фотоотверждаемое производное гликозаминогликана, сшитое производное гликозаминогликана и способы их получения, композиция для медицинского использования, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии

Формула изобретения

1. Фотоотверждаемое производное гликозаминогликана, имеющее молекулярный вес от около 4000 до 2000000, которое представлено одной из следующих формул:

gag-О-(CO-R¹) (1),

gag-О-CO-R³-NH-CO-R¹ (4c),

gag-CO-O-R³-O-CO-R¹ (5c),

gag-CO-O-R³-NH-CO-R¹ (5d),

gag-CO-NH-R³-O-CO-R¹ (5c) или

gag-CO-NH-R³-NH-CO-R¹ (5f)

где gag-O и gag-CO означает гликозаминогликановую часть, а гликозаминогликан выбран из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарина, гепарансульфата, кератосульфата, кератополисульфата, коломиновой кислоты, тейхуроновой кислоты или их производных;

R¹ представляет фотореактивную группу, имеющую по меньшей мере одну двойную С-С связь, способную образовывать циклобутановое кольцо с помощью фотореакции;

R³ означает - (CH₂)_n-, -(CH₂)_pCHY- и (CH₂)_m-C₆H₄(CH₂)_l- где l, m, n и р означают число от 1 до 10 и Y означает СООН или NH₂,

или фотоотверждаемое производное гликоаминогликана представлено следующими формулами:

gag-CO-(O-R¹) (3),

gag-O-CO-R³-CO-O-R¹ (4a),

gag-CO-O-R³-CO-O-R¹ (5a) или

gag-CO-NH-R³-CO-O-R¹ (5g)

где gag-O, gag-CO, R¹ и R³ имеют значения, определенные выше.

2. Фотоотверждаемое производное гликозаминогликана по п.1, в котором -CO-R¹ в формулах (1), (4c), (5c), (5d), (5e) и (5f) означает одну из следующих формул:



где R⁴ и R⁵ независимо означают атом водорода, С₁ - С₆-алкильную группу, С₁ - С₆-алкоксильную группу, нитро- или аминогруппу,



где R⁶ означает атом водорода, атом галогена, С₁ - С₆ алкил- или галоалкильную группу;

R⁷ означает атом водорода, атом галогена, С₁ - С₆-алкил- или галоалкильную группу, цианогруппу, карбоксильную группу или С₁ - С₆-алкоксикарбонильную группу;

R⁸ означает С₂ - С₆ алкиленовую группу, или



где R⁹, R¹⁰ и R¹¹ независимо означают атом водорода или С₁ - С₆-алкильную группу;

R¹² означает С₂ - С₆-алкиленовую группу; и -O-R¹ в формулах (3), (4а), (5а), (5g) означает следующие формулы:



где R¹³, R¹⁴, R¹⁵ имеют значения такие же как у R⁶, R⁷, R⁸ соответственно или



где R¹⁶, R¹⁷ имеют значения такие же как R⁴ и R⁵.

3. Фотоотверждаемое производное гликозаминогликана по п. 1 или 2, представленное формулой (1), в котором гликозамингликановая часть выделена из гиалуроновой кислоты или хондроитинсульфата.

4. Фотоотверждаемое производное гликозаминогликана по п. 1 или 2, представленное формулой (5f), в котором гликозаминогликановая часть выделена из гиалуроновой кислоты или хондроитинсульфата и означает R³ или -(CH₂)_n- или -CH₂)_pCHY,- где n, p и Y определены как в п.1.

5. Фотоотверждаемое производное гликозаминогликана по п.4, в котором частичная структура -NH-R³-NH- является остатком этилендиамина или остатком L-лизина.

6. Композиция, отличающаяся тем, что включает фотоотверждаемое производное гликозаминогликана по п.1 или 2 и растворитель, выбранный из воды, буферного раствора или органического растворителя, приемлемого в медицине.

7. Сшитое производное гликозаминогликана, полученное путем облучения фотоотверждаемого производного гликозаминогликана по п.1 или 2 светом, имеющим длину волны в интервале от около 260 до 400 нм.

8. Сшитое производное гликозаминогликана по п.7, которое включает следующие повторяющиеся структурные звенья димерной структуры



9. Сшитое производное гликозаминогликана по п.7, которое содержит следующие повторяющиеся структурные звенья димерной структуры



10. Сшитое производное гликозаминогликана по пп.7 - 9, которое сформовано и высушено в виде пленки, трубки или гранулы.

11. Композиция, отличающаяся тем, что содержит сшитое производное гликозаминогликана по пп.7 - 9 и стерилизованную воду.

12. Способ получения фотоотверждаемого производного гликозаминогликана по п.1 или 2, отличающийся тем, что проводят взаимодействие по крайней мере одного гликозаминогликана или его соли с кислотным ангидридом формулы (R¹CO)₂O или хлорангидридом кислоты формулы R¹COCl при температуре от 0 до 100^oC в присутствии основного катализатора, где R¹ является фотореактивной группой, способной образовывать циклобутановое кольцо за счет фотореакции, вызывая таким образом межмолекулярную и/или внутримолекулярную сшивку указанной фотореактивной части.

13. Способ получения сшитого производного гликозаминогликана по пп.7 - 10, отличающийся тем, что проводят облучение по крайней мере одного фотоотверждаемого производного гликозаминогликана по пп.1 - 5 светом, имеющим длину волны от около 260 до 400 нм.

14. Способ предотвращения клеточной и/или тканевой адгезии, отличающийся тем, что включает нанесение на рану фотоотверждаемого производного гликозаминогликана по пп. 1 - 5 и облучение его светом, имеющим длину волны от около 260 до 400 нм для образования за счет этого сшитого гликозаминогликана.

15. Способ предотвращения клеточной и/или тканевой адгезии по п.14, отличающийся тем, что включает нанесение на рану сшитого гликозаминогликана по пп.7 - 10.

Приоритет по пунктам:

05.02.92 по пп.1 - 5, 7 - 10;

08.07.92 по пп.6, 12, 13;

21.12.92 по пп.14 и 15.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фотоотверждаемым производным гликозаминогликана, каждое из которых получают химическим связыванием фотореактивного соединения с гликозаминогликаном /здесь и далее иногда именуемым для краткости как "GAG"/, и к сшитым гликозаминогликанам, имеющим трехмерную сетчатую структуру, которую получают, подвергая указанные производные фотореакции для димеризации фотореактивного соединения, к способам их получения, и, далее, к удовлетворительным биосовместимым материалам для медицинского использования, которые их содержат.

Фотоотверждаемые смолы, содержащие гидрофобные полимерные системы, которые могут быть фотодимеризованы для сшивки, до сих пор использовались в литографии, в красках и печати, наряду с другими. Напротив, существует лишь немного известных примеров осуществления фотосшивки гидрофильных полимеров.

С другой стороны, были предприняты попытки сшивать GAGи, которые обычно являются гидрофильными полимерами, с помощью альдегидов, эпоксисоединений, дивинилсульфоновых соединений и т.п. для пролонгирования действия GAG in vivo или для получения материалов для медицинского применения в виде пленок или порошков, например, для предотвращения адгезии тканей. Однако, так как GAGи являются макромолекулами, сшитые производные GAG имеют еще более высокий молекулярный вес, и этот факт затрудняет полное удаление непрореагировавших материалов и/или катализаторов из сшитых производных GAG. Так, при введении или имплантации в живые организмы, указанные производные могут часто оказывать вредное воздействие, и поэтому они не пригодны для практического использования. Кроме того, сшитые производные GAG существуют как гели или твердые вещества, и поэтому их трудно формовать после сшивки, и, следовательно, они не подходят для практических целей. Более того, что касается их использования в качестве носителей в препаратах с замедленным или контролируемым высвобождением /JP-A-62-129226/ соответствующий патент США 5128326/; термин "JP-A" в том смысле, как здесь использован, относится к нерассмотренной опубликованной японской патентной заявке/, замедленного высвобождения активных ингредиентов можно достичь только используя преимущество вязкости сшитых GAG производных, и этот недостаток делает их непригодными для практического использования. Таким образом, такие способы и сшитые GAG производные едва ли могут обеспечить контроль за скоростью высвобождения лекарственных препаратов.

Известно также, что фоточувствительные материалы, полученные при этерификации гидроксильных групп полисахаридов, полученных с помощью микроорганизмов или растений, таких как пуллулан, амилоза и маннан, с циннамоильными группами, которые являются фотодимеризуемыми функциональными группами, применимы как адсорбенты, носителя ферментов или носители для хроматографии или для получения PS пластин или фоторезисторов, или для других применений /JP-B-56-14969/ соответствует патенту США 3960685 /причем термин JP-B означает прошедшую экспертизу опубликованную японскую патентную заявку/ JP-A-60-219202/.

Однако указанные выше фоточувствительные материалы имеют проблемы с точки зрения гарантии безопасности, с трудом могут контролировать клеточную адгезию и обладают плохой биосовместимостью в организме человека, и поэтому не годятся для использования в качестве медицинских материалов для непосредственного использования в живых организмах, в частности, в качестве искусственных органов, медицинских изделий, предназначенных для покрытия ран или в хирургии, носителей фармацевтических препаратов, или других материалов, предназначенных для того или иного способа медицинского лечения.

Соответственно, целью настоящего изобретения является создание фотоотверждаемых гликозаминогликеновых производных и полученных из них сшитых гликозаминогликанов, отличающихся высокой безопасностью и биосовместимостью.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа получения фотоотверждаемых производных гликозаминогликана, легко поддающихся формовке, при желании, например, отливкой в растворителе, причем этим способом можно легко исключить непрореагировавшие вещества, способные вызывать вредные побочные воздействия, и способ получения из них сшитых GAG.

Третьей целью настоящего изобретения является создание материалов для применения в медицине, которые основаны на указанных отверждаемых производных GAG или сшитых GAG и могут широко использоваться для различных целей.

Четвертой целью настоящего изобретения является создание неадгезивных материалов, содержащих сшитый гликозаминогликан, которые не прилипают к тканям, но являются биоразлагаемыми в соответствии со скоростью зарастания ран, и механическая прочность которых может быть легко отрегулирована в соответствии с механическими нагрузками в месте их использования, и неадгезивные материалы, содержащие фотоотверждаемое производное гликозаминогликана, превращаемое в сшитый гликозаминогликан при облучении светом in vivo.

Пятой целью настоящего изобретения является создание материалов или препаратов для осуществления контролируемого высвобождения лекарств, которые содержат сшитый гликозаминогликан, и обеспечивают высвобождение лекарств со скоростью, необходимой для этого включенного лекарства, заключенного или вкрапленного в этот материал, и для целей применения данного лекарства, а также в качестве материалов для осуществления контролируемого высвобождения лекарств, который включает фотоотверждаемый гликозаминогликан, и которые могут быть использованы в качестве носителей в материалах или препаратах, указанных выше, или в качестве исходных для них материалов.

Настоящее изобретение обеспечивает фотоотверждаемые производные гликозаминогликана /здесь и далее иногда называемые для краткости "фотоотверждаемые GAG"/, которые содержат гликозаминогликан и фотореактивное соединение с ним связанное, и сшитый гликозаминогликан /здесь и далее иногда для краткости называемый как "сшитый GAG"/, полученный за счет введения указанного фотоотверждения GAG в реакцию сшивки указанного фотореактивного соединения. Указанный фотоотверждаемый GAG можно, предпочтительно, получить, проводя этерификацию гидроксильных или карбоксильных групп гликозаминогликана фотореакционноспособным соединением, активацией карбоксильных групп гликозаминогликана и подвергая активированные карбоксильные группы реакции амидирования с фотореакционноспособным соединением или подвергая карбоксильные группы гликозаминогликана реакции амидирования с фотореакционноспособным соединением в присутствии конденсирующего агента. Сшитый гликозаминогликан можно получить, облучая фотоотверждаемый GAG светом, вызывая тем самым реакцию сшивки фрагментов фотореакционноспособного соединения друг с другом. Материалы на основе указанных сшитых GAG пригодны для использования в медицине. Фотоотверждаемый GAG, который обеспечивает указанный сшитый GAG, может также служить в качестве материала для использования в медицине.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 представляет ¹H-ЯМР спектр, который используют в примере 1, для количественного определения связанной коричневой кислоты.

Фиг. 2 представляет УФ /видимый спектр, иллюстрирующий уменьшение поглощения на 279 нм за счет экспонирования на свету полученной в примере 1 пленки сшитой гиалуроновой кислоты.

Фиг. 3 графически представляет зависимость контактного угла на степень замещения /DS/ остатков коричной кислоты среди различных пленок сшитой гиалуроновой кислоты.

Фиг. 4 графически изображает зависимость способности набухать от DS остатком коричной кислоты среди различных пленок сшитой гиалуроновой кислоты.

Фиг. 5 представляет собой фотографии клеточной морфологии, которые иллюстрируют различия в адгезии эндотелиальных клеток, как результат различий в DS за счет остатков коричной кислоты среди пленок сшитой гиалуроновой кислоты.

Фиг. 6 графически представляет зависимость степени гелеобразования /%/ при фотоотверждении сложного эфира хондроитинсульфат-коричной кислоты /lot CS-Cin-2/ от его концентрации в его PBS растворе.

Фиг. 7 графически представляет зависимость степени гелеобразования /%/ при гелеобразовании сшитого хондроитинсульфата и способности набухания в зависимости от времени экспонирования свету сложного эфира хондроитинсульфат-коричной кислоты /lot CS-Cin-3/ в PBS.

Фиг. 8 графически представляет зависимость степени желатинирования при гелеобразовании сшитого хондроитинсульфата и способность набухать от DS за счет остатка коричной кислоты.

Фиг. 9 графически представляет зависимость способности набухать от DS пленок сшитого хондроитинсульфата.

Фиг. 10 графически представляет зависимость контактного угла от DS остатка коричной кислоты в пленках сшитого хондроитинсульфата, полученных в примере 8.

Фиг. 11 графически представляет зависимость процента образования тимидинового димера от времени облучения УФ/ультрафиолетом/ в процессе образования пленки сшитой гиалуроновой кислоты при экспонировании НА-Thym-I УФ лучам в примере 14.

Фиг. 12 графически представляет связь между молярным отношением 1-/2-карбоксиэтил/тимин/ HA и DS в синтезе HA-Thym в примере 16.

Фиг. 13 графически представляет связь между молярным отношением 1-/2-карбоксиэтил/тимин/CS и DS в синтезе CS-Thym в примере 17.

Фиг. 14 графически представляет связь между изменением поглощения на 270 нм тимина и временем облучения при экспонировании свету пленок CS-Thym в примере 18.

Фиг. 15 графически представляет связь между степенью желатинирования /%/ и временем облучения при экспонировании свету тонких пленок CS-Thym в примере 18.

Фиг. 16 графически представляет связь между степенью желатинирования /%/ и временем облучения при экспонировании свету другой тонкой пленки CS-Thym в примере 18.

Фиг. 17 графически представляет связь между способностью набухать и временем облучения при экспонировании свету тонкой пленки HA-Thym в примере 18.

Фиг. 18 графически представляет связь между способностью набухать и DS для тонких пленок HA-Thym до и после экспонирования их свету в примере 18.

Фиг. 19 представляет собой ¹H ЯМР спектр сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилокси/уксусной кислоты полученного в примере 20.

Фиг. 20 графически представляет связь между молярным отношением хлорангидридной формы кумарина/хондроитинсульфатных гидроксильных групп /CS - OH/ и DS в образовавшемся сложном эфире.

Фиг. 21 графически изображает связь между изменениями поглощения на 320 нм кумарина и временем облучения при экспонировании свету тонкой пленки сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилокси/уксусной кислоты в примере 21.

Фиг. 22 графически изображает связь между способностью набухать и временем облучения при экспонировании свету тонкой пленки сложного эфира хондроитинсульфат/7-кумарилокси/уксусной кислоты в примере 21.

Фиг. 23 графически представляет связь между способностью к набуханию и DS при экспонировании свету тонких пленок сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилокси/уксусной кислоты примера 21.

Фиг. 24 графически представляет связь между степенью желатинирования /%/ и временем облучения при экспонировании свету тонкой пленки сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилокси/уксусной кислоты в примере 21.

Фиг. 25 графически представляет связь между степенью желатинирования /%/ и концентрацией сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилокси/уксусной кислоты в экспонированных свету тонких пленках, содержащих указанный сложный эфир, в примере 21.

Фиг. 26 графически представляет скорость высвобождения лекарственного препарата из сшитой под действием света пленки HA-Thym /DS = 0,7/ с содержанием лекарственного препарата 10% или 50%, как указано в примере 28, в зависимости от времени, причем указанная скорость выражена в единицах изменения поглощения на 269 нм.

Фиг. 27 графически представляет скорость высвобождения лекарственного препарата из пленки HA-Thym, сшитой под действием света /DS = 2,2/, с содержанием лекарства 10% или 50%, как определено в примере 28, в зависимости от времени, причем указанная скорость выражена в единицах изменения поглощения на 269 нм.

Фиг. 28 графически представляет скорость высвобождения лекарства из пленки фотосшитого CS-Thym /DS = 0,8/ с содержанием лекарства 10% или 50%, как указано в примере 28, в зависимости от времени, причем указанная скорость выражается в единицах изменения поглощения на 269 нм.

Фиг. 29 графически представляет скорость высвобождения лекарства из пленки фотосшитого CS-Thym /DS = 1,3/ при содержании лекарства 10% или 50%, как определено в примере 28, в зависимости от времени, причем указанная скорость выражена в единицах изменения поглощения на 269 нм.

Фиг. 30 графически представляет скорость высвобождения лекарства из пленки фотосшитого CS-Thym /DS = 1,8/ с содержанием лекарства 10% или 50%, как указано в примере 28, в зависимости от времени, причем указанная скорость выражена в единицах изменения поглощения на 269 нм.

Термин "материал для использования в медицине" в рамках настоящего изобретения включает, среди других, материалы для изготовления медицинских приспособлений, используемых для диагностических или терапевтических целей, или для искусственных органов /искусственных кровеносных сосудов, искусственного сердца, искусственной кожи и т.д./, материалы, составляющие покрытия для ран, протезы, неадгезивные материалы или приспособления для контролируемого высвобождения лекарств, и искусственные внеклеточные матрицы или искусственные мембраны, которые можно использовать для адгезии и мультипликации эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток и клеток гладкой мускулатуры при образовании гибридных искусственных органов.

Фотоотверждаемый GAG настоящего изобретения предпочтительно имеет частичную структуру, представленную одной из формул /1/ - /5/, приводимых далее, и при проведении фотореакции дает сшитый GAG. Под каждой из этих формул приводится соответствующий тип реакции, где gag означает частичную структуру любого гликозаминогликана, R¹ является фотореактивной группой /то есть группой, содержащей по крайней мере виниленовую группу/, а R¹-COOH, R¹-NH₂ и R¹-OH каждый являются фотореактивным соединением.

[A] gag-O-(CO-R¹) [1]

gag-OH + R¹-CCOH ---> эфирное связывание ---> [1]

[B] gag-CO-(NH-R¹) [2]

gag-COOH + R¹-NH₂ ---> амидное связывание ---> [2]

[C] gag-CO-(O-R¹) [3]

gag-COOH + R¹-OH ---> эфирное связывание ---> [3]

[D] gag-O-R^2a-R¹ [4]

R^2a является группой, полученной из спейсера, способного реагировать с gag-OH /например, HOOC-R³-COOH, HOOC-R³-NH₂/ и функциональной группой фотореактивного соединения.

[D-1] gag-OH + HOOC-R³-COOH ---> gag-O-CO-R³-COOH

[D-1-c] gag-O-CO-R³-COOH + R¹-OH ---> gag-O-CO-R³-CO-O-R¹ = [4a]

[D-1-b] gag-O-CO-R³-COOH + R¹-NH₂ ---> gag-O-CO-R³-CO-NH-R¹ = [4b]

[D-2] gag-OH + HOOC-R³-NH₂ ---> gag-O-CO-R³-NH₂

[D-2-a] gag-O-CO-R³-NH₂ + R¹-COOH ---> gag-O-CO-R³-NH-CO-R¹ = [4c]

[E] gag-CO-R^2bR¹ [5]

R^2b является группой, полученной из спейсера, способного реагировать с gag-COOH /например, OH-R³-COOH, OH-R³-OH, HO-R³-NH₂, H₂N-R³-NH₂, H₂N-R³-COOH/ и функциональной группой фотореактивного соединения.

[E-0]

[E-0-a] N₂N-R³-NH₂ + R¹-COOH ---> H₂N-R¹-NH-CO-R¹

gag-COOH ^oC H₂N-R³-NH-CO-R¹ [F-1] ---> gag-CO-NH-R³-NH-CO-R¹ = [5-1]

[E-0-b] RNH-R³-NH₂ + R¹-COOH ---> RNH-R³-NH-CO-R¹ [F-2]

RNH-R³-NH-CO-R¹ [F-2] ^oC H₂N-R³-NH-CO-R¹

gag-COOH ^oC H₂N-R³-NH-CO-R¹ [F-1] или

[F-2]

---> gag-CO-NH-R³-NH-CO-R¹ = [5-1]

[F-2] gag-COOH ^oC HO-R³-COOH ---> gag-CO-O-R³-COOH

[E-1-a] gag-CO-O-R³-COOH ^oC R¹-OH ---> gag-CO-O-R³-CO-O-R¹ = [5a]

[E-1-6] gag-CO-O-R³-COOH ^oC R¹-NH₂ ---> gag-CO-O-R³-CO-NH-R¹ = [5c]

[E-2] gag-COOH ^oC HO-R³-OH ---> gag-CO-O-R³-OH

[E-2-a] gag-CO-O-R³-OH ^oC R¹-COOH = gag-CO-O-R³-O-CO-R¹ = [5c]

[E-3] gag-COOH ^oC HO-R³-NH₂ ---> gag-CO-O-R³-NH₂

[E-3-a] gag-CO-O-R³-NH₂ ^oC R¹-COOH ---> gag-CO-O-R³-NH-CO-R¹ = [5d]

[E-4] gag-COOH + H₂N-R³-OH ---> gag-CO-NH-R³-OH

[E-4-a] gag-CO-NH-R³-OH + R¹-COOH ---> gag-CO-NH-R³-O-CO-R¹ = [5e]

[E-5] gag-COOH + H₂N-R³-NH₂ ---> gag-CO-NH-R³-NH₂

[E-5-a] gag-CO-NH-R³-NH₃ + R¹-COOH ---> gag-CO-NH-R¹-NH-CO-R¹ = [5f]

[E-6] gag-COOH + H₂N-R¹-COOH ---> gag-CO-NH-R³-COOH

[E-6-a] gag-CO-NH-R³-COOH + R¹-OH ---> gag-CO-NH-R³-CO-O-R¹ = [5g]

[E-6-b] gag-CO-NH-R³-COOH + R¹-NH₂ ---> gag-CO-NH-R³-CO-NH-R¹ = [5h]

R³ имеет предпочтительно одно из следующих значений:

R^3a: -/CH₂/_n - /n = 1-10/;

R^3b: -/CH₂/_pGHY - /Y является COOH или NH₂; а p = 1-10/;

R^3c: -/CH₂/_m - C₆H₄ - /CH₂/_l - /m = 1-10, l = 1-10/.

R³ имеет предпочтительно одно из следующих значений:

R^3a: -/CH₂/_n - /n = 1-10/;

R^3b: -/CH₂/_pGHY - /Y является COOH или NH₂, а p = 1 - 10/;

R^3c: /CH₂/_m-C₆H₄-/CH₂/_n - /m = 1-10, l = 1-10/.

Хотя в вышеприведенных примерах был использован только один спейсер, можно использовать множество спейсеров.

Вышеуказанные фотореактивные соединения /F - 1/ или /F - 2/ можно использовать вместо R¹ - NH₂ при получении продукта формул /4b/, /5b/ или /5h/.

В принципе, R¹, который является фотореактивной группой, может быть любой группой, при условии, что он способен по крайней мере димеризоваться внутримолекулярно и/или межмолекулярно при экспонировании свету при образовании циклобутанового кольца.

В каждой из вышеуказанных формул -COOH может принимать форму реакционноспособного производного /например, галида, ангидрида карбоновой кислоты, активного сложного эфира/, способного реагировать с гидроксильной или аминогруппой.

В качестве частично предпочтительных примеров R¹-CO-, которые имеют место в формулах /1/, /4c/, /5c/ - /5f/ и т.д., можно указать группы следующих формул:



где R⁴ и R⁵ могут быть одинаковы или различны, и каждый является атомом водорода, или низшим алкилом, или низшей алкилокси, или нитрогруппой, или аминогруппой;



где R⁶ является водородом, или атомом галоида, или низшим алкилом, или галоид-низшийалкил-группой, R⁷ является водородом, или атомом галоида, или циано, карбоксилом, низшим алкоксикарбонилом, низшим алкилом или группой галоид-низший алкил, а R⁸ является низшей алкиленовой группой;



где R⁹, R¹⁰ и R¹¹ могут быть одинаковы или различны, и каждый независимо является атомом водорода или группой низшего алкила, а R¹² является группой низшего алкилена.

Группы указанных выше формул /6/ - /8/ являются наиболее предпочтительными при R^1a-CO- /причем R^1a является фотореактивной группой/ в R^1a-CO-NH-R³-NH в соответствии с формулой /2/, и как R¹-CO- в формуле /5-l/, и R^3a или R^3b предпочтительны в качестве R³. Если R³ является R^3b, в качестве Y предпочтительно COOH.

В качестве предпочтительных примеров R¹-O-, встречающихся в формулах /3/, /4a/, /5a/, /5g/ и так далее, можно указать остатки следующих формул:



где R¹³ является водородом, или атомом галоида, или низшим алкилом, или группой галоид-низший алкил, R¹⁴ является водородом, или атомом галоида, или циано, карбоксилом, низшим алкоксикарбонилом, низшим алкилом или группой галоид-низшего алкила, а R¹⁵ является группой низшего алкилена;



где R¹⁶ и R¹⁷ могут быть одинаковы или различны, и каждый является атомом водорода, или низшим алкилом, или низшей алкокси-, или нитро-, или аминогруппой.

Группы, представленные формулами выше, например, можно также использовать в качестве элементов, составляющих R¹:



Фотоотверждаемый GAG по способу настоящего изобретения способен к межмолекулярной димерилизации при экспонировании свету, в результате чего фотореактивные группы /то есть группы, содержащие по крайней мере винильную группу/, содержащиеся в молекулах фотореактивного соединения, образуют парами циклобутановые кольца в соответствии с приведенным далее уравнением, давая соответствующие сшитые GAG составляющие двух- или трехмерную сетчатую структуру с нужной степенью сшивки. В процесс фотоотверждения может быть также включена внутримолекулярная димеризации



Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением биосовместимые фотосшитые GAG с нужной степенью сшивки, и, следовательно, с нужными физическими свойствами /например, свойство механического удержания структуры, свойство удерживать воду, гидрофильность, смазывающие свойства, скорость высвобождения лекарств/ и с нужными биологическими свойствами /например, клеточная адгезия, способность к биоразложению - абсорбации, физиологическая активность/, которые соответствуют их целевому использованию, можно получить за счет выбора или регулирования фотореактивного соединения и GAG /например, химическую структуру, молекулярный вес и т.д./ и содержания фотореактивного соединения /степень замещения /DS/ фотореактивным соединением/, наряду с другими.

Термин "степень замещения /DS/", как здесь используется, определяется как число молей фотореактивного соединения или групп, связанных с каждым повторяющимся дисахаридным фрагментом /каждый фрагмент содержит уроновую кислоту и гексозамин/ GAG. Так, например, гиалуроновая кислота содержит четыре гидроксильные группы /замещаемые гидроксильные группы/ на каждый дисахаридный фрагмент, что при модификации фотореактивным соединением или группой по всем гидроксильным группам дает DS = 4, тогда как три гидроксильные группы на дисахаридный фрагмент хондроитинсульфата, после его модификации фотореактивным соединением или группой, дают DS = 3.

Термин "гликозаминогликан" или "GAG" в том смысле, как здесь использован, включает коломиновую кислоту, гиалуроновую кислоту /HA/, хондроитин, хондроитинсульфат /CS/, теихуроновую кислоту, дерматансульфат, гепарин, гепаринсульфат, кератосульфат, кератансульфат, кератополисульфат, хитин, хитозан и их производные /ацилпроизводные, полисульфаты, продукты десульфатации, продукты деацилирования и т. д. /. Термин "низший" означает, что рассматриваемая углеродная цепь может быть разветвленной или неразветвленной, и состоит из 1 - 6 атомов углерода. Термин "атом галоида" включает хлор, бром, фтор и иод, а термин "галоид" используют для указания на то, что один или более из атомов водорода был замещен такими атомами галоидов.

В сочетаниях формулы /6/ с формулами /1/, /4c/, /5-1/, /5c/, /5f/ и т.д. R¹CO- является, например, остатком, полученным из замещенной или незамещенной коричной кислоты или его реакционноспособного производного. В качестве замещенного остатка коричной кислоты можно упомянуть остатки, которые содержат один или два низших алкила, низшую алкокси-, нитро- или аминогруппу в любом положении бензольного кольца. Однако R¹CO-, полученный из коричной кислоты, является наиболее предпочтительным.

В сочетаниях формулы /7/ с формулами /1/, /4c/, /5-1/, /5c/ - /5f/ и т. д. R¹CO- является, например, остатком, полученным из урацильного производного, содержащего карбоксиалкильную группу в качестве заместителя в положении 1 или его реакционноспособного производного, с водородом, или атомом галоида, или низшим алкилом, или группой галоид-низшего алкила, представленного R⁶, в положении 5 пиримидинового кольца, водородом, или атомом галоида, или циано, карбоксил, низшего алкоксикарбонила, низшего алкила или группы галоид-низший алкил, представленным R⁷ в положении 6, и низшей алкиленовой группой R⁸, полученной из карбоксиалкильной группы, и образующий сложноэфирную связь с гидроксильной группой oao в положении 1. В частности, предпочтительным является R¹CO-, полученный из 1-/2-карбоксиэтил/тимина.

В сочетаниях формулы /8/ с формулами /1/, /4c/, /5-1/, /5c/ - /5f/ и т. д. R¹CO- является, например, остатком, полученным из 7-карбоксиалкоксил-замещенного производного кумарина или его реакционноспособного производного, причем в положениях 5, 6 и 8 кумаринового кольца каждый независимо имеет атом водорода или низшую алкильную группу, представленную R⁹, R¹⁰ и R¹¹ соответственно, с низшей алкиленовой группы, и образующим сложноэфирную связь с гидроксильной группой oao в положении 7. Наиболее предпочтительной R¹CO-группой является группа, полученная из 7-кумарилоксиуксусной кислоты.

В сочетаниях формулы /10/ с формулами /3/, /4a/, /5a/, /5g/ и т.д. R¹O- является остатком, полученным из 1-гидроксиалкил-замещенного урацильного производного или его реакционноспособного производного, с водородом, или атомом галоида, или низшим алкилом, или группой галоид-низший алкил, представленной R¹³ в положении 5 пиримидинового кольца, водородом, или атомом галоида, или циано, карбоксилом, низшим алкоксикарбонилом, низшим алкилом или группой галоид-низшего алкила, представленных R¹⁴, в положении 6, и низшей алкиленовой группой R¹⁵, полученной из гидроксиалкильной группы, и образующим сложноэфирную связь, с карбоксильной группой oao в положении 1.

В сочетаниях формулы /11/ с формулами /3/, /4a/, /5a/, /5g/ и т.д. R¹O- является, например, остатком, полученным из замещенного или незамещенного коричного спирта или его реакционноспособного производного. Остатком замещенного коричного спирта является, например, один или два низших алкила, низших алкокси-, нитро- или аминогрупп в любом положении бензольного кольца.

Исходные соединения

GAG

GAG не ограничены ни происхождением, ни молекулярным весом. GAG выбирают в соответствии с предполагаемым применением и используют либо отдельно, либо в форме смесей двух или более из них. Хотя GAG природного происхождения, полученные как экстракты органов животных, продукты ферментации и т.д., обычно используют GAG химически или ферментативно синтезированные, или GAG синтезированные полусинтетическими способами могут также быть использованы продукты, полученные из них за счет модификации функциональных групп.

GAG можно повергнуть взаимодействию с фотореактивным соединением как оно есть, но обычно его используют в виде соли щелочного металла, такого как натрий, калий и т.д., щелочноземельного металла, такого как магний, кальций и т.д., третичного амина, такого как три-н-бутиламин, триэтиламин, пиридин и т.д. и т.п.

Если фотореактивное соединение, подлежащее связыванию с GAG, не растворимо в воде, это фотореактивное соединение вводят в органический растворитель, содержащий GAG для проведения реакции.

Органический растворитель, содержащий GAG, получают, например, обрабатывая водный раствор натриевой соли GAG катионнобменником до получения карбоксильного радикала или сульфатного радикала, добавляя к этому смешиваемый с водой органический растворитель /например, диметилформамид /ДМФ/, диметилсульфоксид /ДМСО/, гексаметилфосфорамид /ГМФА/, пиридин или т.п./ и третичный амин /например, три-н-бутиламин/ до получения соли амина GAG и удаляя воду перегонкой.

Если фотореактивное соединение является растворимым в воде, реакцию можно вести, добавляя фотореактивное соединение к водному раствору GAG /например, в виде натриевой соли/.

Фотореактивные соединения

Фотореактивные соединения, из которых образуют связи с такими группами, как -OH, -COOH или -NH₂GAG или спейсера, связанного или способного связываться с GAG, как было указано ранее, имеют такие группы, как -OH, -COOH или -NH₂.

/1/ Если -COOH является функциональной группой:

Фотореактивные соединения связаны с GAG или со спейсерными группами при образовании сложного эфира в соответствии с формулами /1/, /4c/, /5-1/, /5c/, /5d/, /5e/ и /5f/ и включают соединения с химическими структурами, в которых OH или галоид, например, связан с группами формул /6/ - /8/, а именно замещенной или незамещенной коричными кислотами, 1-карбоксиалкилзамещенными урацилами и 7-карбоксиалкилзамещенными кумаринами /7-кумарилоксикарбоновыми кислотами/ и их реакционноспособными производными. В качестве реакционноспособных производных можно указать галоидангидриды /например, хлорангидрид и т.д./ и ангидриды кислот.

Галоидангидриды вышеуказанных 7-кумарилоксикарбоновых кислот можно получить, конденсируя соответствующий, необязательно замещенный, 7-гидроксикумарин со сложным эфиром галоидкарбоновой кислоты в присутствии щелочи и гидролизуя полученный сложный эфир 7-кумарилоксикарбоновой кислоты до получения 7-кумарилоксикарбоновой кислоты или конденсируя соответствующий необязательно замещенный 7-гидроксикумарин с галоидкарбоновой кислотой до получения 7-кумарилкарбоновой кислоты и затем осуществляя взаимодействие полученной таким образом 7-кумарилоксикарбоновой кислоты соответствующей формуле /8/, которая может необязательно иметь заместитель или заместители, с тионилгалидом /см., например, JP-A-3-48674/.

/2/ Если -NH₂ является функциональной группой:

Фотореактивные соединения формулы /G/, приведенные ниже, можно получить при взаимодействии вышеуказанных замещенных или незамещенных коричных кислот, 1-карбоксиалкилзамещенных урацилов или 7-карбоксиалкоксил-замещенных кумаринов /7-кумарилоксикарбоновых кислот/, или их реакционноспособных производных с соединением формулы /Х-1/, или соединением /Х-2/, полученным из него путем защиты одной из аминогрупп такой аминозащитной группой, как трет.-бутоксикарбонил или бензилоксикарбонил, с последующим удалением защиты при необходимости.

H₂N-R³-NH₂ /x-1/

RNH-R³-NH₂ /x-2/

H₂N-R³-NH-CO-R¹ /F-1/

RNH-R³-NH-CO-R" /F-2/

/3/ Если -OH является функциональной группой:

Реакционноспособные производные, соответствующие формуле /9/, можно использовать в качестве фотореактивных соединений. Так, например, соединения циклических эфиров между положениями 1 и 2 пиримидинового кольца могут быть использованы. Специфическими примерами являются 1,2-O-этаноурацил, 1,2-O-этанотимин, 1,2-O-этано-5-хлорурацил, 1,2-O-этано-5-трихлорметилурацил, 1,2-O-этано-6-цианоурацил, 1,2-O-этано-6-хлорметилурацил и 1,2-O-этано-6-трихлорметилурацил.

Можно также указать замещенные или незамещенные коричные спирты, соответствующие формуле /10/.

/4/ Предпочтительные фотореактивные соединения

Хотя подлежащие использованию фотореактивные соединения следует выбирать среди указанных выше в соответствии с предполагаемым применением, предпочтительными с медицинской точки зрения являются фотореактивные соединения, полученные из соединений, оказывающих наименее возможный вредный эффект, даже если в сшитых GAG остаются в непрореагировавшей форме, например, коричная кислота, тимин и кумарин.

В практике настоящего изобретения фотоотверждаемые GAG могут содержать одно или более из фотореактивных соединений, связанных с одной и той же GAG молекулой, или с множеством различных GAG молекул. Это применимо к вышеприведенным формулам /1/ - /3/. Поэтому следует отметить, что сшитые GAG настоящего изобретения включают, в рамках их значений, продукты, полученные при фотосшивке таких фотоотверждаемых GAG.

Реакции введения фотореактивных групп

/1/ Реакция этерификации с gag-OH

Соответствующую соль третичного амина /например, соль три-н-бутиламина, соль триэтиламина, соль пиридина и т.д./ GAG растворяют в соответствующем растворителе /например, ДМФ, пиридине, ДМСО, ГМФА и т.д./ и гидроксильные группы GAG подвергают реакции этерификации замещенной или незамещенной коричной кислотой с частичной структурой формулы /6/ в количестве от 0,5 до 5 моль на моль гидроксильных групп GAG или ее реакционноспособным производным, например галоидангидридом, в присутствии основного катализатора /например, безводного пиридина, и т.д./ или с R¹COOH с частичной структурой формулы /7/ или /8/, или их реакционноспособным производным в присутствии основного катализатора /например, 2-хлор-1-метилпиридиний иодида, пиридина и т.д./ при температуре от 0 до 100^oC, предпочтительно от 70 до 90^oC в течение от нескольких десятков минут до нескольких десятков часов и предпочтительно от 1 до 10 часов, до получения фотоотверждаемого GAG настоящего изобретения.

Степень замещения /DS/ в каждом фотоотверждаемом GAG можно регулировать при желании, изменяя условия реакции. Так, например, значение DS можно повысить, увеличивая молярное отношение R¹COOH или его реакционноспособного производного относительно исходного GAG и/или увеличивая время реакции.

После реакции к реакционной смеси добавляют этанол, насыщенный ацетатом натрия, этанол или метанол и полученный осадок собирают фильтрованием, промывают этанолом или метанолом, а затем сушат при пониженном давлении, в результате чего получают целевой продукт в виде белого порошка.

Реакцию получения соединения формул /5c/ или /5e/ можно вести практически таким же способом, как указано выше.

Некоторые конкретные примеры получаемых таким образом фотоотверждаемых GAG, в которых каждый дисахаридный фрагмент замещен одной молекулой фотореактивного соединения, представлены далее структурными формулами фрагментов. Структурные различия, составляющих целое фрагментов, например, фрагментов, отличающихся числом связанных с ними фотореактивных групп, и/или положений, по которым идет связывание, могут встречаться в одной и той же молекуле.

1/ Фотоотверждаемый GAG /HA-Cin/, полученный при введении коричной кислоты в гиалуроновую кислоту



2/ Фотоотверждаемый GAG /HA-Thym/, полученный при введении 1-/2-карбоксиэтил/тимина в гиалуроновую кислоту



3/ Фотоотверждаемый GAG, полученный при введении 7-кумарилоксиуксусной кислоты в хондроитинсульфат



/2/ Амидирование с помощью gag-COOH /в частности, когда фотореактивное соединение связано со спейсерной группой/; например, формула /5-1/

/2-1/: Если R³ = R^3a

Если соединение формулы /X-1/ или /X-2/ является алкилендиамином /например, этилендиамином/, соответствующую соль третичного амина /например, соль три-н-бутиламина, соль триэтиламина, соль пиридина и т.д./ GAG растворяют в соответствующем растворителе /например, ДМФ, пиридине, ДМСО, ГМФА и т. д. /, как указано в способе /1/, затем добавляют гидроксисоединение /например, N-гидроксисукцинимид, N-гидроксифталимид и т.д./ в количестве, слегка превышающем число молей по отношению к числу карбоксильных групп в GAG, и конденсирующий агент /например, дициклогексилкарбодиимид, 1-этил-3-/диметиламинопропил/карбодиимид и т.д./, и реакцию ведут при температуре от 0 до 50^oC в течение от 1 до 20 час до получения модифицированного GAG активированного по его карбоксильным группам. Затем осуществляют реакцию амидирования при температуре от 0 до 50^oC в течение от 30 мин до 20 часов между модифицированным таким образом GAG и аминогруппой соединения формулы /F-1/ или /F-2/ до получения фотоотверждаемого GAG.

Фотоотверждаемые GAG можно также получить, используя водный раствор GAG и осуществляя реакцию амидирования между соединением формулы /F-1/ или /F-2/ и карбоксильными группами GAG при температуре от 0 до 50^oC в течение от 1 до 20 часов в присутствии конденсирующего агента /например, такого растворимого в воде карбодиимида, как 1-этил-3-/диметиламинопропил/карбодиимид/.

/2-2/: Если R³ = R^3b /Y = COOH/:

Если соединение формулы /X-1/ или /X-2/ является, например, основной аминокислотой /например, L-лизином/, GAG используют в форме водного раствора и проводят реакцию амидирования между аминогруппами соединения формулы /F-1/ или /F-2/ и карбоксильными группами GAG при температуре от 0 до 50^oC в присутствии конденсирующего агента /например, такого растворимого в воде карбодиимида, как 1-этил-3-/диметиламинопропил/карбодиимид/ до получения фотоотверждаемого GAG.

Фотоотверждаемые GAG можно также получить при осуществлении реакции между GAG в виде соли соответствующего третичного амина и гидроксильного соединения, такого как N-гидроксицинимид, в таком подходящем растворителе, как ДМФ в присутствии такого конденсирующего агента, как дициклогексилкарбодиимид, как в способе /2-1/, и, подвергая полученный GAG активированный по его карбоксильным группам, реакции амидирования с помощью аминогрупп соединения формулы /F-1/ или /F-2/.

Реакции, описанные в формулах /2/, /4b/, /5b/ или /5h/, можно провести практически таким же способом, как было указано ранее.

/3/ Этерификация с помощью gag-COOH

Аналогично указанному ранее способу /1/, соответствующую соль третичного амина /например, соль три-н-бутиламина,

соль триэтиламина, соль пиридина и т.д./ GAG растворяют в подходящем растворителе /например, ДМФ, пиридине, ДМСО, ГМФА и т.д./ и проводят реакцию этерификации между реакционноспособным производным урацильного производного формулы /9/, например, циклическим эфиром, или замещенным, или незамещенным коричным спиртом формулы /10/, или его реакционноспособным производным и карбоксильными группами GAG при температуре от 0 до 100^oC в присутствии основного катализатора /например, безводного пиридина и т.д./.

Реакцию, соответствующую формулам /4a/, /5a/ или /5g/, можно вести практически таким же способом, что указано ранее.

Выделение и очистка фотоотверждаемых GAG

После вышеуказанных реакций образующиеся фотоотверждаемые GAG можно выделить и очистить любыми способами, обычно используемыми для выделения и очистки GAG, без каких-либо ограничений.

Так, например, фотоотверждаемые GAG, а именно целевые продукты, можно выделить из непрореагировавших GAG или непрореагировавших фотореактивных соединений, и можно очистить такими способами, как хроматография, используя анионный или катионный ионообменник, способом, в котором используют различие в растворимости в органических растворителях /например, способом осаждения спиртом/, высаливанием или диализом.

Хотя такие сшитые гликозаминогликаны, которые, как известно специалистам, существуют в виде гелей или твердых веществ, и поэтому непрореагировавшие материалы, катализаторы, примесные микроорганизмы, пирогены и другие примеси извлекаются из них с большим трудом, фотоотверждаемые GAG настоящего изобретения растворимы в воде и/или в органических растворителях и поэтому их легко очистить. Так как такие очищенные фотоотверждаемые GAG при экспонировании их свету могут претерпеть внутримолекулярную или межмолекулярную димеризацию фотореактивных групп, легко можно получить сшитые GAG минимально загрязненные непрореагировавшими материалами, катализаторами, загрязняющими микроорганизмами, пирогенами и т.д.

Физические свойства фотоотверждаемых GAG

Физические свойства фотоотверждаемых GAG, полученных и очищенных в соответствии с вышеописанным, могут варьироваться в зависимости от GAG, используемого в качестве исходного материала, его молекулярного веса, используемого фотореактивного соединения, его количества и других факторов, и их можно регулировать при желании, с тем, чтобы они были пригодны для предполагаемых целей. Обычно они имеют молекулярный вес в интервале от 4000 до 2000000, предпочтительно от 10000 до 1000000, а степень замещения /DS/ фотореактивными группами находится в интервале значений от 0,1 до 4,0, предпочтительно от 0,1 до 3,0, и они растворимы в воде и/или органических растворителях. При желании растворимость можно регулировать. Обычно повышение DS приводит к снижению растворимости в воде, но к повышению растворимости в таких органических растворителях, как ДМФ. Если фотореактивной группой является производное коричной кислоты формулы /6/, 7-кумарилоксикарбоновой кислоты формулы /8/ или производное коричного спирта формулы /11/, полученные фотоотверждаемые GAG являются относительно гидрофобными. Напротив, если в качестве фотореактивной группы выступает производное урацила /в частности, производное тимина /формулы /7/ или /10/, получаемый фотоотверждаемый GAG является относительно гидрофильным.

Интервал предпочтительных значений DS может меняться в зависимости от предполагаемого использования фотоотверждаемого GAG или сшитого GAG, и использованных GAG, и фотореактивных соединений. Для получения сшитых GAG не прилипающих к клеткам и использования их в качестве материалов не адгезивных к тканям, например, величина DS должна предпочтительно составлять от около 0,1 до 0,5 в случае сложных эфиров гиалуриновой кислоты-коричной кислоты /HA-Cin/, от около 0,1 до 3,0 в случае сложных эфиров хондроитинсульфат-коричной кислоты /CS-Cin/, от около 0,2 до 1,0 в случае сложных эфиров гиалуриновой кислоты - производных тимина и от около 0,2 до около 1,0 в случае сложного эфира хиндроитинсульфат-производного тимина /CS-Thym/. Для включения биологического вещества, лекарства или тому подобного в трехмерную сетчатую структуру сшитых GAG и достижения за счет этого контролируемого их высвобождения предпочтительны значения DS от 1,0 до 2,5 для каждого из сшитых GAG, указанных ранее.

Более конкретно, если фотоотверждаемый GAG является производным гиалуриновой кислоты формулы /1/, молекулярный вес предпочтительно находится в интервале значений от 100000 до 1000000, а степень замещения DS фотореактивными группами предпочтительно в интервале значений от 0,1 до 3,0. Если фотоотверждаемый GAG является фотоотверждаемым производным хондроитинсульфата формулы /1/, молекулярный вес предпочтительно находится в интервале значений от 10000 до 60000, а DS в интервале от 0,1 до 0,3.

В качестве медицинских материалов фотоотверждаемые GAG и сшитые GAG можно использовать в любом виде. Так, они могут использоваться в различных формах, например, в виде растворов, гелей, твердых продуктов и т.д. Медицинские материалы настоящего изобретения, которые основаны на указанных фотоотверждаемых GAG или сшитых GAG, могут содержать различные растворители /например, воду, буфер, PBS, ДМФ, ДМСО и т.д./, носители /например, марлю, вязаные или тканые полотна, нетканые полотна, ватные или хлопкоподобные материалы, нити или пряжу, пленки, пористые губки, смолы, пластики, металлы, искусственные органы, поверхности тканей живых организмов, включая раны живых тел/, биологические вещества /коллаген, желатин, гепарин, хондроитинсульфат, гиалуроновую кислоту, дерматансульфат и т.д./, лекарственные вещества и так далее.

Формование фотоотверждаемых GAG /отливка с помощью растворителя/ и т.д.

Для использования в качестве медицинских материалов фотоотверждаемые GAG можно отливать в конкретные формы /например, в виде пленок, трубок, гранул/ или наносить на, покрывать ими, прикреплять их или включать их в другие вещества или материалы, как было указано ранее. В этих случаях фотоотверждаемые GAG можно отливать до проведения фотореакции, растворяя их в воде /предпочтительно очищенной воде/, буферном растворе /например, в фосфатном буфере, карбонатном буфере/ или в органическом растворителе /например, ДМФ, ДМСО/ степени чистоты приемлемой для медицины, помещая или распределяя раствор на поверхности плоской пластины в контейнер или тому подобное, изготовленные из стекла, кварца, поливинилхлорида, полистирола, полиуретана или тому подобного/, высушивая его при воздушном обдуве или как либо еще до получения толщины пленки от 1 мкм до 1 мм.

Получение сшитых GAG /фотореакция/

Фотосшитые GAG можно получить, экспонируя фотоотверждаемый GAG, отформованный вышеуказанным способом, или в форме растворов, активирующим лучам или радиации для фотосшивки для того, чтобы вызвать реакцию фотодимеризации. Используемая длина волны или интервал длин волн могут меняться в зависимости от природы фотореактивных групп, но обычно лежит в интервале от около 260 до 400 нм. Более конкретно, можно использовать свет от ртутной лампы высокого давления /450 Вт/ для экспонирования /облучения/, при этом отсекают свет с более короткими длинами волн /260 - 270 нм/. Хотя необходимое время экспонирования /реакции/ зависит от таких факторов, как интервал длин волн, температура и расстояние от источника света, предпочтительны такие условия, при которых реакцию можно провести до завершения за 30 минут. Степень желатинирования /отверждения/ можно регулировать, задавая концентрацию фотоотверждаемого GAG при заданном времени фотореакции. Обычно указанная концентрация составляет от 1 до 30% и предпочтительно от около 2 до 20%.

Конкретные примеры димерных структур, образующихся в результате фотореакции фотоотверждаемых GAG, следующие:

1/ Если фотореактивным соединением является коричная кислота



2/ Если фотореактивным соединением является 1-/2-карбоксиэтил-тимин



3/ Если фотореактивным соединением является 7-кумарилоксиуксусная кислота



Физические свойства сшитых GAG

Физические характеристики полученных таким образом сшитых GAG настоящего изобретения можно регулировать такими факторами, как природа GAG, природа фотореактивных групп соединения, концентрация фотоотверждаемого GAG, степень замещения /DS/ фотореактивным соединением, степень сшивки и время фотореакции. Однако обычно они демонстрируют способность к набуханию /определяемую как вес в набухшем состоянии минус вес в сухом состоянии и деленное на вес в сухом состоянии/ в определенных пределах /0,1 до 200/ и поэтому могут включать и удерживать воду в количестве в определенном интервале.

Способность к набуханию снижается при повышении степени сшивки и DS за счет фотореактивных групп соединения.

Они также демонстрируют угол контакта с водой в определенном интервале /от 10 до 100^o/. Угол контакта отражает гидрофобность /гидрофильность поверхности сшитого GAG/. Увеличение скорости сшивки за счет димеризации фотореактивной группы приводит к возрастанию угла контакта, то есть к возрастанию уровня гидрофобности.

Степень сшивки, которая представляет собой процент, с которым вышеуказанная фотореактивная группа претерпевает димеризацию, можно повысить, увеличивая DS. Ее можно далее регулировать за счет контроля за указанной фотореакцией.

Поэтому биологические функции сшитых GAG можно регулировать, изменяя степень сшивки. Так, например, такие клетки, как эндотелиальные клетки, имеют тенденцию слипаться со сшитыми GAG, демонстрирующими высокую степень сшивки, хотя эта тенденция может отличаться в зависимости от природы GAG и фотореактивного соединения. Такая тенденция заметна для гиалуроновой кислоты, которая не содержит сульфатных групп /см. фото, указанные в разделе примеров/, хотя эта тенденция меньше для сульфатсодержащих GAG /например, хондроитинсульфата/. Учитывая это, имеется возможность усиливать или подавлять клеточную адгезию, используя комбинацию двух или более GAG. Далее, это свойство можно использовать для дифференциации, по функциям, интимы /самое внутреннее покрытие/ и адвентиции искусственных кровеносных сосудов, за счет покрытия интимы и адвентиции различными сшитыми GAG, отличающимися по тенденции к клеточной адгезии, что осуществляют за счет выбора GAG и фотореактивных групп и регулирования DS и/или степени сшивки. Так, например, интиме можно придать свойство не слипаться с клетками, предотвращая тем самым тромбоз, тогда как адвентиции можно придать свойство прилипания к клеткам, обеспечивая тем самым возможность фибробластам прилипать к ней и делать ее непроницаемой для крови.

Применение в качестве медицинских материалов

Фотоотверждаемые GAG и сшитые GAG настоящего изобретения можно использовать как медицинские материалы, включая не только материалы для изготовления интимы и адвентиции искусственных кровеносных сосудов, как было описано ранее, но также и материалы для создания искусственных кож, пленок или материалов неадгезивных к тканям материалов, ускоряющих заживление ран, гибридных искусственных органов, искусственных внеклеточных матриц и искусственных основ для мембран. Кроме того, оказывается возможным включение лекарств за счет перемешивания раствора фотоотверждаемого GAG с физиологически активным веществом /например, гепарином, дерматансульфатом, гепаринсульфатом, противораковым агентом, противовоспалительным агентом, цитокином, гормоном, фактором роста/ или таким ферментом, как активатор плазминогена ткани, супероксиддисмутазой, урокиназой, или тому подобным ферментом и осуществляя фотореакцию сшивки раствора как он есть, или формы, полученной из него. Так, фотоотверждаемые GAG и сшитые GAG можно также использовать в качестве носителей для обеспечения контролируемого высвобождения заключенного в них лекарственного препарата.

