию при переливании компонентов крови. Использованный здесь термин "цитопения" должен распространяться на уменьшение клеточных элементов в крови или в других тканях, являющееся следствием какого-либо заболевания, такого как тромбоцитопения, упорная панцитопения, лейкопения, вызванная токсинами или радиацией, цитопения, следующая за пересадкой костного мозга или цитопения, следующая за химиотерапией, вызванная канцеростатическими средствами, и т.д., а также являющееся следствием какого-либо иммунного заболевания, которое может случайно иметь место в таких условиях. Использованный здесь термин "активность AGIF" включает какой-либо один или более видов активности, которые обозначены номерами с 1 по 6 в списке, приведенном выше. Активность производных AGIF настоящего изобретения, которые представляют собой эквиваленты зрелого AGIF, но лишенного 1-9 N-концевых аминокислот, иллюстрируется следующими далее примерами. Полипептиды настоящего изобретения получают из соединений, встречающихся в природе в теле, и, как таковые, они имеют низкие уровни токсичности. При введении взрослому самцу мыши линии DDY (при весе тела приблизительно 20 г) и после наблюдений в течение 5 дней, показано, что полипептиды настоящего изобретения не имеют поддающейся оценки токсичности при дозах 500 мг/кг тела и менее. Принимая во внимание их активность, производные AGIF настоящего изобретения, которые представляют собой полипептиды, эквивалентные зрелому AGIF, но лишенные 1-9 N-концевых аминокислот, являются подходящими для применения в качестве терапевтических средств при цитопении и паталогическом ожирении. Производные AGIF настоящего изобретения, которые представляют собой полипептиды, эквивалентные зрелому AGIF, но лишенные 1-9 N-концевых аминокислот, могут применяться либо отдельно, либо в комбинации с другими лекарственными средствами. Когда производные AGIF настоящего изобретения применяются для лечения ожирения, препятствующего нормальному функционированию организма, композиция может содержать только такие производные или их сочетание с другими подходящими лекарствами против ожирения, примеры которых включают препараты, подавляющие аппетит, супрессоры парентеральной абсорбции, ингибиторы пищеварительных ферментов, гормоны, ускоряющие метаболизм, ингибиторы синтеза липидов и супрессоры секреции инсулина. Кроме того, композиция может также использоваться в сочетании с лечением диетой и/или лечебной гимнастикой. В этом случае композиция способна усиливать активность или лечебное воздействие других лекарств против ожирения, а также усиливать лечебное действие лекарств, не относящихся к лечебным препаратам против ожирения. Когда производные AGIF настоящего изобретения используются для лечения цитопений, композиция может быть приготовлена таким образом, чтобы содержать или чтобы использоваться в сочетании с другими подходящими гемопоэтическими факторами, примеры которых включают IL-1 - IL-10, фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), фактор стволовых клеток, GM-GSF, G-CSF, M-CSF, фактор, стимулирующий колонии мегакариоцитов (Meg-CSF), фактор отмирания опухоли (TNE) интерферон (IFN) и эритропротеин (EPO). Комбинированное введение, либо в форме отдельных композиций либо в форме комбинированной композиции дает в результате усиление активности гемопоэтического фактора полипептидом настоящего изобретения. Полипептиды настоящего изобретения могут вводиться любым обычным путем, применяемым для соединений такого типа активности, и лекарственная форма может быть приготовлена в смеси с обычными добавками и адъювантами, применяемыми для этих целей. Например, для орального применения они могут быть изготовлены в виде таблеток, капсул, гранул, порошков или сиропов, в то время, как для парентерального введения они могут формулироваться в виде препаратов для инъекций, внутривенного капельного вливания или в виде суппозиториев. Эти фармацевтические препараты могут быть получены любыми обычными способами с применением таких добавок, как носители, связующие, дезинтеграторы, смазывающие вещества, стабилизаторы и корригенты. Когда фармацевтический препарат приготовлен для введения посредством инъекции или внутривенного капельного вливания, он должен быть в форме фармацевтически приемлемого водного раствора, т.е., в виде раствора, который не содержит никаких пирогенов. Такие растворы могут быть приготовлены обычными путями, с учетом таких факторов, как pH, изотоничность и устойчивость, и все это находится в сфере деятельности специалистов. Дозировка может изменяться в зависимости от, например, возраста, пола, веса тела, диеты, симптомов и тяжести инфекционного заболевания пациента, а также от периода введения и других факторов клинического воздействия. Однако для взрослого человека подходящая дневная доза может составлять от 0,01 до 1000 мг/кг веса тела в день, и она может быть введена как единичная доза (одноразово) или разделена на несколько доз. Для парентерального введения подходящая дневная доза составляет от 0,01 до 100 мг/кг веса тела и вводится путем либо внутримышечной, либо подкожной, либо внутривенной инъекции. Настоящее изобретение далее описывается с помощью примеров, не являющихся ограничивающими, из которых примеры A-D описывают различные методы определения активности полипептидов настоящего изобретения, и примеры 1-4 описывают способы получения полипептидов настоящего изобретения. В следующих далее примерах клетки 3T3-LI, которые получают из эмбриональных фибробластов мышей, являются такими, как описано в Green and Kehinde in Cell, 1 (1974) 113-116, и закуплены в American Cell Type CuIture Collection (АТСС). В случае ссылки в следующих далее примерах на клетки культуры ЗТ3-11, эти клетки являются выращенными при 37oC в увлажненной газовой смеси 10 об.% CO2 и 90 об.% воздуха. Субкультура клеток получена в среде A. Среда A
Среда Дульбекко, модифицированная средой Игла (DMEM), содержащая 4,5 г/л глюкозы (произведена Gibco),
10 об.% иммобилизованной сыворотки коровьего эмбриона (FBS), (произведена Hyclone), и
10 мМ N-2-оксиэтилпиперазин-N"-этансульфокислоты (HEPES), pH 7,2, (произведена Sigma). Дифференциация клеток 3T3-LI в адипоциты индуцируется в соответствии со способом Rubin et al., J. Biol. Chem. 253 (1978) 7570-7578. Пример A
Ингибирование трансформации клеток 3T3-LI в адипоциты
Клетки 3T3-LI выращивают суспендированием клеток в среде A, о которой упоминалось выше, при плотности 1,0

