липосомы, содержащие материалы, состоящие из частиц

Формула изобретения

1. Способ образования липосом, содержащих не растворенный или не растворимый в воде, состоящий из частиц биологически, химически или физически активный материал, отличающийся тем, что включает в себя следующие стадии: (а) образование липосом, (в) сушку замораживанием (лиофилизацию) образованных таким образом липосом и (с) регидратацию лиофилизированных липосом и материала, который должен в них содержаться.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что липосомы имеют диаметр более 0,1 мкм и регидратацию проводят в мелкоизмельченной смеси с указанным материалом.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что липосомы являются однослойными, на стадии образования липосом получают однослойные липосомы с размером, достаточным для помещения в них включаемого материала, и регидратацию проводят в мелкоизмельченной смеси с указанным материалом.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что липосомы являются многослойными, на стадии образования липосом получают однослойные липосомы с диаметром, меньшим диаметра целевой многослойной липосомы, и стадию лиофилизации проводят в присутствии указанного материала.

5. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что фактически весь органический растворитель, использующийся для получения липосом на стадии (а), удаляют перед гидратацией.

6. Способ по любому из пп.1 - 5, отличающийся тем, что фактически весь органический растворитель, использующийся для получения липосом на стадии (а), удаляют перед стадией лиофилизации (в).

7. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что указанный материал, фактически не растворенный или не растворимый в воде, содержит микроорганизм, клетку растения или животного или не растворимую в воде структуру, имеющие неустойчивую в органическом растворителе биохимическую или иммунологическую активность.

8. Способ по любому из пп.2, 3 или 5 - 7, отличающийся тем, что стадия (а) образования липосом включает в себя образование липосом с диаметром 0,1 - 50,0 мкм.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что липосомы являются гигантскими липосомами с диаметром 1 - 30 мкм.

10. Способ по любому из пп.1 - 9, отличающийся тем, что стадию (в) проводят с материалом, который должен быть инкапсулирован, уже плотно смешенным с липосомами.

11. Способ по любому из пп.1 - 10, отличающийся тем, что после регидратации к липосомному продукту добавляют протектор против эффектов потери воды.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что протектор представляет собой трегалозу.

13. Способ по пп.1 - 12, отличающийся тем, что стадию (с) проводят путем регулируемого добавления воды в малом количестве, достаточном только для образования суспензии, с последующим добавлением после первого периода в несколько минут подобного количества подходящего буфера, биологически совместимого с инкапсулируемым материалом, так чтобы сохранить его желаемую активность, и полученную таким образом суспензию смешивают с большим объемом буфера после второго периода в несколько минут.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что первый и второй периоды составляют 20 - 40 мин каждый.

15. Способ по п.13 или 14, отличающийся тем, что добавленный буфер представляет собой солевой раствор с фосфатным буфером, pH которого приблизительно составляет 7,4.

16. Способ по любому из пп.1 - 15, отличающийся тем, что стадию лиофилизации (в) проводят путем сушки замораживанием суспензии липосом и инкапсулируемого материала, а общий объем воды и солевого раствора, добавляемых на стадии регидратации (с), достаточен для обеспечения 1 - 10-кратного объема суспензии.

17. Способ по любому из пп.1 - 16, отличающийся тем, что липосомы, образованные на стадии (а), содержат липидную композицию, включающую в себя фосфатидилхолин (РС) и/или дистеароилфосфатидилхолин (DSPC).

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что липидная композиция дополнительно содержит один или несколько из таких компонентов, как холестерин, фосфатидилглицерин (PC) и триолеин (ТО).

19. Способ по любому из пп.1 - 18, отличающийся тем, что стадию образования липосом (а) осуществляют смешиванием раствора липидной композиции в хлороформе с раствором сахарозы с получением эмульсии и эмульсию смешивают с подобной эмульсией эфира в воде с получением эмульсии типа вода в масле в воде, после чего, по существу, весь органический растворитель удаляют, что приводит к образованию липосом.

20. Способ по пп.1 - 19, в котором материал, который должен содержаться в липосоме, включает в себя живой микроорганизм или клетку растения или животного, отличающийся тем, что после стадии регидратации (с) микроорганизм или клетку снабжают питательными веществами через стенку липосомы так, что микроорганизм или клетка культивируются и размножаются.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что питательные вещества содержат ингибитор способности микроорганизма или клетки метаболизировать липид липосомы.

22. Способ по п.20 или 21, отличающийся тем, что клетка находится в форме споры.

23. Способ отделения липосом от незахваченных, не растворенных или не растворимых в воде, состоящих из частиц материалов, отличающийся тем, что предусматривает помещение смеси этих двух компонентов на градиент плотности сахарозы с концентрацией 0,4 - 4,0 М, или градиент, содержащий равноценный диапазон плотности, и/или сахар и центрифугирование ее, удаление фракций градиента, сбор фракций, содержащих отдельные липосомы, и отделение липосом от фракций со свободными материалами, собранными в более нижних слоях.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что липосома получена способом, как указано в любом из пп.1 - 22.

25. Липосома, отличающаяся тем, что она содержит один или несколько живых или аттенюированных микроорганизмов клетки растений или животных или не растворимых в воде структур, имеющих неустойчивую в органическом растворителе биохимическую или иммунологическую активность.

26. Липосома по п.25, отличающаяся тем, что имеет диаметр более 0,1 мкм.

27. Липосома по п.25, отличающаяся тем, что является однослойной липосомой.

28. Липосома по п.25, отличающаяся тем, что является многослойной липосомой.

29. Липосома по п.25, отличающаяся тем, что она получена по способу одного из пп.1 - 22.

30. Липосома по любому из пп.25 - 29, отличающаяся тем, что она содержит живые или аттенюированные вирусы, бактерии и/или простейшие.

31. Липосома по любому из пп.25 - 30, отличающаяся тем, что живые или аттенюированные микроорганизмы выбраны из вируса кори, полиовируса, Bordetella pertussis, Bacille Calmette-Guerin и Salmonella typhy.

32. Липосома по п.25 или 31, отличающаяся тем, что не растворимые в воде неживые структуры включают в себя материалы-носители, несущие цитокин, антиген или антитела.

33. Липосома по любому из пп.25 - 32, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит водорастворимые биохимически или иммунологически активные материалы.

34. Липосома по любому из пп.25 - 31, с диаметром 0,1 - 50,0 мкм в виде препарата с другими такими липосомами, которая содержит жизнеспособные бактериальные споры в количестве более 4 спор на везикулу на сферу липосомы со средним диаметром 6,2 мкм.