Некоторые типичные применения более конкретно рассмотрены далее.

Неадгезивные материалы

Сшитые GAG настоящего изобретения можно использовать в качестве неадгезивных материалов для предотвращения нежелательной адгезии хирургических ран и ускорения заживления. Так, например, пленки сшитого GAG можно использовать путем покрытия абдоминальной стенки внутрибрюшинного органа или органов /например, печени и т.д./ этой пленкой, за счет чего защищают язвы /дефекты/ в перитонеуме и тем самым предотвращают адгезию, и ускоряют заживление ран. Указанная пленка может разлагаться и абсорбироваться по мере заживления раны.

Фотоотверждаемые GAG в форме растворов можно использовать для тех же целей, что и указанные ранее, путем инъекции растворов внутрь ран или нанесения их на раневую поверхность, а затем облучения их светом, вызывая тем самым образование сшитых пленок или мембран in vivo. В частности, такую методику можно использовать для предотвращения адгезии и/или заполнения дефектов при эндоскопических операциях.

Для их использования в качестве неадгезивных материалов сшитые GAG /включая GAG сшитые in vivo/ должны обладать соответствующим уровнем прочности для того, чтобы можно было избежать растрескивания пленки, и устойчивостью к тканевой /клеточной/ адгезии и биоразлагаемостью в соответствии со скоростью заживления ран; продукты биоразложения должны быть практически нетоксичными, даже если они могут абсорбироваться живыми организмами.

Эти функции можно контролировать, выбирая фотоотверждаемые GAG /выбор образцов GAG и фотореактивных соединений, и DS/ и условия облучения /например, расстояние от источника света, тип источника света, интенсивность, толщину пленки и так далее/.

Регулируемое высвобождение лекарств

Сшитые GAG настоящего изобретения можно использовать в качестве материалов /носителей или наполнителей/ для включения лекарств в трехмерную сетчатую структуру для достижения регулируемого высвобождения лекарств. Так, включенные или заключенные лекарственные препараты можно высвобождать за период, соответствующий природе лекарственного препарата и способа применения, поддерживая при этом концентрацию лекарства в определенном интервале, необходимом в окружении, в котором лекарства эти высвобождаются.

Скорость регулируемого высвобождения лекарств можно регулировать, выбирая фотоотверждаемый GAG /выбор образца GAG и фотореактивных групп, а также DS/ и условия облучения /например, время экспонирования, расстояние от источника света, мощность источника света и т.д./. В этом случае, хотя скорость высвобождения обычно снижается при возрастании молекулярного веса лекарства и сил электростатического притяжения между лекарством и сшитым GAG, указанную скорость можно регулировать до нужного уровня, выбирая вышеуказанный фотоотверждаемый GAG в сочетании с лекарством и учитывая их относительные химические структуры /с точки зрения молекулярного веса, электрических зарядов/ степени гидрофильности или гидрофобности /и т.д./.

В этом аспекте настоящего изобретения лекарства иммобилизуют в мягких условиях с тем, чтобы они стабилизировались в таком состоянии, когда предотвращаются разложение и потери активности по сравнению с известными ранее способами.

Материалы, обеспечивающие контролируемое высвобождение лекарств, или препараты, содержащие сшитый GAG и заключенное в него лекарство, можно изготовить в любой нужной форме, в соответствии с природой лекарства и типом его применения. Так, например, их можно изготовить в виде пленок /пленок или покрытий/, желе, гелей, кремов, суспензий, микрокапсул, таблеток, гранул, порошков и т. д. Можно также приготовить фотоотверждаемые GAG, готовые для применения путем погружения подложки /например, марли, бинтов, вязаного или тканого полотна, бумаги, хлопка, нетканого материала, пленки, пористой губки/ в композицию, содержащую фотоотверждаемый GAG и лекарство, или нанесения указанной композиции на такую подложку, с последующим облучением для превращения в сшитый GAG. Более того, композицию, содержащую фотоотверждаемый GAG и лекарство, можно нанести на поверхность или внутрь таких структур, как искусственный орган /например, искусственный кровеносный сосуд, искусственное сердце/, а затем отвердить /сшиванием/.

Для включения лекарства в сшитый GAG настоящего изобретения лекарство растворяют или суспендируют в водном растворе или органическом растворителе /например, ДМФ/, содержащем от около 1 до 30 вес.%, например, соответствующего фотоотверждаемого GAG до концентрации лекарства от около 0,001 до 80%, и, после добавления различных добавок при необходимости, полученную композицию формуют, сушат, а затем облучают светом. После сшивки формы можно использовать как они есть, или измельчить при необходимости до получения материалов с регулируемым выделением лекарств в виде твердых, полутвердых веществ или суспензий.

Материалы с регулируемым высвобождением лекарств настоящего изобретения можно использовать в качестве фармацевтических препаратов. В этом случае сшитые GAG, содержащие лекарства, можно изготовить либо как они есть, либо вместе с обычными фармацевтически приемлемыми добавками, такими как консерванты, стабилизаторы, местные анестезирующие агенты, диспергирующие агенты, модификаторы формовки, растворяющие агенты, и так далее, в нужной дозированной форме. Так, например, после доведения их среднего размера частиц от около 0,5 до 40 мкм содержащие лекарства сшитые GAG можно использовать для получения водных суспензий, вместе с диспергирующими агентами /например, Tweeh 80, НС060/ Ниппон Кемикалз/, карбоксиметилцеллюлозой, альгинатом натрия и т.д./, консервантами /например, метилпарабеном, пропилпарабеном, бензиловым спиртом, хлорбутанолом и т.д./ изотоническими агентами /например, хлоридом натрия, глицерином, сорбитолом, глюкозой и т.д./ и другими добавками, при необходимости, или получения маслянистых суспензий за счет диспергирования их в таких растительных маслах, как оливковое масло, кунжутное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кукурузное масло, или в пропиленгликоле, или тому подобных. Содержащие лекарства сшитые GAG можно также использовать либо как они есть, либо в смеси с эксципиентами /например, крахмалом, карбонатом кальция и т.д./, связующими агентами /например, крахмалом, гуммиарабиком, карбоксиметилцеллюлозой, поливинилпирролидоном, гидроксипропилцеллюлозой и т.д./, смазывающими агентами /например, тальком, стеаратом магния, полиэтиленгликолем 6000 и т.д./ и/или тому подобными для получения таблеток формованием под давлением или для получения порошков, гранул и т.д. Если в капсулы заполняют порошки, гранулы или тому подобное, получают содержащие лекарства капсулы. Более того, содержащие лекарства GAG можно формовать как они есть, в пленки, или иммобилизовывать на каких-либо других подложках, создавая тем самым препараты для накожного поглощения, офтальмологические препараты /например, ускоряющие заживление ран на роговице/, препараты для внедрения в живые тела, или препараты, которые подлежат введению в полости тела /например, суппозитории/. Их можно использовать в качестве повязок на раны, пластырей выделяющих лекарства /например, адгезивных повязок/ и среди других, контрацептивных приспособлений.

Лекарства, которые следует использовать при получении таких фармацевтических препаратов, которые содержат содержащие лекарства сшитые GAG, не ограничены какими-либо конкретными образцами, но могут быть лекарствами, которые необходимо вводить часто для достижения эффективной концентрации в крови или эффективной локальной концентрации, при условии, что они могут быть достаточно удержаны в сетчатой структуре сшитых GAG и могут высвобождаться регулируемым образом. Нижеследующие могут быть указаны в конкретных примерах:

1. Антипиритические анальгетические противовоспалительные агенты, такие как индометацин, мефанаминовая кислота, ацеметацин, альклофенак, ибупрофен, тиарамидгидрохлорид, фенбуфен, мепиризол, салициловая кислота и т.д./.

2. Такие агенты против злокачественных опухолей, как метотрексат, флуороурацил, винкристинсульфат, митомицин C, актиномицин C, даунорубицингидрохлорид и т.д.

3. Противоязвенные агенты, такие как ацеглутамидалюминия, L-глутамин, пара-/транс-4-аминометилциклогексанкарбонил/ фенилпропионовой кислоты гидрохлорид, цетраксатгидрохлорид, сульпирид, гефарнат, циметидин и т.д.

4. Такие препараты ферментов, как химотрипсин, стрептокиназа, лизоцимхлорид, бромелайн, урокината активатор тканевого плазминогена и т.д.

5. Такие антигипертензивные агенты, как клонидингидрохлорид, бунитрололгидрохлорид, празосингидрохлорид, каптоприл, бетанидинсульфат, метопрололтартрат, метилдопа и т.д.

6. Агенты для мочеполовых органов, такие как флавоксатгидрохлорид и т.д.

7. Такие антикоагулянты, как гепарин, гепарансульфат, тромбомодулин, дикумарол, варфарин и т.д.

8. Такие антиартериосклеротические агенты, как клофибрат, симфибрат, эластаза, никомол и т.д.

9. Агенты для циркуляторных органов, такие как никардипингидрохлорид, нимодипингидрохлорид, цитохром C, токоферолникотинат и т.д.

10. Такие стероиды, как гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон, бетаметазон и т.д.

11. Такие промоторы заживления ран, как фактор роста, коллаген и т.д. /см. JP-A-60-222425/.

Кроме того, можно также указать физиологически активные полипептиды, гормоны, противотуберкулезные, антидиабетические агенты, вазодиляторные агенты, антиаритмические агенты, сердечные, антиаллергические агенты, антидепрессанты, антиэпилептические агенты, релаксанты кускулов, антибиотики и тому подобные.

Материалы с контролируемым высвобождением лекарств настоящего изобретения могут быть использованы в качестве медицинских материалов для изготовления составляющих /например, поверхностей/ таких структур, как искусственные органы/ например, искусственные кровеносные сосуды, искусственное сердце и т.д./. В этом случае они особенно полезны в качестве медицинских материалов, составляющих поверхности, которые находятся в контакте с кровью, где антикоагулянт /например, гепарин, гепарансульфат, тромбомодулин/, активатор фибринолиза /например, тканевый плазминогенный активатор, урокиназа/ и/или антитромбоцитное вещество можно включить в сшитый GAG для достижения контролируемого высвобождения этих веществ и придания указанным поверхностям антитромботических свойств.

Искусственные внеклеточные матрицы и мембраны на искусственных основах

Фотоотверждаемые GAG настоящего изобретения либо в смеси с такими протеинами с адгезивными клетками, как коллаген, желатин и фибронектин, или после химического связывания их с протеинами можно превратить в сшитые GAG, которые можно использовать в качестве искусственных внеклеточных матриц или мембран на искусственном основании для обеспечения адгезии и роста клеток /эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, клеток гладкой мускулатуры и т. д. / /см. JP-A-1-124465, 61-128974 и 62-270162/. Их можно использовать в гибридного типа искусственных органах /искусственных кровеносных сосудах, искусственной коже и т.д./.

Нижеследующие примеры далее иллюстрируют настоящее изобретение, но ни коим образом не ограничивают его объем.

Во всех примерах некоторые типичные физические свойства и биологические функции определяют или оценивают указанными далее способами, с применением аппаратуры указанной далее.

¹H ЯМР спектры снимали на JOEL JNM-GX270 FTNMR спектрометре, а УФ/видимые спектры на спектрометре JASCO-Ubest-30 UV/Vis.

Степень замещения /DS/ для каждого фотореактивного соединения рассчитывают на основании данных ¹H ЯМР или УФ/. Ее также определяют, сравнивая данные по поглощению УФ для низкомолекулярных модельных соединений /продукты разложения GAG/ с данными для связанных с ними фотореактивными соединений.

Способность к набуханию для каждого сшитого производного GAG определяют следующим образом.

Способность к набуханию определяют следующим образом: Вес /в набухшем состоянии/ - Вес /сухой/ /Вес/сухой, где Вес /сухой/ представляет собой вес высушенной пленки сшитого GAG, полученной фотооблучением, и

Вес /в набухшем состоянии/ представляет собой вес пленки спустя 24 часа после погружения ее в очищенную воду.

Что касается угла контакта, то контактные углы натекания и оттекания определяют методом жидкой капли, используя гониометр угла контакта /статический измеритель угла Kyowa CA-D, Kyowa Kaimen Kagaku K.K./. Если термин "контактный угол" используют как он есть, он обычно означает "контактный угол натекания".

Эксперименты по адгезии эндотелиальных клеток осуществляют следующим образом. Каждый фотоотверждаемый GAG приготавливают в виде пленки, отливкой из растворителя, и эти пленки иммобилизуют на дне ячейки с клеточной тканью, изготовленной из полистирола /ТСПS/. Ячейки засевают эндотелиальными клетками, полученными из аорты быка в стерильных условиях. Используют культуральную среду Dulbecco, модифицированную средой Игла /ДМЕМ/, дополненную 10 - 15% сывороткой плода теленка /FCS/. Имеет ли место адгезия или нет, оценивают по наблюдению через фазовый контрастный микроскоп спустя 24 часа инкубирования при 37^oC. Для оценки клеточного роста используют скорость роста спустя 1 - 2 дня.

Пример 1. Получение сложного эфира гиалуровоной кислоты - коричной кислоты и получение сшитой гиалуроновой кислоты за счет фотореакции.