DMEM, содержащая 4,5 г/л глюкозы,
10 мМ HEPES (pH 7,2),
3 об.% иммобилизованной FBS,
5 мкг/мл коровьего инсулина (произведен Sigma),
8 мкг/мл d-биотина (изготовлен Sigma),
4 мкг/мл пантотеновой кислоты (произведена Sigma),
1,0 мкМ дексаметазона (изготовлен Sigma), и
0,5 мМ изобутилметилсантина (изготовлен Aldrich). Образец испытуемого материала добавляют в ячейки одновременно со средой B. В каждую ячейку добавляют небольшое количество образца, причем это количество должно составлять менее одной десятой количества использованной среды B. После добавления среды B и образца продолжают дальнейшее выращивание клеток, заменяя среду B на свежую среду B каждые 2 дня. Также, каждый раз, когда заменяют среду, добавляют свежий образец. Через четыре - семь дней после первого добавления среды B и образца, среду замещают эквивалентным количеством среды C - среды для сохранения адипоцитов. Среда C
DMEM, содержащая 4,5 г/л глюкозы,
5 об.% иммобилизованной FBS,
10 мМ HEPES (pH 7,2), и
100 нг/мл коровьего инсулина. Клетки выращивают в течение 2 дней в среде C и затем их фиксируют 5 об.% формальдегида. Липидные капельки, которые собираются внутри клеток, и клеточное ядро подкрашивают красным нейтральным маслом O и гематоксилином, соответственно, согласно способам, описанным в Mitomo and Takayama ["RINSHOKENSAKOZA" (Clinical Testing Seminar)", vol. 12, "Pathology" (1982), Ishiyaku Publishing]. В частности, при окрашивании красным нейтральным маслом O фиксированные клетки сначала промывают дистиллированной водой, затем промывают 60%-ным раствором изопропилового спирта в воде, после чего клетки окрашивают в течение 10 минут, 0,3% раствором нейтрального красного масла O в 60%-ном изопропиловом спирте. По окончании этого времени клетки снова промывают раствором изопропилового спирта и дистиллированной водой. Берут фотографии окрашенных клеток, полученные на микроскопе, и считают окрашенные клетки. Считают как клетки, содержащие красные жирные зернышки, так и клетки, содержащие окрашенные ядра. Степень липогенной дифференциации рассчитывают, используя следующую формулу:
Степень липогенной дифференциации % = 100

