молекула нуклеиновой кислоты (варианты), вектор экспрессии или клонирования, синтетический полипептид, способ получения синтетического полипептида, композиция вакцины для стимулирования иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, способ стимуляции иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, олигосахарид

Формула изобретения

1. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая не менее одной последовательности, принадлежащей к набору последовательностей JD N 1 - 15 и JD N 19 - 21, представленных на фиг.2, 3, 4 или 5, кодирующих антигенные части, соответствующие по меньшей мере частично указанным последовательностям, или гельминтные энзимы аминопептидазы, или последовательностям, кодирующим гельминтные энзимы аминопептидазы, идентичные им не менее, чем на 50%, или которые гибридизируются любой из указанных последовательностей в условиях 2 SSC при комнатной температуре, причем SSC соответствует 0,15 M раствору хлорида натрия, 0,015 M раствору цитрата натрия при pH 7,2.

2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая не менее одной нуклеотидной последовательности, способной кодировать полипептид, вызывающий выработку защитных антител против гельминтных паразитов, причем нуклеотидная последовательность включает не менее одного участка, кодирующего антигенные детерминанты из последовательностей JD N 1 - 15 и JD N 19 - 21, кодирующих аминопептидазу и представленных на фиг. 2, 3, 4 и 5.

3. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая не менее одной нуклеотидной последовательности, соответствующей или комплементарной не менее чем одной последовательности, выбранной из последовательности клонов MI, BIA, BIA-3", B2, MIA US, Aust B1, 0,14 - 0,15 (2,5 PCR), 014 - 872 (3,5 PCR2), A-648 (5" конец B1), A-650 (5" конец 2,5 PCR), A-649 (5" конец 3,5 PCR), 014 - 178 (3" конец Aust B1 2), 014 - 178 (3" конец Aust B1 3 и 6), 014 - 872 (3,5 PCR 10) и 014 - 872 (3,5 PCR 19), HII-1, HII-2 и HII-3, SEQ ID NOS: 1 - 15 и 19 - 21 соответственно, которые содержат последовательность, идентичную на 50% и более, представленной на фиг.2, 3, 4 и 5, или последовательностей, которые имеют идентичные им последовательности на 50% или более, или которые гибридизуются с любой из указанных последовательностей в условиях 2 SSC, при комнатной температуре, где SSC соответствует 0,15 M раствору хлорида натрия, 0,015 M цитрата натрия при pH 7,2.

4. Вектор экспрессии или клонирования, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1 - 3.

5. Синтетический полипептид, содержащий не менее одной аминокислотной последовательности, представляющей энзим-аминопептидазу или ее антигенную часть, соответствующие всей части нуклеотидной последовательности JD N 1 - 15 и JD N 19 - 21, приведенной на фиг. 2, 3, 4 и 5 или их функционально эквивалентные варианты, отличающиеся от синтетического полипептида, соответствующего протеиновому дублету H 110 или его синтетическому полипептиду, выбранному из:

6. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что он является очищенным и содержит аминокислотную последовательность, состоящую из энзима аминопептидазы или его антигенной части, соответствующей всей или части нуклеотидной последовательности JD N 1 - 15 и JD N 19 - 21, представленной на фиг.2, 3, 4 или 5, или их функционально эквивалентных вариантов.

7. Полипептид по п.5 или 6, отличающийся тем, что он существует в форме полипептида слияния, содержащего дополнительный полипептид, слитый с указанной аминокислотной последовательностью, определенной в п.5 или 6.

8. Способ получения синтетического полипептида по любому из пп.5 - 7, отличающийся тем, что культивируют прокариотические или эукариотические клетки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1 - 3 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида, и выделяют указанный полипептид.

9. Композиция вакцины для стимулирования иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, отличающаяся тем, что она содержит по крайней мере один синтетический полипептид по любому из пп.5 - 7, или вирус или клетку-хозяина, содержащие встроенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1 - 3 для стимуляции иммунной реакции полипептидами, кодируемыми встроенной молекулой нуклеиновой кислоты, и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Способ стимуляции иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, отличающийся тем, что осуществляют введение вакционной композиции по п.9.

11. Олигосахарид общей формулы



12. Олигосахарид по п.12, отличающийся тем, что он соответствует формуле



13. Олигосахарид по п. 11 или 12, отличающийся тем, что он связан с синтетическим полипептидом по любому из пп. 5 - 7.

Описание изобретения к патенту

Рекомбинантные молекулы ДНК, кодирующие энзимы - аминопептидазы, и их использование для получения вакцин против инфекций, вызываемых гельминтами.

Настоящее изобретение относится к получению защитных антигенов с помощью технологии рекомбинантных ДНК, для использования в качестве антигельминтных агентов и в качестве защитных иммуногенов для борьбы с заболеваниями, вызываемыми гельминтными паразитами.

Такие паразиты, как гельминты, ответственны за широкий круг заболеваний и заражений паразитами (инвазий) домашних животных, которые приводят к потере продуктивности и даже к гибели животных, что имеет существенное экономическое значение. Так, например, кровососущие нематоды Haemonchus инфицируют выстилку желудочно-кишечного тракта жвачных, что вызывает анемию и потери веса, а если не проводить лечения, это часто кончается гибелью животных. Аналогично, животные, инфицированные некровососущими нематодами Ostetagia не дают привеса и без лечения могут погибнуть. Другие рода гельминтов, представляющие экономическую важность, включают Trichostrongylus and Nematodirus, которые вызывают энтериты у различных животных, и трематоды.

Проблемы создают и такие нематоды, как анкилостомы (например, Necator, Ancylostoma, Uncinaria and Bunostomumbugu) и трематоды (например, Fasciola, Paramphistomum and Dicrocoelium) и их родственники, которые помимо жвачных и домашних животных инфицируют людей, и часто с фатальным исходом.

В настоящее время борьба с паразитами-гельминтами основывается, главным образом, на применении антигельминтных препаратов, наряду с обработкой пастбищ. Такие способы имеют ряд недостатков, частое введение лекарств и обработка пастбищ обычно непрактична и приводит к усиливающему распространению устойчивых штаммов гельминтов.

Поэтому существует необходимость в создании эффективных антигельминтных вакцин, и за последние годы в этой области были сконцентрированы усилия ученых. Однако до сих пор не существует коммерчески доступных молекулярных или субъединичных вакцин против основных видов гельминтов, особенно против желудочно-кишечных нематод жвачных, таких как Haemonchus и Ostertagia.

Наиболее обещающие на настоящее время результаты были получены с новыми протеинами, выделенными из Haemonchus, обладающими потенциалом в качестве защитных антигенов не только против Haemonchus, но и также против ряда других гельминтов. В частности, показано, что протеиновый дублет H110D, обнаруженный на люминальной поверхности кишечника H. contortus, обладает защитным иммунитетом против Haemonchus у овец.

H110D из H. contortus имеет приблизительный молекулярный вес 110 килодальтон (кд) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, что определено с помощью SDS-PAGE и описано в WO 88/00835 и WO 90/11086. Термин "H110D" в том смысле, как здесь использован, относится к протеиновому дублету Н110D, как определено в WO 88/00835 и WO 90/11086. Как недавно было показано, соответствующие протеины находятся и в других видах гельминтов, например, Nеcator americanus.

В WO 88/00835 был описан ряд способов выделения Н110D, что достаточно для характеристики протеина, и они могут быть масштабированы, чтобы обеспечить получение протеина в экспериментально и коммерчески подходящих количествах. Однако существует необходимость в улучшенных и более удобных источниках, из которых можно получать но только H110D, но также и родственные антигенные протеины, особенно для процессов, основанных на технологии рекомбинантных ДНК и экспрессии протеинов в соответствующим образом трансформированных прокариотических и эукариотических организмах.

Настоящее изобретение посвящено поискам такого усовершенствованного способа. Определение последовательности кДНК для H110D из Haemonchus contortus было осуществлено, и было обнаружено, что предсказанная аминокислотная последовательность демонстрирует гомологию с семейством интегральных мембранных аминопептидаз (систематическое название: -аминоацил-пептид- гидролаза/микросомная).

У млекопитающих интегральные мембранные аминопептидазы расположены в нескольких тканях, например, на краях щетки микроворсинок кишечника и в почках. Их роль в почках неясна, но в кишечнике их функцией является расщепление мелких пептидов, которые представляют собой конечный продукт переваривания (см. Kenny и Maroux, 1982; Kenny и Turner, 1987; Noren et al, 1986; Semenza, 1986).

В одном аспекте настоящего изобретения, таким образом, предложены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, которые кодируют гельминтные энзимы-аминопептидазы или их антигенные участки, практически соответствующие всей или части нуклеотидных последовательностей, представленных на фиг. 2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15) или последовательностей, кодирующих гельминтные энзимы-аминопептидазы, которые практически гомологичны любой из указанных последовательностей, или гибридизуются с ними.

Таким образом, нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может быть однонитевой или двунитевой ДНК, кДНК или РНК.

Вариации нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминопептидазы, могут наблюдаться между различными штаммами гельминтов внутри вида, между различными стадиями жизненного цикла гельминтов (например, между личинками и взрослыми особями), между аналогичными штаммами различного географического происхождения, а также внутри одного и того же гельминта. Такие вариации также включены в объем настоящего изобретения.

Термин "практически гомологичны" здесь используют в смысле, который включает последовательности, в которых идентичность последовательностей составляет приблизительно 50% или более, например 60% или более, а также функционально-эквивалентные аллельные варианты и родственные последовательности, модифицированные замещением одного или нескольких оснований, их добавлением и/или делецией. Под "функционально эквивалентными" подразумевают последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие аминопептидазные активности, которые аналогично иммунореактивны, т.е. те, которые вызывают выработку защитных антител хозяина против гельминтов.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с последовательностями, представленными на фиг. 2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15), или любые существенно гомологичные или функционально-эквивалентные последовательности, как указано ранее, также включены в объем изобретения. Термин "гибридизация" в том смысле, как здесь использован, определяет связывание последовательностей в нежестких условиях (6 х SSC/50% формамида при комнатной температуре) (SSC - раствор хлорида и цитрата натрия) и промывку в мягких условиях (2 х SSC, комнатная температура, более предпочтительно - 2 х SSC, 42^oC), или в более жестких условиях, например 2 х SSC, 65^oC), где SSC - 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрата натрия, pH 7,2).

Способы получения таких производных родственных последовательностей, например, сайт-направленным мутагенезом, статистическим мутагенезом или в результате энзиматического расщепления, и/или лигирования нуклеиновых кислот, хорошо известны специалистам, как и способы определения наличия значительной гомологии между модифицированной таким образом нуклеиновой кислотой и подлинной последовательностью, например, с помощью гибридизации.

Таким образом, получение молекулы нуклеиновой кислоты по способу настоящего изобретения позволяет получать рекомбинантные аминопептидазы, или их иммуногенные фрагменты, в количествах, до сих пор недоступных, и, следовательно, позволяет разрабатывать антигельминтные вакцины.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более из полипептидов, способных вызывать выработку защитных антител против гельминтных паразитов, причем эти последовательности включают один или более из участков, кодирующих антигенную детерминанту, как показано на фиг. 2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15).

Настоящее изобретение относится также к синтетическим полипептидам, содержащим одну или более из аминокислотных последовательностей, составляющих энзим-аминопептидазу или его антигенную часть, практически соответствующую всей или части нуклеотидных последовательностей, представленных на фиг.2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15), или их функционально-эквивалентных вариантов, отличных от синтетического полипептида, соответствующего протеиновому дублету Н110D, или синтетического полипептида, соответствующего любой из отдельных полипептидных последовательностей, раскрытых в WO 90/11086.

В другом варианте в настоящем изобретении предложен синтетический полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, составляющую энзим-аминопептидазу или его антигенную часть, практически соответствующую всей или части нуклеотидных последовательностей, представленных на фиг.2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15) или их функционально-эквивалентных вариантов, практически не содержащих других Haemonchus contortus компонентов.

Далее настоящее изобретение относится к композициям вакцин для стимуляции иммунных реакций против гельминтных паразитов у людей или животных, содержащим, по крайней мере, один синтетический полипептид, определенный ранее, наряду с фармацевтически приемлемым носителем.

В WO 90/11086 раскрыт ряд полипептидных или частично полипептидных последовательностей, полученных в результате протеолитического расщепления или химического расщепления протеинового дублета Н110D: (в конце описания).

Неопределенности обозначены либо такой формой, как Phe/Gly, где первый трехбуквенный кодон представляет, по всей вероятности, правильную аминокислоту на основании силы сигнала, или знаком вопроса; знак "-" обозначает неизвестный остаток.

Специфические индивидуальные полипептиды последовательности, которые раскрыты в WO 09/11086, но включены в формулу.

Термин "полипептид", в том смысле, как использован здесь, включает как протеин полной длины, так и более короткие пептидные последовательности.

Термин "функциональный эквивалент" используют в отношении полипептидной аминокислотной последовательности, которая определяет полипептиды, родственные с или полученные из вышеуказанных полипептидных последовательностей, в которых аминокислотная последовательность модифицирована одиночным или множественным замещением, добавлением или делецией аминокислоты, а также последовательностей, в которых аминокислоты модифицированы химически, включая способы гликозилирования или дегликозилирования, но которые, тем не менее, сохраняют защитную (иммуногенную) активность. Такие функционально-эквивалентные варианты могут встречаться как природные биологические вариации, или их можно получить, используя известные методики, например, функционально-эквивалентные рекомбинантные полипептиды можно получить, используя известные методики сайт-направленного мутагенеза, статистического мутагенеза или энзиматическое расщепление и/или лигирование аминокислот.

Обычно синтетический полипептид настоящего изобретения представляет защитные антигенные последовательности.