/1/ Получение сложного эфира гиалуроновой кислоты - коричной кислоты

30 мл безводного пиридина добавляют к раствору три-н-бутиламиновой соли гиалуроновой кислоты /молекулярный вес 880000/ в диметилформамиде /ДМФ/ 150 мг /35 мл/, с последующим добавлением 26,64 мг хлорангидрида коричной кислоты при интенсивном перемешивании при комнатной температуре. Этерификации дают возможность протекать при 75^oC в течение 2 часов, затем к реакционной смеси добавляют этанол, насыщенный ацетатом натрия, и полученный осадок собирают и тщательно промывают этанолом для удаления непрореагировавшего хлорангидрида коричной кислоты до получения сложного эфира коричной кислоты - гиалуроновой кислоты.

Лот: HA-Cin-3

Выход: 95,6 мг

Связанная коричная кислота: 11,0 вес.% /по данным ¹H ЯМР/

¹H спектр вышеуказанного продукта представлен на фиг. 1. Характеристическое поглощение на следующих мд:

6 - 8 мд: относится к протонам бензольного кольца коричной кислоты и двойной связи коричной кислоты.

2 мд: относится к метильным протонам N-ацетильной группы гиалуроновой кислоты.

Рассчитывают отношение числа этих протонов и используют для определения количества связанной коричной кислоты и DS указанного ранее.

/2/. Получение отвержденной сшитой пленки гиалуроновой кислоты

Раствор 30 мг лота HA-Cin-3 в ДМФ помещают на стеклянные пластинки /24 мм х 24 мм/ и сушат стерильным воздухом, нагретым до 40^oC. Полученные пленки экспонируют облучению ртутной лампы высокого давления 450 Вт, через пирексный фильтр заполненный водой, который используют для того, чтобы отрезать длины волн ниже 270 нм. Таким образом получают отвержденную /то есть сшитую/ пленку гиалуроновой кислоты.

Пик поглощения на 279 нм снижается при облучении /фиг. 2/.

Облучение продолжают до тех пор, пока процент ослабления не становится постоянным /время облучения 30 минут/.

Лот: HA-Cin-3-2

Пример 2. Сложные эфиры гиалуроновой кислоты-коричной кислоты получают, используя те же материалы и способы, которые используют в примере 1, за исключением того, что количественное отношение между гиалуроновой кислотой и коричной кислотой меняют, как указано далее в табл. 1 /количество гиалуроновой кислоты при этом всегда составляет 150 мг/. Далее отвержденные сшитые пленки гиалуроновой кислоты получают по способу примера 1.

Пример 3. Контактные углы пленок отвержденной гиалуроновой кислоты

Каждую из отвержденных гиалуроновых пленок гиалуроновой кислоты, полученных в примерах 1 и 2, определяют, измеряя контактные углы натекания и оттекания. Полученные результаты приведены на фиг. 3. Оба контактных угла заметно возрастают по мере того, как повышается DS за счет остатка коричной кислоты.

Возрастание контактного угла отражает увеличение гидрофобности поверхности пленки.

Пример 4. Способность к набуханию оценивают на отвержденных пленках гиалуроновой кислоты

Каждую из отвержденных гиалуроновых пленок, полученных в примерах 1 и 2, оценивают по способности к набуханию, после того, как им дают возможность набухать в очищенной воде в течение 20 часов. Полученные результаты приведены на фиг. 4.

Как видно на фиг. 4, способность к набуханию снижается по мере возрастания DS остатком коричной кислоты.

Снижение способности к набуханию отражает возрастание гидрофобности пленки в целом.

Пример 5. Адгезия эндотелиальных клеток к отвержденным пленкам гиалуроновой кислоты

Адгезию или присоединение эндотелиальных клеток к отвержденным пленкам гиалуроновой кислоты, полученным в примерах 1 и 2 /лоты: HA-Cin-3-2 /DS = 0,5/, 4 - 2 /DS = 0,87/, 5 - 2 /DS = 1,28/ и 6 - 2 /DS = 2,43// оценивают спустя 24 часа инкубирования. Полученные результаты представлены на фиг. 5 /фото/. Как видно из фиг. 5, адгезия эндотелиальных клеток имеет тенденцию возрастать по мере возрастания DS за счет остатков коричной кислоты.

Пленки HA-Cin-3-2 с DS = 0,5 демонстрируют достаточный эффект предотвращения клеточной адгезии, и было обнаружено, что они обладают всеми основными характеристиками, необходимыми для материалов, неадгезивных к тканям.

Полученные данные имеют также значение как фундаментальные данные, на которые можно ссылаться при изготовлении искусственных внеклеточных матриц или мембран на искусственных основаниях, используя сшитые GAG настоящего изобретения в сочетании с прилипающими к клеткам таким белками как коллаген, желатин и фиброноктин, и давая возможность эндотелиальным клеткам, эпителиальным клеткам, клеткам гладкой мускулатуры или тому подобным клеткам прилипать к и расти на указанных матрицах или мембранах, обеспечивая получение искусственных органов гибридного типа /искусственных кровеносных сосудов, искусственной кожи и т.д./.

Пример 6. Получение сложного эфира хондроитинсульфат-коричной кислоты и получение сшитого хондроитинсульфата в результате его фотореакции

/1/. Получение сложного эфира хондроитинсульфата-коричной кислоты

30 мл обезвоженного пиридина добавляют к раствору три-н-бутиламиновой соли хондроитинсульфата /мол.вес = 60000/ в ДМФ /247 мг/15 мл/. К этой смеси добавляют при интенсивном перемешивании при комнатной температуре 19,78 мг хлорангидрида коричной кислоты. Реакцию ведут при 75^oC в течение 2 часов. К реакционной смеси добавляют этанол, насыщенный ацетатом натрия, и образовавшийся осадок собирают, тщательно промывают этанолом и сушат при пониженном давлении.

Лот: CS-Cin-1

Выход: 152 мг

Связанная коричная кислота 7,52 вес.% DS = 0,33

/2/. Получение сшитой пленки хондроитинсульфата

Продукт CS-Cin-1, полученный на стадии /1/ ранее, растворяют в фосфатном буфере до концентрации 15%, а затем получают гель, облучением, используя ту же ртутную лампу, что и в примере 1.

Лот: CS-Cin-1-2

Пример 7. Сложные эфиры хондроитинсульфата-коричной кислоты получают, используя те же материалы и процедуры, что и в примере 6, за исключением того, что количественное отношение хондроитинсульфата и коричной кислоты изменяют в соответствии с данными табл.2 /при этом количество хондроитинсульфата остается всегда 247 мг/, и сшитые хондроинтинсульфатные пленки получают тем же способом, что и в примере 1.

Лот CS-Cin /DS= 0,51/ растворяют в фосфатном буферном солевом растворе /PBS/ в различных концентрациях и полученные растворы облучают светом в течение 30 минут, а затем определяют степень желатинирования. Результаты представлены на фиг. 6, степень желатинирования возрастает при увеличении концентрации. Степень желатинирования /%/ рассчитывают следующим образом:

Процент желатинирования /%/ = 100 x /A-X/ / /A-B/,

где A = поглощение /OD_275нм/ до облучения,

B = поглощение /OD_275нм/ измеренное после достаточного облучения, при котором поглощение достигает постоянного уровня, и

X = поглощение /OD_275нм/ спустя 30 минут облучения.

15% раствор лота CS-Cin-3 /DS=0,65/ в PBS облучают светом и за состоянием геля следят как функции времени. Таким образом, после каждого периода экспонирования образующийся гель погружают в деионизированную воду на 24 часа для деионизации и взвешивают после удаления влаги с поверхности геля. Затем этот гель сушат и рассчитывают способность к набуханию. Определяют также степень желатинирования. Полученные результаты представлены на фиг. 7.

Степень желатинирования возрастает, а способность к набуханию снижается при удлинении периода экспонирования.

Лоты CS-Cin-1 до 5 также оценивают по их поведению относительно их поведения в PBS и полученные гели по их способности к набуханию. Таким образом обнаружилась связь между степенью желатинирования или способностью к набуханию и DS остатком коричной кислоты /молярное отношение относительно хондроитинсульфата составляющего дисахаридный фрагмент представлено на фиг. 8.

Возрастание DS за счет остатков коричной кислоты приводит к возрастанию степени желатинирования, при быстром снижении способности к набуханию.

Пример 8. Оценка способности к набуханию отвержденных хондроитинсульфатных пленок

Сложные эфиры хондроитинсульфата-коричной кислоты, полученные в примерах 6 и 7, формуют в фотоотверждаемые пленки, которые затем облучают светом в течение 30 минут для сшивки до получения отвержденных хондроитинсульфатных пленок.

Эти отвержденные хондроитинсульфатные пленки оценивают на предмет способности к набуханию. Полученные результаты приведены на фиг. 9.

Полученные результаты указывают на то, что в отличие от отвержденных пленок гиалуроновой кислоты отвержденные пленки кондроитинсульфата не демонстрируют столь быстрого снижения в способности к набуханию, как было обнаружено для отверженных пленок гиалуроновой кислоты, даже, когда возрастает DS за счет остатков коричной кислоты. Предположительно это связано с тем фактом, что отвержденные пленки хондроитинсульфата содержат сульфатные группы, и их гидрофильность выше, нежели гидрофильность пленок гиалуроновой кислоты.

Пример 9. Контактные углы отвержденных пленок хондроитинсульфата, полученных в примере 8, измеряют и откладывают по отношению к DS остатка коричной кислоты. Полученные результаты представлены на фиг. 10. График на фиг. 10 показывает, что сшитый хондроитинсульфат дает меньшие контактные углы по сравнению со сшитыми гиалуроновыми кислотами. Предположительно это связано с различием в гидрофильности.

Пример 10. Адгезия эндотелиальных клеток к отвержденным пленкам хондроитинсульфата

Адгезию эндотелиальных клеток к отвержденным пленкам, полученным в примере 8, определяют таким же образом, как в примере 5. В отличие от отвержденных пленок гиалуроновой кислоты, никакой адгезии не наблюдалось безотносительно к DS остатка коричной кислоты.

Пример 11. Связывание производного коричной кислоты с карбоксильными группами гиалуроновой кислоты и сшивка

/1/. Получение амида циннамоилэтилендиамина

Хлорангидрид коричной кислоты /1,666 г/ растворяют в 100 мл хлороформа и прикапывают к полученному раствору 6 г этилендиамина при 0^oC. Спустя 20 часов перемешивания при 40^oC реакционную смесь промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия, а затем тщательно промывают водой. Слой органического растворителя концентрируют при пониженном давлении, а остаток перекристаллизовывают из этанола до получения целевого продукта /1,58 г, здесь и далее именуемого как соединение A/.

/2/. Получение NL-циннамоил-L-лизина

NL-трет. -бутоксикарбонил-L-лизин /2,58 г/ растворяют в 50 мл диметилформамида и к полученному раствору добавляют 30 мл безводного пиридина. К этой смеси добавляют раствор хлорангидрида коричной кислоты в хлороформе /1,665 г/ 20 мл/ и реакцию ведут при 40^oC. Реакционную смесь концентрируют досуха при пониженном давлении, остаток растворяют в 3,6 н HCl /диоксане/33 мл/ и спустя 4 часа выстаивания полученный раствор концентрируют при пониженном давлении до получения целевого соединения /2,43 г здесь и далее именуемого как соединение B/.

/3/. Связывание амида циннамоилэтилендиамина с гиалуроновой кислотой

В 30 мл воды растворяют 150 мг натриевой соли гиалуроновой кислоты /мол. вес = 1200000/, а затем добавляют 42,75 мг соединения A и 71,9 мг 1-этил-3-/3-диметиламинопропил/карбодиимид гидрохлорида. Реакцию ведут при комнатной температуре в течение 20 часов. К реакционной смеси добавляют 1М водный бикарбонат натрия и, после выстаивания при комнатной температуре в течение 1 часа, добавляют этанол насыщенный ацетатом натрия. Полученный белый осадок собирают и тщательно промывают этанолом.

Лот: HA-CinA-1

Выход: 176,2 мг

Связанное соединение A: 16,58 вес.% DS=0,5

/4/. Связывание NL-циннамоил-L-лизина с гиалуроновой кислотой

К раствору три-н-бутиламиновой соли гиалуроновой кислоты /мол. вес = 880000/ в диметилформамиде /150 мг/35 мл/ добавляют 1,224 г N-гидроксисукцинимида и 55 мг дициклогексилкарбодиимида и реакцию ведут вначале при 0^oC в течение 1 часа, а затем при комнатной температуре в течение 10 часов, для активации карбоксильной группы гиалуроновой кислоты. К реакционной смеси добавляют эфир и полученный осадок собирают, промывают эфиром и сушат при пониженном давлении, до получения соответствующего сложного активированного эфира гиалуроновой кислоты.

Эту активированную гиалуроновую кислоту растворяют в диметилформамиде. К этому раствору добавляют раствор соединения B в диметилформамиде /44 мг/50 мл/ и реакцию ведут при комнатной температуре в течение 20 часов. К реакционной смеси добавляют насыщенный ацетатом натрия этанол, и полученный осадок отфильтровывают и очищают, промывая этанолом.

Лот: HA-CinB-1

Выход: 122,1 мг

Связанное соединение B: 25,92 вес.%

Молярное отношение /DS/ относительно гиалуроновой кислоты, составляющей дисахаридный фрагмент: 0,5

/5/. Получение отвержденных пленок гиалуроновой кислоты

Каждый из лотов HA-CinA-1 и HA-CinB-1 /по 30 мг/ формуют в виде пленок таким же способом, что и в примере 1, и сшивают, облучая светом.

Полученные таким образом отвержденные пленки гиалуроновой кислоты /лоты HA-CinA-1-2 и HA-CinB-1-2 соответственно/ демонстрируют способность к набуханию 1,2 и 1,4 г H₂O/г геля соответственно.

Пример 12. Получение сложного эфира гиалуроновой кислоты-/1-/2-карбоксиэтил/тимина/ /1/

К раствору гиалуроновой кислоты /мол. вес 1000000/ /здесь и далее именуемой как HA100/ в диметилформамиде /ДМФ/ /175 мг/50 мл/, содержащем 0,317 г 2-хлор-1-метилпиридиний-иодида, добавляют 0,245 г 1-/2-карбоксиэтил/тимина и 0,461 г триэтиламина и реакцию ведут при 90^oC в течение 4 часов. ДМФ удаляют при пониженном давлении, а избыточное количество этанола добавляют, полученный осадок собирают, промывают этанол и сушат при пониженном давлении. Полученный белый осадок представляет собой сложный эфир гиалуроновой кислоты-/1-/2-карбоксиэтил/тимина/.

Лот: HA-Thym-1

Выход: 160,0 мг

Связанный тимин: 9,1 вес.% DS = 0,46

/Значение DS определяют с расчете на отношение между числом метильных протонов тимина и числом ацетильных протонов гиалуроновой кислоты по данным ¹H ЯМР/

Пример 13. Получение сложного эфира гиалуроновой кислоты- /1-/2-карбоксиэтил/тимина/ /2/

Несколько лотов сложного эфира гиалуроновой кислоты- /1-/2-карбоксиэтилтимина/ получают таким же образом, что и в примере 12, за исключением того, что используют условия, приведенные в табл. 3.

Пример 14. Получение сшитой гиалуроновой кислоты за счет фотореакции сложного эфира гиалуроновой кислоты-/1-/2-карбоксиэтил/тимин/ /1/

Приготавливают пленку из лота HA-Thym-1 /DS = 0,46/ по способу примера 1 и облучают ультрафиолетовым светом /УФ/ от ксеноновой лампы. Ход образования димера тимина, как функция времени экспонирования, представлен на фиг. 11.

Пример 15. Получение отвержденных пленок гиалуроновой кислоты за счет фотореакции фотоотверждения сложных эфиров гиалуроновой кислоты-/1-/2-карбоксиэтил/тимин/ /2/

Лоты HA-Thym-3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 /DS = 0,125, 0,14, 0,26, 0,35, 0,37 и 2,40 соответственно/, полученные в примере 13, соответственно формуют в пленки по способу примера 1 и эти пленки облучают УФ, используя ксеноновую лампу. Полученные таким образом отвержденные пленки гиалуроновой кислоты обозначают как лоты HA-Thym-3-2, 4-2, 6-2, 8-2 и 9-2 соответственно. Далее в табл. 4 представлены данные о степени желатинирования /%/ и способность к набуханию.

Пример 16. Получение сложных эфиров гиалуроновой кислоты-/1-/2-карбоксиэтил/тимина/ /3/

Раствор гиалуроновой кислоты в ДМФ /1,0 мМ/ после предварительной сушки над молекулярными ситами тщательно обезвоживают дополнительной деаэрацией в течение 4 часов.

Отдельно перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре ДМФ раствор, содержащий 1-/2-карбоксиэтил/тимин/ в различных молярных отношениях по отношению к каждой гидроксильной группе гиалуроновой кислоты: /см. фиг. 12/, 2-хлор-1-метилпиридинийиодид /1,2 мМ/ и триэтиламин /1,2 мМ/. Этот раствор добавляют по каплям к вышеуказанному раствору гиалуроновой кислоты, дополненному триэтиламином /1,2 мМ/. Полученную смесь перемешивают при 90^oC в течение 3,5 или 8 часов. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и к остатку добавляют метанол. Полученный осадок отфильтровывают, промывают метанолом и сушат. Таким образом получают сложные эфиры гиалуроновой кислоты -/1-/2-карбоксиэтил/тимина/, отличающиеся по DS /HA-Thym; DS = 0,2, 0,4, 0,6, 0,7, 0,9, 1,3, 1,8, 2,2/.

Пример соотношения между молярным соотношением использованного 1-/2-карбоксиэтил/тимина и DS представлен на фиг. 12.

Пример 17. Получение сложных эфиров хондроитинсульфат- /2-/2-карбоксиэтил/тимина/

По способу примера 16, за исключением того, что используют хондроитинсульфат /мол. вес = 60000/ с молярным отношением 1-/2-карбоксиэтил/тимина меняющимся относительно каждой гидроксильной группы хондроитинсульфата, и тем, что реакции этерификации ведут 3, 5 или 9 часов. К реакционной смеси добавляют метанол или диэтиловый эфир для осаждения продукта. Если используют диэтиловый эфир, осадок тщательно промывают метанолом. Таким образом получают сложные эфиры хондроитинсульфат- /1-/2-карбоксиэтил/тимина/, отличающиеся по DS /CS-Thym; DS = 0,09, 0,4, 0,8, 0,9, 1,3, 1,7, 1,8, 2,2/.

Пример связи между молярным отношением использованного 1-/2-карбоксиэтил/тимина и DS представлен на фиг. 13.

Связь DS и растворимости /в воде или ДМФ/ представлена в табл. 5.

Пример 18. Получение отвержденных пленок гиалуроновой кислоты и отвержденных пленок хондроитинсульфата с использованием производного тимина

Вышеуказанные пленки получают, используя сложные эфиры 1-/2-карбоксиэтил/тимина каждого GAG, из полученных в примерах 16 и 17.

Так, каждый из сложных эфиров гиалуроновой кислоты- /1-/2-карбоксиэтил/тимина/ /HA-Thym; DS = 0,2, 0,4, 0,6, 0,7, 0,9, 1,3, 1,8, 2,2/ и сложные эфиры хондроитинсульфат- /1-/2-карбоксиэтил/тимина/ /CS-Thym; DS = 0,09, 0,4, 0,8, 0,9, 1,3, 1,7, 1,8, 2,2/ растворяют в ДМФ до получения 5% растворяют и 200 мкл раствора помещают на стеклянные пластинки /14 мм диаметром/ и сушат, используя стерильный воздух при температуре 35^oC. Полученные пленки облучают светом от ртутной лампы высокого давления мощностью 400 Вт через пирексовый фильтр с водой до получения пленок сшитого GAG.

Связь между изменением поглощения /270 нм/ и временем экспонирования, обнаруженная при облучении тонких высушенных пленок сложного эфира хондроитинсульфат-/1-/2-карбоксиэтил/тимина/ /CS-Thym/ /DS = 0,09, толщина 2 - 3 мкм /указанным ранее способом, представлена на фиг. 14. Связь между степенью желатинирования /%/ и временем экспонирования, которая при этом происходит, представлена на фиг. 15. Пленки CS-Thym /DS = 0,09/ и толщиной, соответствующей возможностям практического использования /10 - 12 мкм/, также облучают аналогичным способом; соотношение между степенью желатинирования /%%/ и временем экспонирования представлено на фиг. 16.

Высушенные пленки сложного эфира гиалуроновой кислоты- 1-/2-карбоксиэтил/тимина /DS = 0,9, толщиной 10 - 12 мкм/ облучают таким же образом, а связь способности к набуханию в зависимости от времени экспонирования представлена на фиг. 17. Способность к набуханию HA-Thym пленок, отличающихся по DS, определяют до и после облучения /3 часа/ и полученные данные представляют в виде графика от DS, полученные кривые представлены на фиг. 18.

Данные по углам контакта и способности к набуханию, полученные для нескольких полученных из HA-Thym или CS-Thym фотоотвержденных пленок, полученных в этом примере и отличающихся по DS, представлены в табл. 6.

Пример 19. Адгезия эндотелиальных клеток к сшитой пленке гиалуроновой кислоты

Эндотелиальные клетки выращивают на сшитых пленках гиалуроновой кислоты, отличающихся по DS/DS = 0,4, 0,6, 1,3, 1,8/, полученных с производным тимина примера 18, а степень адгезии клеток оценивают спустя 6 часов после начала культивирования.

В результате оказалось, что адгезия, растяжение, распространение и рост эндотелиальных клеток с трудом наблюдается на всех сшитых пленках гиалуроновой кислоты, отличающихся по DS. С другой стороны, нормальное присоединение, разрастание, распространение и рост наблюдаются в ячейках с контрольным TCPS.

Пример 20. Получение сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилоксиуксусной кислоты/

Раствор хондроитинсульфат-три-н-бутиламиновой соли /10,25 мг/мл/ в ДМФ предварительно сушат над молекулярными ситами и 70 мл этого раствора сушат в вакууме при перемешивании в трехгорлой колбе объемом 100 мл при комнатной температуре. Затем воздух заменяют на газообразный азот и добавляют 15 мл перегнанного пиридина. К этому добавляют раствор одного молярного эквивалента 7-кумарилоксиацетилхлорида /хлорангидрид кумарина/ /1,12 г в 5 мл ДМФ на каждую группу хондроитинсульфата. Реакцию ведут при кипячении с обратным холодильником смеси в атмосфере азота при 80^oC в течение 3 часов. Затем реакционную смесь концентрируют и прикапывают диэтиловый эфир. Полученный осадок выделяют, растворяют в деионизированной воде и диализуют проточной водой в течение 3 дней. Полученный диализат лиофилизируют до получения сложного эфира хондоитинсульфат-/7-кумарилоксиуксусной кислоты/ в виде белого порошка.

Выход 965,1 мг

DS = 0,021

Способность к набуханию: 2,8 г H₂O/г сухого геля

Спектр ¹H ЯМР приведен на фиг. 19.

Вышеуказанную процедуру повторяют, за исключением того, что молярное отношение хлорангидрида кумарина к гидроксильным группам хондроитинсульфата изменяют, а DS откладывают от молярного отношения. Полученные результаты представлены на фиг. 20.

Пример 21. Получение фотоотвержденной пленки хондоитинсульфата из сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилоксиуксусной кислоты/

Сложный эфир хондроитинсульфат-/7-кумарилоксиуксусной кислоты/, полученный в примере 20, приготавливают в виде сухой пленки по способу примера 1 и эту пленку облучают УФ светом /320 нм/ до получения фотоотвержденной пленки хондроитинсульфата.

Связь между временем экспонирования и изменениями в спектре поглощения /320 нм/ кумарина представлена на фиг. 21. Способность к набуханию /г H₂O/ сухого геля/ полученной пленки определяют и откладывают от времени экспонирования и DS. Полученные результаты представлены на фиг. 22 и 23, соответственно. Кроме того, степень желатинирования /%/ определяют и откладывают по оси ординат в зависимости от времени экспонирования и концентрации сложного эфира хондроитинсульфат-/7-кумарилоксиуксусной кислоты/. Полученные результаты представлены на фиг. 24 и 25 соответственно.

Пример 22. Сшитая пленка гиалуроновой кислоты/ хондроитинсульфата

HA-Cin-3 /DS=0,5/, полученный в примере 1, растворяют в 20% водном растворе ДМФ при конечной концентрации 5 вес.%. Затем в этом растворяют CS-Cin-4 /DS=1,37/, полученный в примере 7, до конечной концентрации 5 вес.% до получения смешанного сложного эфира гиалуроновой кислоты-коричной кислоты и сложного эфира хондроитинсульфат-коричной кислоты. Используя этот раствор, по способу примера 1 разливают и облучают раствор, получая сшитую пленку гиалуроновой кислоты/хондроитинсульфата.

Аналогично, смешанный раствор, содержащий HA-Cin-3 и CS-Cin-4 в отношении 2:1 или 1:2 /по весу/, получают и для каждого препарата определяют эффект неадгезивности /описание последует/.

Пример 23. /1/ Получение сложного эфира гепарин-коричной кислоты

К раствору соли гепарин-три-н-бутиламина в диметилформамида /ДМФ/ /500 мг/ 125 мл/ добавляют 20 мл пиридина и полученную смесь дегидратируют при пониженном давлении. Затем при интенсивном перемешивании при комнатной температуре добавляют 69,35 мг хлорангидрида коричной кислоты. Реакцию ведут при 75^oC в течение 2 часов, а затем реакционную смесь снова концентрируют до 30 мл при пониженном давлении при 40^oC. К остатку добавляют эфир и полученный осадок выделяют и сушат при пониженном давлении. Его растворяют в 5 мл ДМФ и затем добавляют 40 мл PBS, затем раствор хорошо перемешивают. Его диализуют через диализные мембраны для тщательного удаления низкомолекулярных соединений, а затем лиофилизуют до получения нужного сложного эфира.

Лот: Hep-Cin-1

Количество связанной коричной кислоты /по данным ¹H ЯМР DS/ и растворимость представлены в табл. 7.

/2/ Получение сшитых пленок гепарина

В ДМФ растворяют 30 мг лот /Hep-Cin-1/ и полученный раствор помещают на стеклянную пластинку, 24 мм х 24 мм, и сушат стерильным теплым воздухом при 40^oC. Полученную пленку облучают ртутной лампой высокого давления мощностью 450 Вт через пирексовый фильтр, заполненный водой, до получения сшитой пленки гепарина.

Лот: Hep-Cin-1-2

Контактные углы /натекания и оттекания угол/ и способность к набуханию в воде, и изменение веса в воде представлены в табл. 8.

/3/ Используя вышеуказанные материалы и процедуры, получают сложные эфиры, причем отношение гепарина к хлорангидриду коричной кислоты меняются Hep-Cin-2, Hep-Cin-3, Hep-Cin-4/, а количество гепарина постоянно 500 мг/. Полученные результаты также присутствуют в табл. 7. Кроме того, сшитые пленки гепарина /Hep-Cin-2-2, Hep-Cin-3-2/ получают таким же способом. Физические характеристики этих пленок также представлены в табл. 8.

Пример 24. Раствор три-н-бутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты /1,5 г соответствующее 10 ммоль OH групп/ в 200 мл сухого ДМФ выдерживают под аргоном и охлаждают до 0^oC. Последовательно добавляют 4-диметиламинопиридин /0,305 г, 2,5 ммоль/, ангидрид коричной кислоты /2,78 г, 10 ммоль/ и три-н-бутиламин /4,6 мл, 10 ммоль/, и реакции дают протекать при комнатной температуре в течение 24 часов. После охлаждения до 0^oC постепенно добавляют 5% NaHCO₃ в 100 мл воды и полученный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 48 часов. Избыток NaHCO₃ удаляют последовательным добавлением 1M HCl до pH 4 и IM NaOH до pH 7. При перемешивании добавляют холодный этанол. После декантирования осадок растворяют в воде и процедуру осаждения повторяют с этанолом. Полученный осадок удаляют центрифугированием, растворяют в воде и пропускают через колонку Dowex 50 /H⁺/ с катионообменной смолой при 4^oC. Кислоту нейтрализуют 1M NaOH и лиофилизуют.

Пример 25. Неадгезивный эффект фотоотвержденной пленки гиалуроновой кислоты

Фотоотвержденную пленку сложного эфира гиалуроновой кислоты-коричной кислоты /DS=0,5; толщины 30 мкм, 20 х 20 мм/ получают так же, как и лот HA-Cin-3-2 в примере 1, и используют в качестве неадгезивного материала, и приводят следующие эксперименты.

Осуществляют лапротомию крыс под анестезией и брюшной пресс надрезают для того, чтобы подготовить место, где бы обнажился слой мускулов. Это место покрывают приготовленным ранее неадгезивным материалом. Имплантат удаляют спустя 1 неделю и две недели после покрытия и степень адгезии ткани на поверхности пленки исследуют с помощью светового микроскопа /после подкрашивания гематоксилин-зозином/ и электронного микроскопа для оценки. В качестве контроля используют крыс, у которых место пореза не покрывают пленкой.

В этом эксперименте с применением неадгезивных материалов настоящего изобретения на всех образцах едва обнаруживалось осаждение фибрина и клеточная адгезия спустя одну и две недели. Наблюдения в течение двух недель доказывают, что уже начинается биоразложение пленки.

С другой стороны, в контрольном эксперименте в месте пореза наблюдается последовательное осаждение фибрина, инвазию флогоцитов, фибробластов, и т.д. , и образование коллагена, а кишечный канал тесно прикрепляется к месту пореза спустя неделю.

Вышеуказанный эксперимент повторяют за исключением того, что используют сшитую пленку HA-Cin-3/CS-Cin-4, полученную в примере 22. По сравнению с вышеуказанной гомогенной HA-Cin-3 пленкой /HA-Cin-3-2/ способность к биоразложению повышают с тем, чтобы биоразложение пленки началось спустя неделю после имплантации и сопровождалось внедрением клеток в пленку, а прогресс разложения становится очевидным спустя 2 недели.

Пример 26. Неадгезивный эффект фотоотвержденной пленки хондроитинсульфата при желатировании in situ

Сложный эфир хондроитинсульфат-коричной кислоты лот CS-Cin-3 /Ds=0,65/, полученной в примере 7, растворяют в фосфатном буфере до конечной концентрации 20 вес.% для получения неадгезивного материала в виде раствора.

Животную модель оперированного органа, аналогичную использованной в примере 25, конструируют и место пореза покрывают вышеуказанным неадгезивным материалом. Затем этот материал облучают УФ светом в течение 15 минут для того, чтобы вызвать гелеобразование in situ. Гистологические исследования подтверждают образование слоя геля в тесном контакте с поверхностью ткани брюшной полости.

Серия наблюдений места пореза аналогично примеру 25 показывает, что, как и в примере 25, адгезия не имеет места.

Пример 27. Эффект предотвращения адгезии фотоотвержденной сшитой пленкой гиалуроновой кислоты и фотоотвержденной сшитой пленкой хондроитинсульфата.

Фотоотвержденные пленки сложного эфира гиалуроновой кислоты-коричной кислоты /HA-Cin/ /DS = 0,1, 0,5/, полученные по способам примеров 1 и 2, и фотоотвержденные пленки производного сложного эфира гранулированной кислоты-тимина /HA-Thym; DS = 0,2, 0,6, 0,9, 1,8/ и сложного эфира хондроитинсульфата-производного тимина /CS-Thym; DS = 0,4, 0,9/, полученные по способу примера 18, используют в качестве неадгезивных материалов и проводят следующие эксперименты. Так, каждую фотоотвержденную пленку /14 мм диаметром, 15 - 20 мкм толщиной/ стерилизуют, погружая в 70% этанол на 30 минут, а затем оставляют плавать в стерилизованной воде в течение 1 часа. Что касается образцов с низким DS, их сушат после погружения в воду для удаления этанола и перед опытами на животных погружают на 10 минут в стерилизованную воду. Пленка, набухая, поглощает воду, и образуется гидрогель.

Крыс /белых, штамма Вистар, самцов весом 300 г/ анестизируют эфиром и поддерживают в этом состоянии эфиром и кислородом до операции. Для каждого образца используют по одной крысе. Проводят вертикальное рассечение брюшины у крыс для тог, чтобы обнажить печень. Поверхность обнаженной печени механически рассекают для создания поврежденной поверхности величиной 1 см² и наносят вышеуказанную набухающую фотоотвержденную пленку. Что касается пленки, которую не удается закрепить в месте повреждения, то для закрепления такой пленки с четырех ее концов прилепляют полиуретановый адгезив. Затем ушивают брюшную стенку нейлоновой нитью. Спустя одну и две недели после имплантации крыс умерщвляют и ушитое место иссекают. Пленку, покрывающую печень, исследуют макроскопически, а покровную часть иссекают вместе с окружающими тканями и подвергают гистологическому исследованию, используя световой микроскоп. Полученные результаты представлены в табл. 9.

Гистологическое исследование фотоотвержденной пленки HA-Cin /DS=0,1/, DS = 0,1/, например, спустя 1 неделю после имплантации вовсе не показывает какую-либо клеточную адгезию на поверхности пленки, а биоразложение пленки уже к этому моменту началось, и наблюдается инвазия ткани. В случае фотоотверждаемой пленки HA-Thym /DS = 0,2/ в самом верхнем слое наблюдаются плоские клетки, похожие на клетки брюшины, причем биоразложение уже прогрессирует и осталась нетронутой только небольшая центральная часть.

Используя непокрытый участок раны в качестве контроля, спустя 1 неделю проводят аналогичные исследования. В результате прилипание нельзя нарушить тупым концом операционного ножа или рукой, ни даже отрезая ножом /которое было обнаружено между раневой поверхностью печения и стенкой брюшины/.

Пример 28. Контролируемое высвобождение лекарств за счет использования в качестве носителей фотоотвержденных пленок гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата

/1/ Контролируемое высвобождение индометацина

HA-Thym с изменяющейся DS, полученный в примере 16, растворяют в ДМФ при конечной концентрации 5%, а 1 мкг индометацина растворяют в 200 мкл вышеуказанного раствора. Полученный раствор помещают на стеклянные пластинки 15 мм диаметром и сушат воздухом /стерилизованный теплый воздух, 35^oC/. Полученные таким образом пленки облучают так же, как в примере 18, до получения индометацинсодержащей сшитой пленки гиалуроновой кислоты. Содержимое лекарства контролируют при 10%. Таким же образом приготавливают сшитые гиалуроновые пленки с содержанием лекарства 30%, 50% и 73%. Более того, используя CS-Thym с изменяющимся DS, как были получены в примере 17, таким же способом приготавливают сшитые пленки хондроитинсульфата с содержанием лекарства 10%, 30% и 50%.

Тест по высвобождению лекарства из каждой пленки осуществляют следующим образом. Так тестовую пленку суспендируют в воде при 20^oC или в фосфатном буферированном солевом растворе /37^oC/ и перемешивают. Через определенные промежутки времени отбирают образцы жидкой фазы и измеряют УФ поглощение на 269 нм.

В табл. 10 показана связь тестовых данных по растворимости в воде для фотоотвержденных пленок гуалуроновой кислоты /DS = 0,7, 1,3, 1,8/ с содержанием лекарства 30%, с DS и способностью к набуханию. В качестве тестовых данных по растворимости используют время, за которое из используемой пленки высвобождается 20% лекарства.

Из данных табл. 10 следует, что, как тенденция, чем выше DS, тем выше степень сшивки и, следовательно, тем тверже пленка, при соответствующем снижении способности к набуханию и связанное с этим снижение скорости высвобождения лекарств. Значение этого факта предполагает, что способность пленки абсорбировать воду является важным фактором в скорости высвобождения лекарства. Что касается пленок со значениями DS 1,3 и 1,8, то скорость высвобождения имеет тенденцию снижаться по мере возрастания содержания лекарства.

Фотоотвержденные пленки гиалуроновой кислоты /DS = 0,7, 2,2/ и фотоотвержденные пленки хондроитинсульфата /DS = 0,8, 1,3, 1,8/ сравнивают по скоростям высвобождения лекарств в PBS при содержании лекарств 10% и 50%. Полученные результаты представлены на фиг. 26 - 30. Из этих графиков очевидно, что контролируемое высвобождение лекарств возможно для пленок со значениями DS не менее чем некоторое пороговое значение /для CS-Thym, DS = 1,3/.

/2/ Контролируемое выделение гепарина

В 20% водном растворе ДМФ растворяют сложный эфир хондроитинсульфат-коричной кислоты /CS-Cin-4 /DS = 1,37/, CS-Cin-5 /DS = 2,43/, полученный в примере 7 при конечной концентрации 20 вес.%, а также сложного эфира гиалуроновой кислоты-коричной кислоты /HA-Cin-3 /DS = 0,50/, HA-Cin-5 /DS = 1,28/, HA-Cin-6 /DS = 2,43/, полученных в примерах 1 и 2 при конечной концентрации 10 вес.%. К 10 мл каждого из этих растворов добавляют 100 мг гепарина и полученный раствор покрывают стеклянной пластинкой /10 см х 10 см/, и сушат при комнатной температуре в течение 1 часа до получения пленки. Эту пленку облучают ртутной лампой высокого давления мощностью 450 Вт в течение 30 минут. Толщина каждой пленки составляет приблизительно 100 мкм.

Каждую их этих пленок, нанесенную на стеклянную пластинку, полностью погружают в сосуд, содержащий 100 мл воды, и перемешивают со скоростью 60 об. /мин. Количество выделяющегося гепарина в зависимости от времени определяют способом с использованием карбазол-серной кислоты. Полученные результаты показывают, что все пленки пригодны для контролируемого высвобождения гепарина.

Кроме того, каждую из вышеуказанных пленок с контролируемым высвобождением гепарина формируют на внутренней стенке тестовой ампулы. Затем в соответствии с JP-A-4-41432 добавляют цитратную кровь и определяют время образования сгустков. Все образцы демонстрируют противотромботическую активность.

/3/ Контролируемое высвобождение фактора высвобождения гормона роста

В 20% водном растворе ДМФ растворяют сложный эфир гиалуроновой кислоты-коричной кислоты /HA-Cin-3 /DS = 0,5// при конечной концентрации 10 вес.% и 1 мг фактора высвобождения гормона роста /GRF, человека, мол. вес 5039,8/ примешивают в 1 мл вышеуказанного раствора. Полученную смесь затем наносят на стеклянную пластинку /3 см х 3 см/ и сушат при комнатной температуре в течение 1 часа до получения пленки. Эту пленку облучают ртутной лампой высокого давления мощностью 450 Вт в течение 30 минут. Толщина этой пленки составляет 110 мкм.

Вышеуказанные пленки, как они и нанесены на стеклянные пластинки, погружают в сосуд, содержащий 10 мл воды и перемешивают со скоростью 60 об/мин. Скорость высвобождения GRF от времени определяют с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа и рассчитывают кумулятивное количество высвободившегося вещества. Было обнаружено, что можно с успехом осуществить контролируемое высвобождение GRF.

Пример 29. Сосудистые протезы

Внутреннюю поверхность искусственных кровеносных сосудов с небольшой полостью /внутренний диаметр 3 мм/ покрывают раствором HA-Cin-3, полученного в примере 1, с помощью техники вращения и после сушки нанесенную пленку отверждают УФ облучением, используя оптическое волокно малого калибра, в результате чего получают сосудистый протез, внутренняя поверхность которого покрыта отвержденной гиалуроновой кислотой.

/Эффект изобретения/

Настоящее изобретение может легко обеспечить легко очищаемые фотоотверждамые GAG за счет выбора высокобезопасных и биосовместимых исходных материалов, таких фотореактивных соединений и гликозаминогликанов, которые специально указаны здесь, и связывания первых с последними. Далее, настоящее изобретение обеспечивает материалы для медицинского применения за счет облучения указанных фотоотверждаемых GAG светом. Эти материалы имеют двухмерную или трехмерную сетчатую структуру и являются совершенно безопасными, биосовместимыми и биоразлагаемыми/абсорбируемыми. В настоящем изобретении также сшитые материалы на основе GAG с нужными физическими свойствами, необходимыми для материалов для применения в медицине, за счет соответствующего выбора молекулярных весов GAG, DS фотореактивных соединений и других факторов. Таким образом, рассматриваемое изобретение может весьма широко применяться в различных областях медицины.