Пример B
Подавление активности липопротеина липазы
Способность образца подавлять активность липопротеина липазы (LPL) может быть измерена с использованием известных методов. В дальнейшем, клетки получают и испытывают, следуя методу, описанному в Beutler et al., in J.Immunal., 135 (1985) 3972-3977. Коротко, это выполняется следующим образом. Дифференцированные адипоциты 3T3-L1 получают, используя способ, описанный выше в примере A. Однако среда B используется одна, т.е. образец не добавляется к дифференцирующим клеткам на этой стадии. После роста в среде B эту среду замещают свежей средой C, имеющей состав, указанный выше в примере A. На этой стадии также добавляют испытуемый образец в количестве, составляющем примерно одну восьмую объема среды, и клетки выращивают в течение 18 часов (см. фиг. 2). По окончании этого времени среду удаляют и клетки дважды промывают буфером PBS (-) /фосфатная буферная соль без Mg2+ и Ca2+, изготовленная Nissui Seiyaku/. Затем в каждую ячейку добавляют 300 мкл среды D. Среда D
DMEM, содержащая 4,5 г/л глюкозы,
5 об.% иммобилизованной FBS,
10 мМ HEPES (pH 7,2),
100 нг/мл коровьего инсулина, и
10 U/мл гепарина натрия (изготовлен Novo Industies). Клетки затем выращивают в течение 1 часа, после чего собирают 100 мкл супернатанта культуры и используют для измерения активности. Измерения выполняют трижды для каждого образца, и окончательный результат получают, определяя среднее из трех измерений. Активность липопротеина липазы измеряют, используя метод Нильсона-Эля (NiIsson-Ehle) и Schotz описанный в J.Lipid Res. 17 (1976) 536-541. Этот способ кратко может быть изложен следующим образом. Смешивают 100 мкл супернатанта культуры, полученного так, как описано выше, с равным объемом раствора субстрата, имеющего следующий состав:
13 мМ глицерол-три /9,10 (n)-3H/ олеиновой кислоты (51,8 KB eq/мкмол, изготовлена Amersham),
1,3 мг/мл L-

20 мг/мл коровьего сывороточного альбумина (изготовлен Sigma),
135 мМ трис-гидрохлорида (трис-HCl, pH 8,1, изготовлен Sigma),
16,5 об.% глицерина, и
16,5 об.% иммобилизованной FBS. Получают 13 мМ глицерол-три (9,10(n)-3H/ олеиновой) кислоты (51,8 KB eq/мкмол), разбавляя глицерол-три /9,10(n)-3H/-олеиновую кислоту 370 GB eq/ммол) (изготовлена Amersham ) триолеином (изготовлен Sigma), с последующей очисткой с использованием колоночной хроматографии на силикагеле. Смеси позволяют реагировать при 37oC в течение 120 минут. По окончании этого времени реакцию останавливают путем добавления 1,05 мл буфера карбонат калия - борная кислота (pH 10,5) и 3,25 мл смеси метанола, хлороформа и гептана с объемным соотношением 141:125:100. После энергичного перемешивания реакционную смесь центрифугируют при 3000

Увеличение количества тромбоцитов
750 мкг AGIF





Контрольная группа: число тромбоцитов = 893 000

Расчеты даются на кубический миллиметр образца как среднее





Пример D
Производное AGIF, полученное так, как описано в примере 2, т.е. производное, в котором отсутствуют 9 N-концевые аминокислоты зрелого протеина, испытывают по способу, описанному выше в примере C. Подобным образом, это соединение показывает способность увеличивать число тромбоцитов. Пример 1
Экспрессия AGIF
(a) Конструирование вектора экспрессии для AGIF
Действуют по способу, описанному в Kawashima et al., FEBS Letters, 283 (1991) 199-202, чтобы получить плазмиду pcD -20-2. В соответствии с этим способом готовят библиотеку кДНК в векторе экспрессии pcD из поли(A)+РНК, выделенной из стромальной клетки линии KM-102. Стромальную клеточную линию KM-102 получают из костного мозга человека. Библиотеку скринируют олигонуклеотидом, селективным для AGIF, и выделяют соответствующие клоны. После испытания этих клонов (например, используя способ испытания, описанный выше в примере A), из клона выделяют плазмиду, которая способна направлять экспрессию протеина, обладающего активностью типа AGIF в клетках COS-1 (широко доступная клеточная линия, получаемая из клеток обезьян), и обозначают ее pcD -20-2. Затем из клона pcD -20-2 экстрагируют кДНК, кодирующую AGIF, используя стандартные технологические приемы. Эту кДНК затем вводят в вектор высокой экспрессии pcDL - SR