Термин "защитный антиген" используют для обозначения антигенов, способных вызывать защищающую хозяина (иммуногенную) иммунную реакцию, т.е. реакцию хозяина, которая приводит к выработке иммунных эффекторных молекул, антител или клеток, которые стерилизуют оплодотворяющую способность источника поражения, ингибируют или убивают паразита и тем самым "защищают" хозяина от клинического или субклинического заболевания и снижения продуктивности. Такая защитная иммунная реакция обычно может проявляться в виде выработки антител, которые способны ингибировать метаболические функции паразита, приводя к задержке развития, отсутствию продуцирования яиц и/или к гибели.

Синтетические полипептиды в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения можно получить за счет экспрессии в хозяйской клетке, содержащей рекомбинантную ДНК молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, подробно описанную ранее, оперативно связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию, или вектор клонирования рекомбинантной ДНК, или вектор, содержащий такую рекомбинантную ДНК молекулу. В другом варианте такие полипептиды можно экспрессировать непосредственной инъекцией выделенной молекулы ДНК настоящего изобретения в клетки хозяина.

Экспрессированный таким образом полипептид может быть полипептидом слияния, содержащим участок, представляющий иммуногенность всего или части энзима аминопептидазы, и дополнительный полипептид, кодируемый слитой ДНК. Так, например, может оказаться желательным получить протеин слияния, содержащий синтетическую аминопептидазу или другой полипептид настоящего изобретения, соединенный с таким протеином, как - галактозидаза, фосфатаза, глютатион-S-трансфераза, уреаза, коровий антиген вируса гепатита B (Francis et al. , 1989) и т.п. Большинство протеинов слияния получают за счет экспрессии рекомбинантного гена, в котором две кодирующие последовательности соединены вместо в рамке считывания. В другом варианте полипептиды можно слить in vitro с помощью химических способов. Все такие слияния или производные гибридов аминопептидазу-кодирующих молекул нуклеиновых кислот и их соответствующих аминокислотных последовательностей входят в объем настоящего изобретения. Такие подходящие методики экспрессии рекомбинантных ДНК и полипептидов раскрыты, например, у Sambrook et al., 1989. В другом варианте, синтетические полипептидазы можно получить химическими способами, например, хорошо известным способом твердофазного синтеза Меррифильда.

Другие аспекты изобретения включают использование молекулы нуклеиновой кислоты, или синтетического пептида, или полипептида, как определено ранее, для получения композиции вакцин для стимуляции иммунных реакций у людей или животных, предпочтительно, млекопитающих, против заболеваний, вызываемых гельминтными паразитами.

В другом варианте в настоящем изобретении предложен способ стимуляции иммунной реакции у людей или животных, предпочтительно млекопитающих, против инфекций, вызываемых гельминтными паразитами, включающий введение указанному животному композиции вакцины, включающей одну или более из пептидаз, кодируемых указанной ранее нуклеотидной последовательностью.

Композиции вакцин можно получить по способу настоящего изобретения способами, известными специалистам в изготовлении вакцин. Традиционные вакцинные композиции могут содержать один или более из синтетических полипептидов по способу настоящего изобретения вместе с подходящим одним или более из соответствующих адъювантов, например, гидроксида алюминия, сапонина, Quil A или более очищенных их форм, дипептида мурамила, минеральных масел или Novasomes, в присутствии одного или более из фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей. Подходящие носители включают такие жидкие среды, как физиологический раствор, подходящие для использования в качестве носителей для введения пептидов или полипептидов в пациента. Могут быть включены такие дополнительные компоненты, как консерванты.

Альтернативные композиции вакцин могут содержать вирусы или клетки хозяина, например, микроорганизма (например, вирус осповакцины, аденовирус, Salmonella) со встроенной в них молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК) по способу настоящего изобретения для стимуляции иммунной реакции, направленной против полипептидов, кодируемых встроенной молекулой нуклеиновой кислоты.

Введение композиции вакцины можно осуществить любым удобным способом, например, орально или парентерально, например, внутривенной инъекцией, необязательно с интервалами, например, в виде двух инъекций с интервалом 7-28 дней.

Как было указано ранее, трансляция аминокислотных последовательностей, изображенных на фиг. 2, 3, 4 или 5, демонстрирует гомологию последовательностей с семейством интегральных мембранных аминопептидазных энзимов. Это было определено при поиске различных баз данных, доступных в пакете анализа последовательностей компьютерной группы генетиков, версия 7.01, ноябрь 1991 (Devereux et al., 1984), используя трансляции последовательностей, представленных на фиг. 2, 3, 4 или 5. Два из таких сопоставлений представлены на фиг.6.

Экспрессию последовательностей, кодирующих аминопептидазу настоящего изобретения, можно, как это было указано ранее, осуществить, используя различные известные методики и системы экспрессии, включая экспрессию в таких прокариотических клетках, как E. coli, и в таких эукариотических клетках, как дрожжи или бакуловирусные системы клеток насекомых, или в трансформированных клетках млекопитающих и в трансгенных животных и растениях. Наиболее выгодно экспрессировать нуклеотидные последовательности, используя трансгенные системы нематод, такие как систему для нематод Caenorhabditis, описанную, например, у Fire (1986); Fire et al. (1989); Spieth et al. (1988); Han et al. (1990).

В следующем аспекте изобретение предлагает способ получения синтетического пептида, описанного ранее, который включает культивирование эукариотических или прокариотических клеток, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, как указано ранее, в условиях, в которых осуществляется экспрессия указанного полипептида, и выделение полученного таким образом указанного полипептида.

В дальнейшем аспекте изобретение включает клонирование векторов экспрессии, содержащих нуклеотидные последовательности изобретения. Такие векторы экспрессии включают такие соответствующие контрольные последовательности, как например, элементы, контролирующие трансляцию (например, кодоны старта и остановки) и транскрипцию (например, промотор-операторные участки, рибосомные связывающие сайты, терминальные стоп-последовательности), связанные в считывающей рамке с молекулами нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

Векторы настоящего изобретения могут включать плазмиды и вирусы (включая как бактериофаги, так и вирусы эукариотов), согласно хорошо известным и опубликованным способам, и могут быть экспрессированы в различных экспрессирующих системах, также хорошо известных специалистам. Подходящие вирусные векторы включают, как было указано ранее, бакуловирусы, а также аденовирусы и вирус осповакцины. Специалистам известно множество других вирусных векторов.

Известны и могут быть использованы различные методики введения таких векторов в прокариотические и эукариотические клетки для экспрессии, или в зародышевые или соматические клетки для создания трансгенных животных. Подходящие способы трансформации или трансфекции подробно описаны в литературе.

Следующий аспект настоящего изобретения составляют трансформированные или трансфектированные клетки эукариотических или прокариотических хозяев или трансгенные организмы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

Вообще эукариотические экспрессионные системы, и нематодная система экспрессии в частности, обладают тем преимуществом, что посттрансляционный процессинг и, в частности, гликозилирование, могут осуществляться (в случае трансгенных нематодных систем можно ожидать гликолизирование, соответствующее тому, которое происходит в нативном протеине). Это составляет важный аспект изобретения, так как во многих случаях посттрансляционный процессинг необходим для того, чтобы рекомбинантный протеин экспрессировал оптимум биологической активности.

Системы экспрессии клеток млекопитающих также имеют ряд преимуществ. Клетки млекопитающих обеспечивают хорошее воспроизведение нативной формы и защитных эпитопов антигена, так как эукариотическая экспрессионная система приводит к более подобному гликозилированию образцов, дисульфидным связям и другим посттрансляционным модификациям, нежели E. coli, которая может продуцировать нерастворимый протеин, требующий восстановления трехмерной организации и обладающий плохой репродукцией нативной формы. Кроме того, гликозилирование у млекопитающих, по-видимому, не индуцирует иммунной реакции, которая отличается от защитной антипротеиновой реакции. Для защиты людей и домашних животных, таким образом, предпочтительно использовать фибробласты или миеломные клеточные линии человека или животных, такие, как HeLa - клеточная линия человека; BHK - клетки почек детеныша хомяка; FR 3T3 - крысиные фибробласты Фишера; VERO - клеточная линия почек обезьяны; NIH3T3 - клеточная линия фибробластов мышей; клеточная линия опухоли молочной железы мышей - C127I; CV-I - фибробласты почек африканской зеленой обезьяны; 3T6 - фибробласты эмбриона мыши; L клетки - мышиная клеточная линия; CHO - клеточная линия яичников китайского хомяка; NSO NS1, SP2 и другие мышиные миеломные клеточные линии, и клеточные линии миелом у крыс, такие как YB2/0 и Y3.

Специалистам хорошо известны векторы, соответствующие различным классам клеточных линий млекопитающих. Обычно они содержат промотор и/или энхансер, операбельно связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антиген или его фрагмент. Подходящие промоторы включают ранний или поздний промоторы SV40, например, PSVL вектор, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор металлотионеина I мыши и длинный терминальный повтор вируса опухоли молочной железы мыши. Этот вектор, предпочтительно, включает подходящий маркер, такой как ген дигидрофолатредуктазы или глутамин-синтетазы. Векторы этих типов описаны в WO 86/05807, WO 87/04462, WO 89/01036 и WO 89/10404.

Трансфекцию клеток хозяев можно осуществить, используя стандартные методики, например, используя фосфат кальция, ДЕАЕ декстран, полибрен, протопластное слияние, липосомы, прямую микроинъекцию, генную бомбардировку или электропорацию. Последняя методика предпочтительна и способы трансфекции клеточных линий млекопитающих с использованием электропорации раскрыты Andreason et al., 1980. Вообще, линейную ДНК вводить легче, нежели циркулярную ДНК.

В случае протеина H110D, было обнаружено, что он имеет уникальную и необычную схему гликозилирования, которая, по-видимому, вносит вклад в иммуноактивность, так как многие моноклональные антитела до сих пор полученные против Н110D из Haemonchus распознают углеводные эпитопы, которые могут оказаться важными при разработке нужных вакцин.

В частности, был продемонстрирован следующий набор гликозилирования для Н110D из Haemonchus:

i) около 65% олигосахаридов N-связаны, остальные O-связаны;

ii) основная часть (около 48%) N-связанных олигосахаридов принадлежит к сложному классу;

iii) практически все (более 95%) олигосахариды не имеют заряда;

iv) относительное молярное содержание составляющих моносахаридов таково: N-ацетилгалактозамин 1,0, фукоза 3,6, галактоза 4,1, глюкоза 4,4, манноза 6,2 и N-ацетилглюкозамин 5,2;

v) олигосахариды, отличающиеся от основного олигосахарида (обозначаемого олигосахарид D), практически устойчивы к деградации в широком интервале экзо-гликозидаз (например, - D-маннозидазы, - D-маннозидазы, - D-глюкозидазы, - D-галактозидазы, - D-галактозидазы, - L-фукозидазы, - D-ксилозидазы, - D-N-ацетилглюкозаминидазы).

Такие олигосахариды и гликопротеины, содержащие их, составляют следующий аспект настоящего изобретения.

Олигосахарид D из Haemonchus H110D гликопротеина относится к N-связанному типу и имеет новую структуру, состоящую из двух фукозных остатков, соединенных через - 1,3 связь и - 1,2 связь с ядром маннозы (N-ацетилглюкозамин).

Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен олигосахарид формулы



и более конкретно формулу



особенно, если связан с протеином, например, таким рекомбинантным протеином, как протеин гельминтной аминопептидазы или ее антигенный фрагмент, или если используют для создания антиидиопатических антигенов для иммунизации, особенно очень молодых животных.

Гликопротеины животных обычно содержат - 1,6-фукозную связь, и поэтому - 1,3-фукозная связь олигосахарида настоящего изобретения представляется необычной характеристикой.

Далее настоящее изобретение будет более подробно описано для Н110D из Haemonchus contortus. Однако, в результате использования таких методик, как гистохимия и ДНК гибридизация, Н110D эквиваленты наблюдались и в других видах паразитов. Считают, что Н110D протеин представляет собой мультигенный комплекс, и, кроме того, нуклеотидная кодирующая его последовательность может демонстрировать вариации между различными штаммами и различными жизненными циклами развития гельминтов. Более того, существует множество энзимных форм (изоэнзимы), которые могут по-разному экспрессироваться на различных стадиях или в различных штаммах.

В настоящем исследовании ДНК последовательности и, следовательно, предсказанные аминокислотные последовательности были определены из кДНК клонов и PCR продуктов, полученных из мРНК, соответствующих H110D гену, за счет технологии рекомбинантных ДНК из различных источников, и для различных стадий развития паразитов H. contortus жизненного цикла.

Секвенирование кДНК и PCR продуктов позволило нам идентифицировать три близко родственные H110D последовательности, которые обозначены H11-1 (последовательность ID N 19), H11-2 (последовательность ID N 20) и H11-3 (последовательность ID N 21). H11-1 содержит три непрерывные и перекрывающиеся последовательности, кДНК клон Aust B1 (последовательность ID N 6), PCR продукт А-648 (последовательность ID N 9) и с 3" конца PCR продукт 014-178 (последовательность ID N 12); H11-2 содержит PCR продукты А-650 и 2,5 кb (последовательность ID N 10 и 7 соответственно); H11-3 содержит PCR продукты 3,5 кb и А-649 (последовательности ID N 8 и 11 соответственно). Специфическое взаимоотношение между клонами индивидуальной секвенированной кДНК и PCR продуктов и H11-1, H11-2 и H11-3 суммированы на фиг.1 и детально изображены на фиг.3, 4 и 5.

Наблюдаемые различия и вариации в последовательностях, полученных из кДНК клонов и PCR продуктов, которые видны, в частности, на фиг. 2, 3, 4 и 5 (состоящих из последовательностей ID NN 1-15 и 19-21) представлены в таблице 1.