35. Липосома по п.34, отличающаяся тем, что она является многослойной и число жизнеспособных спор в названном препарате составляет 6 спор на сферу липосомы со средним диаметром 3,2 мкм или более.

36. Липосома по п.34, отличающаяся тем, что она является однослойной, и число жизнеспособных спор в названном препарате составляет 13 спор на сферу липосомы со средним диаметром 7,2 мкм и более.

37. Композиция, содержащая физиологически приемлемый носитель и одну или более липосом или препарат липосом по любому из пп.25 - 36.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается липосомных препаратов, применимых в введении лабильных в органических растворителях материалов, так как целые живые или аттенюированные клетки, в тело человека или животного. Такие препараты имеют применение в доставке лабильных биоактивных материалов, посредством которых обеспечивается медленное высвобождение, которое может быть направлено к конкретным зонам тела.

Применение липосом для введения вакцинных агентов хорошо известно, и их адъювантная активность была продемонстрирована многочисленными исследованиями в иммунопотенциировании большого разнообразия бактериальных, вирусных, содержащих простейшие, белковых и пептидных вакцин (см. обзоры GregoriacHs G (1990) Immunol Today, 89-97 и Alving С R (1991) J Immunol Meth. 140. p1- 13).

Все эти исследования проводили с использованием липосом, получаемых способами, генерирующими везикулы с субмикронным средним диаметром (см. Gregoriadis G (ed) (1993) Liposome Technology, 2nd Edition, Volumes 1-111 CRC Press, Boca Raton, 1993), которые способны включать в себя пептиды и белки, но не способны быть эффективными носителями более крупных вакцин. Такие более крупные вакцины включают в себя ряд аттенюированных или убитых вирусов и бактерий, таких как вирус кори, полиовирус, Bordetella pertussis, бацилла Calmette-Guerin и Salmonella typhi (см. Mimms C A et al (1993) Medical Microbiologi, Chapter 36, Mosby).

Хотя большинство этих вакцин обладает высокой иммуногенностью, существуют обстоятельства, при которых их введение в достаточно большие липосомы может быть предпочтительной альтернативой. Например, в случае поливалентных вакцин, состоящих из смеси растворимых и состоящих из частиц (например, микробных) антигенов, или вакцинных препаратов, содержащих также цитокины, одновременное предоставление всех материалов иммунокомпетентным клеткам через общий липосомный носитель может быть выгодным с точки зрения улучшения иммуногенности к антигенам.

Кроме того, известно, что липосомы, содержащие антигенный материал в их водной фазе, предотвращают взаимодействие антигена с его антителами в предиммунизированных животных и последующие аллергические реакции или нейтрализацию антигена (Gregoriadis and Allison (1974) FEBS Lett., 45, 71- 74. Таким образом, можно видеть, что липосомы могли бы давать преимущество при использовании их в качестве носителей для введения вакцин младенцам грудного возраста в целях профилактики против агентов, для которых присутствовали материнские антитела, например, таких как вирус кори или индивидуумам с гиперчувствительностью к вакцинным примесям.

Известно включение материалов в виде частиц в большие липосомы, имеющие средний диаметр до 9,2 мкм, при помощи способов, в которых растворители, такие как хлороформ, образуют маленькие сферические тела, содержащие капельки воды меньшего размера (см. Kim and Martin (1981) Biochimica et Biophysica Acta, 646, 1-9). При помощи этого способа были заключены в сферы такие материалы, как коллаген, ДНК и бактерии (Streptococcus salivarius), но было замечено, что лабильные глобулярные белки, такие как сывороточный альбумин и гемоглобин, не позволяют образования липосом, предположительно, благодаря поверхностной денатурации и что имеет место денатурация белков. Такой способ непригоден для инкапсулирования лабильных материалов из-за повреждающего и цитотоксического действия органического растворителя и определенно непригоден для инкапсулирования целых (живых) или аттенюированных бактерий, простейших, вирусов или клеток многоклеточных животных или растений.

Способы заключения растворимых материалов в липосомы без применения органических растворителей в стадии инкапсулирования были известны в течение нескольких лет (см. Kirby and Gregoriadis (1984) Liposome Technology, Vol I, Gregoriadis G (ed), CRC Press, Inc Boca Raton, FL, pp 19-28: Deamer and Uster (1983) Liposomes, Ostro M J (ed) Marcel Dekker, Inc, NY, pp 27-51; Deamer and Barchfield (1982) J Mol Evol 18, 2032206), и они основаны на способе, который дегидратирует предварительно образованные липосомы, а затем регидратирует их в присутствии растворимых материалов. В этих способах растворимые материалы входят с водой, т.к. сливание липосом вместе приводит к инкапсулированию материала в многослойные липосомы. Используемые липосомы имели 40-80 нм в диаметре перед сушкой замораживанием, а полученный объем многослойных пузырьков (везикул) был еще меньше. Такой объем и такая структура непригодны для инкапсулирования мкм-размера и/или живых материалов, и уровни инкапсулирования для растворимых лекарственных средств не так высоки, как для однослойных липосом вследствие относительно низкой площади поверхности для вхождения в пузырьки. Тот же самый способ был применен также для небольших однослойных липосом с целью инкапсулирования водных растворов (см. ЕР 0171710).

Вышеупомянутый способ является относительно мягким и его применяли для успешного инкапсулирования неустойчивых растворенных веществ, таких как фактор VIII (см. Kirby and Gregoriadis (1984) Biotechnology, 2, 979-984) и столбнячный токсоид (Gregoriadis et а1 (1987) Vaccine, Vol 5, p 145-151). Он основан на вхождении растворенного вещества в липосомы при их образовании с одновременным вхождением в липосомы воды. Несмотря на подобную работу на растворенных веществах, все еще не был создан способ для инкапсулирования лабильных (неустойчивых) частиц, несущих целые (живые) или атгенюированные организмы, клетки или другие нерастворимые структуры, бактериальные, содержащие простейших, вирусные или др., без их повреждения.

Кроме того, пока еще не создан способ для инкапсулирования неустойчивых в воде растворимых материалов в липосомах большего размера, однослойных или многослойных, который сделал бы возможным направление к специфическим тканям еще больших количеств материала.

Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что дегидратация/регидратация способна обеспечить успешное инкапсулирование нерастворимых частиц, таких как целые живые или аттенюированные организмы, клетки или микроскопические нерастворимые в воде структуры, имеющие неустойчивую в органических растворителях активность, посредством которого организмы не убиваются и активность сохраняется. Изобретение позволяет получать однослойные и многослойные липосомы размером несколько микрометров (т.е. 0,1-50 мкм в диаметре), которые в противоположность предшествующим липосомам способны инкапсулировать частицы размером несколько мкм и/или живой материал и имеют внутренние пузырьки относительно высокой емкости, сходные по размеру с их наружным диаметром в случае однослойных гигантских липосом.

Особенно удивительно, что i) при дегидратации и последующей регидратации липосом размером в несколько мкм однослойная липосомная структура сохраняется, что обеспечивает улучшенную емкость для растворенного материала, а также способность удерживать описанные выше частицы, и (ii) при использовании таких условий, при которых образуются многослойные липосомы, содержащие нерастворимый или нерастворенный материал, они имеют скорее размер нескольких микрон, чем получаемый ранее размер с диаметром 40-80 нм.

Таким образом, в первом аспекте изобретения обеспечен способ образования липосом с диаметром более 0,1 мкм, предпочтительно более 1 мкм, содержащих нерастворенный или нерастворимый биологически, химически или физически активный материал в виде частиц, предусматривающий (а) образование однослойных липосом, (b) лиофилизацию полученных липосом и затем (с) регидратацию их в тонкоизмельченной (плотной) смеси с нерастворенным или нерастворимым материалом, который должен содержаться в липосомах. Когда должны быть получены однослойные липосомы, стадия (а) образует липосомы с диаметром более 0,1 мкм и использует их в стадии (b).

Когда должны быть получены многослойные липосомы, размер этих липосом не должен фиксироваться в стадии (а), а определяется нерастворенным или нерастворимым материалом, с которым они предпочтительно лиофилизируются в стадии (b) перед регидратацей в стадии (с).

Стадию лиофилизации (сушка охлаждением), в случае как однослойных, так и многослойных липосом, предпочтительно проводят со смесью липосом и материала, который должен быть инкапсулирован, и эту стадию можно проводить известными способами лиофилизации липосом. Стадия регидратации предпочтительно регулируется таким образом, чтобы число липосом, разрушенных осмотическим давлением, индуцированным концентрациями растворенных веществ, генерируемыми вхождением воды в везикулы, было минимальным.

Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает далее липосомы, полученные способом первого аспекта изобретения, и, в частности, обеспечивает липосомы, характеризующиеся тем, что они имеют диаметр более 1 мкм и содержат биологически, химически или физически активные материалы, активность которых повреждалась или разрушалась бы контактом с органическими растворителями.

Особенно предпочтительно, чтобы весь какой-либо органический растворитель, применяемый в стадии (а) получения липосом, был удален перед стадией (с) регидратации, наиболее предпочтительно перед стадией лиофилизации (b).

Предпочтительными материалами в виде частиц являются микроорганизмы, в том числе бактерии, простейшие и вирусы, клетки растений и животных или нерастворимые в воде структуры, имеющие неустойчивую в органическом растворителе биохимическую или иммунологическую активность. Следует заметить, однако, что любая нерастворимая в воде частица может быть инкапсулирована при помощи этого способа. Например, плохо растворимые катализаторы или лекарственные средства могут быть также включены в липосомы, так что может быть достигнуто медленное выделение их в тело больного. Однако, поскольку нет оснований ожидать неблагоприятного действия органических растворителей на эти материалы, такой способ был бы лишь одним из выбираемых способов, который мог бы при меняться вместо известных способов; основное преимущество этого предпочтительного аспекта данного способа реализуется в его применении к чувствительным к органическим растворителям микроорганизмам, клеткам и материалам и в достижении увеличенной емкости с многослойными липосомами.

Стадия (а) образования липосом может использовать любой из известных способов, в том числе способы, включающие в себя применение растворителей при их изготовлении, поскольку эти способы удаляют такие растворители, оставляя полые тела. Эти полости образуют пузырьки (везикулы), в которые должны быть помещены растворы, микроорганизмы, клетки или нерастворимые структуры после захвата. В типичном случае для получения однослойных липосом стадия (а) будет включать в себя способ образования так называемых "гигантских липосом" подходящего размера для инкапсулирования материала, добавляемого в стадии (с). Пригодным является, например, способ, Kim and Martin, описанный выше. Более предпочтительно, эти липосомы должны быть размером на уровне "микрометров" или "микронов", т.е. иметь диаметр, как определено здесь, от 0,1 до 50,0 мкм, более предпочтительно 1 - 50 мкм. Для получения многослойных липосом могут быть образованы стандартные, полученные дегидратацией/ регидратацией пузырьки (DRV).

Для наиболее удовлетворительных скоростей инкапсулирования стадию лиофилизации (b) проводят с материалом, который должен быть инкапсулирован, уже мелкоизмельченным в смеси с липосомами. Таким образом достигались относительно высокие скорости инкапсулирования, тогда как если смесь липосом и материала для инкапсулирования не была достаточно мелкоизмельченной (плотной), более вероятно незначительное включение или отсутствие включения. Это не так, когда включаются растворы, как в прежних способах.

Стадию (с) проводят любым способом регидратации, позволяющим липосомам впустить инкапсулируемый материал. Было обнаружено, что удобно включать процедуру, в которой воду в любой доступной форме, например, дистиллированную или водопроводную воду, или буферный раствор добавляют регулируемым образом клиофилизированной смеси липосом и инкапсулируемого материала. Предпочтительно, сначала добавляют дистиллированную воду во избежание дальнейшего осмотического стресса для структуры липосом. Ее удобно добавлять в малом количестве, достаточном лишь для получения суспензии, с последующим (после нескольких минут, предпочтительно после 20-40 мин) добавлением сходного количества буфера, пригодного для того, чтобы инкапсулируемый материал сохранял его желаемую активность, одним из таких буферов является содержащий фосфатный буфер солевой раствор (PBS) pH 7,4. Также и в этом случае буфер предпочтителен на этой стадии для балансирования высокого осмотического давления раствора, образующегося в пузырьках липосом, когда материалы, присутствующие перед стадией высушивания, медленно регидратируются.

Полученную таким образом суспензию предпочтительно смешивают с большим объемом буфера, например, PBS, после дополнительного периода, опять предпочтительно после 20-40 мин, предпочтительно в течение 30 мин. Эти липосомы обычно лиофилизируют из суспензии липосом и общего объема воды и солевого раствора, добавленного при регидратации, обычно достаточно для обеспечения 1-10-кратного объема суспензии, хотя здесь нет конкретных ограничений.

Стадию регидратации можно проводить при любой температуре, совместимой с жизненностью или поддержанием желательной активности материала, который должен быть инкапсулирован. Поэтому обычно любая температура от 0 до 60^oC может быть выбрана, когда в липосомах используют липиды с высокой точкой плавления и материал, который должен быть инкапсулирован, устойчив к этой температуре. При использовании живых материалов или белков более обычны были бы 0-40^oC, предпочтительно 10-30^oC. Однако следует понимать, что определенные организмы и белки способны выдерживать обработку при более высоких температурах.

Для наибольшего увеличения выживания лабильной активности и целостности липосом при хранении может быть выгодным включение криопротектора для противодействия влияниям замораживания и потери воды. Такими типичными протекторами являются сахара и их производные, в частности, такие сахара, как трегалоза (см. Crowe and Crowe in Liposome Technology (1993) Vol 1, pp 229-249, CRC Press Inc. Boca raton), со способами их применения, хорошо известными специалистам в этой области.

Композиция преформированных липосом, получаемых в стадии (а), также не ограничена конкретно, но она должна позволять стабильное образование липосом, имеющих достаточную способность для удерживания инкапсулируемого материала. Типичные липидные композиции, применяемые для образования так называемых "гигантских липосом" и DRV, включают в себя фосфатидилхолин (PC) или дистеароилфосфатидилхолин (DSPS) и их необязательно дополняют такими компонентами, как холестерин, фосфатидилглицерин (PG) и/или триолеин (ТО). Можно также применять другие компоненты, известные в данной области, или усовершенствованные на их основе компоненты, которые обеспечивают стабильность липосом или индуцируют образование везикул.

Образование гигантских липосом из таких смесей удобно достигается смешиванием раствора в хлороформе этих соединений с раствором сахарозы с образованием эмульсии, затем смешиванием полученной смеси с подобной эфирно-водной эмульсией с образованием эмульсии типа вода в масле в воде, из которой удаляют органические растворители для генерирования липосом. Образование DRV может быть достигнуто путем растворения эквимолярных PC или DSPC или холестерина в хлороформе и роторного испарения смеси с получением тонкой пленки липидов на стенке колбы. Затем эту пленку разрушают при 4^oC (для PC) или 60^oC (для DSPC) 2 мл дистиллированной воды с последующим разрушением ультразвуком в течение 2 мин для получения небольших однослойных пузырьков (SUV). После этого суспензия пригодна для лиофилизации с инкапсулируемым сулируемым материалом, в результате чего образуются многослойные DRV с диаметром более 0,1 мкм.

В третьем аспекте данного изобретения обеспечен способ отделения липосом изобретения от незахваченных микроорганизмов, клеток или водонерастворимых структур, характеризующийся тем, что помещают смесь их на градиент плотности и центрифугируют его. Фракции градиента удаляют, собирают фракции, содержащие отделенные липосомы и выделяют из них липосомы общепринятыми способами. Свободные материалы обычно собираются в нижних фракциях, а липосомы в верхних фракциях. Предпочтительным является сахарозный градиент 0,4 - 4 М, в том числе эквивалентный диапазон плотности или аналогичный сахар. Если требуется также отделение растворимых материалов, то липосомы центрифугируют приблизительно при 600 g в буфере, например, PBS и собирают в виде осадка.

Таким образом, четвертым аспектом данного изобретения является форма липосом изобретения, не содержащая неинкапсулированной формы нерастворенных или нерастворимых частиц, которые они содержат. Такие формы, конечно, обладают преимуществом при определении предоставляемой дозы.

Как отмечалось в вводных абзацах выше, иногда выгодно доставить более одного агента к зоне-мишени больного одновременно, и данное изобретение обеспечивает это преимущество, при котором липосомы изобретения, способ их приготовления и способ отделения их от незахваченных материалов позволяют содержать или доставлять водорастворимый агент. Таким образом, липосомы, получаемые способом второго аспекта изобретения, могут содержать живые или аттенюированные микроорганизмы, клетки и/или водонерастворимые структуры вместе с водорастворимыми агентами, такими как вакцины, антитела, антигены или ферменты.

Таким образом, этот способ получения липосом изобретения будет, если необходимо содержание растворимых материалов, включать растворимый материал и нерастворимый материал с липосомами в стадии регидратации, предпочтительно в стадии лиофилизации, и для отделения незахваченного материала от липосом будут использовать способы как градиента плотности, так и центрифугирования в буфере.

Дальнейший аспект данного изобретения, благодаря уникальным преимуществам вышеуказанных аспектов, обеспечивает новые липосомы, характеризующиеся тем, что они содержат живые или аттенюированные микроорганизмы, клетки растений или животных или водонерастворимые неживые структуры, имеющие неустойчивые в органических растворителях биохимическую или иммунологическую активности. Последние включают в себя убитые организмы, которые сохраняют желательную активность, которая неустойчива к обработке органическими растворителями. Липосомы данного изобретения можно легко идентифицировать на основе того, что их содержимое можно выделить и показать, что оно сохранило способность к культивированию и/или к вызыванию биохимических или иммунологических ответных реакций. Кроме бактерий, простейших, клеток и вирусов, липосомы данного изобретения могут содержать неживые структуры, такие как материалы, несущие цитокин, фермент, антиген или антитела, причем такими материалами-носителями могут быть бусины латекса или другие полимерные тела-носители.

В предпочтительной форме этого аспекта липосомы и, следовательно, их везикулы имеют диаметр от 0,1 до 50 мкм, предпочтительно от 1 до 30 мкм и наиболее предпочтительно 1-14 мкм с наиболее предпочтительным средним диаметром (5,52,2 мкм), но требуемый размер пузырьков будет обязательно диктоваться количеством или размером раствора, микроорганизма, клетки или водонерастворимой структуры, который предназначен для инкапсулирования. Для этой цели способы, которыми первоначально образуются липосомы, не являются важными и, следовательно, изменение в размере пузырьков потенциально нелимитировано, т.к. обеспечен способ включения лабильных материалов, в частности микроорганизмов или нерастворимых структур, в уже готовые липосомы без убивания или инактивирования этих материалов или нарушения целостности липосом.

Применение липосом данного изобретения делает возможной специфическую направленную доставку к макрофагам, фагоцитам и/или продуцирующим антитела клеткам тела, благодаря тому факту, что предпочтительные липосомы, такие как стабилизированные холестерином, PG или равноценными материалами, фактически не выделяют самопроизвольно их состоящее из частиц содержимое. Поэтому судьба этого материала состоит в обработке макрофагами или фагоцитами, в результате чего иммунная ответная реакция и относящиеся к ней эффекты, например, цитокины, усиливаются. Кроме того, то, что частица защищена от циркулирующих в крови антител липидом, до контактирования с макрофагами или фагоцитами, гарантирует максимальную доставку к иммунной системе и продуцирующим антитела клеткам.

Липосомы и способы данного изобретения будут теперь иллюстрироваться ссылкой на следующие чертежи, не ограничивающие примеры, и сравнительный пример. Многочисленные другие пригодные липосомы и способы их получения, охватываемые объемом данного изобретения, будут вполне очевидны для специалистов данной области в свете этих чертежей и примеров.

Образование гигантских однослойных липосом

В этих примерах преформируют гигантские липосомы, которые имеют средний диаметр (5,50,2) мкм, и смешивают их с состоящими из частиц или растворимыми материалами с последующей регулируемой регидратацией.

Было обнаружено, что полученные липосомы сохраняют их первоначальный средний размер и диапазон диаметров и содержат до 26,7% (средняя величина) добавленных материалов. Содержащие частицы липосомы можно было бы лиофилизировать в присутствии трегалозы с извлекаемостью большей части (до 80 %) захваченного материала в пузырьках, образуемых при реконституировании (восстановлении) с солевым раствором.

Источники и чистота яичного фосфатидилхолина (PC), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), холестерина, иммуноочищенного столбнячного токсоида и трегалозы были описаны в другом месте (Davis and Gregoriadis, 1987, 61, 229- 234). Фосфатидилглицерин (PG) и триолеин (ТО) были из Lipid Products (Nuthill, Surrey) и Sigma Chemical Company (London) соответственно. Убитые Bacillus subtilis и Bacille Calmette-Guerin (BCG) были подарком от доктора Bruce Jones (PubUc Health Laboratories Service, Porton Down, Salisburi, Wilts) и доктора J.L. Stanford (Dept of Medical Microbiology, UCL Medical Scool, London), соответственно. Радиоактивное мечение столбнячного токсоида, В. subtilis и BCG ¹²⁵I проводили, как описано ранее (Kirby and Gregoriadis, 1984, как описано выше). Мечение В. subtilis флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (Sigma) проводили инкубированием этих бактерий в 1 мл 0,1 М натрийкарбонатного буфера (pH 9,0), содержащего 1 мг FITS, в течение 24 ч при 4^oC (Mann and Fish (1972) Meth. Enzymology, 26, 28-42) Все другие реагенты были аналитической чистоты.

Фиг. 1 показывает процент добавленной радиоактивности или липида фракций градиента для центрифугирования в плотности сахарозы гигантских липосом, содержащих меченую ¹²⁵I В. subtjlis. Отделение захваченных липосомами от не захваченных липосомами бактерий (A) и пустых липосом от добавленных свободных бактерий (b) проводили при помощи разделения в сахарозном градиенте, как описано ниже. Показанные распределения радиоактивности (о) и липида () являются типичными для PC или DSCP липосом, полученных любым из способов, описанных в сравнительном примере и примере 1 ниже. Величины представляют собой процент радиоактивности или липида, применяемых для фракционирования.

Фиг. 2 показывает процент удерживания B.subtilis в липосомах изобретения в зависимости от времени инкубирования в плазме. PC или DSPC липосомы, содержащие ¹²⁵I меченую В. subtilis, инкубировали с мышиной плазмой (о) или РВS () при 37^oC. С интервалами времени пробы фракционировали на сахарозном градиенте для отделения свободной В. subtilis от захваченной липосомами, и величины для опытов в трех повторностях представляют собой % + SD (стандартное отклонение) радиоактивности, извлеченной липосомами.

Фиг. 3 показывает удерживание столбнячного токсоида липосомами изобретения в присутствии плазмы. PC или DSPC липосомы, содержащие ¹²⁵l) меченый столбнячный токсоид, инкубировали в присутствии плазмы (о) или PBS () npu 37^oC. С временными интервалами пробы центрифугировали при 600 g для отделения свободного от захваченного токсоида. Величины из трех повторностей представляют собой % +SD (стандартное отклонение) радиоактивности, извлеченной липосомами.

Фиг. 4 показывает выведение столбнячного токсоида и В. subtilis после внутримышечной инъекции в мышей. Мышей инъецировали их в задние лапки свободным (о) или захваченным липосомами () ¹²⁵I меченым столбнячным токсоидом (A) или В. subtilis (В). Животных убивали с интервалами времени и определяли радиоактивность в ампутированной лапке. Каждая величина представляет трех животных и выражена как %+SD радиоактивности, обнаруженной в лапке сразу после инъекции.

Сравнительный пример.

Получение содержащих вакцину гигантских липосом в присутствии органических растворителей

Гигантские липосомы с инкапсулированными в них материалами получали по способу испарения растворителя малых сфер (Kim and Martin, 1981) с модификациями. Вкратце, 1 мл 0,15 М раствора сахарозы, содержащего ¹²⁵I меченый материал для инкапсулирования (210³-10⁴ имп/мин; 1-2 мг столбнячного токсоида и 10⁵ бактерий В. subtilis в виде спор), смешивали при помощи вортекса в течение 45 с с 1 мл раствора хлороформа, содержащего PC или DSPC, холестерин, HG и ТО (4:4:2:1 молярное соотношение, 9 мкмолей общих липидов). Полученную эмульсию типа вода в хлороформе смешивали при помощи вортекса в течение 15 с с эмульсией типа диэтиловый эфир в воде, приготовленной из 0,5 мл раствора липидов, описанных выше, в диэтиловом эфире и 2,5 мл 0,2 М раствора сахарозы. Полученную таким образом эмульсию типа вода в масле в воде помещали в коническую колбу на 250 мл и органические растворители выпаривали промыванием азотом при 37^oC при осторожном перемешивании в шейкерном термостате.

Образовавшиеся липосомы центрифугировали дважды при 600 g в течение 5 мин с 5%-ным раствором глюкозы и осадок ресуспендировали в 0,1 М содержащем фосфат натрия буфере с добавлением 0,9 % NaCl, pH 7,4 (PBS). Эта последняя стадия позволяла разделить заключенный в липосомы и свободный токсоид. Для отделения незахваченных бактерий В. subtilis (которые осаждались вместе с липосомами) применяли фракционирование в сахарозном градиенте (см. ниже). В некоторых экспериментах FITC-меченые частицы полистирола (0,5 и 1 мм диаметром, Polysciences) или FITC-меченые B.subtilis были инкапсулированы, как описано выше, в липосомы, которые применяли в флуоресцентно- микроскопических исследованиях.

Пример 1. Инкапсулирование живых вакцин в преформированных гигантских липосомах по способу изобретения

Для захвата потенциально неустойчивых состоящих из частиц материалов гигантскими липосомами в отсутствие органических растворителей "пустые" гигантские липосомы, содержащие только сахарозу, готовили, как описано в cравнительном примере (в двух получениях общее количество липида было 36 мкмоль и центрифугировали через 5%-ный раствор глюкозы в настольной центрифуге при 600 g в течение 5 мин.).

Осадок липосом ресуспендировали в 1 мл 0,1 М натрий- фосфатного буфера с добавленным 0,9 % NaCl, pH 7,4 (PBS), смешивали с 1 мл раствора или суспензии инкапсулируемого материала (В. subtilis в виде спор, столбнячного токсоида и BCG и виде спор) и лиофилизировали, как описано ранее (Gregoriadis et al, 1987; Kirby and Gregoriadis, 1984) обработкой под вакуумом. Обычно 2 мл суспензии липосом в дистиллированной воде смешивали с 2 мл суспензии или раствора инкапсулируемого материала в круглодонной колбе на 50 мл или стеклянной пробирке с диаметром 21 мм и смесь быстро замораживали в виде тонкой оболочки путем перемешивания с завихрением в морозильной смеси из cardice и изопропанола. После замораживания препараты лиофилизировали, например, в лиофилизаторе Hetosicc, при вакууме 0,1 тор в течение 5 ч или при 13 Па в течение ночи.

Лиофилизированный материал регидратировали сначала добавлением 0,1 мл дистиллированной воды при 20^oC (регидратация липосом, содержащих DSPC с высокой точкой плавления, при 50-60^oC не обнаружила значительного действия на % захваченного материала). Эту суспензию интенсивно перемешивали вортексом и давали ей стоять в течение 30 мин. Процесс повторяли после последовательного добавления 0,1 мл PBS и 0,8 мл PBS спустя 30 мин. Все материалы для инкапсулирования были помечены ¹²⁵I для оценки поглощения. В одном эксперименте содержащие В. subtilis липосомы, приготовленные, как описано выше, лиофилизировали в присутствии 0,25 М (конечная концентрация) трегалозы и затем восстанавливали в PBS.

Пример 2. Отделение липосом, содержащих инкапсулированный материал, от неинкапсулированного материала

Отделение инкапсулированного от некапсулированного материала проводили центрифугированием в сахарозном градиенте (B.subtilis и BCG; см. ниже) или центрифугированием при 600 g в течение 10 мин с последующим суспендированием дважды промытого PBS осадка в 1 мл PBS (столбнячный токсоид). Удерживание В. subtilis восстановленными пузырьками оценивали при помощи фракционирования в градиенте плотности сахарозы. Ступенчатый сахарозный градиент готовили (Gregoriadis, (1970) J. Biol. Chem 245, 5833-5837) путем наслаивания 10 разведении (содержание сахарозы в пределах от 0,4 до 4 М) 4 М раствора сахарозы в центрифужных пробирках для бакет-ротора. Препараты (1 мл) с захваченными и незахваченными В. subtilis или BCG из примера 1 помещали на верхний слой градиента и затем центрифугировали в течение 1,5 ч при 25000 об/мин, в Dupont Combi Plus ультрацентрифуге при помощи бакет-ротора. После центрифугирования фракции по 1 мл брали пипеткой с верхнего слоя градиента и анализировали на ¹²⁵I радиоактивность в Wallac Minigamma счетчике и на содержание фосфолипидов (Stewart, (1979) Anal. Biochem. 104, 10- 14). Отделение липосом от сахарозных фракций проводили разведением их водой или PBS, например, с применением достаточного количества разбавителя, чтобы сделать объем пригодным для пробирок бакет-ротора, затем центрифугированием их при 600 g в течение 10 мин, как для удаления неинкапсулированного столбнячного токсоида.

Измерение размера везикул (пузырьков). Средний диаметр с точки зрения распределения объемов гигантских липосом измеряли в Makvem Mastersizer.

Световая микроскопия. Исследования при помощи светового микроскопа на липосомах, содержащих FITS-меченые B.subtilis или частицы полистирола, проводили при помощи Nicon микроскопа и конфокального микроскопа Leica, причем оба были оборудованы источниками флуоресцентного света. Для улучшения визуализации липосом их окрашивали путем добавления масло-red-O в раствор липидов в хлороформе во время получения липосом.

Стабильность гигантских липосом в плазме PC или DSPC гигантские липосомы (3-5 мг общих липидов), содержащие радиоактивно меченый столбнячный токсоид (10³ имп/мин; 0,1 - 0,2 мг) или B.subtilis (3-510³ имп/мин.; 10³ бактерий), готовили по способу изобретения, как в примерах 1 и 2, и смешивали в трех повторностях с 5 объемами мышиной (самец, CDI штамм) плазмы или PBS и инкубировали при 37^oC. С интервалами времени пробы удаляли и удерживание захваченных материалов липосомами определяли путем фракционирования в сахарозном градиенте (В. subtilis) или центрифугирования при 600 g (токсоид). Стабильность пузырьков выражали как процент исходного инкапсулированного материала, удерживаемого пузырьками. Выведение захваченных липосомами токсоида и В. subtilis после внутримышечной инъекции в мышей

48 самцов CDI мышей (вес тела 20-25 г) произвольно делили на 4 группы из 12 животных и инъецировали внутримышечно в заднюю лапку 0,1 мл (а) свободного радиоактивно меченого токсоида (610³ имп/мин; 0,01 мг), (b) свободной радиоактивно меченой В. subtilis (310³ имп/мин/ 10³ бактерий в виде спор); (c) токсоида, как в (а), захваченного по способу примера 1 в DSPC липосомы (1 мг общего липида); (d) В. subtilis, как в (b), захваченной в DSPC липосомы, как в (с). Животных в группах из трех животных убивали и задние лапки удаляли сразу после инъекции (для установления величин O-времени) и с интервалами времени. ¹²⁵I измеряли в ампутированных лапках и результаты выражали в виде процента радиоактивности, выделенной в ткани при O-времени.

Результаты: исследования инкапсулирования. Оценка захвата в гигантские липосомы B. subtilis не может быть достигнута центрифугированием, т.к. оба материала осаждаются при низкой скорости. Однако полное разделение получали при помощи фракционирования в сахарозном градиенте, как уже описано. Величины ¹²⁵I радиоактивности (В. subtilis) и фосфолипида (липосомы), измеренные во фракциях после центрифугирования, показывают, что содержащие бактерии PC и DSPC липосомы были получены в верхних 10 фракциях по 0,5 мл градиента, тогда как свободная B.subtilis осаждалась в нижних фракциях.

Было обнаружено, что средний (+SD) диаметр этих пузырьков в восьми различных PC и DSPC препаратах, приготовленных согласно протоколу примеров, варьировал значительно (5,52,2 мкм) с нижним и верхним пределами диаметра 1-14 мкм. Не было статистически значимого различия в среднем диаметре между PC и DSPC липосомам. Возможность, что бактерии адсорбируются поверхностью пустых пузырьков, не может приниматься во внимание, т.к. инкубирование таких липосом с В. subtilis в течение 22 ч перед градиентным центрифугированием приводило к количественному получению бактерий в нижней фракции. На основании присутствия В. subtilis в верхних 10 фракциях сахарозного градиента (что согласовалось с присутствием липосомного фосфолипида в тех же самых фракциях) захват В. subtilis в 12 отдельных экспериментах по способу Kim and Martin варьировал со средней величиной 31,6 % примененных бактерий. Однако попытки инкапсулировать таким же способом столбнячный токсоид (в присутствии органических растворителей) не удались, предположительно, вследствие денатурации белка в интерфазе вода-хлороформ и последующей неспособности измененного белка оставаться в водной фазе.

Это открытие и перспектива подобного повреждения или иного способа инактивации других белковых антигенов и аттенюированных или живых микробов, предназначенных для инкапсулирования, показывает успех данного способа и получаемых им липосом данного изобретения. Регулируемая регидратация порошка, полученного лиофилизацией преформированных липосом с В. subtilis, DCG и столбнячным токсоидом, приводила к образованию пузырьков со средним диаметром (4,61,3 мкм и нижним и верхним пределом 1-18 мкм; все препараты), сходным с диаметром родительских пузырьков (см. выше), содержащих вариабельные, но значительные доли В. subtilis, BCG и токсоида (8,4 - 27,8 % использованного материала). Не было значимого различия в величинах захвата В. subtilis, полученных при помощи данной процедуры и по способу Kim and Martin, но в отличие от указанного способа способность к бактериальному росту при инокуляции содержимого липосом на культуральные чашки сохранялась.

Морфологические исследования. Световая микроскопия обнаружила, что почти все гигантские пузырьки, окрашенные oil red-O, содержали варьирующее число FITS-меченых бактерий В. subtilis, которые во многих случаях, по-видимому, прилипали (или осаждались) к внутренней стенке пузырьков. Эксперименты с применением частиц из полистирола и частиц из латекса (0,5 и 1 мкм в диаметре) в качестве состоящего из частиц материала для инкапсулирования в липосомах с диаметром 18 мкм дали сходные результаты. То, что локализация частиц внутри липосом была достигнута, дополнительно подтверждалась конфокальной микроскопией, которая позволила визуализировать их в различных "срезах" пространства внутри пузырьков.

Стабильность гигантских липосом в плазме. Важным предварительным требованием для успешного применения липосом в качестве носителей живых или аттенюированных микробных вакцин (в отдельности или в комбинации с растворимыми антигенами) в предиммунизированных животных (животных с материнскими антителами к этим вакцинам или с антителами к вакцинным примесям) было бы исключение взаимодействия между антителами и вакцинами перед их доставкой к несущим антиген клеткам. Более ранняя работа (Gregoriadis and Allison, 1974) показала, что такое взаимодействие действительно исключено при внутривенной инъекции содержащих белок многослойных липосом в мышей, предыммунизированных этим белком: тогда как все животные, инъецированные свободным белком, умерли от анафилактического шока, животные, получавшие инкапсулированный белок, выжили, предположительно, вследствие заключения антигена внутри бислоев. Подобным образом не было реакции Артуса в таких мышах, инъецированных подкожно (в подушечку стопы) липосомным антигеном (Gregjriadis and Allison, 1974). Следовательно, было интересно посмотреть, сохраняют ли гигантские липосомы, полученные способом дегидратации/регидратации, все еще их состоящее из бактерий или столбнячного токсоида инкапсулированное содержимое в присутствии плазмы крови мышей при 37^oC.

В этом случае содержащие В. subtilis PC гигантские липосомы сохраняли 80-90 % из бактериального содержания в течение по меньшей мере 24 ч в присутствии плазмы. Поскольку приблизительно 10% бактерий высвобождались вскоре после смешивания с плазмой, возможно, что они представляли собой бактерии, адсорбированные на поверхности липосом во время захвата, и затем удалялись плазменными компонентами. Это подтверждается фактом, что липосомы, экспонируемые с PBS, сохраняли все свое содержимое В. subtilis. Удерживание В. subtilis DSPC липосомами в присутствии плазмы было даже большим (более 95%) в течение приблизительно 7 ч. Далее, величины удерживания незначительно отличались от величин, наблюдаемых в присутствии PBS, возможно, вследствие того, что липосомный бислой, содержащий DSPC, в их структуре мог быть более жестким и, следовательно, более устойчивым к адсорбции частиц. В противоположность почти количественному удерживанию В. subtilis (диаметр 0,8 мкм), гигантские липосомы, по-видимому, постепенно теряют значительные количества содержания токсоида в присутствии плазмы, причем эта потеря более выражена в случае PC (48%), чем в случае DSPC липосом (38%; 24-часовые величины).

Стабильность гигантских липосом in vivo после внутримышечной инъекции. Степень удерживания столбнячного токсоида и В. subtilis гигантскими липосомами после внутримышечной инъекции в мышей нельзя было оценивать непосредственно, например, измерением выделившихся и инкапсулированных материалов в мышечных тканях. Однако рассудили, что сравнение скоростей выведения (клиренса) свободных и заключенных в липосомы столбнячного токсоида и В. subtilis из ткани могло бы дать указание о степени, до которой липосомы удерживают их содержимое in situ. Гораздо больше (67% от содержания, измеренного в ткани сразу после инъекции) столбнячного токсоида, введенного через липосомы, обнаружили в ткани через 10 ч после инъекции, чем токсоида, введенного в свободном виде (27%). Эта значительная разница в скоростях выведения (клиренсе) между двумя препаратами токсоида (инкапсулированным и свободным) предполагает, что большое количество токсоида удерживается в пузырьках in situ.

На основании низкой скорости выведения липосомного токсоида можно полагать, что липосомы постепенно дестабилизируются, выделяя токсоид, который будет затем выводиться из ткани в виде свободного токсоида. Однако возможно, что часть пузырьков, особенно пузырьков небольшого размера, может также перемещаться в лимфатическую систему. Скорости выведения свободной и липосомной В. subtilis, с другой стороны, были сначала сходными и если предположить, что липосомы, содержащие В. subtilis или токсоид, дестабилизированы (и выделяют их содержимое) до одной и той же степени в их локальное окружение, то более медленное выведение липосомной В. subtilis (по сравнению с липосомным токсоидом) во время первых 5 ч обусловлено, возможно, одинаково медленным выведением свободных бактерий. Тем не менее значительная разница в тканевых уровнях между двумя препаратами В. subtilis через 24 ч после инъекции указывает значительную степень, до которой липосомы остаются стабильными в инъецированной ткани.

Так, было показано, что применение растворителей, вредных для живых или аттенюированных микробов и присутствие детергента в препаратах, делающее их токсичными для применения in vivo, можно исключить при помощи данного изобретения. Липосомы, приготовленные согласно данным способам, сохраняют (при выделении из наружной среды) большую часть содержащихся в них бактерий или растворимого антигена в присутствии плазмы крови и значительную часть их in vivo. Таким образом, липосомы не только могли бы служить в качестве иммуноадъювантов для микробных вакцин, в соединении с одновременно инкапсулированными растворимыми антигенами или цитокинами, если требуется, но также в качестве носителей живых или аттенюированных микробных вакцин в случаях, когда существует необходимость предотвращения взаимодействия последних с материнскими антителами или преформированными антителами к вакцинным примесям.

Кроме того, данное изобретение позволяет инкапсулирование микроорганизмов или клеток внутри липосом с последующим культивированием их в инкапсулированном состоянии для увеличения "дозы" активного материала без необходимости оптимизации стадии инкапсулирования. Например, только немного клеток требуется инкапсулировать в стадии регидратации, затем их можно обеспечить питательными элементами через стенку липосомы, предпочтительно с ингибитором липидного метаболизма, так что они размножаются, делая липосомные пузырьки более сильно загруженными желаемым материалом. Как только достигается подходящая загрузка, липосомы лиофилизируют для хранения с последующей регидратацией непосредственно перед их применением.

Образование многослойных липосом данного изобретения

Пример 3. Инкапсулирование живых спор и других материалов в многослойных DRV липосомах

Небольшие однослойные пузырьки, состоящие из PC или DSPC и эквимолярного холестерина (18 мк/моль фосфолипида), готовили, как описано в Kirby and Gregoriadis, 1984), в результате чего фосфолипид и холестерин растворяли в хлороформе, который затем испаряли в роторном испарителе с образованием тонкой липидной пленки на стенках колбы. Пленку разрушали при 4^oC (PC) или 60^oC (DSPC) 2 мл дистиллированной воды и затем разрушали ультразвуком в течение приблизительно 2 мин, получая SUV в суспензии. Эту суспензию смешивали с 2 мл ¹²⁵I мечеными живыми спорами (10⁷), 100-150 мкг ¹²⁵I меченым токсоидом или смеси радиоактивно меченых спор и немеченого токсоида и лиофилизировали в течение ночи. Лиофилизированный материал смешивали интенсивно с 0,1 мл воды при подходящей температуре (как в примере 2) и давали стоять в течение 30 мин. Эту стадию повторяли с 0,1 мл PBS и после 30 мин к суспензии добавляли 0,8 мл PBS. Конечную суспензию фракционировали на сахарозном градиенте для отделения инкапсулированных от неинкапсулированных спор или центрифугировали при 90000 g дважды в течение 20 мин для отделения свободного токсоида от инкапсулированного токсоида. Немеченый токсоид измеряли по способу с флуоресцамином (Anderson and Desnick (1979) J. Biol. Chem., 254, 6924).

Результаты: инкапсулирование спор было неожиданно высоким (63,6-78 %) вопреки прежним открытиям об относительно малом размере пузырьков для этого типа пузырьков. Средний размер для PC-DRV был 3,6 мкм и для DSPC-DRV 3,2 мкм в диаметре.

Жизнеспособность спор:

Гигантские или DRV липосомы, содержащие споры В. subtilis, тестировали на жизнеспособность спор путем обработки их Тритоном Х-100 для высвобождения спор. Их серийно разводили в питательном бульоне и затем высевали на чашки с агаром для оценки общего числа колоний, определения количества жизнеспособных спор и среднего числа жизнеспособных спор на отдельный пузырек. Результаты представлены в таблице 1, в которой даны числа колоний.

Число колоний, продуцируемых каждым обработанным тестируемым препаратом, было гораздо больше, чем наблюдаемое с интактными липосомами; споры внутри интактных липосом были способны образовать только одну колонию. Данные таблицы показывают, что можно было найти до 20 спор в отдельных пузырьках без видимой связи между числом спор и примененным фосфолипидом. Существовала положительная связь между числом инкапсулированных спор и размером пузырьков.

Среди 6 разных примененных препаратов гигантских липосом самое низкое число спор получили для самого малого диаметра пузырька и наивысшее число спор для самого большого диаметра пузырька. Однако в случае DRV их меньший размер не был отражен в более низких числах спор.

Споры В. subtilis инкапсулировали в гигантские липосомы по способу сравнительного примера (А), примера 1 (В) или DRV липосомы, как PC, так и DSPC липиды применяли для приготовления соответствующих типов. Определение числа спор на пузырек (везикулу) выполняли делением числа колоний после обработки Тритоном на число контроля, при этом число колоний в варианте с Тритоном равно числу жизнеспособных спор, высвобождающихся из пузырьков. Число колоний в контроле эквивалентно числу пузырьков, т.к. инкапсулированные споры продуцируют только одну колонию. Показано токсическое действие растворителя (способ A) на споры, этот эффект увеличивался на растущих бактериях.