Плазмиду, полученную так, как описано на стадии (а), затем трансфектируют в клетки COS-1. Трансфекцию выполняют путем электропорации, используя установку внедрения гена GTE-1, производимую Shimadzu Seisakusho Ltd. Клетки COS-1 готовят для трансфекции путем выращивания клеток в колбе (клетки выращивают в среде Дульбекко, модифицированной средой Игла, содержащей 10% сыворотки коровьего эмбриона, в течение 3 дней при 37oC) до тех пор, пока клетки не достигнут состояния полуслияния. Клетки затем собирают из колбы путем обработки трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислотой (трипсин-ЭДТА), после чего собранные клетки дважды промывают буферной фосфатной солью (-) /PBS (-)/ (изготовлена Nissui Seiyaku). После этого промытые клетки суспендируют в буфере PBS (-) при концентрации 1


Получение полипептида, обладающего активностью AGIF
Добавляют 0,5 мкг трипсина (произведен Sigma) к 500 мкл супернатанта культуры клеток COS-1, содержащих AGIF, полученного в соответствии со стадией (b) примера 1, и образовавшуюся в результате смесь инкубируют при 37oC в течение 20 минут. По окончании этого времени для инактивации трипсина к смеси добавляют 0,5 мкг ингибитора трипсина из фасоли лима (произведен Sigma). Раствор затем анализируют методом вестерн-блот и результаты этого вестерн-блотанализа показаны на фиг. 1. Как показано на фиг. 1, зрелая форма AGIF демонстрирует кажущуюся молекулярную массу порядка 23000 дальтон, как определено электрофорезом в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель (SDS -Page) в условиях восстановления. После обработки этого зрелого AGIF трипсином образуется полипептид, демонстрирующий молекулярную массу порядка 22000 дальтон, что определено электрофорезом в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель в условиях восстановления, диализ индуцированного трипсином переваривания зрелого AGIF с применением денситометра (CS-930, изготовлен Shimadzu Seiakusho Ltd.) показывает, что приблизительно 60% зрелой формы AGIF переваривается трипсином в полипептид, имеющий молекулярную массу порядка 22000 дальтон, что установлено электрофорезом в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель в условиях восстановления. Известно, что трипсин обычно демонстрирует субстратную специфичность, т. е., что он "узнает" некоторые аминокислоты. В частности, трипсин будет разрезать пептидную связь в полипептиде только со стороны карбоксильных групп аминокислот - либо аргинина, либо лизина. Поэтому предполагается, что производное зрелого AGIF с более низкой молекулярной массой будет образовываться в результате гидролиза трипсином связи между остатком аргинина в положении 9 в N-конце зрелого A6LF и аминокислотным остатком в положении 10 N-конца. Чтобы подтвердить это теоретическое предположение, получают вариант зрелого AGIF, в котором остаток аргинина из N-конца в положении 9 замещают другой аминокислотой (но не лизином), например, аспарагином. Этот мутант получают, используя in vitro систему мутагенеза (изготовлена Amersham). После приготовления мутант обрабатывают трипсином в тех же условиях, какие описаны выше. После обработки этим ферментом снижения молекулярной массы полипептида не наблюдается, следовательно, отсутствует и переваривание. Это подтверждает тот факт, что производное AGIF, т.е. полипептид, имеющий молекулярную массу порядка 22000 дальтон, что определено электрофорезом в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель в условиях восстановления, который получен в результате обработки трипсином зрелой формы AGIF, имеет валин в качестве N-концевой аминокислоты, т.е., 10-й аминокислоты в N-конце зрелой формы AGIF. После того как супернатант культуры, полученный трансфекцией клеток COS-1 с pSR