Наблюдаемые различия можно приписать различным мДНК (мультигенного семейства). Кроме того, вариации могут быть связаны, по крайней мере, частично, с различными вариантами H110D-кодирующей последовательности или мРНК, присутствующей на различных стадиях жизненного цикла или в штаммах различного географического происхождения.

В таблице 2 дополнительно представлены уровни идентичности и сходства для соответствующих предсказанных аминокислотных последовательностей и двух опубликованных последовательностей аминопептидаз млекопитающих.

Фиг.1 демонстрирует карту секвенированных клонов кДНК и PCR продуктов H. contortus H110D и их соотношения и относительные положения с Н110D мРНК.

Фиг. 2 представляет H110D нуклеотидные последовательности, обозначенные H11-3 (последовательность ID N 21, полученная из клонированных PCR продуктов последовательностей ID N 8 и 11 и кДНК клона M1AUS, последовательности ID N 5), H11-2 (последовательность ID N 20, полученная из клонированных PCR продуктов последовательностей ID N 7 и 10) и H11-1 (последовательность ID N 19, полученная из клонированных PCR продуктов последовательностей ID N 9 и 12 и кДНК клона Aust B1, последовательности ID N 6).

Фиг.3 представляет последовательность H11-3 (последовательность ID N 21) (представлена на фиг. 2) с параллельно расположенными кДНК клонами M1 и M1AUS (последовательности ID N 1 и 5).

На фиг. 4 представлена последовательность H11-2 (последовательность ID N 20, представлена на фиг.2) и выравненный кДНК клон B2 (последовательность ID N 4).

На фиг.5 представлена последовательность, обозначенная H11-1 (последовательность ID N 19) и выравненный кДНК B1A и Aust B1 (последовательности ID N 2 и 6 соответственно).

На фиг. 6 представлены: а) предсказанные аминокислотные последовательности (последовательности ID N 22, 23 и 24), полученные из ДНК последовательностей H11-1, H11-2 и H11-3, представленных на фиг.2; bi) и ii) представляют предсказанную аминокислотную последовательность H11-3 в сравнении с опубликованной аминокислотной последовательностью микросомной аминопептидазы крыс М (Watt et al., 1989) и микросомной аминопептидазы мышей A (Wu et al., 1990) соответственно; идентичные части заключены в прямоугольники, пунктиром обозначены участки, введенные для максимизации уровня гомологичности сравниваемых последовательностей. Использован обычный однобуквенный код для аминокислот. Горизонтальная линия над последовательностью указывает положение трансмембранного участка, а звездочки указывают положение цинк-связывающего фрагмента. Уровни сходства указаны в таблицах 1 и 2.

На фиг. 7 представлены выравнивание аминокислотных последовательностей (обозначенных Pep A, Pep В, Pep C, Pep D и Pep Е), полученных из C NBr и Lys-C фрагментов H110D, как было ранее описано (международная патентная заявка WO 90/11086 и как перечислено ранее, полипептидных последовательностей (a), (b), (e) (k) и (aa) соответственно) и трех новых последовательностей (последовательности ID N 16, 17 и 18), полученных из H110D после переваривания эластазой или термолизином с трансляциями a) H11-1, b) H11-2 и с) H11-3.

В следующем аспекте изобретения предложены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, которые практически соответствуют или которые практически комплементарны одной или более из последовательностей, выбранных из клонов M1, B1A, B1A-3", B2, M1AUS, Aust B1, 014-015 (2,5PCR), 014-872 (3,5PCR клон 2), A-648 (5" конец B1), A-650 (5"конец 2,5PCR), A-649 (5" конец 3,5PCR), 014-178 (3" конец Aust B1 клона 2), 014-178 (3" конец Aust B1 клонов 3 и 6), 014-872 (3,5PCR клона 10) и 014-872 (3,5PCR клона 19), H11-1, H11-2 и H11-3, последовательности ID N 1-15 и 19-21 соответственно, как представлено на фиг.2, 3, 4 и 5 или последовательности, которые практически гомологичны с любой из этих последовательностей или гибридизуются с ними.

Как указано ранее было, сравнение последовательностей различных указанных ранее клонов с компьютерными базами данных известных последовательностей выявляет существенную гомологию с семейством микросомных аминопептидазных энзимов (EC.3.4.11. -). Исследования энзиматической активности и ингибирующей способности, осуществленные для Н110D протеина и его субфракций, подтверждают, что протеин на самом дело является микросомной аминопептидазой ( -аминоацил-пептид-гидролазой (микросомной)). Эти исследования показали далее, что проявляются как аминопептидаза A-подобные, так и аминопептидаза N-подобные активности, и что каждый из компонентов Н110D дублета отдельно демонстрирует энзиматическую активность.

Исследования протеолитического расщепления Н110D также проводились. Используя энзим-эластазу, удалось обнаружить, что Н110D может быть расщеплен частично, образуя при этом две фракции, детергент-растворимую фракцию (которая остается с мембраной) и водорастворимую фракцию (которая обозначается Н11S). Н11S существует в виде протеинового димера, который можно разделить на два компонента. Интересно, что было обнаружено, что только подобная аминопептидазе М активность связана с водорастворимой Н11S фракцией, тогда как аминопептидаза A-подобная активность связана только с детергент-растворимой фракцией.

В следующих далее примерах приводится описание исследований, которые привели к определению последовательностей, представленных на фиг.1-7, со ссылкой на следующие дополнительные фигуры.

На фиг. 8 представлены результаты Вестернблоттинга интегральных мембранных протеинов, присутствующих в детергентном экстракте Haemonchus contortus взрослых особeй, зондированных аффинно-очищенными антителами, элюированными из потенциальных H110D клонов; а) антигены в детергентном экстракте Haemonchus, распознаваемые антисывороткой к экстракту; b) антитела, элюированные из полоски так, как показано в a), тестированные снова против блота детергентного экстракта, подтверждают успех стадии элюирования; с) антитела, что и в b), которые связываются с клоном M1 экспрессированного протеина, четко распознают участок 110 кb (и относительно узкую полосу около 205 кb; d) связывания антител не происходит, если для абсорбции сыворотки используют не рекомбинанты;

На фиг. 9 представлен Нозернблоттинг мРНК выделенных из 11-, 15- и 23-дневных Haemonchus contortus зондированных a) кДНК клоном M1 (последовательность ID N 1); b) кДНК клоном M1 AUS (последовательность ID N 5); c) кДНК клоном B1A (последовательность ID N 2 и 3); d) кДНК клоном Aust B1 (последовательность ID N 6); е) клонированным PCR продуктом 014-872 (3,5-2, последовательность ID N 8); и f) клонированным PCR продуктом 014-015 (последовательность ID N 7). Номера 11, 15 и 23 указывают возраст Haemonchus из которых были получены мРНК.

На фиг.10 представлен Саузернблоттинг Haemonchus contortus геномной ДНК, зондированной кДНК клонами M1AUS (последовательность ID N 5), В1А (последовательность ID N 2 и 3) и Aust B1 (последовательность ID N 6) и PCR продуктами 014-872 (3,5-2, последовательность ID N 8) и 014-015 (последовательность ID N 7); а) блоты промывают в условиях умеренной жесткости, b) блоты промывают в существенно жестких условиях; для каждого зонда дорожка 1 содержала Hind III -гидролизат ДНК в качество маркера, или оставлена без маркера, дорожки 2 и 3 содержали EcoR1 и Hind III гидролизаты, соответственно, геномной ДНК Haemonochus.

На фиг. 11 представлены Вестернблотты рекомбинантных GST-М1 и GST-B1A протеинов слияния, зондированных аффинно-очищенными антителами к электрофоретически очищенным Н110D (Н110DЕ).

На фиг.12 представлен Вестернблоттинг Con A Н110D антигена, зондированного антисывороткой к Con A H110D и к рекомбинантным GST-M1 и GST-B1A протеинам слияния.

На фиг. 13 представлены а) результаты анализа Н110D протеина и аминопептидазных активностей во фракциях, полученных с помощью ионообменной хроматографии Con A Н110D на Mono Q колонке;

b) SDS-PAGE фракций, представлен на фиг.13a).

На фиг. 14 представлены а) pH значения, при которых были получены фракции в эксперименте с изоэлектрическим фокусированием в свободном потоке;

b) SDS-PAGE в восстанавливающих условиях фракций из 14a), где нижняя полоса H110D дублета обнаружена во фракции 6, а верхняя полоса во фракции 16, с варьируемыми количествами каждой из них в перекрывающихся фракциях;

c) Вестернблоттинг фракций представлен в 14b) зондированных

i) моноклональными антителами, обозначенными TS 3/19.7, и

ii) аффинно-очищенными поликлональными анти-MI антителами; контрольные антитела но дают детектируемой реакции.

На фиг. 15 представлены а) pH значения, при которых получают фракции в другом эксперименте изоэлектрического фокусировавания в свободном потоке; b) SDS-PAGE в восстанавливающих условиях для фракций от 15a), использованного в энзиматическом анализе, где нижняя полоса H110D дублета найдена во фракциях 4-6, а верхняя полоса - во фракциях 16-18, с варьируемыми количествами каждой полосы в перекрывающихся фракциях; с) микросомные аминопептидазные специфические активности фракций, представленных в 15 b).

На фиг. 16 представлена защита овец с помощью вакцинации отдельно верхней (U), нижней (L), рекомбинантной (U + L) и промежуточной дублетной (D) полосами из H110D; а) количество откладываемых паразитами яиц, выраженное как количество яиц на г фекалий, b) погибших червей относительно контроля.

На фиг. 17 представлена защита овец в результате вакцинации водорастворимым фрагментом (H11S), полученным из H110D в результате переваривания эластазой и H11А, остаточным детергент- растворимым H110D; а) количество яиц паразитов, выраженное в единицах яиц на г фекалий, b) погибших червой по отношению к контрольным значениям (C).

На фиг. 18 представлены примеры соотношения между ингибированием Ai), Bi) аминопептидаза M-подобной и Aii), Bii) аминопептидаза A-подобной активностями H110D за счет антисыворотки отдельных овец, вакцинированных H110D с уровнями защиты, достигнутыми за счет Ai, ii) % уменьшения погибших червей, и Bi, ii) % уменьшения количества яиц в фекалиях; - анти-H110D, - антилошадиный ферритиновый контроль.

На фиг. 19 представлена гистохимическая локализация активности энзима аминопептидазы у взрослых особей Haemonchus contortus - световые микрофотографии криосекций взрослых самок Haemonchus contortus демонстрируют активность аминопептидазы (красный продукт реакции появляется как темная полоса (отмечена стрелкой) на этих черно-белых фотографиях), связанную только с микроворсинками (mv) кишечника (i). Ни одна из других тканей (например, кутикул (c), гиподермиса (h) генитального тракта (gt), мускулов стенок (wm)) не демонстрирует активности. В а) субстратом был L-лейцин-4-метокси -- нафтиламид, в b) субстратом был - (4-метокси -- нафтиламид) L-глутаминовой кислоты;

На фиг. 20 представлена карта 3,5PCR продукта (клон 2) (последовательность ID N 8), субклонированного в бакуловирусный вектор экспрессии pBlue Bacll.

На фиг. 21 представлен Вестернблоттинг экстрактов из бакуловирус-инфицированных Spodoptera frugiperda (Sf) 9 клеток, зондированных анти-H110DN антителами. Две клонированнные бляшки, Р3A и P4A, экспрессируют полной длины иммунопозитивный H110D (указан стрелкой), а контроль - нет.

Пример

Методы

Конструирование U.K. GTII библиотеки

Выделение мРНК

Взрослых Haemonchus contortus (0,5 г) из Великобритании (U.K.), замороженных в жидком азоте, измельчают в жидком азоте, используя предварительно охлажденную ступку и пестик. Из измельченной массы экстрагируют РНК 10 объемами 4 М гуанидингидрохлорида в 25 мМ цитрате натрия, содержащем 0,5% вес. /об. саркосила и 0,7% вес./об. 2-меркаптоэтанола, с последующей экстракцией фенолом и хлороформом, используя способ Chomczynski и Sacchi (1987). Информационную РНК (мРНК) получают из этого с помощью аффинной хроматографии на олиго-dT- целлюлозе (дважды) по способу Maniatis et al. (1982) и качество определяют за счет in vitro трансляции, используя набор лизатов ретикулоцитов кролика и ³⁵S-метионин от Amersham International plc в соответствии с рекомендациями изготовителей. Определяют полипептиды длиной вплоть до 120 кb.

Получение комплементарной ДНК

Первую нить комплементарной ДНК (кДНК) синтезируют из 1 мкг мРНК, используя статистическое праймирование и птичью обратную транскриптазу, а вторую нить синтезируют, используя реакцию замещения RNase H и E. coli ДНК полимеразу 1 с последующей репарацией 3" выступа, используя T4 ДНК полимеразу по способу Gubler и Hoffman (1983). Выход двунитевой (ds) кДНК составляет приблизительно 400 нг из 1 мкг мРНК. Двунитевую кДНК исследуют электрофоретически в 1% агарозном геле с последующей авторадиографией. Двунитевая кДНК имеет размер в интервале 0,2-9,4 килооснований (кв), причем основная часть имеет длину 0,5-2,3 кb.

Клонирование кДНК в gt II

Неселектированную по размерам кДНК используют для конструирования библиотеки в gt II, используя систему клонирования кДНК Amersham (набор N RPN 1280. Amersham International plc и in vitro упаковывающие экстракты (набор N 334, Amersham) в соответствии с указаниями изготовителей, а также Eco RI линкерные олигонуклеотиды (5"GGAATTCC). Полученную библиотеку помещают в E. coli штамм Y1090 в присутствии изопропилтио -- D-галактозида (IPTG) и 5-бром, 4-хлор, 3-индолил- -- D-галактозида (X-gal), в таких условиях, в которых рекомбинантные gt II проявляются как чистые ("белые") бляшки, а дикого типа не рекомбинантные gt II - как голубые бляшки. Библиотека содержала 90% белых бляшек и эффективность клонирования была оценена как 4 10⁷ бляшкообразующих единиц (plaque forming units = pfu) на мкг кДНК, и титр библиотеки составляет 2 10⁶ бляшкообразующих единиц на мл. Анализ ДНК из 20 рекомбинантов, взятых произвольно, дает средний размер вставки 0,51 кb. Однако это значение нарушается одним клоном, вставка в котором составляет 3,5 кb. Основная часть вставок имеет более 300 пар оснований (bр). Затем эту неамплифицированную библиотеку, полученную из мРНК червей из Великобритании, подвергают иммуноскринированию.

Получение антительных зондов

Антисыворотка к интегральным протеинам.

Кишечник взрослой особи Haemonchus contortus (из Великобритании) иссекают и гомогенизируют в ледяном фосфатном буфере (PBS), pH 7,4, содержащем 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕДТА) и N1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Полученный гомогенат центрифугируют в течение 10 минут, используя микроцентрифугу, и полученный осадок снова суспендируют в том же буфере, содержащем 0,1% об./об. Твина 20 (Твин - торговая марка). После повторного центрифугирования осадок суспендируют в том же буфере, содержащем 2% об./об. Trion X-100, и экстрагируют в течение 2 часов при 4^oC. Этот экстракт центрифугируют как указано ранее до получения надосадочной жидкости, содержащей интегральный мембранный протеин (IMP).

Овцу гипериммунизируют IMP в полном адъюванте Фрейнда (FCA) с помощью внутримышечной инъекции 50, 50, 120 и 130 мкг IMP, который вводят в 0, 7, 11 и 15 неделю. Спустя 6 недель после последней инъекции, собирают сыворотку и обозначают ее как сыворотка ЕЕ-068.

Получение интегральных мембранных протеинов за счет детергентной экстракции Haemonchus contortus

Экстракт приготавливают, гомогенизируя червей в 5-10 объемах PBS, содержащего 1 мМ ЕДТА и 1 мМ PMSF. Суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 20 минут при 4^oC и осадок промывают тем же буфером, содержащим 0,1% об. /об. Твина 20, а затем экстрагируют 5 объемами 2% об./об. Triton) Х-100, как указано ранее. Надосадочную жидкость снова центрифугируют при 100000 g в течение 1 часа, а полученную надосадочную жидкость, которая обогащена H110D, но содержит другие IMP, используют в Вестернблоттинге и для получения неденатурированного H110D (см. далее).

Получение H110D и аффинно-очищенной анти-H110DN

Обогащенный H110D экстракт обрабатывают с помощью аффинной хроматографии на ConA-агарозе, а затем с помощью ионообменной хроматографии на Mono Q (как указано в WO 88/00835 и WO 90/11086. Очищенный H110D вводят внутримышечно ягненку в FCA. С трехнедельными интервалами вводят 3 дозы по 100 мкг. Сыворотку у ягненка отбирают спустя 4 недели после последней инъекции и очищают с помощью аффинной хроматографии, используя абсорбцию на колонке, содержащей очищенный H110D, который был соединен с цианогенбромид-активированной сефарозой (Pharmacia). Присоединение H110D к сефарозе, связывание антисыворотки и элюирование анти-H110D антител осуществляют в соответствии с инструкциями Pharmacia. Эти аффинно-очищенные антитела обозначают анти-H110DN. Буква "N" отличает эти антитела от тех, которые вырабатываются к денатурированным, электрофоретически очищенным HIIOL, которые обозначают анти-H110DE.

Вестернблоттинг

Весторнблоттинг осуществляют, используя стандартную методику - (Johnstone et al., 1982).

Выделение и характеристика клонов

Иммуноскрининг gt II библиотеки (из Великобритании)

Иммуноскрининг библиотеки осуществляют по способу Bowtell et al. (1986). Перед использованием сыворотку (ЕЕ-068) инактивируют на анти-E. coli антитела за счет абсорбции с лизатами и целыми клетками E. coli Y1090. Библиотеку высевают на клетки E. coli Y1090 плотностью 10³ pfu на пластину 90 мм диаметром. Пластины закрывают нитроцеллюлозными фильтрами, пропитанными IPTG и инкубируют в течение ночи. Фильтры промывают TBST (50 мМ Tris, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% об./об. Твин 20), а затем блокируют с 5% об./об. лошадиной сывороткой в TBST в течение 2 часов. Добавляют сыворотку ЕЕ-068, разбавленную 1: 200 в TBST, содержащем 5% лошадиную сыворотку, и полученные фильтры инкубируют в течение 4 часов при осторожном встряхивании. Фильтры снова промывают в TBST, затем инкубируют с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированной с лошадиным антиовечьим IgG, разбавленным 1:500 в TBST, содержащем 5% об./об. лошадиной сыворотки в точение 2 часов. (Антисыворотку к овечьему IgG вырабатывают в лошадях, антиовечий IgG очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с сефарозой с овечьим IgG, и антитела конъюгируют с HRP по способу Nakane and Kawaoi, 1974). Фильтры промывают далее в TBST, и положительные бляшки определяют, используя 0,6 мг/мл 3,3"-диаминобензидин (ДАВ) и 0,1% об. /об. перекиси водорода. Отбирают 25 предположительно позитивных и повторно скринируют с помощью аффинно-очищенного анти-H110DN, как указано ранее. После этого второго скринирования 5 рекомбинантов все еще остаются позитивными, причем клон, обозначенный как M1, дает наиболее сильный сигнал.

Аффинная очистка антител на рекомбинантном фаге

Конфлюэнтные пластины получают на E.coli Y1090 газонах, засевая 10³ pfu каждого из антителоположительных клонов или нерекомбинантных gt II негативных контрольных фагов. Газоны инкубируют в течение 4 часов при 42^oC, а затем покрывают фильтрами, пропитанными IPTG и продолжают инкубирование в течение ночи при 37^oC. Фильтры удаляют с пластин и промывают в TBST перед тем, как блокировать с 5% об./об. лошадиной сывороткой в течение 1 часа. Затем полученные фильтры инкубируют с 1:100 разбавлении антисыворотки ЕЕ-068 в точение 6 часов, перед тем, как тщательно промывают TBST. Связанные антитела элюируют с фильтров, дважды нанося по 2 мл элюирующего буфера (5 мМ глицина, 500 мМ NaCl, 0,2% Твин 20, pH 2,3) в течение 2-3 минут каждый, нейтрализуют, добавляя 200 мкл 1 М трис-HCl, pH 7,4, разбавляют 1 в 200 и используют для иммуноскрининга Вестернблоттов H110D- обогащенного экстракта.

ДНК секвенирование M1 клона

Лямбда ДНК выделяют из M1 клона по способу Maniatis et al., (1982). 2,38 кb KpnI-S st1 фрагмент, содержащий 300 bp M1 фрагмент, выделяют с помощью гель-электрофореза, очищают, используя GENECLEAN набор (Stratagene) (GENECLEAN представляет торговую марку B10101), и субклонируют в pBluescriptll SK^* (Stratagene). EcoRI фрагмент очищают, используя ту же методику, и снова субклонируют в том же векторе.

Нуклеотидную последовательность M1 вставки определяют, используя T7 набор для секвенирования (Pharmacia, UK), используя как прямой и обратный праймеры M13.

Получение кДНК библиотек GTII и ZAP из Австралии

Выделение мРНК

5 г взрослых особей Haemonchus contortus (австралийский McMaster восприимчивый штамм), замороженный в жидком азоте, измельчают в жидком азоте и РНК экстрагируют, используя горячий фенол по способу Gordingley et al. (1983). Полный выход РНК составляет 10,35 мг. 1,3 мг этой РНК используют для получения мРНК с помощью аффинной хроматографии на олиго-dT- целлюлозе (2 последовательные очистки), используя способ, описанный Maniatis et al. (1982). Выход мРНК составляет 21,6 мкг. Качество мРНК оценивают in vitro трансляцией в лизатах ретикулоцитов кролика в присутствии ³⁵S-метионина (Amersham) в соответствии с инструкциями изготовителя. Полученные продукты трансляции имеют заметно отличающиеся полосы, включая полосы более 200 кb, что продемонстрировал электрофорез на SDS-полиакриламидных гелях с последующей флюорографией.

Синтез кДНК и получение библиотеки

1 мкг мРНК используют для получения кДНК за счет затравки с помощью олиго-dT или статистических праймеров, используя кДНК набор для синтеза кДНК Amersham International plc в соответствии с рекомендациями изготовителей. Выход 115 нг двунитевой (ds) кДНК. Качество кДНК исследуют с помощью электрофореза ³²P-меченных ДНК на щелочном агарозном геле по способу Ametsham инструкций к набору кДНК. Размер кДНК (определенный по сравнению с - Hind III маркерами, New England Biolabs) составляет от 150 bp до более 10 кb, причем основная часть продукта имеет размер 0,6-5 кb. Олиго-dT-праймированные и статистически-праймированные dS кДНК собирают и лигируют с избытком EcoRI 8-мерными линкерами (5" GGAATTСС3" New England Biolabs, Catalogue N 1018), которые были помечены- ³²P-ATP и T4 полинуклеотидкиназой. Связанные кДНК переваривают EcoRI и избыток линкеров удаляют с помощью хроматографии на сефарозном геле 4B (Pharmacia) по способу Maniatis et al. (1982). Фракции из колонки собирают в две порции, одна из которых содержит кДНК с размерами более 2 кb, а другая - менее 2 кb. Затем каждую порцию лигируют отдельно с 1 мкг EcoRI отрезками, обрабатывают фосфатазой ZapII спейсеры (Stratagene) и упаковывают отдельно, используя Gigapack Gold (Stratagene). кДНК большего размера дают 1,3 10⁵ рекомбинант, а меньшие кДНК дают 1,4 10⁵ рекомбинант, их собирают до получения библиотеки из 2,7 10⁵. Zap библиотеку амплифицируют, помещая на клетки XLI-Blue (Stratagene) в количестве 2 10⁴ pfu на 135 мм пластины. Титр амплифицированной библиотеки составляет 7 10⁷ pfu/мл.

Дополнительно 2 мкг мРНК используют для получения кДНК описанным ранее способом, но используя в качество праймера только олиго-dT. Выход ds кДНК составляет 740 нг. Эту кДНК обрабатывают EcoRI метилазой по способу Maniatis et al. (1982) перед добавлением ЕсоRI линкеров, и в этом случае используют 12-мерные линкеры (5" CCGGAATTCCGG3" New England Biolabs, N по каталогу 1019). После переваривания обработанной линкером кДНК EcoRl, все фракции из колонки с сефарозой 4B, которые содержат кДНК, собирают и лигируют с 2 мкг отрезков ЕсоRI, обрабатывают фосфатазой gtII спейсеры (Stratagene). Лигирующую смесь разделяют надвое и упаковывают с двумя порциями Gigapack Gold (Stratagene); их собирают до получения gtII библиотеки из 7 10⁶ pfu. Библиотеку амплифицируют, помещая на ST9 клетки в количестве 5 10⁵ pfu на 135 мм пластины. Титр амплифицированной gtII библиотеки составляет 4,5 10¹¹ pfu/мл.

Скринирование gtII библиотеки из Австралии с помощью антисыворотки к H110D

Антисыворотку вырабатывают, инъецируя овце H110D протеин (из Великобритании), который был электроэлюирован из полиакриламида после электрофореза в SDS следующим образом: ConA H110D, полученный по способу WO 88/00835 и WO 90/11086, обрабатывают электрофоретически на SDS-полиакриламидных гелях (Laemmli, 1970) до получения электроэлюированных H110D. После электрофореза участки полиакриламидного геля, содержащие отрезки H110D), помещают в электроэлюатер (Atto), и элюирование проводят в течение 3 часов при мощности 10 ватт. Электроэлюированные H110D (обозначенные H110DЕ) концентрируют на Centriprep 10 (Amicon), и буфер обменивают на РД10 колонке (Pharmacia) в 50 мМ аммонийбикарбоната/0,07% SDS, смешанном с адъювантами, а затем вводят овце с помощью инъекции. Иммуноглобулины из сыворотки осаждают сульфатом аммония (Johnstone and Thorpe, 1982). Осажденные антитела снова суспендируют в концентрации 60 мг/мл в фосфатном буферированном растворе и разбавляют 1:10 в Tris -забуференном физиологическом растворе (TBS), содержащем 5% вес./об. молочного порошка с низким содержанием жира. 10 мг ConA H110D доводят до 0,5% SDS, нагревают до 100^oC в течение 3 минут и сушат на нитроцеллюлозном фильтре. После промывки TBS, содержащим 0,2% об./об. Твин 20 и 0,5% Triton X-100 (TBSTT) фильтр инкубируют в течение 1-2 часов при комнатной температуре с антителами к H110DE. После промывания фильтра в течение 2 часов TBSTT, связанные антитела элюируют 3 мл 0,1 М глицина, 0,15 М NaCl, pH 2,6 в течение 2 минут, и немедленно доводят до нейтрального pH, добавляя 75 мкл 1,5 М Tris, pH 8,0. Эти аффинно-очищенные антитела, обозначаемые анти-Н110DЕ, используют для скринирования 5 10⁵ pfu библиотеки кДНК gt II из Австралии описанным ранее способом.

5 10⁵ рекомбинантов из библиотеки gt II, полученных из австралийских Haemonchus contortus, иммуноскринируют и три позитивных из них отбирают. После дальнейшего скринирования два из этих рекомбинантов остаются все еще положительными, и их обозначают B1А и B2.

Секвенирование B1А и B2 клонов

Эти два клона переваривают EcoRI, получая одну вставку приблизительно 500 bp для B1А, и три фрагмента B2A (около 400 bp) B2B (около 100 bp) и B2C (около 100 bp) для B2. Их субклонируют в BlueScript SK^* (Stratagene) и секвенируют, используя набор секвеназ 2,0 (United States Biochemicals).

Экспрессия клонов M1 и B1A

M1 (последовательность ID N 1) и B1A (последовательность 1ID N 2 и 3) вставки экспрессируют в Е.coli, используя вектор p GEX (Smith and Johnson, 1988). Этот вектор экспрессирует протеины C-конца глутатион-S-трансферазы Schistosoma japonicum (GST). M1 и B1A EcoRI-вставки лигируют с EcoRI-гидролизатом, обрабатывают фосфотазой pGEXI и трансформируют в Е.coli штамм JM101 по способу, описанному Maniatis et al., 1982. Восемь экземпляров потомства отбирают из каждой трансформации, и 2 мл культур выращивают в течение 6 часов при 37^oC. Добавляют IPTG для индуцирования слияния протеинов, и инкубирование продолжают в течение ночи. Клетки собирают центрифугированием, разрушают кипячением в том же самом буфере (Laemmli, 1974) и полученные экстракты анализируют с помощью SDS-PAGE и проводят Вестернблоттинг, используя аффинно-очищенные антитела овец, специфические для SDS-денатурированных H110D дублетов (анти-Н110DE см. ранее). Связанные антитела определяют, используя конъюгат щелочной фосфатазы с кроличьим антиовечьим IgG (Jackson Immunoresearch) с последующим цветовым проявлением с помощью 5-бром, 4-хлор, 3-индолилфосфата (BCIP) и нитроблютетразолиума, (NBT). Культуры иммунопозитивных клонов выращивают и индуцируют как указано ранее, и разрушают ультразвуком. Продукты, полученные в результате этой обработки, разделяют на растворимые и нерастворимые фракции за счет центрифугирования (Sorval RC-2B центрифуга, HS4 ротор, 7000 об/мин, 30 минут, 4^oC). Нерастворимый осадок снова суспендируют в 8 М мочевине с помощью ультразвука и образцы фракций исследуют с помощью SDS-PAGE.

Протеины слияния обнаруживают в нерастворимых фракциях тел включения. Каждый из этих препаратов используют для вакцинации 2 овец трижды в количестве 150 мкг протеина слияния на дозу в адъювантах Фрейнда. Позитивных контрольных овец иммунизуют нативным ConA H110D протеином, а негативных контрольных овец иммунизуют солюбилизированным протеином из E.coli, содержащим p GEX вектор без Haemonchus вставки. Сыворотку от вакцинированной овцы анализируют с помощью Вестернблоттинга против H110D.

Скринирование ZAP библиотеки из Австралии с помощью ДНК гибридизации с M1 и B1A вставками.

M1 и B1A плазмидные ДНК (клонированные в pBluescript) переваривают EcoRI и вставки выделяют электрофорезом в TBE(трис- борат-ЕДТА; 89 мМ трис-борат, 89 мМ борной кислоты, 2 мМ ЕДТА, pH приблизительно 8,3) буфере в 1% агарозном геле с последующей очисткой с помощью набора GENECLEAN. Выделение и очистку повторяют во избежание загрязнений зонда плазмидными ДНК последовательностями, которые могли бы гибридизоваться с ZAP последовательностями, вызывая недопустимый уровень фона. Очищенные вставки ДНК метят - ³²P-dCTP, используя набор для ник-трансляции (Promega Biotech) в соответствии с инструкциями изготовителей. Меченые ДНК выделяют от непрореагировавших меток на Spin хроматографической колонке (Maniatis et al. , 1982). Восемь 135 мм пластин ZAP библиотеки помещают в количество 10⁵ pfu/пластину и бляшки снимают на нитроцеллюлозные фильтры (Maniatis et al., 1982). После нагревания в вакуумном термостате в течение 2 часов при 80^oC фильтры прегибридизуют в течение 2 часов, затем гибридизуют при 42^oC в течение ночи (как указано далее в разделе "Анализ по Саузерну"). Четыре фильтра скринируют M1 зондом, а четыре B1A зондом. Фильтры дважды промывают в 1 х SSC, содержащем 0,5% SDS, и все это при 50^oC, и авторадиографируют. Потенциальные положительные бляшки отбирают и снова скринируют с зондами. Фаги с высокими титрами приготавливают из подтвержденных позитивов (обозначенных M1AUS для M1-гибридизующего клона и Aust В для B1A-гибридизующего клона) и клоны помещают в pBluescript в соответствии с инструкциями изготовителей для ZAP (Stratagene), используя BB4 штамм Е.coli в качестве хозяина. Плазмидные ДНК мини-препараты полученного потомства получают щелочным лизисом (Maniatis et al. , 1982) и перевариванием EcoRI. Перевары анализируют электрофорезом на агарозном геле.

Секвенирование вставки M1AUS

Секвенирование ДНК ведут на очищенной pBluescript плазмидной ДНК, используя набор секвеназ United States Biochemicals, версия 2,0, в соответствии с рекомендациями изготовителей. Для первой реакции секвенирования используют праймеры с концов векторной последовательности для праймирования реакции. Полученные в этих реакциях данные секвенирования используют для конструирования второй пары праймеров, а из данных, полученных с этой второй парой праймеров, конструируют третью пару. Таким образом секвенируют ДНК, "прогуливаясь вдоль" с обоих концов: 5" и 3".

Секвенирование вставки Aust B1

Его проводят, используя секвеназную 2,0 T7 полимеразу (USB Biochemicals) по способу секвенирования вставки M1AUS.

Полимеразные цепные реакции

Получение кДНК

мРНК (1 мкг) из 11-дневных постинфицированных U.K.H. contortus, полученную как указано для взрослых UK червей, смешивают с T17 адаптор-праймером:

(5"-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3") в диэтилпирокарбонатом (DEPC)-обработанной воде, затем нагревают до 65^oC в течение 5 минут и немедленно помещают на лед. Добавляют гидроксид метилртути до конечной концентрации 28,6 мМ и полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 минут. Добавляют 1-меркаптоэтанол до финальной концентрации 14,2 мМ и полученную смесь помещают на лед. К синтезированной кДНК добавляют RNase Guard (Pharmacia) до 1 ед/мкл. Буфер обратной транскриптазы (Life Sciences) до однократной концентрации, dATP, dGTP, dCTP и dTTP каждый до 1 мМ и AMV обратная транскриптаза (Life Sciences) до 2 ед/мкл (все указаны как конечные концентрации). Реакционную смесь инкубируют при 41^oC в течение 75 минут, затем экстрагируют фенолом и хлороформом и очищают на Spin хроматографической колонке (Maniatis et al, 1982). Очищенную реакционную смесь разбавляют в 2,5 раза и хранят при 4^oC.

PCR амплификация кДНК с использованием MIAUS-специфических праймеров

PCR реакции проводят, используя программируемый термоциклер (M.J. Research Inc.). Реакционную смесь, содержащую 1 мкл из 250 мкл разбавленной кДНК, приготовленной как указано ранее, 25 пмолей первой нити T17-адаптор-праймера, 25 пмолей второй нити праймера амплификации (либо на основании положений 865-884 (5" ACGGGTGTTCGGTTTCCGTAT 3"), либо на основании положений 30-49 (5"GCTGAATCTAACTCCAATCC 3") M1AUS последовательности (последовательность ID N 5). 1 Tag буфер (Northumbria Biologicals Ltd) и 0,5 мМ каждого из dATP, dTTP, dGTP и dCTP в 100 мкл реакционного объема, и покрывают 40 мкл минерального масла во избежание испарения. Затем эту смесь нагревают в термоциклере до 95^oC в течение 2 минут, затем выдерживают при 72^oC. Все еще при 72^oC добавляют 2 единицы Tag полимеразы и осторожно смешивают с остальными реагентами. Затем термоциклеру задают следующую программу:

Стадия 1: отжиг при 50^oC, 5 минут

Стадия 2: удлинение при 72^oC, 40 минут

Стадия 3: денатурация при 94^oC, 40 секунд

Стадия 4: отжиг при 50^oC, 2 минуты

Стадия 5: удлинение при 72^oC, 3 минуты

Стадия 6: 39 циклов стадий 3-5

Стадия 7: окончательное удлинение при 72^oC в течение 15 минут

Стадия 8: хранение при 4^oC.

Эти условия заданы Frohman et al. (1988).

Клонирование PCR продуктов

PCR продукты из вышеуказанных реакций выделяют электрофорезом в агарозном геле. Полосы ДНК приблизительно 2,5 и 3,5 кb электроэлюируют на стекловолокно (Whatman), экстрагируют фенолом и очищают хроматографически на G50 (Pharmacia) (Sambrook et al., 1989). Очищенную ДНК лигируют в pT 7 Blue T-вектор (Novagene) в соответствии с рекомендациями изготовителей.

Секвенирование 2,5 кb и 3,5 кb продуктов PCR

ДНК секвенирование осуществляют с набором секвеназ 2,0 (USBiochemicаls), используя "олигонуклеотидную прогулку", методику, описанную в разделе секвенирования M1AUS.

Реакции полимеразной цепи для 5" концов

Получение первой нити кДНК

1 мкг мРНК из 11-дневных постинфицированных UK Haemonchus contortus, полученной по способу, описанному для взрослых червей, смешивают с постоянным праймером (5" AAIGAAAGCGGATGGCTTGAIGC 3"), сконструированным из консервативного участка Aust B1 и 2,5 кb PCR и 3,5 кb PCR продуктами (последовательности ID N 6, 7 и 8 соответственно). Полученную смесь нагревают до 65^oC в течение 5 минут, помещают на лед и добавляют гидроксид метилртути до конечной концентрации 28,6 мМ. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут, затем добавляют 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 14,2 мМ, и полученную смесь помещают на лед. Первую нить ДНК получают, используя реагенты из 5" RACE системы (Gibco/BRL) при конечной концентрации 20 мМ Tris/HCl pH 8,4, 50 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл BSA, 0,5 мМ dATP, dCTP, dTTP. Добавляют 200 единиц Superscript обратной трансферазы и реакционную смесь инкубируют при 42^oC в течение 30 минут, а затем нагревают при 55^oC в течение 50 минут. Добавляют RNAse H до конечной концентрации 100 ед/мл и реакционную смесь инкубируют в течение 10 минут, а затем помещают на лед. кДНК очищают, используя Glassmax spin колонку (Gibco/BRL) и хранят при -20^oC.

Наращивание C-конца кДНК

1/5 первой нити кДНК нагревают при 70^oC в течение 5 минут, затем охлаждают на льду в течение 1 минуты. Добавляют реагенты из 5" RACE системы (Gibco/BRL) до конечной концентрации 10 мМ Tris/HCl, pH 8,4, 25 мМ KCl, 1,25 мМ MgCl₂, 50 мкг/мл BSA, 0,2 мМ dCTP, 500 ед/мл терминальной трансферазы добавляют и реакционную смесь инкубируют при 37^oC в течение 10 минут, затем нагревают при 70^oC в течение 15 минут и хранят на льду.

PCR амплификация с использованием Aust B1, 2,5 кb PCR и 3,5 кb PCR специфических праймеров

PCR реакции осуществляют на программируемом термоциклере (M.J. Research Inc.). Для 3" конца используют один из трех праймеров.

1. Праймер, специфический для 2,5 кb PCR продукта, основанный на положениях 374-394 (5" TGTTGTGGCTAATTTCGTCCA 3").

2. Праймер, специфичный для 3,5 кb продукта, основанный на положениях 1210-1229 (5" CATCTTIAGTTATCTGACCAG 3").

3. Праймер, специфический для кДНК клона Aust B1, основанный на положениях 357-377 (5" GACCATCGCTGATGAAGTCGG 3"). Для 5"конца реакций используют обычный "якорный праймер"

(5" CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG3")

Каждая реакционная смесь содержит 4 мкл из 50 мкл кДНК с C-концом, 25 пмолей соответствующих 2 праймеров, 1 х Tag полимеразный буфер (Boechringer/Mannheim) и 0,5 мМ каждого из dATC, dCTP, dGTP и dTTP до конечного объема 100 мкл. Эту смесь покрывают 50 мкл минерального масла и нагревают до 95^oC в циклере в течение 2 минут. Реакционную смесь выдерживают при 80^oC и в это время добавляют 0,6 ед. Tag полимеразы, а затем включают следующую программу:

1. Отжиг при 50^oC в течение 5 минут

2. Удлинение при 72^oC в течение 10 минут

3. Денатурация при 94^oC в течение 45 секунд

4. Отжиг при 50^oC в течение 1 минуты

5. Удлинение при 72^oC в течение 2,5 минуты

6. 39 циклов пунктов 3-5

7. Удлинение при 72^oC в течение 15 минут

8. Хранение при 4^oC

Клонирование 5" PCR продуктов

PCR продукты выделяют электрофоретически на агарозном геле и полосы ожидаемого размера 1,3 кb, вырезают, ДНК очищают, используя GENECLEAN набор, и лигируют в PT7BlueT-вектор (Novagene) в соответствии с указаниями изготовителей.

Полимеразная цепная реакция для получения 3" конца Aust B1

Первую нить кДНК, которую используют, является нитью, описанной для получения кДНК для использования с M1AUS праймерами. Используют специфический праймер от 1414 до 1435 (5" TCTTGAAGAAATGAAAAAGCTT 3") в Aust B1 (последовательность ID N 6) с T17 адаптерным праймером, использованным для M1AUS PCR, и реакцию ведут в термоциклере (M.J. Research Inc.). Реакционная смесь состоит из 25 пмолей каждого из праймеров, 2 мкл кДНК 1 х Tag полимеразного буфера) (Boehringer Mannhein), 0,5 мМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP в 100 мкл. Все это покрывают 50 мкл минерального масла и нагревают до 95^oC в течение 2 минут, добавляют 0,6 мкл Tag полимеразы и проводят тот же самый программируемый цикл, что и для 5" PCR, описанный ранее.

Клонирование и секвенирование 3" продуктов

Продукты PCR разделяют электрофоретически в агарозном геле и вырезают полосу ожидаемого размера, 1,3 кb, ДНК очищают с помощью набора GENECLEAN и лигируют в PCR-script (Stratagene) в соответствии с рекомендациями изготовителей.

Секвенирование клонированных PCR продуктов

ДНК PCR клонов секвенируют, используя набор секвеназ 2,0 (United States Biochemical) в соответствии с инструкциями изготовителей. Используют олигонуклеотидные праймеры для "прогулки вдоль" ДНК клонов как с 5", так и с 3" концов.

Анализ всех последовательностей ДНК

Последовательности анализируют, используя программное компьютерное обеспечение GCG (Genetics Computer Group), Devereux et al., 1984.

Норзэрнблоттинг и Саузернблоттинг

Получение Норзерн блотов

Норзерн блоты получают в формальдегидных гелях в соответствии с рекомендациями Maniatis et al. , (1982). мРНК образцы (от 11-, 15- и 23-дневных взрослых H.contortus) обрабатывают 17,5% об./об. формальдегида и 50% об./об. формамида в буфере MOPS (20 мМ 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты, pH 7,0, 8 мМ ацетата натрия, 1 мМ ЕДТА) при 65^oC в течение 15 минут и охлаждают на льду. Гели обрабатывают электрофоретически в MOPS буфере и получают блоты на дуралоновых мембранах за счет капиллярного переноса по способу Sambrook et al. (1989).

Проведение Саузернблоттинга

2 г взрослых Haemonchus contortus, которые были заморожены в жидком азоте, измельчают в мелкий порошок в жидком азоте. Порошок медленно добавляют к 25 мл лизисного буфера (0,05 М Tris/HCl, pH 8, 0,1 М ЕДТА, 1% вес./об. саркозила, 0,05 мг/мл протеиназы K (Boehringer Mannheim)) и инкубируют в течение 2 часов при 65^oC. Затем суспензию дважды экстрагируют одним объемом фенола плюс хлороформ, дважды двумя объемами хлороформа и осаждают этанолом. Осадок геномной ДНК ресуспендируют с 20 мл Tris, ЕДТА буфера (TE, pH 8) в течение ночи при 4^oC на качалке, затем проводят диализ против двух замен одного литра TE. РНК удаляют, инкубируя с DNase, не содержащей RNase A типа 1 (Sigma) в конечной концентрации 20 мкг/мл, при 37^oC в течение одного часа, а затем один раз экстрагируют фенол-хлороформом, один раз хлороформом и осаждают этанолом. Осажденную геномную ДНК дважды промывают 70% об/об этанолом и ресуспендируют в 2 мл TE, как указано ранее.

Геномную ДНК переваривают EcoRI или Hind III (25 мкг ; ДНК в каждом переваре) в течение ночи при 37^oC, затем электро-осаждают в 5 мкг порциях на 1% вес. /об. агарозном геле в Tris-ацетатном буфере. Гель обрабатывают по Саузерну и капиллярно переносят по способу Maniatis et al., (1982) на Hybond-N мембрану (Ametsham International). ДНК фиксируют на мембране, используя ультрафиолетовое облучение в соответствии с рекомендациями изготовителей.

Получение зондов

pBluesript плазмиды, содержащие M1AUS, B1A или Aust B1 вставки, переваривают EcoRI. pT7Blue плазмиды, содержащие 3,5 кb PCR продукта вставки переваривают BamHI, и те, которые содержат 2,5 кb PCR вставки, переваривают BamHI и Xbal. Перевары обрабатывают электрофоретически, вставки выделяют и метят радиоактивно - ³²P-dCTP ник-трансляцией, как описано ранее в разделе скринирования библиотеки ZAP.

Условия гибридизации

Для Саузернблоттинга

Мембраны нарезают на полоски и прегибридизуют в гибридизационном буфере, как указано ранее, в течение 3 часов при 28^oC. Полоски Саузерн блотов геномных ДНК гибридизуют с каждым из указанных ранее зондов в течение ночи при 28^oC, дважды промывают при комнатной температуре (24^oC), затем дважды при 42^oC, в 2 х SSC, содержащем 0,1% вес./об. SDS (умеренная жесткость) и авторадиографируют. После проявления авторадиограмм полоски промывают в жестких условиях (0,1 х SSC, 0,1% вес./об. SDS при 65^oC) и снова авторадиографируют.

Для Норзернблоттинга

Для зондов M1, M1AUS и B1A (последовательности ID N 1, 5 и 2 соответственно).

Норзерн блоты мРНК из 11-, 15- и 23-дневных зондируют вначале M1 вставкой. Фильтр предварительно гибридизуют в течение 2 часов при 42^oC в 2 х SSC (где 20 х SSC = 3 М NaCl, 0,3 М цитрата натрия, pH 7,2), содержащего 5 х Денхардта (0,1% вес./об. Fucoll 400 (Pharmacia), 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% бычьего сывороточного альбумина фракции V (Sigma Chemical Corp.)) 0,5% SDS (натрийдодецилсульфат), 10% декстрансульфата, 0,1 мг/мл ДНК икры лосося и 50% деионизированного формамида. Гибридизацию с зондом осуществляют в том же буфере в течение ночи при 42^oC. Фильтры дважды промывают в течение 30 минут в 2 х SSC, содержащем 0,5% SDS и 50% формамида, дважды в течение 30 минут в 2 х SSC, содержащем 0,5% SDS, и дважды в течение 30 минут в 2 х SSC. Первую промывку осуществляют при 42^oC, а все остальные промывки ведут при 37^oC. После авторадиографии блоты отпаривают, промывая в кипящем 0,1% SDS и снова авторадиографируют, чтобы убедиться в удалении зондов. Затем те же блоты зондируют M1AUS вставкой, промывают и авторадиграфируют. Блоты снова отпаривают и проверяют, а затем зондируют B1A вставкой. После нового отпаривания блоты зондируют, как указано далее.

Для зондов Aust B1, 2,5 кb и 3,5 кb PCR продукты (последовательности ID N 6, 7 и 8)

Норзерн блоты гибридизуют с Aust B1 вставками, используя условия умеренной жесткости, как описано для гибридизации Саузернблоттинга. После авторадиографии блоты отпаривают кипящим 0,1% SDS в соответствии с рекомендациями изготовителей (Amersham), затем зондируют 2,5 кb PCR вставкой (клон 2), снова отпаривают и зондируют 3,5 кb PCR (клон 2) вставкой.

Переваривание H110D и анализы энзимной активности

Получение H110D

Нативную H110D (H110DN) получают способом, описанным в WO 88/00835 и WO 90/11086.

Получение эластазного фрагмента (H11S) H110D

Взрослых Haemonchus гомогенизируют в 10 объемах охлажденного льдом PBS /0,02% азида натрия, а затем центрифугируют в течение 20 минут при 13000 об/мин. Осадок снова суспендируют в 10 объемах PBS /азида, снова гомогенизируют и повторяют центрифугирование. После повторного суспендирования в 50 мМ MOPS буфера, pH 7,4 (объем для суспензии составляет 1 мл для каждых 0,17 г червей) и предварительно нагревают при 37^oC в течение 30 минут, материал осадка переваривают эластазой (800 мкл/20 мл суспензии; 1 мг/мл свежего исходного раствора, приготовленного в 1 мМ HCl/2 мМ Ca²⁺) в течение 1 часа. Переваривание прекращают, добавляя 3,4 дихлоризокумарина (300 мкл исходного раствора 10 мМ в ДМСО/20 мл перевара). Полученную смесь центрифугируют при 13000 об/мин в течение 20 минут, и выпавший материал осадка сохраняют. Надосадочную жидкость обрабатывают в ультрацентрифуге при 100000 g в течение 1 часа 20 минут. Полученную надосадочную жидкость вводят в ConA колонку и получают связанные фракции. Для анализа эту фракцию обрабатывают в SDS-полиакриламидном геле и электрофоретически переносят на поливинилиденфторидную мембрану (Immobilon-P, Millipore), слегка подкрашенную Кумасси синим, вырезают полосу 105 кb и анализируют в газофазном аминокислотном секвенаторе. Для исследования вакцинации ConA связывающие фракции очищают далее, концентрируя и вводя в гель-фильтрационную колонку Sperose 12 (Phatmacia), и собирают те фракции, которые содержат аминопептидазную активность.

Термолизиновое переваривание H110D

H110D дублет очищают электроэлюацией из препаративного 8% SDS-полиакриламидного геля до получения H110DЕ, как указано в WO 90/11086, и электроэлюированием димерной формы, выходящей как раз над 200 кb (которая дает характерный дублет на 110 кb, если повторить обработку на SDS-PAGE), до получения H110DE. Растворы H110DЕ концентрируют до 200 мкл, добавляют хлорид кальция до 5 мМ и полученную смесь нагревают до 37^oC. Свежеприготовленный раствор 1 мг/мл термолизина (в 1 мМ HCl, 2 мМ CaCl₂) добавляют в отношении 0,1 мкг термолизина на мкг H110DЕ. Полученную смесь инкубируют при 37^oC в течение 120 минут и затем реакцию останавливают, добавляя 5 мкл 0,5 М ЕДТА.

Протеиновые фрагменты разделяют электрофоротически в 15% SDS-полиакриламидном геле и электрофоретически переносят на поливинилиденфторидную мембрану (Immobilon-P, Millipore). После окрашивания Кумасси синим наиболее интенсивные дискретные полосы вырезают и анализируют в газофазном аминокислотном секвенаторе.

Получение H110D фракции (H11A), обогащенной аминопептидазной A активностью

Осадок, полученный после эластазной обработки центрифугированием на 17000 g в течение 20 минут (см. ранее), ресуспендируют в PBS при 4^oC и снова осаждают центрифугированием, затем снова суспендируют в 1% Твин 20 в PBS /азиде и оставляют (при перемешивании) на 1 час. Суспензию центрифугируют при 17000 g в течение 20 минут и надосадочную жидкость удаляют. Осадок повторно экстрагируют 1% Thesit в PBS /азиде. Надосадочные жидкости после центрифугирования при 17000 g в течение 20 минут комбинируют и ультрацентрифугируют в течение 1 часа 20 минут при 100000 g. Надосадочную жидкость вводят в ConA аффинную колонку (Affigel, Biorad) и связанный материал элюируют и далее фракционируют с помощью ионообменной хроматографии на MonoQ колонке.

Анализ энзиматических активностей

- аминоацилпептидгидролазные (микросомные) аминопептидазные активности в H110D препаратах характеризуют в анализах, используя L-лейцин, метионин, фeнилaлaнин, - глутaминoвую кислоту и лизин-р- нитроанилиды (pNA). Все аминокислотные р-нитроанилидные субстраты (за исключением - глутаминовой кислоты) получают от Sigma, Poole, Dorset UK, - глутаминовая кислота от Fluka, Dorset, UK. Отдельные гидрофобные (лейцин- или фенил-аланин-) и заряженные (- глутаминовая кислота-) аминокислотные pNA, как известно, являются субстратами для аминопептидаз-М(ApM) и -A(ApA) млекопитающих, соответственно, были выбраны как мера действия ингибиторов энзимов и сывороточного ингибирования на активность H110D аминопептидазы.

а) анализ микропластин

Ячейки микро-ELISA пластины (Dynatech Immulon 1, Vitginia, USA) заполняют (каждую) 250 мкл либо 50 мМ HEPES, либо MOPS pH 7 плюс 10 мкг подлежащей анализу фракции. Затем плаcтины преинкубируют при 37^oC в течение 10 минут перед тем, как добавить 10 мкл 25 мМ аминокислотного р-нитроанилидного субстрата на ячейку. Затем определяют оптическую плотность (ОД) в момент 0 на 405 нМ, используя ELISA считывающее устройство, а затем пластины инкубируют при 37^oC в течение 15-30 минут. Коночное значение регистрируют, как и раньше, и рассчитывают ОД изменение в минуту на мг протеина.

b) ингибиторная чувствительность

Способ, использованный для анализа энзимов, тот же, что и в а), за исключением того, что ингибиторы добавляют к 250 мкл буфера плюс 10 мкл 1 мг/мл ConA H110D и предварительно инкубируют в течение 10 минут при 37^oC перед добавлением субстратов (лейцин-pNA или - глутаминовая кислота-pNA). Процент ингибирования рассчитывают следующим образом:



где x - ОД/мин энзима без добавления ингибитора, а

y - ОД/мин энзима плюс ингибитор.

Девять соединений с различными классами энзимов тестируют отдельно: Amastatin, Bestatin (металлопротеаза, аминопептидаза), 1,10 фенантролин, ЕДТА (металлопротеаза), фосфорамидон (металлопротеаза, термолизин, коллагеназа), Aprotinin (серин-протеаза), Pepstatin (аспарагин протеаза), PMSF (серин- и цистеин-протеазы) и E64 (цистеин-протеаза). Amastatin, bestatin, 1,10 фенантролин, PMSF и пепстатин были получены от Sigma Dorset, UK. Все остальные ингибиторы были получены от Boehringer-Mannheim. Каждый ингибитор используют в двух концентрациях, равных или больше, чем максимальные концентрации, рекомендованные Boehringer-Mannheim.

с) анализ ингибирования энзима антисывороткой

Анализ осуществляют по способу, описанному в а), за исключением того, что используют две микро-ELISA пластины. На одной пластине 10 мкл ConA H110D (1 мл/мл) плюс 10 мкл антисыворотки от каждой овцы на ячейку предварительно инкубируют при 37^oC в течение 15 минут. Вторую пластину с 250 мкл HEPES/бикарбонатный буфер плюс 10 мкл либо фениланин-pNA, или - глутаминовая кислота-pNA субстрата на ячейку также предварительно инкубируют при 37^oC в течение 15 минут. Смеси ConA-сыворотки добавляют к смесям буфер-субстрат на второй пластине с помощью мультипипетки Определяют ОД/мин. Для внесения поправок процент ингибирования рассчитывают по формуле, приведенной ранее в разделе b), где х представляет среднее ОД/мин для ячеек, которые содержат энзим плюс сыворотку от негативных контрольных овец (вакцинированных ферритином селезенки лошади), а у ОД/мин для ячеек, которые содержат энзим плюс сыворотку от овец, вакцинированных H110D. Для внесения поправок (фиг.18) процент защиты рассчитывают, используя формулу в разделе b), где x - либо среднее количество яиц в фекалиях на грамм, либо среднее количество червей в контроле, а y - либо количество яиц в фекалиях на грамм во время эксперимента, либо количество червей у отдельной овцы, вакцинированной H110D.

Локализация активности энзима гистохимически

Аминопептидазную активность демонстрируют на 10 мкм криостатированных отрезках Haemonchus contortus, используя L- лейцин-4-метокси -- нафтиламид и L-глутамин -- 4-метокси -- нафтиламид в качество субстратов по способу Nachlas et al. (1957), Nakane et al., (1974) и Lojda et al. (1980).

Экспрессия рекомбинантных H110D в эукариотической системе бакуловирусклетки насекомых

Конструирование плазмид экспрессии

3,5 кb PCR фрагменты, описанные ранее, создают за счет амплификации между олиго-dT-адаптером (который содержит Sal I сайт) и олиго-872, который представляет основания N 30-49 в M1AUS последовательности, и клонируют в pT 7 Blue вектор. Клон pT 73.5-2 ориентирован векторным полилинкерным BamHI сайтом с 5" конца и Hind III, XbaI и Sal I сайтами с 3" конца. Последовательность с 5" конца имеет вид:



Звездочки указывают 3" dT/dA выступ, используемый для клонирования в pT 7 Blue вектор.

3,5 PCR клон 2 переваривают Hind III (отдельный сайт в полилинкерной векторной последовательности с 3" конца 3,5 K гена) и концы дополняют деоксинуклеотидами, используя ДНК полимеразу (фрагмент Кленова), по способу Maniatis et al. (1982). Линкер BamHI (5" CGGATCCG 3", New Ehgland Biolabs Catalog N 1021) лигируют с тупыми концами, и клоны с дополнительным BamHI сайтом, который позволяет вырезать полной длины последовательность H110D гена, как BamHI фрагмент, отбирают. Фрагмент BamHI выделяют электрофоретически на 0,6% вес. /об. агарозном геле в трис-ацетатном буфере, а затем очищают, используя (GENECLEAN (B10101). Эту процедуру проводят дважды. Затем этот очищенный фрагмент лигируют с BamHI-отрезком, фосфатазируют pBlue Bac II (Invitrogen Corp.), и клоны, содержащие фрагмент в правильной ориентации (т. е. с 5" концом 3,5 PCR клона 2) помещают под контроль бакуловирусного полиэдринового промотора, определенного перевариванием Nhel и XBal. Полученную плазмиду частично переваривают BamHI и концы дополняют, как указано выше. NcoI линкер, содержащий ATG (5" CCC GG 3"; New England Biolabs Catalog N 1040), добавляют и смесь лигируют. Клоны, содержащие линкер, лигированный по 5" концу BamHI сайта 3,5 PCR клона 2, а но 3" сайт, определяют, переваривая Ncol. Полученная плазмида, обозначенная pBB 3,5-2 (N), схематически изображена на фиг.19.

Эта конструкция приводит к встраиванию в рамке ATG на 5" конце вставки 3,5 PCR клона 2 для инициации трансляции. Последовательность, окружающая этот инициирующий ATG, представляет собой:



В экспрессированном протеине не хватает аминокислот 2-9, соответствующих H110D последовательности, и в ней содержатся 3 аминокислоты линкерной последовательности, непосредственно после ATG.

Создание рекомбинантных бакуловирусов, содержащих H110D последовательности

Плазмиду pBB 3,5-2 (N) трансформируют в Spodoptera frugiperda (Sf 9) клетках (полученных от Invitrogen Corp.), используя линейную ДНК вируса ядерного полиэдроза Autographica californica (ACNPV) и катионные липосомы (Invitrogen Corp. трансфекционный модуль), в соответствии с указаниями изготовителей. Клетки культивируют в TC-100 среду (SIGMA), дополненную сывороткой плода теленка (CSL Ltd; термоинактивирована при 56^oC в течение 45 минут) и антибиотиками (пенициллин/стрептомицин, гентамицин CSL Ltd). Контрольную трансфекцию, используя pBB 3,5-2 (N) плазмиду с ATG вставкой по 3" концу 3,5 PCR клона 2 последовательности, также осуществляют. Рекомбинантные бляшки отбирают на том основании, что вектор Blue Bac II также кодирует E. coli - галактозидазу (- gal), включая X-gal в агарозный слой при рекомендуемых уровнях. Проводят отбор синих бляшек и подвергают двум циклам дополнительной очистки бляшек, после чего инфицированные монослои уже не демонстрируют свидетельств содержания дикого типа вируса (что проявляется наличием ядерной полиэдры). Очищенные вирусы обозначают 3,5-2-P2A, -P3A и P4A и амплифицируют двумя последовательными инфицированиями Sf 9 клетками перед использованием. Бляшки, выделенные из контрольной трансфекции, обозначают 3,5-2-rev.

Оценка экспрессии H110D в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом

Монослои Sf 9 клеток (1 10⁶ клеток в 25 см² склянках) инфицируют 3,5-2 вирусами, дикого типа вирусом (wt), контрольным вирусом, экспрессирующим - gal, или не инфицируют. После 4 дней выращивания при 26^oC монослои отделяют осторожным встряхиванием, клетки выделяют центрифугированием (2000 об/мин, 10 минут) и клеточный осадок разрушают тремя циклами замораживание - оттаивание. Полученные лизаты снова суспендируют в 500 мкг PBS и аликвоты по 25 мкл анализируют на ApM активность с помощью анализа в микроячейках.

15 мкл аликвоты (3 10⁴ клеток эквиваленты) вышеуказанных лизатов обрабатывают электрофоретически на денатурированных 7,5% SDS-полиакриламидных гелях. Затем один гель подкрашивают Кумасси синим для оценки уровня экспрессии. Остальные гели подвергают Вестернблоттингу и блоты зондируют анти-H110D (как было указано ранее).

Результаты

Анализ иммуноположительных клонов

Анализ антител, аффинно-очищенных на клоне M1

Аффинно-очищенные антитела, специфические для каждого из 5 антителоположительных клонов, получают и используют для зондирования Вестерн блота H110D-обогащенных экстрактов. Как показано на фиг. 8, все 5 клонов, по-видимому, распознают H110D дублет. Однако реакция с клоном M1 дает более сильный сигнал (фиг.8d) по сравнению с gt II негативным контрольным блотом. Поэтому этот клон исследуют далее.

Норзернблоттинг клона M1

Результаты Норзернблоттинга Haemonchus contortus мРНК, зондированной M1 вставкой, представлены на фиг.9. Распознается отдельная мРНК полоса приблизительно 3,5 кb. Это достаточный размер для кодирования протеина около 110 кb.

Анализ последовательности клона M1

Анализ рестрикционных переваров ДНК с помощью EcoRI демонстрирует M1 вставку приблизительно 300 bp. ДНК последовательность M1 фрагмента определена и представлена на фиг.3. Фрагмент содержит 295 bp и открытую считывающую рамку, начинающуюся с основания номер 3.

Норзернблоттинг клона B1A

Норзернблоттинг Haemonchus contortus мРНК, зондированной B1A вставкой, представлен на фиг. 9c. Как и для M1, распознается отдельная мРНК полоса приблизительно 3,5 кb.

Секвенирование клонов B1A и B2

Клоны B1A были секвенированы (последовательности ID N 2 и 3) и полная последовательность (последовательность ID N 2) представлена в сопоставлении с H11-1 (последовательность ID N 19) и Aust B1 (последовательность ID N 6) на фиг. 5. Вставка составляет 484 bp и имеет полную ORF от первого основания. 3 фрагмента B2, полученные в результате переваривания EcoRI, секвенируют, и полная последовательность для B2 (последовательность ID N 4) имеет 581 bp. Она представлена в сопоставлении с H11-2 на фиг. 4. Последовательность имеет ORF от положения 3 до 213 bp, стоп кодон и нетранслируемый участок, совместимый с участком 2,5 кb полученной в PCR последовательности (последовательность ID N 7).

Экспрессия M1 и B1A в E. coli

В результате субклонирования в вектор экспрессии GST получают клоны, которые экспрессируют протеины слияния 38-40 кb для M1 и 45 кb для B1A. Это согласуется с предсказанными для вставок размерами, обеспечивая молекулярный вес глутатион -S- трансферазы. Оба протеина слияния очень интенсивно реагируют в Вестернблоттинге с аффинно-очищенными антителами к H110DE (фиг. 11). Протеины слияния экспрессируются как нерастворимые тела включений.

Реакция антител у овец, вакцинированных M1-GST и B1A-GST протеинами слияния

Антисыворотку овец, инфицированных протеинами слияния, тестируют в Вестернблоттинге против H110D препаратов. Как GST-M1, так и GST-B1A приводят к выработке антител, которые специфически распознают H110D дублет (фиг. 12). Сыворотка от негативно контрольных овец не распознает H110D дублет.

Выделение и характеризация клонов, селектированных за счет гибридизации с ДНК вставок M1 или B1A

Подтвержденные позитивные клоны, гибридизованные с M1 зондом, обозначают M1AUS (последовательность ID N 5), а клон, гибридизованный с B1A, обозначают AustB1 (последовательность ID N 6). Рестрикционное переваривание очищенных плазмидных ДНК EcoRI выявляет размер вставки около 900 bp для M1AUS и около 1,6 кb для Aust B1. Как представлено на фиг. 9b) и 9d), при Норзернблоттинге M1AUS и Aust B1 гибридизуются с того же размера мРНК (около 3,5 кb), что и M1 и B1A.

Анализ последовательности M1AUS

Полное секвенирование M1AUS фрагмента выполняют, используя "прогулку" синтетических олигонуклеотидов вдоль ДНК с каждого конца. Анализ полученной последовательности выявляет M1AUS вставку в 948 bp, что представлено на фиг. 3. Последовательность (последовательность ID N 5) начинается с ATG (который кодирует метионин) и содержит открытую считывающую рамку (ORF) по всей длине его. Последовательность на 19 пар оснований длиннее, чем M1 последовательность, с 5" конца, и на 634 bp длиннее с 3" конца. Последовательности, общие для двух клонов (основания 20- 314), идентичны, за исключением двух нуклеотидных различий в положении третьего кодона. Сравнение всех возможных считывающих рамок в различных базах данных показывают, что считывающая рамка, начинающаяся с ATG у основания номер один, обеспечивает гомологичность с членами семейства микросомных аминопептидаз.

Последовательность AustB1

Полное секвенирование Aust B1 фрагмента выполняют, используя "прогулку" синтетических олигонуклеотидов вдоль ДНК с обоих концов. ДНК последовательность (последовательность ID N 6) представлена на фиг. 5. Этот клон имеет длину 1689 bp и имеет ORF с остатка 2. Эта последовательность образует часть H11-1, как видно на фиг. 1. Трансляция аминокислот этой последовательности демонстрирует фрагмент сайта связывания цинка, характерный для аминопептидаз.

PCR амплификация кДНК мРНК H110D

PCR с использованием M1AUS праймеров

кДНК синтезируют из Haemonchus contortus мРНК, используя в качестве праймера олиго-dT, содержащий адапторную последовательность, для облегчения последующего клонирования и манипуляций с ДНК. Затем эту ДНК используют для амплификации M1AUS последовательности в PCR, используя в качестве праймера 5" конца синтетический олигонуклеотид, основанный на положениях 965-885. PCR фрагмент около 2,5 кb амплифицируют. Он имеет размер, приблизительно соответствующий ожидаемому на основании известного размера мРНК и последовательностей кДНК аминопептидазы млекопитающих.

Осуществляют второй набор PCR реакций, используя праймер вблизи 5" конца M1AUS (основания 30-49). На агарозном геле детектируют четыре полосы. Наибольшая из них, при 3,5 кb, соответствует предсказанному размеру PCR продукта.

Клонирование и секвенирование 2,5 кb и 3,5 кb PCR продуктов из M1AUS праймеров

2,5 кb и 3,5 кb PCR продукты клонируют и обозначают 2,5 PCR (последовательность ID N 7) и 3,5 PCR (последовательность ID N 8, 14 и 15 для клонов N 2, 10 и 19 соответственно). В Нозернблоттинге 2,5 PCR и 3,5 PCR (клоны 2, 3.5 PCR-2) гибридизуются с мРНК около 3,5 кb (фиг. 9e, 9f) таким же образом (по отношению к возрасту Haemonchus, использованных для получения мРНК), что и M1, B1A, M1AUS и Aust B1.

Полное секвенирование клонов осуществляют в "олигонуклеотидной прогулке". Как видно на фиг. 1, последовательность для 2,5 кb продукта (последовательность ID N 20) и последовательность для 3,5 кb продукта (последовательность ID N 8) является основной частью H11-3 (последовательность ID N 21). Трансляция аминокислот обоих этих последовательностей (представленных на фиг. 6) содержит фрагмент связывания цинка His Glu Xaa His Xaa Trp (HEXXHXW), характерный для микросомных аминопептидаз.

Секвенирование 5" конца PCR клонов

кДНК синтезируют, используя праймерное типирование консервативной последовательности в кДНК клона Aust B1, 2,5 PCR и 3,5 PCR (последовательности ID N 6, 7 и 8), которые гибридизуются с мРНК для этих последовательностей около 1,3 кb с 5" конца кДНК завершают C-хвостом с 5" конца, а затем проводят PCR реакции с универсальным Anсhor (A) праймером для 5" конца и тремя праймерами, специфическими для каждой из последовательностей Aust B1, 2,5PCR и 3,5 PCR-клона 2 (последовательности ID N 6, 7, 8) для 3" конца. В каждой реакции получается продукт предсказанного размера, а именно 1,3 кb : 1301 bp (последовательность ID N 9), 1280 bp (последовательность ID N 10) и 1292 (последовательность ID N 11) соответственно. Все три последовательности имеют нетранслируемый участок с 5" конца (фиг.2). Все начинаются с одной и той же 22 bp последовательности (5"GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG 3"), которая известна как сплайсированная лидерная последовательность I (SLI) и присутствует в нетранслируемом 5" участке широкого круга нематод Huang et al., 1990. В последовательностях ID N 9 и 10 SLI последовательность следует непосредственно перед инициирующим ATG. В последовательности ID N 11 существуют 13 bp между SLI и инициирующим ATG. Все три последовательности имеют полную ORF.

Секвенирование Anst B1 3" конца PCR клона

Используя специфический праймер, соответствующий положениям 1414-1438 в Aust B1 (последовательность ID N 6), PCR продукт дает полосу предсказанного размера около 1,3 кb. Секвенирование клонированной полосы приводит к получению последовательностей ID N 12 и 13. Они дают ORF из 1-615 bp и практически нетранслируемый участок.

Анализ последовательностей клонированных PCR продуктов

Составы последовательностей, описанных ранее и обозначенных H11-1, H11-2 и H11-3, представлены на фиг.2. Аминокислотные последовательности, предсказанные для них, представлены на фиг. 6a. Значения предсказанных трансляций представленных ДНК последовательностей совершенно подтверждаются соответствием с аминокислотными последовательностями, определенными деградацией Эдмана из CN Br и протеолитическим расщеплением фрагментов (фиг.7). Так, 27 остатков из 29 остатков N-терминальной последовательности H11S (последовательность ID N 16) соответствуют H11-2 из остатков 61-90 (фиг.7b). Соответствия валина (V) в положении 78 и глицина (G) в положении 90 являются характеристическими для H11-1, тогда как H11-3 имеет аспарагин (N) в положении 90 и H11-1 имеет лейцин (L) в положении 86 (что соответствует положению 78 в H11-2). Два остатка H11S N-конца аминокислотной последовательности (последовательность ID N 16) не соответствуют ни одной из трех представленных H110D последовательностей. Особо следует отметить точное соответствие очень близких, но различающихся послодовательностей Pep A и B (ранее описанных в WO 90/11086) с H11-2 и H11-1, соответственно на участке остатков 540-555. Аналогично, на участке остатков 450-470 Pep D точно соответствует H11-2, тогда как аналогичная, но различающаяся Pep E более близко соответствует H11-3.

В качестве примера транслированную аминокислотную последовательность одной из полной длины последовательностей (H11-3) сравнивают на фиг. 6b с двумя последовательностями микросомных аминопептидаз млекопитающих. Гомологичность H110D трансляции с этими аминопептидазами представлена как заключение в прямоугольник идентичных аминокислот. Характеристическим фрагментом микросомных аминопептидаз является аминокислотная последовательность HEXXHXW, которая функционирует как сайт связывания цинка (Jongeneel et al., 1989; Vallee et al., 1990); это показано звездочками на фиг. 6. Эта последовательность, которая должна присутствовать в трансляциях H11-1, H11-2 и H11-3, является консервативной во всех микросомных аминопептидазах. Другими характеристиками, общими для микросомных аминопептидаз Haemonchus и млекопитающих, являются присутствие сравнительно коротких внутриклеточных участков, отдельной трансмембранной последовательности, соседней с N-концом, и несколько потенциальных сайтов гликолизирования. Уровни гомологии (сходства в 52-55%, идентичности в 30-32%) H11-1, -2 и -3 с микросомными аминопептидазами млекопитающих представлены в таблице 2.

Саузернблоттинг

Результаты Саузернблоттинга H. contortus геномной ДНК, зондированной различными H110D кДНК клонами и PCR продуктами, представлены на фиг. 10. Все зонды демонстрируют множество полос гибридизации; это типично для мультигенного семейства. Как и ожидалось, B1A и Aust B1 демонстрируют аналогичный ход гибридизации друг с другом, так же, как и M1AUS и 3,5 кb PCR. Однако эти схемы заметно отличаются друг от друга и от того, что наблюдается для 2,5 кb PCR зонда, даже в условиях умеренной жесткости (фиг. 10а), что отражает различные уровни гомологичности между этими тремя кДНК.

Демонстрация активностей аминопептидаз, связанных с H110D

Было обнаружено, что активность микросомной аминопептидазы связана с теми фракциями, которые содержат H110D, т.е. надосадочная жидкость после ультрацентрифугирования Thesit экстрактов, ConA связывающих фракций (ConA H110D) и фракций, содержащих H110D, полученных ионообменной хроматографией на Mono Q колонке (таблица 3). Специфические активности со всеми тестированными субстратами повышаются с повышением чистоты H110D.

Влияние ингибиторов аминопептидаз млекопитающих на активности аминопептидазы H110D

Добавление ингибитора бестатина (который ингибирует микросомную аминопептидазу млекопитающих) к ConA H110D в концентрациях, рекомендуемых изготовителем (Boehriger Mannheim), снижает активность против лейцин-р-нитроанилида приблизительно на 70%. Проведена серия экспериментов для определения активности ингибирования для ряда протеазных ингибиторов. Те ингибиторы, которые не специфичны для металлопротеаз или аминопептидаз, но обладают ингибирующим эффектом на скорость реакции. Те ингибиторы, которые, как известно, влияют на металлопротеазу или аминопептидазу, оказывают влияние на скорость реакции, как видно из данных таблицы 4. Наиболее эффективным ингибитором оказался 5 мМ фенантролин (см. таблицу 4).

Субфракционирование H110D

Распределение активностей, связанных с фракциями после ионообменной хроматографии ConA H110D на Mono Q, представлено на фиг. 13a, а SDS-PAGE фракций - на фиг. 13b.

Далее, энзиматическая активность связана с субфракциями H110D, разделенными рециклизацией изоэлектрического фокусирования свободного потока (фиг. 14 и 15). При низких значениях pI (pH 4,5) эти субфракции содержат только более крупные из полос, составляющих H110D дублет, видный на SDS-PAGE, а при более высоких значениях (pH 6,5) они содержат только меньшие полосы, которые составляют H110D дублет. Промежуточные фракции содержат все эти полосы. Меньшие полосы можно также получить как отдельную фракцию с помощью ионообменной хроматографии на Mono Q, используя Pharmacia SMART аппарат. Все эти субфракции связывают антитела овец с H110D аффинно-очищенных на протеине, экспрессированном gt II клоном M1, тогда как антитела, элюированные из gt II без вставки, не связывают (фиг. 14c). Все субфракции связывают мышиные моноклональные антитела, обозначаемые TSЗ/19,7 (фиг. 14c), которые также связываются с рекомбинантным протеином, экспрессируемым клоном M1. Все субфракции демонстрируют микросомную антипептидазную активность (фиг. 15c), хотя эта активность сравнительно ниже для фракций, полученных при наиболее высоких и наиболее низких значениях pI. Эта более низкая активность может быть приписана более низкой концентрации протеинов, эффектам крайних значений pH во время субфракционирования или требованиями наличия как наибольших, так и наименьших полос для максимальной активности.

Вакцинация выделенными компонентами H110D

Выделенные высшие и низшие полосы, полученные изоэлектрическим фокусированием свободного потока или ионообменной хроматографией, индуцируют образование защитных антител, когда их инъецируют в овец, что иллюстрируется следующим экспериментом. 30 овец возраста примерно 6 месяцев разделяют на 5 групп по 6 овец так, чтобы вес овец в каждой группе был одинаковым. Каждому животному инъецируют по 150 мкг протеина в трех равных дозах по способу Munn et al. (1992) и Tavernor et al. (1992a, b) за промежуток времени 54 дня. Животным в группе L вводят нижние (меньшие) полосы H110D дублета, группе U верхнюю полосу, L+U - снова объединенные верхнюю и нижнюю полосы, D - две (неразделенные) полосы, полученные изоэлектрическим фокусированием свободного потока при промежуточных значениях pH, и в качество контроля (группа C) ферритин селезенки лошади (антигенный неродственный протеин). Овец заражают 10000 инфекционных личинок спустя три недели после третьей инъекции, и эксперимент заканчивают на 29-31 день после инфицирования.

Результаты эксперимента суммированы на фиг. 16. Введение любой из субфракций снижает количество яиц паразитов в эксперименте на 90% и уменьшает полное количество червей на 63-84%, причем все демонстрируют существенное отличие (p < 0,05) по сравнению с контролями, используя непараметрический статистический анализ. Уменьшение количества червей-самок (70-88%) оказывается больше, чем уменьшение количества червей-самцов, и (за исключением уменьшения количества самцов-червей у овец, которым вводили рекомбинантные верхнюю и нижнюю полосы, составляло p < 0,07) для обоих полов уменьшение было значительным (p < 0,05).

Вакцинация H11S и H11A

Усеченную, водорастворимую форму H110D (H11S, которая сохраняет энзиматическую активность) можно получить из нативной молекулы, обработанной эластазой. Обнаружено, что эта форма содержит преимущественно ApM-подобную активность, a Thesit экстракт эластазного перевара (H11A) обогащен ApA-подобной активностью.

Отношение

Аминопептидаза-M (лейцин-pNA): - Амиропептидаза-A (- глутаминовой кислоты-pNA)

H110D - 1,44:1

H11S - 26,0:1

H11A - 0.48:1

Нижеследующий эксперимент показывает, что вакцинация овец либо H11S, либо Н11A обеспечивает защиту против Haemonchus заражения или инфицирования. 18 овец (примерно восьмимесячных) делят на 3 группы по 6 так, чтобы в каждой группе вес овец был примерно одинаков. Каждому животному вводят всего 100 мкг протеина в двух равных дозах по способу Munn et al. (1992) и Tavernon et al. (1992a, b) за 23 дня. Животным в группе A вводят H11A, группе S вводят H11S, а группе C - ферритин селезенки лошади (антигенно неродственный протеин) в качество негативного контроля. Затем овец заражают 10000 инфекционных личинок спустя 25 дней после второй инъекции, и экcперимент заканчивают через 34-36 дней после инфицирования. Результаты эксперимента приведены на фиг. 17. Введение H11S снижает количество яиц паразитов за время эксперимента на 89% и снижает полное количество червей на 76%. Введение H11A уменьшает количество яиц паразитов за время эксперимента на 84%. Это показывает заметное различие (p < 0,05) от контрольных значений по данным непараматрического статистического анализа.

Ингибирование H110D аминопептидазной активности антителами

Растворы, содержащие H110D, инкубируют сывороткой от отдельных овец, которым были введены фракции, содержащие H110D от контрольных овец. Затем растворы анализируют на активность аминопептидазы с использованием фенилаланина и - глутаминовой кислоты pNA в качестве субстратов. Степень ингибирования активности (максимально 80%) коррелирует с уровнем защиты, демонстрируемым отдельными овцами, у которых отбирали сыворотку (см. фиг. 18).

Локализация энзиматической активности

Замороженные отрезки взрослых Haemonchus contortus исследуют на активность аминопептидазы. Как видно на фиг. 19, активности энзима аминопептидазы локализованы в люминальной поверхности кишечника. H110D протеин также специфически обнаружен в этом место.

Экспрессия H110D (3,5 PCR клон. 2) с использованием эукаротической системы бакуловирус-клетки насекомого

Экспрессия аминопептидазной активности в клетках насекомого

Инфицированные клетки собирают и оценивают на аминопептидазную активность, используя phe-, leu-, met- и lys -pNA в качество субстратов. Анализ осложняется наблюдением, что клетки насекомых обладают аминопептидазной активностью с заметным преимуществом для lys-связвнных амидных связей. Однако клеточные экстракты, содержащие экспрессированный H110D дополнительно расщепляются leu-, met- и phe-pNA в порядке предпочтительности.

Молекулярный вес и иммунореактивность экспрессированного H110D (3,5 PCR клона 2) протеина

Образцы инфицированных или контрольных клеточных экстрактов обрабатывают электрофоретически на 7,5% SDS-полиакриламидном геле, который затем окрашивают Кумасси синим. 3,5-2-Р3А и 3,5-2-P4A инфицированные клеточные лизаты оба содержат полосу того же размера, что и H110D, 110 кb, которая мигрирует непосредственно под совместно-экспрессированным - gal, который имеет молекулярный вес 120 кb. Эта полоса 110 кb не присутствует ни в одном из негативных контрольных лизатов. (Она также отсутствует в P2A лизате, который не экспрессирует энзимную активность).

Дубликатный гель подвергают Вестернблоттингу и зондируют анти-H110DN (фиг. 21). Очень сильная, специфически позитивная иммунореакция наблюдается для 110 кb полосы, экспрессированной 3,5-2-P3A и 3,5-2-P4A, и для нативного H110D дублета в контрольной полосе, содержащем ConA H110D, тогда как реакция не наблюдается ни для одной из контрольных негативных полос.