способ разделения смеси жирных кислот фракции c₂ - c₇ методом газожидкостной хроматографии

Формула изобретения

1. Способ разделения смеси жирных кислот фракции С₂ - С₇ методом газожидкостной хроматографии, включающий подготовку пробы биологического субстрата, введение образца в испаритель хроматографа и разделение на колонке с неподвижной фазой, отличающийся тем, что в испаритель вводят надосадочную жидкость, а разделение проводят на кварцевой капиллярной колонке длиной 30 1 м, внутренним диаметром 0,25 0,02 мм с использованием в качестве неподвижной фазы сополимера полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой в виде пленки толщиной 0,25 мкм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что подготовку пробы осуществляют путем ее обработки дистиллированной водой, или хлористоводородной кислотой, или последовательно дистиллированной водой и хлористоводородной кислотой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области хроматографического разделения веществ и может быть использовано, в частности, для аналитического исследования биологических субстратов и других объектов, содержащих смесь летучих жирных кислот (уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой, капроновой и энантовой).

Известен способ разделения жирных кислот фракции C₂-C₆, включающий подготовку пробы путем гомогенизации в растворе NaOH, центрифугирование, упаривание, добавление H₂SO₄, экстракцию смеси кислот серным эфиром в присутствии сернокислого натрия, введение экстракта в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 3 метра с внутренним диаметром 3 мм, заполненную 5%-ным полиэтиленгликолятадипинатом на хромосорбе, модифицированным 2% H₃PO₄ (Тамм А.О. и др. "Метаболиты кишечной микрофлоры в диагностике дисбиоза" в журнале "Антибиотики и медицинская биотехнология" т. 32, N 3, 1987, с 191-195)

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ, предусматривающий разделение смеси жирных кислот фракции C₂-C₆ методом газожидкостной хроматографии, включающий пробоподготовку образца биологического субстрата путем добавления H₂SO₄ до pH 2-3, перегонки с паром, добавление NaOH до pH 9-10, упаривания пробы, добавления серного эфира и H₂SO₄ до pH 3, введения подготовленного образца в виде эфирного раствора в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 1,2 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненную неподвижной фазой (15% Carbowax 20М, модифицированной терефталевой кислотой (1,5%) на Chromaton с диаметром зерна 0,16-0,20 мм) ("Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза (дисбиоза) в клинике внутренних болезней" Методические рекомендации МЦ УДПРФ под редакцией проф. Минушкина О.Н., проф. Минаева В.Н., Москва, 1997, с 16-17)

Недостатками известных способов является сложность пробоподготовки, невысокая степень разделения смеси кислот на фракции, содержащие индивидуальные кислоты, приводящие к появлению систематических ошибок в оценке концентраций кислот.

Задачей настоящего изобретения является создание газохроматографического способа разделения жирных кислот C₂-C₇ из биологических субстратов, характеризующегося высокой степенью разделения при значительном упрощении пробоподготовки образцов.

Поставленная задача решается описываемым способом разделения смеси жирных кислот фракции C₂-C₇ методом газожидкостной хроматографии, включающим обработку пробы биологического субстрата водой или водным раствором хлористоводородной кислоты, или последовательно водой и кислотой, введения надосадочной жидкости в испаритель хроматографа и разделения на кварцевой капиллярной колонке длиной 301 метр с внутренним диаметром 0,250,02 мм с использованием в качестве неподвижной фазы пленки сополимера полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой при толщине пленки 0,25 мкм.

Ниже приведены примеры разделения смеси кислот C₂-C₇ с целью определения их содержания в различных биологических объектах.

Однако приведенные ниже примеры не ограничивают сферы применения заявленного способа разделения.

Пример 1

К пробе препарата (образец фекалий) весом 2,0 г приливают 3 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания летучих жирных кислот), перемешивают путем встряхивания в течение 10 минут, добавляют 2 мл 1 N HCl, центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин. Микрошприцем вводят пробы надосадочной жидкости в испаритель хроматографа с детектором ионизации в пламени, снабженном кварцевой капиллярной колонкой длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой - сополимером полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой в виде пленки толщиной пленки 0,25 мкм.

Режим работы хроматографа: изотермический с температурой термостата 140^oC, температурой испарителя и детектора 230^oC. Газ-носитель - азот, с давлением на входе в колонку 1,8 ати. Расход газа-носителя 2,0 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. Соотношение потоков газа-носителя на сброс и в колонку 50:1. Время хроматографирования 15 мин.

Результат разделения представлен на фиг. 1

Примеры 2-5

(Разделение кислот C₂-C₇ с целью их определения в слюне, церебральной жидкости, асцитической жидкости, сыворотке крови).

Образец жидкого биологического субстрата 2 мл помещают в пробирку для центрифуги, приливают к содержимому 1 мл 6 N HCl и 1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания C₂-C₇). Скоагулированные белки отделяют центрифугированием 7000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в испаритель хроматографа и ведут разделение при тех же условиях хроматографирования, как в примере 1. Время хроматографирования 15 мин.

Результаты разделения приведены на фиг. 2-5.

Пример 6. (без обработки биосубстрата хлористоводородной кислотой)

К пробе препарата (образец фекалий) весом 2,0 г приливают 3 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания летучих жирных кислот), перемешивают путем встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в испаритель хроматографа и ведут разделение при тех же условиях хроматографирования, как в примере 1.

Результаты разделения приведены на фиг. 6.

Представленные хроматограммы показывают четкие пики индивидуальных кислот, пригодные для точного расчета их содержания в анализируемых образцах.

На фиг. 7 представлена хроматограмма разделения кислот C₂-C₇ из стандартной смеси.

Содержание индивидуальных кислот в смеси осуществляется путем расчета площадей хроматографических пиков как методом "треугольника", так и методом компьютерной обработки хроматограмм.

Из представленных хроматограмм следует, что предложенный способ обеспечивает высокую степень разделения.