Экспрессия полипептида, обладающего активностью AGIF в Escherichia coli
Этот пример показывает получение и экспрессию производного AGIF, которое соответствует зрелому AGIF за вычетом N-концевой аминокислоты. Вектор M13 mp19 RFI ДНК (изготовлен Toyobo), который представляет собой двухцепочечную ДНК, расщепляют (переваривают) ферментом рестрикции Bam HI, после чего расщепленную ДНК обрабатывают щелочной фосфотазой, чтобы удалить концевые фосфатные группы. Плазмиду pSR




в дистиллированной воде
1% бактотриптона,
0,5% дрожжевого экстракта,
1% NaCI, и
1,5% бактоагара. Из образовавшихся колоний отбирают наугад 12 клонов и отбирают плазмидный клон, обозначенный pMAL -с-20-2




в дистиллированной воде
1% бактотриптона,
0,5% дрожжевого экстракта,
0,5% NaCl, и
0,2% глюкозы. Инокулированную среду затем выращивают в течение ночи при 30oC и при встряхивании. По окончании этого времени 10 мл культуральной жидкости инокулируют в 1 л свежей среды E и выращивают далее при 30oC и встряхивании. Когда оптическая плотность культуральной жидкости при 600 нм достигнет 0,5, добавляют изопропил -

в дистиллированной воде
10 мМ трис(оксиметил)аминометан-HCl (трис-HCl),
0,2 М NaCl,
1 мМ азида натрия,
10 мМ 2-меркаптоэтанола, и
1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), pH 7,4. Образовавшуюся суспензию обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут, чтобы раздробить бактерии, после чего раздробленные бактерии отделяют центрифугированием при 9000






и смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. По окончании этого времени реакционную смесь концентрируют путем осаждения при обработке трихлоруксусной кислотой (TXK), после чего ее подвергают электрофорезу в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель, используя гель, содержащий 12,5% (вес/об), в условиях восстановления. После электрофореза протеиновую полосу переносят с полиакриламидного геля на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану /торговое наименование ImmobiIon, производства Millipore/, используя прибор для гель-мембранного переноса (KS-8441, изготовлен Marisol), в буфере для переноса /0,02% SDS, 20% метанола и 25 мМ трисборной кислоты /pH 9,5/, работая при 0,8 мА/см2, при 4oC в течение 15 часов. После переноса мембрану промывают в течение 5 минут в 10 мМ натрийборатном буфере, содержащем 25 мМ NaCl, и затем в течение 5 минут в чистой воде при постоянном встряхивании. Затем ее высушивают. После этого отрезают часть мембраны, на которую перенесена полоса с молекулярной массой порядка 23000 дальтон, и определяют последовательность от N-конца до 9-го аминокислотного остатка, используя газофазный секвенсер для определения ковалентных формул белков /модель 475A, производства AppIied Biosystems/. Отделяют фенилтиогидантоиновые (PTH) аминокислоты, полученные в каждом реакционном цикле, и идентифицируют посредством высокопроизводительной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (HPLC) /применяемая хроматографическая аппаратура представляет собой аппаратуру модели 120A, изготовленной Applied Biosystems/. Аминокислотная последовательность, определенная таким способом, имеет вид
Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Xaa-Val-
/Xaa изображает неидентифицированный аминокислотный остаток. Последов. ID N 11/. На основании этого результата утверждают, что выделенный протеин представляет собой AGIF




Экспрессия полипептида, обладающего активностью AGIF в клетках COS-1
Следующий далее пример показывает получение и экспрессию производного FGIF, которое соответствует зрелому AGIF за вычетом N-концевой аминокислоты. Следуя процедурам, подобным тем, которые описаны в примере 3, но используя синтетическую олигонуклеотидную последовательность, обозначаемую PRO-DEL 1, имеющую последовательность
5"-GATACAGCTGTCGCCGGGCCCCCACCTGC-3"
/последовательность ID N 16/, и одноцепочечную векторную ДНК M13 mp19 (20-2) /получена так, как описано в примере 3/, получают мутантный фаговый клон, обозначаемый M13 mp19 (20-2)












