фармацевтический препарат на основе интерлейкина-2 (варианты)

Формула изобретения

1. Фармацевтический препарат на основе интерлейкина-2 в качестве активного вещества, содержащий стабилизатор, солюбилизатор, антиоксидантный агент и буфер, отличающийся тем, что твердая форма препарата содержит в качестве стабилизатора вещество, выбранное из группы, содержащей маннитол, человеческий сывороточный альбумин или их смесь, в качестве солюбилизатора - вещество, выбранное из группы, содержащей гуанидин гидрохлорид, додецилсульфат натрия, в качестве антиоксидантного агента - вещество, выбранное из группы, содержащей глутатион в восстановительной форме, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол, в качестве буфера - фармацевтически приемлемый буфер, при следующем содержании компонентов, мг:

Интерлейкин-2 - 0,1 - 7,0

Стабилизатор - 5,0 - 350,0

Солюбилизатор - 1,0 - 70,0

Антиоксидантный агент - 0,1 - 3,5

Буфер, мМ - 5,0 - 10,0

2. Фармацевтический препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве интерлейкина-2 он содержит рекомбинантный интерлейкин-2.

3. Фармацевтический препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве интерлейкина-2 он содержит нерекомбинантный интерлейкин-2.

4. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в виде таблетки.

5. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в виде капсулы.

6. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в виде порошка.

7. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в виде гранул.

8. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в виде суппозитория.

9. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в виде липосомной формы.

10. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в форме, пригодной для наружного применения.

11. Фармацевтический препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что он выполнен в жидкой форме, полученной растворением твердой формы в фармацевтически приемлемом растворителе.

12. Фармацевтический препарат на основе интерлейкина-2 в качестве активного вещества (вариант), содержащий стабилизатор, солюбилизатор, антиоксидантный агент и буфер, отличающийся тем, что жидкая форма препарата содержит в качестве стабилизатора вещества, выбранное из группы, содержащей маннитол, человеческий сывороточный альбумин или их смесь, в качестве солюбилизатора - вещество, выбранное из группы, содержащей гуанидин гидрохлорид, додецилсульфат натрия, в качестве антиоксидантного агента - вещество, выбранное из группы, содержащей глутатион в восстановленной форме, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол, в качестве буфера - фармацевтически приемлемый буфер, при следующем содержании компонентов, мг:

Интерлейкин-2 - 0,1 - 5,0

Стабилизатор - 5,0 - 250,0

Солюбилизатор - 1,0 - 50,0

Антиоксидантный агент - 0,1 - 2,5

Буфер, мМ - 5,0 - 10,0

13. Фармацевтический препарат по п.12, отличающийся тем, что в качестве интерлейкина-2 он содержит рекомбинантный интерлейкин-2.

14. Фармацевтический препарат по п.12, отличающийся тем, что в качестве интерлейкина-2 он содержит нерекомбинантный интерлейкин-2.

15. Фармацевтический препарат по пп.12 - 14, отличающийся тем, что он выполнен в виде эмульсии.

16. Фармацевтический препарат по пп.12 - 14, отличающийся тем, что он выполнен в виде сиропа.

17. Фармацевтический препарат по пп.12 - 14, отличающийся тем, что он выполнен в виде эликсира.

18. Фармацевтический препарат по пп.12 - 14, отличающийся тем, что он выполнен в виде капель.

19. Фармацевтический препарат по пп.12 - 14, отличающийся тем, что он выполнен в виде липосомной формы.

20. Фармацевтический препарат по пп.12 - 14, отличающийся тем, что он выполнен в форме, пригодной для наружного применения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и фармакологии, касается фармацевтического препарата на основе интерлейкина-2 и может использоваться для лечения тяжелых состояний у млекопитающих, вызванных инфекцией, например, сепсиса различной этиологии, а также онкологических заболеваний и иммунодефицитных состояний.

Известен препарат, содержащий интерлейкин-2 человека, полученный из донорской крови (номер по каталогу 03-020-050, производство фирмы Advanced Biotechnology Inc., США). Этот препарат содержит 10%-ную фетальную бычью сыворотку, приготовленную на культуральной среде для роста культуры клеток RPMI-1640. Однако, этот препарат содержит компоненты крови человека, относится к потенциально биологически опасным препаратам и требует обращения в соответствии с правилами "Уровня 2 биологической опасности", согласно рекомендациям производителя.

Известен также рекомбинантный препарат интерлейкина-2 человека, продуцируемый кишечной E.coli, полученный методами генной инженерии, производства фирмы Sigma (номер по каталогу Е3267). Однако, этот препарат в лиофильно высушенной форме содержит буфер PBS (натрий-фосфатный буфер, pH 7,4) и 0,1%-ный бычий сывороточный альбумин в качестве носителя. Этот препарат не содержит стабилизатора или антиоксидантного агента, вследствие чего, согласно информации производителя, проявляет низкую биологическую активность, имеет ограниченное время хранения и должен быть использован сразу после растворения. Кроме того, препарат должен храниться при -70^oC, в противном случае он теряет биологическую активность.

Известен также фармацевтический препарат "Пролейкин" в виде лиофилизированной формы производства фирмы Chiron, США. Препарат представляет собой рекомбинантный аналог интерлейкина-2 человека, продуцируемый клетками кишечной палочки E. coli. В его состав входит в качестве активного вещества мутированный интерлейкин-2 (1 мг), в качестве солюбилизатора - додецилсульфат натрия (0,13 - 0,23 мг), в качестве носителя - маннитол (50 мг), а также NaH₂PO₄ H₂O (0,17 мг) и Na₂HPO₄ (1,2 мг). Этот препарат не содержит антиоксидантного агента. Однако, необходимо отметить, что "Пролейкин" является мутеином, т.е. аминокислотная последовательность интерлейкина-2 изменена путем удаления цистеинового остатка в положении 125 и замены его серином или аланином (U.S. Patent No. 4, 518, 584). Это изменение нативной структуры белка было проведено для того, чтобы получить окисленную форму препарата интерлейкина-2, причем образование дисульфидного моста у такого мутеина происходит только с участием двух оставшихся цистеиновых остатков. Однако, следует отметить, что этот препарат обладает большим количеством побочных эффектов (1). Часть этих эффектов обусловлена тем, что это мутеин, часть - бактериальным происхождением этого рекомбинантного интерлейкина-2, часть - тем, что искусственно приданная окисленному интерлейкину-2 высокая биологическая активность значительно превосходит таковую природного белка и может стимулировать синтез провоспалительных цитокинов, провоцируя серьезные системные побочные эффекты (2). Известно, что кишечная палочка является условно-патогенным микроорганизмом и даже использованием высокотехнологической очистки не в полной мере обеспечивается удаление эндотоксинов E.coli. Кроме того, известные способы окисления нетехнологичны: значительно удлиняется технологическая схема и затрудняется отделение интерлейкина-2 от примесных белков. Кроме того, известные способы окисления требуют большого разбавления радстворов, концентрации белков в таких растворах составляют до 1 /мл (3). Существующие технологические способы концентрации больших объемов растворов не позволяют сохранить биологическую активность интерлейкина-2, таким образом, при получении окисленной формы интерлейкина-2 происходит некоторая потеря биоактивности.

Задачей настоящего изобретения является создание фармацевтического препарата на основе интерлейкина-2, в таких формах и с таким составом, которые позволили бы получить биологически активный препарат с меньшим числом побочных эффектов, с технологической схемой производства и составом, позволяющими сохранить биологическую активность интерлейкина-2.

Эта задача решается фармацевтическим препаратом в твердой форме на основе интерлейкина-2 в качестве активного вещества, содержащим стабилизатор, солюбилизатор, антиоксидантный агент и буфер. Препарат содержит в качестве стабилизатора вещество, выбранное из группы, содержащей маннитол, человеческий сывороточный альбумин или их смесь, в качестве солюбилизатора - вещество, выбранное из группы, содержащей гуанидин гидрохлорид, додецилсульфат натрия, в качестве антиоксидантного агента - вещество, выбранное из группы, содержащей глутатион в восстановленной форме, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол, в качестве буфера - фармацевтически приемлемый буфер, при следующем содержании компонентов, мг:

Интерлейкин-2 - 0,1 - 7,0

Стабилизатор - 5,0 - 350,0

Солюбилизатор - 1,0 - 70,0

Антиоксидантный агент - 0,1 - 3,5

Буфер, мМ, pH 7,4 - 8,0 - 5,0 - 10,0

Частным случаем реализации фармацевтического препарата в твердой форме на основе интерлейкина-2 данного изобретения являются фармацевтические препараты, содержащие в качестве интерлейкина-2 либо рекомбинантный интерлейкин-2, либо нерекомбинантный интерлейкин-2.

Частными случаями реализации фармацевтического препарата в твердой форме на основе интерлейкина-2 данного изобретения являются таблетки, капсулы, порошки, гранулы, суппозитории, липосомные формы, формы, пригодные для наружного применения, например, мази, гели, увлажненные салфетки, или жидкие препараты на основе твердой формы, полученные растворением твердой формы в фармацевтически приемлемом растворителе, полученные стандартными технологическими способами (4, 5, 6, 7).

Эта задача также решается препаратом в жидкой форме на основе интерлейкина-2 в качестве активного вещества, содержащим стабилизатор, солюбилизатор, антиоксидантный агент и буфер. Препарат содержит в качестве стабилизатора вещество, выбранное из группы, содержащей маннитол, человеческий сывороточный альбумин или их смесь, в качестве солюбилизатора - вещество, выбранное из группы, содержащей гуанидин гидрохлорид, додецилсульфат натрия, в качестве антиоксидантного агента - вещество, выбранное из группы, содержащей глутатион в восстановленной форме, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол, в качестве буфера - фармацевтически приемлемый буфер, при следующем содержании компонентов, мг:

Интерлейкин-2 - 0,1 - 5,0

Стабилизатор - 5,0 - 250,0

Солюбилизатор - 1,0 - 50,0

Антиоксидантный агент - 0,1 - 2,5

Буфер, мМ, pH 7,4 - 8,0 - 5,0 - 10,0

Частным случаем реализации фармацевтического препарата в жидкой форме на основе интерлейкина-2 данного изобретения являются фармацевтические препараты, содержащие в качестве интерлейкина-2 либо рекомбинантный интерлейкин-2, либо нерекомбинантный интерлейкин-2.

Частными случаями реализации фармацевтических препаратов на основе жидкой формы данного изобретения являются также эмульсии, сиропы, эликсиры, капли, липосомные формы, формы, пригодные для наружного применения, например, мази, гели, увлажненные салфетки, полученные стандартными технологическими способами (5, 7).

Далее изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Получение фармацевтического препарата на основе интерлейкина-2 в твердой форме (варианты).

Получали раствор, содержащий интерлейкин-2 человека, путем очистки стандартными способами белковой химии (8) экстракта, полученного из клеток штамма 1-GRF18(MSIL) дрожжей Saccharomyces cerevisiae, депонированного во Всесоюзный коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-У791 (9).

Измеряли концентрацию интерлейкина-2 в элюате. Элюат, полученный при гельфильтрации вышеупомянутого раствора на колонке с сефакрилом S-300, содержит интерлейкин-2 в концентрации, в среднем, от 1 до 2 мг на 1 мл аммоний-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1% додецилсульфат натрия (ДСН), 1 мМ этилендиаминтетрахлоруксусную кислоту (ЭДТА), 5 мМ 2-меркаптоэтанол (2-МЭ) и 0,01% NaN₃.

К 100 мл вышеупомянутого элюата, содержащего интерлейкин-2 в концентрации 1,5 мг/мл, добавляли 400 мл охлажденного до -18^oC ацетона и оставляли на 15 минут при -18^oC. Центрифугировали в течение 15 минут при скорости 2500 оборотов в минуту при температуре -18^oC. Ацетон сливали, высушивали осадок, содержащий интерлейкин-2, и растворяли его в 150 мл буфера следующего состава (мг):

Маннитол - 7500

Додецилсульфат натрия - 1500

Дитиотреитол - 48

Бикарбонат аммония - 120

или в 150 мл буфера следующего состава (мг):

Маннитол - 7500

Додецилсульфат натрия - 1500

Дитиотреитол - 48

Бикарбонат аммония - 120

Человеческий сывороточный альбумин - 7500

Таким образом, концентрация интерлейкина-2 в этом формулирующем буфере равна 1 мг/мл. Показатель концентрации ионов водорода полученного раствора, измеренный стандартным способом на pH-метре "Beckman", США, составил 7.7. Полученный раствор стерилизовали холодной стерилизацией стандартным способом (8), разливали в ампулы по 1 мл и лиофильно высушивали. Таким образом, одна ампула фармацевтического препарата в твердой форме на основе интерлейкина-2 содержит (мг):

Интерлейкин-2 - 1,0

Маннитол - 50,0

Додецилсульфат натрия - 10,0

Дитиотреитол - 0,32

Бикарбонат аммония - 0,8

или

Интерлейкин-2 - 1,0

Маннитол - 50,0

Додецилсульфат натрия - 10,0

Дитиотреитол - 0,32

Бикарбонат аммония - 0,8

Человеческий сывороточный альбумин - 50,0

Аналогичным способом получают фармацевтический препарат в твердой форме на основе нерекомбинантного интерлейкина-2.

Пример 2. Получение фармацевтического препарата на основе интерлейкина-2 в жидкой форме (варианты).

Получали элюат, содержащий интерлейкин-2, способом, описанным в Примере 1.

К 100 мл вышеупомянутого элюата, содержащего интерлейкин-2 в концентрации 1,0 мг/мл, добавляли 400 мл охлажденного до -18^oC ацетона и оставляли на 15 минут при -18^oC. Центрифугировали в течение 15 минут при скорости 2500 оборотов в минуту при температуре -18^oC. Ацетон сливали, высушивали осадок, содержащий интерлейкин-2, и растворяли его в 100 мл буфера следующего состава (мг):

Маннитол - 5000

Додецилсульфат натрия - 1000

Дитиотреитол - 32

Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 124

Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 20

или

Маннитол - 5000

Додецилсульфат натрия - 1000

Дитиотреитол - 32

Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 124

Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 20

Человеческий сывороточный альбумин - 5000

Таким образом, концентрация интерлейкина-2 в этом формулирующем буфере равна 1 мг/мл. Показатель концентрации ионов водорода полученного раствора, измеренный стандартным способом на pH-метре "Beckman", США, составил 7.6. Полученный раствор стерилизовали холодной стерилизацией стандартным способом (8), разливали в ампулы по 1 мл и запаивали в токе стерильного воздуха. Таким образом, одна ампула фармацевтического препарата в жидкой форме на основе интерлейкина-2 содержит (мг):

Интерлейкин-2 - 1,0

Маннитол - 50,0

Додецилсульфат натрия - 10,0

Дитиотреитол - 0,32

Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,24

Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 0,20

или

Интерлейкин-2 - 1,0

Маннитол - 50,0

Додецилсульфат натрия - 10,0

Дитиотреитол - 0,32

Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,24

Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 0,20

Человеческий сывороточный альбумин - 50.0

Пример 3. Исследование биологической активности и стабильности фармацевтических препаратов на основе интерлейкина-2, выполненных в твердой и жидкой форме (варианты).

Биологическую активность фармацевтических препаратов в твердой форме на основе интерлейкина-2 исследовали по их способности стимулировать пролиферацию, цитотоксических Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2. Специфическая биологическая активность ИЛ-2 выражается в Международных Единицах (МЕ), 1 мг ИЛ-2 в восстановленной форме должен иметь биологическую активность в пределах от 300 тыс. МЕ до 1,5 млн. МЕ.

Непрерывную пролиферацию клеток линии CTLL-2 поддерживали в полной культуральной среде RPMI 1640 с необходимыми добавками (2 мМ L-глутамина, 2 мМ пировиноградной кислоты, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл бензилпенициллина или ампициллина, 100 мкг/мл стрептомицина или 50 мкг/мл гентамицина, 16 мкМ/мл натрия бикарбоната, 25 мкМ/мл HEPES и 10% инактивированной нагреванием при +5^oC в течение 1 часа сыворотки фетальной плода коровы, (СПК), содержащей ИЛ-2 в концентрации 35 - 45 МЕ/мл. В качестве источника ИЛ-2 использовали супернатант клеток крысиной селезенки, стимулированных конканавалином А. Селезенку крыс линии Wystar разрушали мягкими методами до клеточного состояния. Клетки селезенки дважды промывали средой RPMI 1640. Получали суспензию клеток в концентрации около 5 10⁶ кл/мл. Добавляли 5% сыворотки фетальной и конканавалин А до концентрации 5 мкг/мл. Смесь инкубировали в течение 30 ч при 37^oC в атмосфере 5% CO₂. Клетки отделяли центрифугированием. Супернатант стерилизовали фильтрованием сквозь мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Оценивали наличие и концентрацию ИЛ-2 в полученном растворе. Стерильные растворы хранили в замороженном состоянии в течение года.

Для культивации использовали CO₂-инкубатор, в котором поддерживали на постоянных уровнях влажность, концентрацию углекислого газа (5,0 + 1,0)% и температуру (37,0 + 0,2)^oC. Клетки культивировали в объеме 1,0 - 1,5 мл описанной выше среды с добавками в 24-луночных планшетах для культур клеток однократного применения (ТУ 64-2-56-81) с неплотно закрывающимися пластиковыми крышками. Производили пересевы после того, как клеточная суспензия достигала концентрации 1 10⁶ клеток/мл (обычно каждые 2 - 3 дня). Для закладки новых культур использовали начальную концентрацию 5 10³ живых клеток/мл в свежей среде. Перед определением активности препарата для удаления следов ИЛ-2 клетки тщательно, не менее двух раз, отмывали описанной выше средой.

Содержимое каждой ампулы с вариантами 1 - 4 фармацевтических препаратов на основе ИЛ-2 в твердой форме растворяли в 1,00 0,01 мл 0,1% ДСН. Полученный раствор в 0,1% ДСН разводили в 100 раз при помощи 0,1% ДСН сериями двух последовательных разведений, после чего разводили в 10 раз при помощи среды RPMI 1640 без добавок. В случае, когда необходимо определить биологическую активность окисленной формы фармацевтических препаратов на основе интерлейкина-2 в твердой или жидкой форме, содержимое ампулы разбавляли в 400 мл 0,9% изотонического раствора NaCl при комнатной температуре. Полученный раствор раститровывали по лункам, заполненным 100 мкл среды RPMI 1640 без добавок, путем двукратных разведений, перенося по 100 мкл из лунки в лунку, тщательно перемешивая перед каждым последующим разведением так, чтобы не менее пяти последовательных двукратных разведений анализируемого образца содержали рИЛ-2 в концентрации, примерно, от 50 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл. Для каждого варианта разведения использовали не менее 3 лунок.

В качестве позитивных контрольных вариантов использовали растворы стандартизированного препарата интерлейкина-2 человека (10), раститровывая его аналогичным образом, используя не менее 3 лунок на каждое разведение. В качестве негативных контрольных вариантов (контроль фона) использовали не менее 3 лунок, в которые вносили по 100 мкл среды, содержащей смесь вспомогательных веществ, входящих в состав препарата (маннитол, додецилсульфат натрия, дитиотреитол, бикарбонат аммония), в концентрациях, соответствующих их содержанию в испытуемых образцах.

Во все лунки с пробами анализируемого препарата и с контрольными вариантами добавляли по 100 мкл отмытых средой RPMI 1640 без добавок, содержащей 5% фетальную сыворотку плода коровы, клеток CTLL-2 (1 10⁵ живых клеток/мл) и закрывали планшет газопроницаемой пленкой или неплотной крышкой. Пробы инкубировали в CC₂-инкубаторе во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа при 37^oC в течение 40 - 42 часов. В пробах, содержащих интерлейкин-2 человека, наблюдали пролиферацию клеток CTLL-2.

После инкубации в каждую лунку вносили 10 мкл раствора MTT (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5 дифенилтетразолина бромид) (0,005% МТТ в среде RPMI 1640 без добавок или стандартном буфере PBS) и инкубировали eщe 4 - 6 часов в CO₂-инкубаторе во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа при 37^oC.

В жизнеспособных клетках, стимулированных интерлейкином-2, образовывались нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана. Планшеты центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об/мин и удаляли супернатант из лунок резким стряхиванием. В каждую ленку добавляли по 100 - 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и встряхивали планшеты на шейкере в течение 15 мин до полного растворения образовавшихся кристаллов формазана.

В пробах, содержавших интерлейкин-2 человека, наблюдали темно-синее окрашивание раствора, которое было дозово-зависимым от концентрации интерлейкина-2 в культуральной среде.

Для количественного определения биологической активности использовали 96-луночные планшеты, пригодные для фотометрии (например, Titertek производства Flow Laboratoris, Англия). Измеряли оптическую плотность раствора во всех лунках спектрофотометрически при длине волны 540 и 690 нм, используя компьютеризированный фотометр-ридер ("Униплан" фирмы "Биосервис", Москва). Во все лунки, за исключением одной или нескольких "нулевых", вносили по 100 мкл среды RPMI 1640, не содержащей интерлейкин-2.

Далее работали со значениями, полученными как разница этих двух измерений. Значения оптической плотности в лунках с негативным контролем не должны были превышать 0,2.

Строили новую, отражающую зависимость измеренных значений разницы оптических плотностей в лунках от количества внесенного в них стандартного образца интерлейкина-2 человека (в полулогарифмическом масштабе). На том же графике строили аналогичную кривую для зависимости измеренных значений оптической плотности в лунках от степени разведения внесенного в них анализируемого препарата. Обе кривые имели сигмоидную (S-орбазную) форму и располагались параллельно.

Для стандартного образца ИЛ-2 наклонный участок кривой должен располагаться в пределах от 0,2 МЕ до 5 МЕ.

Для оценки активности анализируемого препарата использовали лист вероятностей (пробитной) бумаги, где на оси абсцисс (в арифметическом масштабе) откладывали степень разведения препарата, выраженную в логарифмах по основанию 2 (log₂), а на оси ординат (в вероятностном масштабе) откладывают степень окраски, которую выражают в долях (%) от максимального уровня окраски, достигнутого в позитивном контрольном варианте со стандартным препаратом интерлейкина-2 человека.

Полученные данные отображали в указанном масштабе в виде точек с соответствующими значениями координат.

Определяли показатели степени К1 и К2. К1 равен такому значению степени разведения стандартного образца интерлейкина-2, которому соответствует 50%-ная степень окраски, а К2 равен аналогичному значению для испытуемого препарата.

Вычисляли активность А испытуемого препарата в международных единицах активности (МЕ) по формуле: А = 2^к2/2^к1.

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами.

Ниже представлены результаты исследования биологической активности и стабильности фармацевтических препаратов на основе интерлейкина-2, выполненных в твердой форме (варианты).

Вариант 1 - мг

интерлейкин-2 - 1,0

маннитол - 50,0

додецилсульфат натрия - 10,0

дитиотреитол - 0,32

бикарбонат аммония - 0,8

pH - 7,7

Вариант 2 - мг

интерлейкин-2 - 1,0

маннитол - 50,0

додецилсульфат натрия - 10,0

бикарбонат аммония - 0,8

pH - 7,7

Вариант 3 - мг

интерлейкин-2 - 1,0

маннитол - 50,0

человеческий сывороточный альбумин - 50,0

додецилсульфат натрия - 10,0

дитиотреитол - 0,32

бикарбонат аммония - 0,8

pH - 7,7

Вариант 4 - мг

интерлейкин-2 - 1,0

человеческий сывороточный альбумин - 50,0

додецилсульфат натрия - 10,0

дитиотреитол - 0,32

бикарбонат аммония - 0,8

pH - 7,7

Фармацевтические препараты на основе интерлейкина-2 в твердой или жидкой форме настоящего изобретения, содержащие рекомбинантный белок в восстановленном состоянии, являются такими же удобными для клинического применения, как аналогичный препарат, содержащий интерлейкин-2 в окисленном состоянии, но, в отличие от последнего, практически не имеет побочных эффектов и проявляет более высокую биологическую стабильность. Известно, что восстановленная форма интерлейкина-2 быстро окисляется в физиологических условиях, например, в физиологическом растворе, плазме, крови.

Для стабилизации и предотвращения потери биологической активности интерлейкина-2 в состав фармацевтических препаратов данного изобретения введен человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). Это делает также более удобным применение препарата для парентерального введения, т.к. отпадает необходимость добавления альбумина в физиологические растворы, в составе которых применяют интерлейкин-2 системно. В тех случаях, когда фармацевтический препарат на основе интерлейкина-2 вводят местно, используют фармацевтические препараты данного изобретения, не содержащие человеческий сывороточный альбумин.

Из представленных в таблице 1 данных (пункт 1) видно, что биологическая активность препарата варианта 1 (содержащего дитиотреитол) превосходит таковую варианта 2 (не содержащего дитиотреитол), следовательно, дитиотреитол повышает биологическую активность препаратов в твердой форме на основе интерлейкина-2 (пункт 1), а также способствует сохранению биологической стабильности на протяжении двух лет хранения (пункты 2, 3 Таблицы 1).

Биологическая активность препарата варианта 3 (содержащего совместно ЧСА и маннитол) несколько превосходит таковую варианта 4 (содержащего ЧСА, не содержащего маннитол) и варианта 1 (содержащего маннитол, не содержащего ЧСА), следовательно, совместное использование маннитола и ЧСА способствует более эффективному сохранению биологической активности препаратов в твердой форме на основе интерлейкина-2.

Стабилизированный вышеупомянутыми веществами интерлейкин-2 может храниться при температуре от -20^oC до +4^oC в течение двух лет, что продемонстрировано экспериментами по изучению сохранения биологической активности различных фармацевтических препаратов изобретения на основе интерлейкина-2 (пункты 2, 3 Таблицы 1).

Биологическая активность вариантов препаратов в твердой форме на основе интерлейкина-2 на протяжении первого года понижается на 12,5% у препаратов вариантов 1 и 4, на 5,5% - у препарата варианта 3, к концу 2 года хранения снижается на 20,0% у препаратов вариантов 1 и 4, на 14,0% - у препарата варианта 3, следовательно, наиболее стабильным является вариант препарата на основе интерлейкина-2 в твердой форме, содержащей совместно маннитол и ЧСА.

Биологическая активность вариантов твердых форм препаратов настоящего изобретения в окисленном состоянии сравнима с таковой природного интерлейкина-2 (пункт 4 Таблицы 1). Продемонстрированное повышение биологической активности, связанное с окислением, является закономерным для биологически активных молекул. Из представленных данных видно, что в окисленном состоянии биологическая активность препарата варианта 3 (содержащего совместно маннитол и ЧСА) превосходит таковую варианта 1 (содержащую маннитол), но уступает таковой варианта 4 (содержащего ЧСА), следовательно, ЧСА лучше стабилизирует окисленный интерлейкин-2 в составе фармацевтических препаратов в твердой форме. Следует отметить, что активность аналогичного препарата "Пролейкин", выпускаемого в окисленной форме, колеблется от 11 до 24 млн. МЕ на 1 мг белка.

Аналогичные закономерности отмечены в экспериментах с вариантами 5, 6, 7 жидкой формы фармацевтических препаратов на основе интерлейкина-2.

Вариант 5 - мг

Интерлейкин-2 - 1,0

Маннитол - 50,0

Додецилсульфат натрия - 10,0

Дитиотреитол - 0,32

Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,24

Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 0,20

pH - 7,6

Вариант 6 - мг

Интерлейкин-2 - 1,0

Маннитол - 50,0

Человеческий сывороточный альбумин - 50,0

Додецилсульфат натрия - 10,0

Дитиотреитол - 0,32

Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,24

Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 0,20

pH - 7,6

Вариант 7 - мг

Интерлейкин-2 - 1,0

Человеческий сывороточный альбумин - 50,0

Додецилсульфат натрия - 10,0

Дитиотреитол - 0,32

Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,24

Натрий фосфорнокислый однозамещенный - 0,20

pH - 7,6

Биологическую активность этих препаратов исследовали по их способности стимулировать пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 методом, описанным выше в этом примере. Различие заключалось в том, что содержимое ампулы, уже находящееся в жидком состоянии, разводили в 100 раз 0,1% ДСН и далее раститровывали по описанной методике. Далее, в качестве негативных контрольных вариантов (контроля фона) использовали смесь вспомогательных веществ, входящих в состав жидкой формы (маннитол, додецилсульфат натрия, дитиотреитол, натрий фосфорнокислый однозамещенный и натрий фосфорнокислый двузамещенный), в концентрациях, соответствующих их содержанию в испытуемых образцах. Специфическую биологическую активность ИЛ-2 также выражали в Международных Единицах (МЕ). Результаты представлены в Таблице 2.

Биологическая активность препарата варианта 6 (содержащего совместно ЧСА и маннитол) несколько превосходит таковую варианта 7 (содержащего ЧСА, не содержащего маннитол) и варианта 5 (содержащего маннитол и не содержащего ЧСА), следовательно, совместное использование маннитола и ЧСА способствует более эффективному сохранению биологической активности препаратов в жидкой форме на основе интерлейкина-2.

Биологическая активность вариантов препаратов в жидкой форме на основе интерлейкина-2 к концу 2 года хранения на 25% у препаратов вариантов 5 и 7, на 18,0% - у препарата варианта 6, следовательно, наиболее стабильным является вариант 6 препаратов жидкой формы, содержащий совместно маннитол и ЧСА.

Биологическая активность вариантов жидких форм препаратов настоящего изобретения в окисленном состоянии сравнима с таковой природного интерлейкина-2 и несколько превосходит таковую вариантов препарата в твердой форме в окисленном состоянии. Следует отметить, что биологическую активность окисленного варианта 7 (содержащего ЧСА) превосходит таковую окисленного варианта 6 (содержащего совместно маннитол и ЧСА), и активности окисленных вариантов 6 и 7 выше активности окисленного варианта 5.

Следовательно, в физиологических условиях биологическая активность выше у препаратов в твердой и жидкой форме на основе интерлейкина-2, содержащих ЧСА, и активность препарата с ЧСА в жидкой форме несколько выше таковой препарата с ЧСА в твердой форме.

Биологическая стабильность выше у препаратов на основе интерлейкина-2 в твердой форме, чем таковая у препаратов в жидкой форме, наибольшая - у препарата в твердой форме, содержащего совместно маннитол и ЧСА.

Пример 4. Изучение побочных эффектов фармацевтического препарата на основе интерлейкина-2 в твердой форме (вариант 1).

Изучение общетоксического действия интерлейкина-2 проводили на грызунах (50 рандомбредных белых мышей, 230 белых крыс и 12 кроликов породы Шиншилла). Исследование включало в себя токсикологическое изучение однократного воздействия препарата в дозе 5 мг/кг, что превышает терапевтическую дозу в 50 раз, а также хронический токсикологический эксперимент.

Токсикологическое изучение однократного воздействия препарата в максимально-переносимой дозе 5 мг/кг внутривенно свидетельствует об устойчивости этих видов млекопитающих к интерлейкину-2. В этом эксперименте препарат вызывал кратковременную гипертермию, не оказывал влияния на клеточные элементы периферической крови (эритроциты, лейкоциты), несколько изменялись поведенческие реакции. Половые различия у мышей к токсическому действию препарата при разовом введении не наблюдались. У кроликов-самцов после однократного внутривенного введения в дозе 3 мг/кг наблюдали учащение дыхания, признаки беспокойства. Анализ ЭКГ, снятой через 24 часа после введения препарата кроликам, не выявил какого-либо кардиотропного действия.

Гистологическое исследование органов и тканей крыс после однократного введения препарата в дозе 5 мг/кг не обнаружило каких-либо структурных изменений в мозге, гипофизе, селезенке, лимфатических узлах, семенниках. Тимус подопытных крыс не отличался от структуры тимуса контрольных животных.

Таким образом, обнаружено отсутствие существенных токсических эффектов препарата в эксперименте по острой токсичности при однократном введении максимально-переносимой дозы.

Хронический токсикологический эксперимент проводили на протяжении трех месяцев на 230 рандомбредных белых крысах обоего пола. Самцы имели массу тела 300 - 315 г, самки - 310 - 320 г. Животных содержали в пластиковых клетках площадью 2150 см² по 8 особей, кормили брикетированными и натуральными кормами. Препарат вводили внутрибрюшинно по стандартной методике эксперимента по хронической токсичности в дозе, рассчитанной для крыс по Ю.Р. Рыболовлеву, Р.С. Рыболовлеву (1979 г.), соответствующей 0,1 мг/кг. При завершении эксперимента часть подопытных животных декапитировали, вскрывали, определяли относительную массу органов и забирали материал для патоморфологических исследований. Органы и ткани фиксировали в нейтральном формалине, гистологические препараты готовили общепринятым методом заливки в парафин и окраски гематоксилин-эозином. Все материалы экспериментов обрабатывали общепринятым методом по Стьюденту.

Выявили преимущественно функциональные и поведенческие изменения. В Таблице 3 представлены результаты сравнения побочных эффектов препарата варианта 1 с таковыми препарата Пролейкин в эксперименте по изучению хронической токсичности на белых крысах.

Из Таблицы 3 видно, что у препарата варианта 1 отсутствует большинство побочных эффектов, проявляемых аналогичным препаратом Пролейкин.

Далее эффекты препарата варианта 1 сравнивали с контрольной группой животных, не получавших данный препарат.

В течение трех месяцев хронического эксперимента у подопытных животных не наблюдалось признаков выраженной интоксикации и существенных изменений в поведении.

Динамика прироста массы тела крыс обоего пола не отличалась значимо от контрольных животных. Наблюдали кратковременное снижение эмоционального компонента поведения крыс-самцов под влиянием терапевтической дозы препарата, увеличение количества "умываний" и "чисток" у крыс-самцов. Препарат не оказывал эффекта на исследовательское поведение подопытных животных. Оценка поведенческих реакций животных "в открытом поле" в течение хронического эксперимента не позволила выявить закономерных существенных изменений.

В течение трех месяцев хронического эксперимента детоксицирующая, выделительная и поглотительная функции печени подопытных крыс не отличались значимо от нормы. Структура печени крыс в пределах нормы. Воспалительные явления отсутствовали.

При вскрытии животных макроскопически не обнаружены какие-либо выраженные изменения. Исследование гистологической структуры органов и тканей подопытных животных сравнительно с контрольными крысами не выявило существенных структурных изменений, вызванных воздействием препарата. Сердечная мышца не имела существенных отклонений от нормы.

Наблюдались изменения в структуре селезенки подопытных крыс. Лимфатические фолликулы белой пульпы селезенки, в основном, имели центры размножения, в которых отмечали больше макрофагов, а также большее количество митозов, чем в контрольной группе. В красной пульпе повышено количество мегакариоцитов и макрофагов. Эти изменения являются закономерными исходя из иммунотропной природы препарата на основе интерлейкина-2, вызывающего пролиферацию вышеупомянутых клеток иммунной системы.

Через месяц воздействия препарата варианта 4 под влиянием терапевтической дозы наблюдались рост уровня гемоглобина, а также снижение свертывания крови только у крыс-самцов. Снижение свертывания имело временный характер и нормализовалось к концу эксперимента у крыс-самцов. У крыс-самок через три месяца введения препарата отмечали лишь уменьшение скорости свертывания крови на третьей минуте.

В тимусе отмечено полнокровие капилляров. В семенниках наблюдали полнокровие капилляров интерстициальной ткани.

Анализ местного раздражающего действия препарата варианта 1 проводили путем макроскопического и гистологического исследований тканей на месте введения препарата. Анализ не выявил каких-либо существенных макро- и микроскопических изменений брюшины, стенки сосудов и окружающих тканей на месте введения препарата.

В целом, препарат характеризуется как низкотоксичный, хорошо переносимый, не обладающий специфическими побочными эффектами.

Список литературы:

1. Sedlacek H.-H, Moroy T./Immune reactions. p. 15 - 17. Springer, 1995.

2. Hack C.E. et al. The vascular leak syndrom induced by interleukin-2: pathogenesis and treatment with C1-elastase inhibitor. In: The immune consequences of trauma, shock and sepsis - mechanisms and therapeutic approaches, vol. 1, p. 72 - 77. 1996. E. Faist et al. (Eds).

3. Weil M. P. , Sparks J. Purification and renaturation of recombinant human interleukin-2. Biochemical Journal, v. 245, p. 85 - 91. 1987.

4. Муравьев И.А. Технология лекарств. Т. 1. М.: Медицина, 1981, с. 391.

5. Муравьев И.А. Технология лекарств. Т. 2. М.: Медицина, 1981, с. 703.

6. Стрельников Л.С. Технологические и биофармакологические аспекты создания липосомных препаратов на основе биологически активных дисперсионных сред. Диссертация доктора фармацевтических наук. - Харьков; 1992.

7. Кейтс М. Техника липидологии. М.: 1975, с. 324.

8. Methods of enzymology. V. 182. Guide to protein purification. Ed. Murray P. Deutscher. P. 894. 1993. Academic Press.

9. Патент SU N 1770359. Мясников А.Н., Смирнов А.Н., Авот А.Я., Грен Э. Я., Романчикова Н.В., Циманис А.Ю. Рекомбинантная плазмидная ДНК pJDB(MSIL), обеспечивающая синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей Saccharomyces cervisiae, способ ее получения и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцент интерлейкина-2 человека".

10. Gearing A.J., Thorpe R. The international standard for human interleukin-2. Calibration by international study. Journal of Immunological Methods, v. 114, p. 3 - 9. 1988. Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division).