Полученная так, как описано выше, pSR






колонка: CM-ToyopearI Pack 650M (2,2 х 20 см, производство Tosoh),
буфер для элюирования:
раствор A: 10 мМ борная кислота - NaOH (pH 9,0), 13 мМ KCl,
раствор B: раствор A, содержащий 300 мМ NaCl,
скорость потока 3 мл/мин,
объем фракции 3 мл,
градиент концентрации: линейный градиент концентрации - от 100% раствора A до 100% раствора B /в течение 50 минут/. Фракции, полученные хроматографией и содержащие AGIF



Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro
/последовательность ID N 17/. Эта последовательность идентична последовательности аминокислот 2-7 зрелого AGIF, и посредством этого подтверждают, что выделенный протеин представляет собой зрелый AGIF, лишенный N-концевого остатка пролина. Очищают AGIF



i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 1065 пар азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая; кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК -мДНК
iii/ Гипотетические: нет
iii/ Антисмысловые: нет
ix/ Признак
/A/ Ключевое название (Name/Key): CDS
/B/ Размещение: 18 .. 614
ix/ Признак
/A/ Ключевое название: зрелый/mat/ пептид
/B/ Размещение: 81 .. 614
ix/ Признак
/A/ Ключевое название: sig nenmug
/B/ Размещение: 18.. 80
Описания последовательностей N 1 - 19 приведены в конце описания. /2/ Информация о последовательности ID N 2
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 199 аминокислот
/B/ Тип: аминокислота
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекулы: протеин
/2/ Информация о последовательности N 3
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 534 пары азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК - мРНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
ix/ Признак
/A/ Ключевое название: CDS
/B/ Размещение: 1 .. 534
/2/ Информация о последовательности ID N 4
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 178 аминокислот
/B/ Тип: аминокислота
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: протеин
Информация о последовательности ID N 5
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 531 пара азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК - мРНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
ix/ Признак
/A/ Ключевое название: CDS
/B/ Размещение: 1 .. 531
/2/ Информация о последовательности ID N 6
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 177 аминокислот
/B/ Тип: аминокислота
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: протеин
/2/ Информация о последовательности N 7
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 507 пар азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК - мРНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
ix/ Признак
/A/ Ключевое название: CDS
/B/ Размещение: 1 .. 507
/2/ Информация о последовательности ID N 8
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 169 аминокислот
/B/ Тип: аминокислота
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: протеин
/2/ Информация о последовательности ID N 9
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 33 пары азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: одинарная
/D/ Топология: линейная
ii) Тип молекул: кДНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
ix/ Признак
/A/ Ключевое наименование: CDS
/В/ Размещение: 1 .. 33
/2/ Информация о последовательности ID N 10
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 11 аминокислот
/B/ Тип: аминокислота
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: протеин
/2/ Информация о последовательности ID N 11
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 9 аминокислот
/B/ Тип: аминокислота
/C/ Цепочечность: одинарная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: пептид
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
v/ Тип фрагмента: N-концевой
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
/2/ Информация о последовательности ID N 12
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 33 пары азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекулы кДНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
/2/ Информация о последовательности ID N 13
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 33 пары азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
/2/ Информация о последовательности ID N 14
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 37 пар азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: одинарная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК
iii/ Гипотетические: нет
xi/ Антисмысловые: нет
/2/ Информация о последовательности ID N 15
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 37 пар азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: одинарная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК
iii/ Гипотетические: нет. iv/ Антисмысловые: есть
/2/ Информация о последовательности ID N 16
/A/ Длина: 30 пар азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: одинарная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
/2/ Информация о последовательности ID N 17
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 6 аминокислот
/B/ Тип: аминокислота
/C/ Цепочечность: одинарная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: пептид
/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
v/ Тип фрагмента: N-концевой
/2/ Информация о последовательности ID N 18
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 33 пары азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нет
/2/ Информация о последовательности ID N 19
i/ Характеристики последовательности
/A/ Длина: 30 пар азотистых оснований
/B/ Тип: нуклеиновая кислота
/C/ Цепочечность: двойная
/D/ Топология: линейная
ii/ Тип молекул: кДНК
iii/ Гипотетические: нет
iv/ Антисмысловые: нетC
Класс C07K14/54 интерлейкины (ИЛ)
Класс C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона