способ очистки гемоглобина в коммерческом масштабе

Формула изобретения

1. Способ очистки гемоглобина в коммерческом масштабе из сырого раствора, содержащего загрязняющие протеиноподобные вещества, путем ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что сырой раствор используют в концентрации 0,1 - 20%, раствор на первой стадии пропускают через колонку, заполненную либо анионообменником для очистки сырого раствора, в котором загрязняющие вещества имеют более кислую реакцию, чем гемоглобин, либо катионообменником для очистки сырого раствора, в котором загрязняющие вещества имеют более основную реакцию, чем гемоглобин, при этом непрерывное пропускание сырого раствора на первой стадии осуществляют вначале до полного насыщения колонки гемоглобином и компонентами с высоким сродством к соответствующему ионообменнику, а в дальнейшем - до сверхнагрузки колонки с последующим замещением на ней гемоглобина, на второй стадии осуществляют пропускание элюата, полученного на первой стадии, через анионо- или катионообменник, не выбранный на первой стадии, при этом хроматографию осуществляют также вначале до насыщения колонки гемоглобином и веществами с более высоким сродством к колонке, а затем до сверхнагрузки и замещения на ней гемоглобина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что первая стадия представляет собой анионообменную хроматографию, а вторая стадия - катионообменную хроматографию.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве предварительно отобранного гемоглобина применяют нормальный гемоглобин взрослого человека.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что первую стадию - анионообменный процесс - проводят при pH 5 - 9, используя пропускаемый раствор с низкой удельной проводимостью менее 3 миллиСименсов (мСм).

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что первую стадию - анионообменный процесс - проводят при pH 6,5 - 8,5, используя пропускаемый раствор с удельной проводимостью менее 1 мСм.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что пропускаемый раствор наносят на колонку со скоростью не выше 10 см в минуту.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что вторую стадию - катионообменный процесс - проводят при pH 6,5 - 8,5, используя пропускаемый раствор с удельной проводимостью менее 3 мСм.

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что вторую стадию - катионообменный процесс - проводят при pH 7 - 7,5, используя пропускаемый раствор с удельной проводимостью менее 1 мСм.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что пропускаемый раствор наносят на второй стадии на катионообменную колонку со скоростью не выше 10 см в минуту.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что концентрацию пропускаемого раствора на второй стадии катионообменной колонки составляет 2 - 6%.

Описание изобретения к патенту

Это изобретение касается очистки гемоглобина хроматографией и, более конкретно, относится к хроматографическому процессу очистки гемоглобина в коммерческом масштабе, который приводит к получению раствора гемоглобина, содержащего не менее 99% растворенного вещества. Данное изобретение также относится к новым препаратам гемоглобина, имеющим неожиданные полезные свойства для использования в качестве заменителя крови.

Разработка гемоглобина, основного заменителя крови, продолжает привлекать коммерческое внимание, и недавние разработки показали, что гемоглобин из кровяных клеток млекопитающих после соответствующей модификации, такой как, например, внутримолекулярное поперечное связывание и, в некоторых случаях, полимеризация, является многообещающим средством в качестве основы кровезаменителя. Однако по мере развития этой возможности постоянно повышаются требования к чистоте гемоглобина. Одно время предполагалось, что гемоглобину необходимо только, чтобы он был свободен от стромы, - условие, которое достигается промывкой и мягким лизингом красных кровяных клеток (эритроцитов) с последующей фильтрацией лизата. Впоследствии было обнаружено, что присутствие следовых количеств примесей, таких как фосфолипиды, приводит к более специфичным реакциям, например, к сужению кровеносных сосудов. Даже после того, как препарат подвергался различным стадиям фильтрации, он все еще содержал недопустимо высокие следовые количества потенциально опасных примесей, таких, как ферменты эритроцитов, модифицированные и различные формы гемоглобина, фосфолипиды и поверхностные антигены.

Одной из наиболее важных проблем в области кровезаменителей, особенно в области переносчиков кислорода на основе гемоглобина, является разработка эффективных процессов для рациональной и экономичной очистки гемоглобина в коммерческом масштабе. Этот препарат должен быть конкурентоспособным с другими потенциальными веществами, используемыми для увеличения объема плазмы, крови, и жидкостями, переносящими кислород, которые предлагаются в качестве кровезаменителей.

В то время как степень разделения и время анализа являются важными характеристиками в аналитическом выделении, решающими параметрами в препаративной хроматографии для использования в коммерческом или полукоммерческом масштабе являются следующие параметры:

- количество вещества, выделенного в единицу времени, с определенным уровнем чистоты (пропускная способность), и

- экономические характеристики процесса, такие как размер колонки, среда, буферные растворы, оборудование, рецикл и повторное использование компонентов, реагентов и т.п.

Методы очистки гемоглобина, которые бы отвечали критериям экономически эффективного способа получения, отсутствуют в литературе.

Кровезаменитель на основе гемоглобина требует либо единственной формы гемоглобина, либо, если присутствует более чем одна форма, - тщательного контроля состава известных форм гемоглобина. Таким образом, успешный способ очистки является необходимым для того, чтобы отделить одну форму гемоглобина от другой, а также для отделения требуемой формы гемоглобина от загрязняющих компонентов красных кровяных телец, таких, как ферменты эритроцитов, белки, фосфолипиды и антигены.

Хроматографические методы применялись для очистки растворов гемоглобина. В патенте США 4925474, Hsia и др. описывается техника аффиной хроматографии для очистки гемоглобина с использованием колонок, в которых лиганд, имеющий преимущественное химическое сродство к DPG-участку гемоглобина, связывается со стационарной фазой колонки.

Для очистки гемоглобина применялась также техника ионнообменной хроматографии. Основные принципы ионнообменной хроматографии хорошо известны. Смесь различных веществ в растворе наносится на соответствующим образом приготовленную ионнообменную колонку. Каждое из веществ в смеси имеет различное сродство к химическим реакционноспособным группам колонки. Изменяя условия на колонке, например pH раствора, отдельные вещества могут связываться или элюироваться с колонки избирательно, так чтобы отделить индивидуально одно из веществ из смеси. Применение этой техники для очистки белков, таких как гемоглобин, экономически невыгодно, за исключением случаев использования в малых масштабах и аналитических работах. Для очистки гемоглобина в промышленном масштабе для использования, например, в качестве переносчика кислорода в реанимационных растворах (кровезаменитель) эта техника для стандартного применения является нерациональной. Количество гемоглобина, которое требуется абсорбировать и затем элюировать из хроматографической колонки, так велико, что требуемые размеры колонки становятся невыполнимо большими и дорогими.

Christensen и др. , J.Biochem. Phys. 17 (1988), 143-154, описал хроматографическую очистку человеческого гемоглобина. Используемая методология представляет собой стандартный способ ионнообменной хроматографии и не дает возможности для экономичного производства на промышленном уровне.

Winslow и Chapman "Приготовление растворов гемоглобина в опытном масштабе", Methods in Enzymology (Pilot-scale Preparation of Hemoglobin Solutions), vol. 231, p3 (1984) описали получение стромсвободного гемоглобина (SFH), высокоочищенного гемоглобина Ао и поперечносвязанного гемоглобина, используя в качестве исходного материала устарелую человеческую кровь. SFH был получен фильтрацией. Гемоглобин Ао был получен из SFH хроматографией в крупном масштабе, используя сильную ионообменную среду и градиент высокой ионной силы.

Как Christensen и др. , так и Winslow и Chapman описанные выше работы выполняли в институте Letterman Army Institute for Research (LAIR), известном сейчас под названием Walter Reed Army Institute of Research.

В патенте США 5084588, Rausch и Feola (Biopure) описывается применение стандартного анионо- и катионообменного метода хроматографии для разделения и очистки гемоглобина. В случае анионообменной хроматографии в этом патенте приводится три стандартных подхода:

а) связывание Hb при повышенном pH и элюция градиентом с понижающимся pH или ступенчатым градиентом с более низким значением pH,

б) связывание Hb при высоких pH, низкой ионной силе и элюция солевым градиентом,

в) нагрузка со значениями pH, при которых гемоглобин не связывается с анионообменником и не задерживается на колонке, в то время как примеси (более кислые примеси) задерживаются на колонке.

Методы а) и б) подробно описаны, но они не подходят для производства в большом масштабе из-за ограничений, связанных с низкой емкостью, не позволяющей достигнуть достаточного разделения продуктов гемоглобина. Эта нагрузка обычно составляет 20-30 мг/мл и вынуждает применять недопустимо большие и дорогие колонки для очистки гемоглобина в коммерческом масштабе. Например, для одной дозы в 50 мг конечного переносчика кислорода на основе гемоглобина (HBOC) потребовалась бы колонка объемом 1,5-2,5 л.

Хотя подход в) кажется более рациональным, он дает на практике немодифицированный гемоглобин взрослого нормального человека Ао, который по своим хроматографическим свойствам и содержанию некоторых основных примесей, таких как HbAlc, не представляется удовлетворительным для практического применения.

Стандартные подходы катионообменной хроматографии для очистки гемоглобина млекопитающих имеют аналогичные ограничения.

В патенте США 5084588 также описывается получение растворов бычьего гемоглобина, в которых более чем 99,9% белка присутствует в виде бычьего гемоглобина, но в этом патенте не представлены данные по определению белковых компонентов.

Объект настоящего изобретения представляет собой новый хроматографический способ очистки гемоглобина.

Другим объектом настоящего изобретения является хроматографический способ, дающий в коммерческом масштабе и в экономически доступной форме гемоглобин в водном растворе с чистотой более 90% из загрязненного водного раствора, в котором содержится не менее 60% гемоглобина.

Еще одним и более специфическим объектом настоящего изобретения является получение водного раствора гемоглобина или поперечносвязанного гемоглобина в коммерческих количествах, в котором гемоглобин или поперечносвязанный гемоглобин составляет не менее 99% растворенного вещества, и их использование в указанной степени чистоты в качестве кровезаменителя с проявленными in vivo свойствами ранее не было описано.

Настоящее изобретение представляет собой способ, посредством которого водный раствор образцов предварительно разделенного гемоглобина (Hb) с содержанием Hb от 60 до 99% растворенного вещества подвергается ионообменной хроматографии в две стадии. Одной из стадий является анионообменная хроматография и другой - катионообменная хроматография. Эти два вида ионообменной хроматографии могут быть проведены в любом порядке. Сырой раствор предварительно разделенных образцов гемоглобина, например, HbAо, является сырьем для первой стадии хроматографии, например анионообменной хроматографии, в условиях, при которых все составные части смешанного растворенного вещества первоначально адсорбируются на твердой фазе хроматографической колонки. Для анионообменной хроматографии требуются относительно высокие значения pH. Условия также подобраны таким образом, что достигается очень эффективная нагрузка на колонку благодаря использованию исходного раствора с низкой ионной силой, что приводит к такой ситуации, в которой практически все доступные участки твердой хроматографической фазы заполняются веществами из исходного раствора. Собранный на этой стадии элюат не содержит белкового продукта. Замещение HbAо и примесей с низким сродством к колонке при выбранных условиях достигается затем нагрузкой дополнительных объемов водного исходного раствора, как описано выше. В достигнутых условиях, называемых здесь условиями перегрузки, примеси с более высоким сродством к колонке замещаются гемоглобином, а примеси с меньшим сродством элюируются из колонки. Если первой стадией хроматографического разделения является анионообменная хроматография, то примеси с большей кислотностью, чем выделяемые образцы гемоглобина, адсорбируются на твердой фазе хроматографической колонки и отделяются здесь от образцов Hb, которые появляются в элюате среди других более основных примесей. В том случае, когда в качестве первой стадии выбирают катионообменную хроматографию, более основные примеси отделяются от более кислотных примесей и образцов Hb, которые находятся в элюате, благодаря более высокому сродству первых в колонке.

Затем на второй хроматографической стадии данного способа изобретения проводится второй ионообменный процесс частично очищенных образцов Hb, содержащихся в элюате первой колонки, в условиях различных значений pH. Когда элюат из первой колонки содержит образцы гемоглобина и более основные компоненты, вторая стадия хроматографии является катионообменной хроматографией, и наоборот. Снова производится подача этого загрязненного раствора на вторую колонку, пока не достигается насыщающая и более высокая нагрузка, с тем чтобы создать условия перегрузки в колонке. В условиях перегрузки образцы предварительно разделенного гемоглобина элюируются с колонки путем замещения, осуществляемого примесями с большим сродством в выбранных условиях, и затем собираются в элюате второй колонки с высокой степенью чистоты. Способ изобретения можно в большинстве случаев называть "выполняемой в две стадии самозамещающей хроматографией".

В результате образцы Hb элюируются из колонки в исключительно чистом виде, обычно при более чем 90% чистоты и с коммерчески приемлемым выходом. Примеси более кислотные, чем разделенные образцы Hb, остаются связанными на одной смоле колонки, а более основные - на другой. Колонки могут быть легко регенерированы с использованием традиционных очищающих и регенерирующих методов.

Важнейшим фактором успешного проведения этого способа, особенно в большом, промышленном масштабе, являются селективные с высокой степенью нагрузки колонки по отношению к примесям, позволяющие элюировать образцы Hb.

Когда способ изобретения применяется для очистки человеческого гемоглобина Ао, производится новый вид человеческого гемоглобина, имеющий состав и свойства, не описанные ранее в литературе. Этот препарат гемоглобина составляет соответственно другой аспект настоящего изобретения, независимый от описанного здесь способа очистки. Этот продукт обладает высокоценными свойствами и характеристиками, ранее необнаруженными и неописанными в связи какими-либо препаратами человеческого гемоглобина Ао и особенно полезными при их использовании в качестве основы кровезаменителя. Среди этих свойств важным является полное отсутствие вирусных частиц, особенно липидных частиц инкапсулированных вирусов, полное отсутствие вазоактивности при его введении in vivo, отсутствие токсичности по отношению к эндотелиальным клеткам при инкубации in vitro, о чем свидетельствует пониженное высвобождение лактатдегидрогеназы в сравнении с подобным введением других препаратов гемоглобина. В добавление, что касается стандартных необходимых свойств гемоглобина для использования в качестве кровезаменителя, таких как отсутствие эндотоксинов и других пирогенов, продукт настоящего изобретения также имеет улучшенные свойства по сравнению с другими препаратами гемоглобина.

Сопроводительные чертежи

Фиг. 1 является графической иллюстрацией первоначальной ионообменной части предпочтительного способа настоящего изобретения.

Фиг. 2 является подобной иллюстрацией второй, катионной части предпочтительного способа настоящего изобретения.

Фиг.3 представляет собой аналитическую анионообменную хроматограмму, полученную по результатам примеров 2 и 3, приведенных ниже.

Фиг.4 представляет собой аналитическую анионообменную хроматограмму, полученную по результатам примера 4, приведенного ниже.

Фиг. 5 является графическим представлением результатов примера 8, приведенного ниже.

Фиг. 6 является копией бумажной полоски при анализе изоэлектрического фокусирования продукта примера 13, приведенного ниже.

Фиг.7 является копией результатов эксперимента по окрашиванию и блотированию, описанных в примере 13.

Фиг.8 графически представляет результаты примера 14, приведенного ниже.

Фиг. 9 и 9а графически представляют результаты примера 15, приведенного ниже.

Фиг.10 графически представляет результаты примера 16, приведенного ниже.

Заместительная хроматография или заместительная элюция, как это обычно называется, - известный метод в области разделения белков. Это один из трех методов, по которому образцы веществ выделяют из хроматографической колонки. Когда этот метод применяют для разделения соответствующих белков из раствора их смеси, белки с более высоким сродством будут замещать на матрице белки с меньшим сродством, так чтобы иерархия белков в заместительном порядке по сродству устанавливалась сверху в пределах колонки от входа до выхода. Когда белки замещают другие белки, отчетливая линия разделения между образцами белков образуется редко. Потому применение этой техники для получения высокоочищенного раствора единственного белка, такого как гемоглобин, является неприемлемой. Если для разделения выбирают небелковые вещества, то в результате хроматографическая матрица будет связана с веществами, имеющими очень высокое сродство, и носитель будет трудно регенерировать для повторного использования.

Основным промышленным использованием предложенного способа является получение очищенного гемоглобина взрослого человека Ао (HbAо) и таким образом оно будет в основном описано с включением литературных ссылок. Данный способ, однако, не ограничивается очисткой HbAо, но дополнительно применим и для других предварительно разделенных образцов гемоглобинов, таких как производные избирательно поперечносвязанного гемоглобина, отдельные виды бычьего гемоглобина, другие виды гемоглобина, такие как гемоглобин плода, серповидноклеточный гемоглобин и т.д., генноинженерный гемоглобин и т.д.

Способ данного изобретения чрезвычайно экономически выгоден при использовании для очистки HbAo в промышленном масштабе для производства кровезаменителей. Он обеспечивает особо высокоэффективную емкость колонки. Способ позволяет, следовательно, использовать колонки с относительно малыми размерами для очистки относительно больших объемов загрязненного раствора гемоглобина. Он может проводиться периодически или непрерывно для очистки данной партии раствора гемоглобина, полученной из красных кровяных телец (эритроцитов) по стандартной процедуре, растворов, обычно содержащих порядка 80% гемоглобина, но которые содержат обычно широкий набор примесей, как белковоподобных, так и небелковых. Более того, загрязненный раствор гемоглобина сам используется как средство замещения. При этом исключается обеспечение и использование различных вытеснителей с их неудобствами в обслуживании, сложностью и дороговизной.

Типичный общий способ для получения очищенного раствора HbAo, включающий методику настоящего изобретения, начинается с нормальных красных кровяных телец (эритроцитов) взрослого человека. Их объединяют и подвергают фильтрации для удаления лейкоцитов. Клетки промывают для удаления белков сыворотки и лизируют, чтобы экстрагировать гемоглобин и другие клеточные компоненты. Лизат фильтруют, чтобы удалить мембраны красных кровяных телец (эритроцитов), и затем образующийся раствор гемоглобина диафильтруют и концентрируют. Загрязненный экстракт гемоглобина обрабатывают окисью углерода для образования CO-Hb- комплекса и нагревают для пастеризации, тем самым инактивируя примеси вирусов в растворе. Эта смесь затем центрифугируется и фильтруется для удаления дальнейших остатков и клеточных осколков. После этого раствор подготовлен к осуществлению самозаместительного способа настоящего изобретения.

По предпочтительному осуществлению данного изобретения первой стадией хроматографического процесса является анионообмен, а второй - катионообмен. Первый анионообменный процесс проводят при высоких pH, например pH 7-10, и предпочтительно при pH 8,5 - 9,0 и в условиях низкой ионной силы, т.е. низкой удельной проводимости. Соответственно проводимость составляет менее 3 мСм (mS - миллиСименс) и предпочтительно менее 1 мСм. Такие условия определяют необходимость бессолевого буфера. Целевые образцы HbAo в этих условиях первоначально связываются со средой колонки вместе с другими веществами. Когда снабжение колонки загрязненным раствором HbAo продолжается, те вещества, которые проявляют более высокое сродство к матрице, чем NbAo, чаще всего более кислотные примеси, постепенно замещают HbAo и более основные примеси из колонки. В конце концов достигается сверхнагрузка колонки, так что весь HbAo и более основные примеси замещаются, оставляя связанными только более кислотные примеси. В большинстве случаев эта нагрузка в избытке превышает нагрузку колонки, рекомендуемую производителем. Таким образом, на этой стадии достигается хроматографическое разделение более кислых примесей от HbAo.

Снабжение загрязненным раствором гемоглобина проводится с низкой линейной скоростью потока, не выше 10 см/мин и предпочтительно 1 см/мин. Такая скорость допускает установление кинетического равновесия на колонке. Концентрация поступающего раствора не является решающим фактором, но подходящей является концентрация в пределах 0,1-20%, предпочтительно 2-7%.

Достижение сверхнагрузки может контролироваться анализом вытекающего из колонки раствора - когда он совсем не содержит или содержит только следы кислотных примесей, то достигается максимум практической нагрузки колонки.

Фиг. 1 сопутствующих чертежей иллюстрирует с помощью диаграмм часть анионообменного способа настоящего изобретения. Ионообменная колонка, имеющая химические группы -N+R3 (обычно анионообменная смола), показанная на стадии А этого способа на фиг. 1, снабжается раствором, содержащим смесь веществ, изображенных звездочками, для более кислотных примесей, эллипсы представляет собой HbAo и прямоугольники - более основные примеси. На стадии нагрузки, стадия В, в основном все активные химические группы N-R3 связываются электростатически с одним из веществ, содержащихся в смеси.

Наносят дополнительное количество того же раствора с тем, чтобы нагрузка на колонку достигла условий сверхнагрузки, что показано на фиг. 1, стадия С. Затем все более основные примеси (прямоугольники) и некоторые HbAo (эллипсы) замещаются оттуда более кислотными компонентами (звездочки), которые проявляют более высокое сродство к колонке при этих условиях. Продолжают снабжать дополнительным количеством этого раствора до сверхнагрузки колонки, достигая стадии D, показанной на фиг.1, на которой кислотные вещества замещают в основном весь HbAo из колонки благодаря их более высокому сродству в выбранных условиях. В этом случае вытекающая из колонки жидкость в основном не содержит кислотных примесей. Таким образом получают достаточно чистый раствор HbAo, но он еще содержит некоторое количество основных веществ.

Вторая стадия предпочтительного способа настоящего изобретения использует катионообменную колонку, и на нее наносят элюат с первой колонки в подобных условиях сверхнагрузки. Целевой HbAo и другие нежелательные более основные примеси связываются в сверхнагрузочных количествах. Частично очищенный раствор гемоглобина с первой колонки продолжает насыщать вторую колонку. Снова используется относительно низкая скорость пропускания раствора (10 см/мин или менее предпочтительно 1 см/мин), допускающая установление кинетического равновесия между твердой и жидкой фазой в элюате с первой колонки. Поддерживают pH 5-9, предпочтительно pH 6,5-8,5 и наиболее предпочтительно pH 7-8 перед нанесением элюата на катионообменную колонку. Используют раствор с низкой ионной силой, т.е. удельная проводимость меньше 3 мСм (mS - миллиСименс), предпочтительно менее 1 мСм. Удельная проводимость 2,5 мСм полезна только в случае очень низкой скорости потока и очень высокого разбавления используемого раствора. Снова используются условия сверхнагрузки. Белковоподобные примеси с большим сродством, т.е. более основные, чем HbAo, замещают HbAo на колонке, и, таким образом, HbAo элюируется и возвращается в исключительно чистом виде.

Фиг. 2 сопутствующих рисунков показывает с помощью диаграмм, подобно фиг. 1, часть способа, осуществляемого на катионообменной смоле, содержащей SO3-группы. Элюат с первой колонки после доведения до соответствующего pH наносится на колонку и первоначально в стадии А колонка насыщается как HbAo (эллипсы), так и более основными примесями (прямоугольники), путем электростатического связывания с химическими группами колонки. Хотя эти группы изображены как сульфогруппы, но равным образом могут быть выбраны и другие возможности, такие как карбоксильные группы. Нанесение элюэнтного раствора на колонку продолжают до достижения условий сверхнагрузки, показанное на фиг. 1, стадия В, в которой более основные примеси благодаря их большему сродству к колонке в этих условиях замещают HbAo на колонке. При продолжении нанесения раствора до сверхнагрузки колонки, как показано на фиг. 2, стадия С, почти 100% чистого HbAo замещается таким образом и находится в растворе в качестве элюанта с колонки. Соответственно, чем выше нагрузка колонки, тем выше процентное содержание полученного очищенного HbAo с колонки. Элюат анализируется для того, чтобы определить присутствие основных примесей (прямоугольников) в нем. Когда при замещении на колонке больше не обнаруживается HbAo, в этой точке определяют максимум ее нагрузки.

Используемый здесь термин "более основные примеси" относится к тем примесям, которые элюируются с колонки при более высоком pH, чем требуется для элюирования HbAo. В противоположность этому термин "более кислотные примеси" относят к тем примесям, которые элюируются с колонки при более низких pH, чем требуется для элюирования HbAo. В предпочтительном способе согласно данному изобретению, в котором первой проводится анионообменная хроматография, более основные примеси элюируются перед HbAo, а более кислотные примеси - после HbAo. В зависимости от использования ионообменной среды для хроматографии могут быть рассмотрены различные кривые элюции с незначительными отклонениями в порядке элюции.

Как для первой, так и для второй колонки скорость потока неочищенного раствора гемоглобина должна быть оптимизирована для избирательного концентрирования этого раствора. Линейная скорость потока 1 см/мин или меньше является оптимальной для растворов гемоглобина в концентрации 2-7%. Скорость потока выше 2 см/мин может успешно применяться для разделения более разбавленных растворов, например, менее чем 1%Hb. Ha разделение ионообменной хроматографией при низкой степени нагрузки обычно не влияет линейная скорость потока, однако для способа настоящего изобретения кинетическое равновесие в процессе хроматографии сильно зависит от скорости потока. Концентрация наносимого раствора не является решающей на любой стадии.

По методу заместительной хроматографии настоящего изобретения, используя сначала анионообменную хроматографию для удаления более кислотных компонентов и затем катионообменную хроматографию для удаления более основных примесей, можно достигнуть высокого выхода исключительно чистого HbAo, в основном полностью свободного от заметных количеств других белков, таких как сывороточные и мембранные белки, в промышленном масштабе. Чистота по данным аналитической анионообменной хроматографии составляет 99% и обычно более 99,5%. Эффективность процесса, по крайней мере, на порядок выше, чем при обычном хроматографическом подходе. Кроме удаления белковоподобных примесей, способ настоящего изобретения позволяет также исключительно полно удалить модифицированные и другие нежелательные формы гемоглобина, давая высокочистый HbAo (99,5%). Кроме того, как описано более детально ниже, может быть достигнуто практически полное удаление инкапсулированных вирусных частиц, как активных, так и неактивных.

Преимущества масштабности способа настоящего изобретения по сравнению со способом, использующим стандартную ионообменную хроматографию с адсорбцией-элюцией, показаны в табл. 1. Цифры в колонке "самозамещение" получены из рабочего примера способа данного изобретения, описанного ниже. Цифры в колонке "адсорбция- элюция" получены из вышеупомянутой статьи Winslow и др.

Из анализа этих цифр ясно, что самозаместительная хроматография по способу настоящего изобретения может быть проведена быстрее с достаточно небольшими колонками. Она может проводиться при низком давлении и температурах окружающей среды. Эффективная емкость может быть достигнута в 10-20 раз выше, чем емкость, сообщенная для стандартных хроматографических методов, давая возможность использования колонок с относительно небольшим объемом. Это приводит к снижению потребности в воде, уменьшаются отходы и потребность в буферных растворах, все это заметно улучшает промышленную экономику данного способа.

Очищенный раствор гемоглобина, представляющий собой элюат катионообменной колонки, может быть диафильтрован в выбранный буфер и доведен до необходимой концентрации HbAo.

В способе настоящего изобретения выбор материала ионообменного геля в качестве стационарной фазы не является решающим. Выбор может быть сделан успешно в пределах современного уровня науки. Здесь могут быть использованы любые из обычных коммерчески доступных гелей такого типа при условии, что они могут быть успешно дериватизированы для использования в ионообменном методе в условиях селективного сродства для веществ, которые будут разделяться. Общие классы носителей для ионообменных средств включают в себя макропористые, макросетчатые и непористые дивенилбензол - поперечносвязанные полистиролы или полиметакрилаты, полиалкиленамины, целлюлозы, агарозы, двуокись кремния, керамику, стекло, окись алюминия, металлические частицы и др. Коммерчески доступные носители включают те, которые продаются под торговыми марками POROS, Fractogel, Huper D, Dowex, Amberlite, Duolite, Bio-Rex, Chelex, Sephadex, Sepharose, Toyopearl, Macro-prep, Bio-protocol, Accell, Monotypes и др. Функциональные группы, привязанные к таким носителям для целей ионного обмена, включают сульфонат, сульфопропил, карбоксиметил, карбоксилат, фосфо, четвертичный амин, четвертичный аминоэтил, диметиламиноэтил, полиэтиленамин, триметиламиноэтил, диэтиламиноэтил, аспартамид и др.

Способ данного изобретения может также работать для получения раствора гемоглобина не менее 99% чистоты и неожиданно свободного от вирусных частиц, активных или неактивных, особенно липидных инкапсулированных вирусов, таких как ВИЧ, герпес, симплекс-вирус (HSV), вирус бычьей диареи, который во многих случаях является моделью для вируса человеческого гепатита С.

Это некоторые из наиболее серьезных и опасных вирусных примесей крови. Это очень важное дополнительное достижение, которое было получено при использовании настоящего изобретения, и это достижение не могло быть предсказано до того, как этот способ был испытан и результаты проанализированы. Хотя предпочтительный процесс согласно данному изобретению включает стадию пастеризации для инактивации вирусов до очистки, как описано выше, но достижение возможности удаления вирусных частиц как части способа очистки представляется особенно ценным. Способ дает возможность удалять из кровезамещающих материалов различные активные вирусные частицы, которые могут сохраняться при пастеризации, и какие-либо остаточные неактивированные вирусные частицы. Все это может быть достигнуто без использования какой-либо дополнительной специфической стадии удаления вирусных частиц и без добавления каких-либо специальных реагентов или чего-то подобного для удаления вирусов. Может быть достигнуто исключительно полное удаление липидных инкапсулированных вирусов. Было также достигнуто заметное снижение количества других вирусов.

Насколько это известно заявителю, препараты гемоглобина настоящего изобретения имеют более высокую степень чистоты, чем ранее описанные препараты. Возможно, благодаря их необычно высокой степени чистоты или, возможно, благодаря другим, еще не полностью объясненным факторам, продукты данного изобретения проявляют неожиданные и высокополезные свойства, ранее не описанные для препаратов гемоглобина, по крайней мере, для препаратов, производимых в большом масштабе.

Точнее говоря, продукты настоящего изобретения, HbAo, свободны от всех белков мембраны красных кровяных телец (эритроцитов), как показано с помощью изоэлектрического фокусирования и иммунноблот-анализа. Следовые количества человеческого сывороточного альбумина (HSA) на уровне менее чем 4 мкг и обычно 2-4 мкг HSA/100 мг Hb присутствуют в препаратах, как обнаружено с помощью иммуноабсорбционных методов. Единственными другими определяемыми белками, которые иногда обнаруживаются в продуктах изобретения, являются фрагменты альфа- и бета-глобиновых цепей гемоглобина, и они не превышают 1 мкг на 100 мг гемоглобина. При этом чрезвычайно высоком уровне чистоты продукт настоящего изобретения является необычным и проявляет неожиданные свойства, описанные ниже. Одно из них - снижение или отсутствие сосудосуживающей активности. Другое свойство - отсутствие токсичности по отношению к культивируемым эндотелиальным клеткам.

Описанные ранее высокоочищенные гемоглобины, как поперечносвязанные, так непоперечносвязанные, давали при вливании прессорную реакцию [1,2]. Поскольку продукты, по-видимому, были достаточно высокоочищенными, существующие теории полагали, что здесь, должно быть, проявляются собственные свойства самого гемоглобина, который является за это ответственным. В частности, предполагали, что гемоглобин связывается оксидом азота, который вызывает этот эффект. Оксид азота, называемый также эндотелийобразующим релаксирующим фактором, является мощным вазодилатором, синтезируемым эндотелиальными клетками при помощи синтазы оксида азота как посредника. Поскольку молекула гемоглобина будет связывать оксид азота с высокой степенью сродства, то было постулировано и в настоящее время общепринято, что внутривенное введение раствора гемоглобина, особенно растворов непоперечносвязаного гемоглобина, будет удалять оксид азота и вызывать гипертензивный эффект с сужением кровеносных сосудов.

Обнаружение того, что продукты настоящего изобретения не проявляют вазопрессорной активности в моделях изоволемического обмена и геморрагического шока, явилось также полной неожиданностью, так как противоречит современным теориям и мнениям в отношении присущих гемоглобину свойств. Настоящее изобретение наводит на мысль, что это не собственное свойство гемоглобина, которое обуславливало его сосудосуживающую активность (как сообщалось ранее), но, по крайней мере, частично связано с примесями, которые присутствуют в очень малых количествах и которые не были ранее успешно удалены, несмотря на сообщения об очень высоком уровне чистоты гемоглобинов, описанных ранее.

Преимущества отсутствия вазопрессорной активности продуктов настоящего изобретения сохраняются в поперечносвязаных и полимеризованных гемоглобинах, полученных из продуктов настоящего изобретения, например, с помощью способа, описанного в заявке США N 08/231945, апрель 21, 1994.

Кроме того, продукт настоящего изобретения проявляет более высокую степень снижения токсичности по отношению к эндотелиальным клеткам при введении in vivo, чем ранее описанные гемоглобины. Исследования с ранее описанными растворами оксигемоглобина, включая хроматографически чистые гемоглобины, показали наличие клеточных повреждений, на что указывает заметное увеличение лактатдегидрогеназы в эндотелиальных клетках культуральной среды по сравнению с его уровнем в среде контрольной эндотелиальной клеточной культуры. Лактатдегидрогеназа является маркером клеточного повреждения. Снова было постулировано и признано, что эта токсичность есть собственное свойство оксигемоглобина, поскольку испытуемые растворы содержали оксигемоглобин высокой степени очистки [3].

Неожиданно было обнаружено, что гемоглобин согласно настоящему изобретению не является посредником в высвобождении лактатдегидрогеназы. В противоположность гемоглобину настоящего изобретения, при инкубировании эндотелиальных клеток с растворами гемоглобина, не содержащих стромы и очищенных другими хроматографическими способами, было отмечено значительное повышение высвобождения лактатдегидрогеназы.

Вообще важно и очевидно, что любой кровезаменитель и любой компонент или сырье для кровезаменителя должен быть достаточно очищенным, так чтобы он был свободен от вредных примесей. Ранее такими признанными вредными примесями считались клеточная строма, эндотоксины и другие пирогены, негемоглобиновые белки, фосфолипиды и т. п. Было сообщено, что прежние кровезаменители "свободны в основном" от одной и более таких примесей. Однако термин "свободен в основном" является относительным субъективным термином, интерпретация и ограничения которого зависят от способа определения соответствующих параметров, и он использовался для описания предшествующего уровня техники. В результате улучшения очистки и техники анализа стали появляться сообщения о препаратах кровезаменителей и гемоглобина все более высокого уровня чистоты. Например, предшествующая научная литература содержит сообщения о растворах гемоглобина, в которых более чем 99,9% белка представлено гемоглобином в той или другой форме (см. вышеупомянутый патент США 5.084.588, Rausch и др.). В соответствии с настоящим изобретением постулируется, что даже такая чистота не является достаточной для успешных кровезаменителей, потому что природа оставшихся примесей может быть причиной сосудосуживающих эффектов и проявления клеточной токсичности.

Можно показать, что не содержащий стромы гемоглобин, который получают из института Walter Reed Army Research Institute (WRAIR), обычно признаваемый в качестве промышленного стандарта чистоты, содержит большое число (больше 10) различных загрязняющих белков, многие из которых присутствуют в количествах менее 0,01% общего белка. Хотя, на первый взгляд, это очень небольшое количество, однако гемоглобин как кровезаменитель вводится субъекту в относительно больших количествах, и поэтому их опасность определяется общим количеством вводимой смеси, а не их концентрацией в исходном растворе. Одна единица раствора кровезаменителя на основе гемоглобина будет содержать 25-50 гемоглобина, так что 0,01% примесей составит 2,5-5 мг. Среди широкого разнообразия присутствующих белков может быть один или два, которые чрезвычайно токсичны на этом уровне. Настоящее изобретение дает препараты гемоглобина, в которых содержание негемоглобиновых белков ниже 0,5%, предпочтительно ниже 0,1% и, вероятно, но необязательно, что в результате этого они проявят невысокий сосудосуживающий эффект и незначительную активность по отношению к эндотелиальным клеткам. Изобретение также дает способ, по которому растворы гемоглобина могут быть получены на промышленном уровне, как описано выше. Еще одним важным достоинством продуктов настоящего изобретения является их способность снизить прокоагулянтную активность. По-видимому, в этих продуктах очень значительно снижено содержание агентов, потенциирующих коагуляцию крови по сравнению с другими доступными препаратами гемоглобина, не содержащими стромы, которые описаны ранее.

Далее в изобретении описаны для иллюстрации следующие неограничивающие его примеры.

ПРИМЕР 1. Получение неочищенного лизата гемоглобина

Девяносто шесть единиц (приблизительно 30 л) упакованных красных кровяных телец (RBCs) одного и того же типа объединяют и разбавляют 24 л 0,9% физиологического раствора. Эту смесь затем фильтруют через полипропиленовые фильтры 20 микрон и 8 микрон для удаления остаточных лейкоцитов.

После того, как лейкоциты отфильтровывают, RBCs промывают 6 объемами 0,9% физиологического раствора до постоянного объема путем диафильтрации, используя полые волокнистые мембраны сепракор полиэфирсульфон 3,5 м², 0,3 микрона. Промывной буфер затем заменяют 50 ммоль трис-лизирующим буфером и RBCs постепенно растворяют в 6 объемах этого буфера.

Неочищенный лизат собирают и концентрируют от приблизительно 2,5% общего гемоглобина (THb) до приблизительно 9,0% THb, используя миллиноровские (Мillipore) РТТК-мембраны, отделяющие вещества с молекулярным весом 30H. Емкость с сконцентрированным веществом насыщают CO для превращения гемоглобина в COHb-форму. Лизат пастеризуют при 62+-2^oC в течение 10 часов в емкости, снабженной рубашкой. Пастеризованный лизат охлаждают и затем центрифугируют. Дальнейшая глубокая фильтрация через миллипоровские фильтры 0,8 микрон дает пастеризованный лизат для диафильтрации на другой миллиноровской мембране 30К PTTK. Материал подвергают диафильтрации с 5-ммольным трис-буфером при pH 8, пока его проводимость не будет меньше 0,3 мСм (mS - миллиСименс), а pH - 8,9+-0,2. Затем его разбавляют до 4,5-5% THb, и с этого момента он готов для последующей хроматографической очистки.

ПРИМЕР 2. Самозаместительная хроматография на анионообменной смоле

Колонку 1х10 см, наполненную анионообменной смолой Per Septive Роros HQ-50, промывают 4 объемами 1N NaCl и уравновешивают 5- ммольным трис-буфером при pH 8,8. После уравновешивания на колонку нагружают 50 мл 3% (3г/100мл) неочищенного лизата гемоглобина ( 85% HbAo) в 5 ммоль триса, полученного как описано в примере 1, pH 8,8 со скоростью 0,78 мл/мин (1 см/мин). Это приводит к конечной перегрузке колонки - 200 мг растворенного вещества на 1 мл смолы при сравнении со стандартной емкостью 50 мг/мл (объявленной фирмой-производителем). Элюат собирают. Колонку затем промывают 2 объемами 5- ммольного трис-буфера, pH 8,8, и этот элюат объединяют с элюатом, собранным во время нанесения. Затем колонку промывают 1N NaCl для вымывания остаточных белков, и этот промывной элюат отбрасывают. Колонку регенирируют, используя 3 объема 1M NaCl/HCl и 4 объема 1М NaOH. Элюат гемоглобина с анионообменной смолы анализируют на аналитической анионообменной колонке с использованием градиента pH, как описано более подробно ниже в примере 11. Как было показано, он содержит 95-96% HbAo (фиг. 3), с возвратом 90% HbAo, нанесенного на колонку.

ПРИМЕР 3. Самозаместительная хроматография на анионообменной смоле

Колонку (1х10 см), наполненную Merck Fractogel - TMAE, промывают 4 объемами 1 N NaCI и уравновешивают 5-ммольным трис-буфером, pH 8,8. После уравновешивания на колонку наносят 50 мл 3% (3г/100мл) неочищенного лизата гемоглобина (85% HbAo) в 5 ммоль трис- буфера, полученного как описано в примере 1, pH 8,8, со скоростью 0,78 мл/мин (1 см/мин). Это аналогично приводит к конечной перегрузке колонки. Элюат собирают. Колонку затем промывают 2 объемами 5-ммольного трис-буфера, pH 8,8, и этот элюат объединяют с элюатом, собранным во время нанесения. Колонку затем промывают 1N NaCl для вымывания остаточных белков и промывной элюат отбрасывают. Колонку регенерируют, используя 3 объема 0,5N HCl и 4 объема 1M NaOH. Элюат гемоглобина с анионообменной смолы анализируют на аналитической анионообменной колонке, используя градиент pH, как описано более детально ниже в примере 11. В нем определено около 95-96% HbAo, как показано на фиг.3, и возвращено 73% HbAo, нанесенного на колонку.

ПРИМЕР 4. Самозаместительная хроматография на катионообменной смоле

Колонку 1х10 см, наполненную Perseptive Poros HS-50, промывают 4 объемами 1N NaCl и уравновешивают 5 ммольным трис- буфером, pH 7,5. После уравновешивания на колонку наносят 120 мл 2% (2 г/100 мл) очищенного на анионообменной смоле гемоглобина 95% HbAo в 5 мл трис-буфера pH 7,5, полученного, как описано в примерах 2 и 3, со скоростью 0,78 мл/мин (1 см/мин). Это приводит окончательно к существенной перегрузке колонки примерно в 5 раз по сравнению с рекомендацией фирмы-производителя. Этот элюат собирают. Колонку промывают затем 2 объемами 5- ммольного трис-буфера, pH 7,5, и этот элюат объединяют с элюатом, собранным при нанесении. Колонку затем промывают 1N NaCl для вымывания остаточных белков и этот раствор отбрасывают. Колонку регенерируют, используя 3 объема 0,5N HCl и 4 объема 1 М NaOH. Элюат гемоглобина с катионообменной смолы анализировали на аналитической анионообменной колонке, используя градиент pH, и содержание оказалось больше 99% HbAo, как показано на фиг. 4, с возвратом около 90% HbAo, нанесенного на колонку.

ПРИМЕР 5.

Было изучено влияние проводимости на самозаместительную хроматографию на анионообменной смоле (первая стадия).

Эффективная заместительная хроматография в большой степени зависит от ионной силы буфера и/или образца, что определяется показателями проводимости. Эксперимент, результаты которого показаны ниже в табл. 2, был проведен на основе неочищенного лизата по примеру 1 для анионообменной смолы Poros HQ-50 из PerSeptive Biosystems Inc. Элюат с колонки анализировали с помощью аналитической анионообменной хроматографии. Все фракции, полученные в опыте 1, были свободны от определяемых кислотных примесей, тогда как даже первые фракции в опыте 2 были загрязнены кислотными примесями.

ПРИМЕР 6. Выход как функция нагрузки белка

Перегрузкой колонки достигается более высокое извлечение очищенного HbAo. Эксперименты, описанные ниже в табл. 3, демонстрируют очень высокую перегрузку 10 мл колонки с катионообменной смолой Poros HS-50, что гарантирует адсорбцию примесей на всех местах связывания, позволяющую получить более высокое извлечение очищенного HbAo. Перегрузка в первом эксперименте была в 13,5 раз больше рекомендаций изготовителя (308 мг белка/мл). Перегрузка во втором эксперименте была примерно в 5 раз выше по сравнению с рекомендацией фирмы-изготовителя. Высокая перегрузка приводит к значительному улучшению извлечения HbAo с колонки.

ПРИМЕР 7. Сравнение между малой и большой колонками

Процесс вытеснительной хроматографии согласно настоящему изобретению может быть использован на больших и малых колонках. Используя последовательно анионообменную смолу Роros HQ-50 и катионообменную смолу HS-50 и колонки 15 и 10 литров соответственно, было проведено сравнение с колонкой 10 мл. Раствор, поступающий на колонку с Poros HQ-50, был приготовлен, как описано в примере 1. Элюат с колонки HQ-50 был направлен на колонку HS-50. Табл. 4 показывает условия и результаты использования колонки с Poros HQ-50. Табл. 5 показывает результаты использования колонки с Poros HS-50. Результаты показывают, что стадии процесса могут быть масштабированы до размеров, по меньшей мере, 10-15-литровых колонок для коммерческого применения.

ПРИМЕР 8. Анализ неочищенного лизата гемоглобина и очищенного гемоглобина путем изоэлектрического фокусирования (IEF)

Анализ изоэлектрического фокусирования (IEF) проводят, используя основной гель агарозы, в котором стабильный градиент pH достигается использованием коммерчески доступных амфолитов. Используют такие амфолиты, 90% из которых имели pH в диапазоне 5-8 и 10% в диапазоне pH 3,5-10. Агароза в геле была в конечной концентрации 1,25% и амфолит присутствовал в конечной концентрации около 2%. С целью определения чистоты гель сильно перегружали (1 мг белка на линию). Электрофорез проводился при низкой силе тока для обеспечения движения белка однородной прямой полосой. После достижения устойчивого состояния напряжение и силу тока увеличивали на короткий период для получения более четкой полосы. После электрофореза белок на геле агароэы закрепляли, используя трихлоруксусную кислоту и раствор сульфосалициловой кислоты. После стадии фиксации гель окрашивали с помощью Comasie-Blue для проявления полос белка. С целью изучения гель высушивают на воздухе и затем используют лазерный денситометр для получения трасс электрофокусированных линий, соответствующих лизату неочищенного гемоглобина и очищенному гемоглобину. На фиг. 5 показано сравнение между IEF неочищенного лизата гемоглобина, полученного, как описано в примере 1, и очищенного HbAo, полученного согласно изобретению. Очистка раствора гемоглобина была проведена с использованием последовательно колонки с Poros HQ-50, как описано в примере 2, и колонки с Poros HS-50, как описано в примере 4.

ПРИМЕР 9. Иммуноанализ лизата неочищенного гемоглобина и очищенного гемоглобина

Для определения количества различных загрязнений в лизате неочищенного гемоглобина из примера 1 и очищенного гемоглобина, полученного согласно способу по изобретению, использовали технику иммуноокрашивания. После электрофокусирования белков на геле агарозы белки переносили на нитроцеллюлозную бумагу, используя капиллярное всасывание. Остающиеся свободными места связывания на бумаге блокировали путем инкубации пятна в растворе гидролизованного рыбьего желатина. После инкубации пятно промывали трис-буферным физиологическим раствором (TBS) и инкубировали затем с первичным антителом. (Первичное антитело - это антитело, против которого испытывался образец, т. е. античеловеческий альбумин сыворотки (анти-HSA), который должен быть использован для определения HSA в растворах гемоглобина). После этой инкубации пятно промывали TBS и затем инкубировали со вторым антителом, связанным с маркировочным ферментом (например, пероксидазой хрена), которое является антителом против первичного антитела. После инкубации с вторичным антителом пятно снова промывали TBS и затем добавляли субстрат для маркировочного фермента. Окрашенный осадок появится там, где вторичное антитело связано с первичным антителом, которое имеет связь с его антигеном, таким образом указывая на количество и положение антигена по отношению к первичному антигену на IEF-геле.

Результаты приведены в табл. 6 в конце описания, в которой "+++++++" указывает на сильный сигнал, "+" - едва определяемый сигнал и "-" обозначает, что сигнал не определяется.

а) Используя стандарты HSA на иммуноблотах было подсчитано количество HSA, присутствующее в очищенном HbAo - меньше 5 пикограмм/мг Hb (меньше 50 ppm - частиц на миллион).

b) Были определены следы загрязнений с pI 5,2, которые взаимно реагируют с анти-RBC антителом. Другие исследователи также сообщают о подобных белках в их очищенных растворах Hb - см. Christensen и др., цит. лит.

с) Анти-HSA антитела, присутствующие в античеловеческой плазме, определены присутствием HSA в очищенном HbAo.

ПРИМЕР 10. Альбумин сыворотки человека - иммуноопределение (HSA-ID)

Для определения количества HSA (сывороточного человеческого альбумина), присутствующего в растворах гемоглобина, используют хроматографический метод. В этом методе используется антитело (анти-HSA), ковалентно связанное с матрицей колонки. Когда образец наносят на колонку, все, кроме антигена для антитела (HSA), проходят через стадию нанесения/промывки. При использовании буфера элюции связанный антиген (HSA) элюируют с колонки и площадь пика используют для подсчета антигена, присутствующего в образце.

Катридж (ID) ImmunoDetection (торговая марка), используемый для определения, был получен из фирмы PerSeptive Biosystems. Скорость потока, используемая для определения, была равна 2 мл/мин. Колонку в форме катриджа (D 1,6mm х L 26 мм) уравновешивали буфером (10-ммольный фосфатный буфер + 300 ммоль NaCI, pH 7,2) и затем наносили 50 мкл образца. Нагружающий буфер использовали для промывки колонки в течение 0,25 минут, затем использовали элюирующий буфер (в течение 3,5 минут) для элюции связанного HSA с колонки. Элюат контролировали на спектрофотометре Beckman при 220 ими 414 нм. Колонку затем снова уравновешивали нагружающим буфером для следующего нанесения. Количество HSA, присутствующее в очищенном гемоглобине, подсчитанное с использованием этого метода, составило не более 0,0005% по весу, в расчете на гемоглобин.

ПРИМЕР 11. Аналитическая анионообменная хроматография

Хроматографические методы, используемые для анализа чистоты гемоглобина в продуктах, в примерах 2 и 4 были следующими. Определение было основано на методе, описанном Muisman и Dozy(4). Образцы наносили на анионообменную колонку при высоком pH (pH 8,5) так, что все белки связывались на колонке, затем использовали градиент pH от 8,5 до 6,5 для последовательной элюции белков с колонки. Используя этот хроматографический анализ, могут быть разделены очень близкие белки (например, различные виды гемоглобина). Для этого определения была использована аналитическая анионообменная колонка 4,6 мм х 100 мм из PerSeptive Biosystems. Использовались буферы: А) 25 ммольный трис + 25- ммольный бис-трис, pH 8,5 и В) 25 ммольный трис + 25- ммольный бис-трис, pH 6,5. Определение проводили при скорости потока 5 мл/мин. После того как колонку уравновешивали буфером В, на колонку наносили 10 мкл образца (конц. 10 мг THb/мл) и начинали градиентную элюцию (100% буфер А к 100% буферу В через 25 объемов колонки). Элюат контролировали в УФ-свете при 280 нм для идентификации белковых пиков. Фиг.3 представляет хроматографическую кривую анионообменной очистки гемоглобина (продукт примера 2), а фиг. 4 - очищенный HbAo (продукт примера 4) при анализе этим способом.

Этот метод является стандартным анализом для проверки чистоты растворов гемоглобина. Было найдено, что очищенный согласно изобретению HbAo свободен от всех загрязнений, наблюдаемых в стромсвободном гемоглобине. Иногда в пике HbAo наблюдается небольшое плечо, что приписывают окисленной форме HbAo (Мet HbAo). Чистота в соответствии с данным изобретением, определенная этим аналитическим методом, обычно составляла больше чем 99,5%.

ПРИМЕР 12. Удаление вирусов

Способ, представленный в изобретении, был испытан на его способность удалять вирусы из неочищенного гемоглобина.

К образцам неочищенного лизата, полученного, как описано в примере 1, и к образцам частично очищенного раствора гемоглобина, выходящего из анионной колонки, т. е. к продуктам из примеров 2 и 3, добавлялись испытуемые количества следующих вирусов в активной форме:

Полиовирус тип 1

Вирус человеческого иммунодефицита (HIV)

Вирус бычьей диареи (который является моделью вируса человеческого гепатита)

Вирус герпеса тип I (HSV-1).

Аликвоты элюатов с соответствующих колонок прибавляли к испытуемым клеточным системам. В случаях поливируса, вируса герпеса и вируса бычьей диареи активный вирус реагирует с испытуемыми клетками, давая зоны гемолиза. Проводились известные стандартные испытания. В случае вируса HIV аликвоты добавлялись в среду культуры ткани. Количество присутствующего вируса определялось по изменению роста линии клеток. Это изменение обозначается как TCID50 (доза, при которой культура ткани инфицируется на 50%). Результаты приведены ниже в табл. 7.

Эти результаты показывают небольшое уменьшение количества полиовируса при использовании как анионообменной самозаместительной, так и катионообменной самозаместительной стадии настоящего изобретения, но значительное уменьшение вируса в случае вируса человеческого иммунодефицита (HIV), вируса герпеса (HSV) и вируса бычьей диареи после анионообменной хроматографии и в меньшей степени - после катионообменной хроматографии. Это было совершенно непредсказуемым результатом, который дал значительные преимущества при использовании настоящего изобретения.

ПРИМЕР 13. Анализ на чистоту способом изоэлектрического фокусирования и метод Western Blotting

Эксперименты по изоэлектрическому фокусированию (lEF) проводились, используя метод Saravis and Zamсheck[5].

Гели IEF были получены с использованием агарозы (1% конечная концентрация), и градиент pH был создан с помощью амфолитов (Pharmacia Bioteсh Inc., Piscataway, N.Y.) таким образом, что 90% амфолитов имели pH в диапазоне 5-8, а 10% -в диапазоне 3,5-10. Обычно 10 мкл растворов Hb 100 мг/мл наносили на гель IEF. После фокусирования белков гель фиксировали с помощью 10% трихлоруксусной кислоты (TCA), сушили, окрашивали с помощью Coomassie-Blue A3U. Обычно общая белковая нагрузка на линию составляла 1 мг.

Анализ изоэлектрического фокусирования (IEF) проводили для сравнения чистоты SFH (стромсвободного гемоглобина) и четырех (4) различных образцов NbAo, очищенных согласно изобретению. 50 мкг полного Hb или 1 мл полного Hb наносили на каждый проход. Результаты показаны на фиг. 6. Линия 20 представляет гемоглобин, не содержащий стромы, при полной нагрузке Hb - 50 мкг, линии 22, 24, 26 и 28 представляют образцы гемоглобина, очищенного согласно изобретению, при той же самой нагрузке. Линия 30 представляет SFH при 1 мг общей нагрузки и линии 32, 34, 36 и 38 представляют образцы Hb, очищенного согласно изобретению, при той же самой нагрузке. При нагрузке 50 мкг образца общего Hb получали очищенный HbAo и SFH одинаковой чистоты. Однако при нагрузке 1 мг общего гемоглобина многочисленные белки красных кровяных клеток, белки плазмы или белки мембран, обнаруженные в линии SFH, отсутствуют в линии HbAo. Очень слабая белковая полоса P1 около 5,2 обнаружена для линии очищенного HbAo, возможно, обусловленная фрагментами глобиновой цепи. Полосы выше полосы HbAo в линии 50 мкг образца обусловлены более положительно заряженным Methb, который образуется в процессе электрофокусирования.

После изоэлектрического фокусирования (IEF) был использован метод "Western Blotting", который включает окрашивание антитела (иммуноокрашивание), что содействовало тщательному исследованию чистоты продукта данного изобретения. Так, белки с геля IEF были перенесены на нитроцеллюлозную бумагу с помощью полимерного всасывания. Остающиеся свободными места связывания на нитроцеллюлозной бумаге были блокированы путем инкубирования пятна с гидролизованным рыбьим желатином (Hipure Liquid Gelatin, Norland Products Inc., New Brunswick, N.Y.). Пятно затем инкубировали с антителом кролика по отношению к человеческой плазме. (Dako Corporation, Santa Barbara, CA, Lot # 010) (антитела разбавляли 1:500 в трис-буферном физиологическом растворе. После инкубации в течение ночи пятно промывали трис-буферным физиологическим раствором (TBS), содержащим 1% рыбьего желатина, затем инкубировали с комплексом козлиного-антикроличьего антитела с IgG-пероксидазой хрена (HRP) (разбавленной 1: 1000 в TBS). После инкубации в течение 1 часа пятно снова промывали с помощью TBS, содержащего 1% рыбьего желатина. Комплекс антиген-антитело-HPR проявляли, используя 4-хлор-1-нафтол (30 мг/20 мл метанола) и перекись водорода (50 мкл в 100 мл TBS). Зона пурпурного осадка указывает на присутствие антигенов, специфических для белков плазмы.

Дубликаты образцов гемоглобина, не содержащего стромы, Hb по изобретению, lEF-Hb по изобретению, очищенного гемоглобина из института Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) (очищенного, как описано в вышеупомянутой статье Hinslow и др.) и очищенного Hb из Sigma Corporation (который описан в их текущем каталоге диагностических реагентов как "Hemoglobin АО, reference H 0267") были сфокусированы на геле IEF. Половина геля была окрашена Coomassie-Blue, другая половина была перенесена на нитроцеллюлозную бумагу. Пятно затем было окрашено для проявления комплексов человеческая плазма - антитело человеческой плазмы.

Результаты представлены на фиг.7. На этом чертеже линия 40 - это IEF-гемоглобин, не содержащий стромы, окрашенный Coomassie-Blue; линии 42, 44, 46 относятся соответственно к линии HbAo согласно данному изобретению, Hb института WRAIR и Hb Sigma Corporation. Линия 48 - это Western Blot - тест антитела человеческой плазмы на свободный от стромы гемоглобин, и линии 50, 52 и 54 относятся соответственно к HbAo согласно данному изобретению, Hb института WRAIR и Hb Sigma Corporation.

Значительные количества белков плазмы были определены в SFH. В противоположность этому только очень незначительные следы человеческой сыворотки крови (HSA) были определены в линии продукта согласно изобретению. Никакие другие белки плазмы не были определены в линии продукта, полученного в изобретении. Никакого определяемого уровня HSA не было найдено в HbAo WRAIR, но было определено множество других белков плазмы, имеющих полосы ниже и выше HbAo. Стандарт HbAo Sigma содержит много загрязнений, происходящих от плазмы, включая значительную концентрацию HSA.

ПРИМЕР 14. Изучение острой гиповолемии у находящихся в сознании крыс

Продукт настоящего изобретения был испытан на вазопрессорную активность.

Крысам Sprague-Dawby, произвольно разделенным на группы по 6 (n=6), дали возможность акклиматизироваться в течение 4 дней, в которые проводилось постоянное канюлирование с использованием техники Tabata and Chang (6). Соответствующим образом канюлированные животные получали внутривенно гепарин, 150 IU/кг. Каждая артериальная канюля была связана с датчиком давления Stratham для определения кровяного давления и частоты пульса. Эти параметры постоянно записывались на рекордере Grass polygraph. После регистрации стабильной основной линии вызывали летальный геморрагический шок по методу Wiggers, который включает удаление 67% общего объема крови через другой артериальный катетер по 0,2 мл/мин в 2 стадии. Сразу же после вызова шока каждая крыса получала испытываемый материал со скоростью 0,5 мл/мин, т.е. гомологичную кровь, HbAo согласно изобретению (HbAo) или поперечносвязанный HbAo согласно изобретению, которые реагируют с о-раффинозой - поперечносвязывающим реагентом, как описано в вышеупомянутой заявке на патент США 08/231.945 от 21 апреля 1994 (том х 3). Среднее значение артериального давления (MAP) и частоты пульса регистрировались в течение 30 минут после окончания инфузии. Каждую крысу затем возвращали в отдельную клетку и контролировали в течение 14 дней вес тела, гематокрит и выживаемость.

Результаты представлены графически на фиг. 8, где показана графическая зависимость MAP от времени.

Данные показывают, что продукт изобретения является высокоочищенной формой гемоглобина Ао, и имеет ту же эффективность, что и полная кровь в восстановлении значения артериального давления после геморрагического шока в модели крыс, находящихся в сознании. Не наблюдалось никаких различий в восстановлении артериального давления и частоты пульса в испытываемых группах между полной кровью и HbAo.

Пример 15. Гемодинамические эффекты от изоволемического обменного переливания крови у крыс

HbAo настоящего изобретения был испытан для оценки гемодинамического эффекта при изоволемическом обменном переливании крови крысам, находящимся в сознании. Наружная подвздошная вена и артерия крыс были канюлированы через бедренную область, см. Keipert and Chang (8). После 24 часов восстановительного периода животные, находящиеся в сознании, были подвергнуты непрерывному 50% изоволемическому обменному переливанию крови. В течение обменного переливания крови объем крови, удаляемой через подвздошную артерию, был заменен испытуемым раствором через подвздошную вену со скоростью 0,5 мл/мин, используя инфузионный насос, работающий с постоянной скоростью. Давление крови и частота пульса постоянно измерялись: 1) за 30 минут до обмена, 2) в течение обмена, 3) через 2-3 часа после обмена. Значения артериального давления и частоты пульса были вычислены на основе кривой давления крови.

Одной группе крыс (численностью 4) был перелит альбумин человеческой сыворотки, HSA. Для другой группы крыс (числом 6) испытуемым раствором был гемоглобин, не содержащий стромы (SFH). Для третьей группы крыс (числом 8) испытуемым раствором был HbAo - продукт данного изобретения.

Результаты представлены в графическом виде на фиг. 9 и 9a.

Для всех испытуемых растворов значение артериального давления возрастало на 10-20 мм Hg в течение процедуры обменного переливания. С контрольным раствором альбумина значение артериального давления падало на 15 мм Hg ниже основного уровня во время отдыха в период после обмена и оставалось на пониженном уровне в течение всего периода после обмена, приблизительно 2,5 часа (фиг. 9). Эти наблюдения согласуются с ранее опубликованными наблюдениями Keipert and Chang (8).

С гемоглобином, не содержащим стромы, значение артериального давления падало вниз к основному уровню в конце периода обмена, но поднималось в течение периода после обмена максимум на 15 мм Hg выше основного уровня в течение 30-40 минут после обмена (фиг. 9a).

В противоположность этому для HbAo настоящего изобретения значение артериального давления после обмена возвращалось к основному уровню и возрастало в период после обмена не более чем на 5 мм Hg, тем самым сохраняя MAP (среднее значение артериального давления) внутри нормального диапазона.

Результаты этого изучения показывают, что HbAo настоящего изобретения лишен сильной вазоактивности, связанной с обменным переливанием, по сравнению с гемоглобином, не содержащим стромы.

Пример 16.

Анализ in vitro на культуре ткани для измерения окислительного повреждения эндотелиальных клеток, предварительно обработанных препаратами гемоглобина

Было изучено свойство HbAo согласно настоящему изобретению вызывать окислительное повреждение эндотелиальных клеток в культуре. Высвобождение лактатдегидрогеназной активности в среде является маркером клеточного повреждения и цитотоксичности.

Эндотелиальные клетки грудной аорты свиньи культурировали до слияния, субкультурировали в соотношении 1: 3 в повторяющейся форме. В пределах 48 часов 7 повторов клетки были использованы для эксперимента. Клеточное повреждение было определено путем измерения количества лактатдегидрогеназы, освобождающегося из клеток в среду. Прежде чем были добавлены гемоглобиновые растворы, среда была удалена и клетки промыты дважды физиологическим раствором, забуференным фосфатом. Клетки были инкубированы с гемоглобинами (250 микромоля гема) в полной EGM-среде от 6 до 24 часов при 37^oC (n=4-6). Только клетки, инкубированные в полной EGM-среде, использовались в качестве отрицательного контроля. В конце инкубационого периода из каждой ячейки было отобрано 50 микролитров (мкл) среды и была определена лактатдегидрогеназная активность по методу определения Sigma. Лактатдегидрогеназная активность в каждой ячейке была сравнена с активностью, появляющейся в клетках после добавления 2% Тритон Х-100 (полное выделение ZDH), и рассчитана как процент от полного выделения.

После 6 часов инкубации наблюдалось значительное увеличение выделения лактатдегидрогеназы в присутствии гемоглобина, не содержащего стромы SFH (74,44,2%, p меньше 0,005). Подобное, но меньшее увеличение наблюдалось с очищенным гемоглобином из Walter Reed Army Institute of Research. Никакого увеличения не наблюдалось с очищенным HbAo по данному изобретению (39,82,3%) при сравнении с контролем (37,52,2%). В присутствии гемоглобина, не содержащего стромы, выделение лактатдегидрогеназы возрастает дальше, после 24 часов инкубирования (99,6+3,5%), тогда как никаких изменений не наблюдалось с HbAo по данному изобретению (41,64,6%) в сравнении с контролем (34,12,6%).

Инкубирование культурированных эндотелиальных клеток с HbAo, полученным по способу, описанному в этом изобретении, не вызывало появления лактатдегидрогеназной активности маркера клеточного повреждения. Следовательно, цитотоксичность в отношении культурированных клеток не является свойством, присущим гемоглобиновым растворам, и очистка HbAo удаляет цитотоксические компоненты, присутствующие в гемоглобине, не содержащем стромы.

ПРИМЕР 17. Удаление прокоагулянтной активности

Продукт настоящего изобретения был испытан на содержание в нем агентов, которые потенциируют коагуляцию крови. Использован метод Biessels и др. (9).

Морские свинки были анестезированы HyponormTM, и в каротидную артерию была вставлена силастиковая канюля. После канюлирования 30% объема крови было отобрано (рассчитано как 2% от веса тела) и замещено равным объемом испытуемого раствора. Вливали 1% раствор человеческого альбумина по 2,5 мл/час, чтобы поддерживать доступ к канюле. За начало эксперимента было принято начало вливания альбумина. Фибринопептид A (FPA), который, как известно, образуется из фибриногена при коагуляции крови, был измерен до и после введения фактора Ха (8-9 мкг/кг) в дозе, которая сама по себе не вызывает коагуляцию. Образцы коагуляции были собраны в антикоагулянтную смесь гепарина (1000 ед/мл), Trasylol (1000 ед/мл) и цитрата натрия (3,8%), разделены, и плазма сохранялась на льду.

Образцы плазмы обрабатывались, как описано для определения FPA по методу Leesma, 1984(10) и образовавшийся FPA измеряли по методу RIA, ранее описанному в работе Gerrits(ll). Белки плазмы осаждали равным объемом 40% PEG 6000 в фосфатном буферном физиологическом растворе. Супернатант нагревали на кипящей бане, центрифугировали и сохраняли для анализа. Результаты показаны ниже в табл. 8.

Эти данные показывают, что продукт настоящего изобретения по существу не имеет коагулянтной активности при сравнении с гемоглобином, не содержащим стромы. Полагают, что такая прокоагулянтная активность главным образом связана с загрязнением испытуемых растворов липидами или фосфолипидами.

ПРИМЕР 18. Определение количества примесей сывороточных белков человека методом ELISA

Количество примесей сывороточного белка в очищенном препарате гемоглобина настоящего изобретения было измерено и сравнивалось с их количеством в других доступных препаратах гемоглобина по сэндвич-методу ELISA.

В настоящем примере использовался сэндвич-метод ELISA согласно общим способам и методикам работы Butler, J.E.(12).

4 микротитрованные пластины размером 1мм Dynatech 96 well были покрыты в качестве твердой фазы козьей сывороткой, абсорбированной антителами комплекса кроличьей и античеловеческой сыворотки (Dako Corporation, Santa Barbara, CA, Lot # 72), разбавленной 1:40 трис-буферным физиологическим раствором. После инкубации в течение 2 часов при 37^oC пластинки промывали трис-буферным физиологическим раствором (TBS) и оставшиеся свободные участки пластины были блокированы инкубированием с гидролизованным рыбьим желатином (Hipure Liquid Gelatin, Norland Products Inc., Hew Brunswick, N.Y.). После инкубирования в течение 1 часа пластинки промывали TBS и добавляли испытуемые образцы в двукратном серийном разбавлении. После инкубирования в течение 1 часа пластинки снова промывали TBS и инкубировали с твердой фазой кроличьей сыворотки, покрытой козьим антителом античеловеческой сыворотки, фракция IgG (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury H.Y., Lot #H036), содержащей 1% рыбьего желатина, разбавленного 1:1000 с TBS (трис-буферным физиологическим раствором). После инкубирования в течение 1 часа пластинка промывалась TBS и затем инкубировалась с очищенным комплексом кроличьего антикозьего антитела, фракция IgG (пероксидаза хрена конъюгированная HRP) (BioRad Lot #75312), разбавленного 1:250 с TBS. После инкубирования в течение 2 часов пластинка промывалась TBS (трис-буферным физиологическим раствором). Комплекс антиген-антитело-HRP проявлялся с использованием о-фенилендиаминдихлорида (OPD - 26 мг/15 мл лимонной кислоты, pH 5,0). Бледно-желтый цвет указывал на присутствие антигенов, в частности белков плазмы. Показатели абсорбции были сняты на приборе Molecular Devices Thermomax Microplate при 490 нм.

Были подвергнуты анализу дубликатные образцы нормальной человеческой сыворотки (Dimension Laboratories Inc., Missisauga, Ontario, Lot #30317), очищенный HbAo из Sigma Corporation (H- 0267), очищенный HbAo из Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) (Lot #92092) и очищенный HbAo из настоящего исследования. Сводка результатов приводится в табл. 9. Очевидно, что продукт изобретения содержал не более 0,0004% белков плазмы, в то время как другие испытанные образцы содержали по крайней мере на порядок выше этих белков.

Во всех проведенных испытаниях единственным сывороточным белком, который содержал продукт настоящего изобретения, являлся человеческий сывороточный альбумин (HSA). Сывороточные белки, обнаруженные в других образцах, по-видимому, представляют собой гетерогенные смеси, включающие HSA и другие белки сыворотки.

Список литературы

1. Hess et al., "Systemic & Pulmonary Hypertension After Resuscitation with Cell-Free Hemoglobin", 1993.

2. Chang et al., "Effect of Single Replacement...", BIOМAT, Art Cells and Immob. Biotech., 20 (2-4), pp 503-510 (1992).

3. Simori et al., "Reaction о Human Endothelial Cells to Bovine Hemoglobin Solutions and Tumour Necrosis Factor".

4. Huisman et al., "Studies on the Heterogeneity of Hemoglobins. IX - The Use of Tris-Hcl Buffers in the Anion-Exchange Chromatography of Hemoglobins", J. Chromatog., 19, 160-169, (1965).

5. Saravis and Zamcheck.

6. Tabata and Chang, Artificial Organs, 6, 213-214 (1982).

7. Wiggler, С.J., "Physiology of Shock", New York, The Common Fund, pp 138-139 (1950).

8. Keipert and Chang, "Effecs of Partial...", Vox. Sang 53, 7-14 (1987).

9. Biessels et al. Annual Report of the Karl Landsteiner Fo undation, 1991.

10. Leeksma et al. Blood 67: 650-654, 1986.

11. Gerrits et al., Thromb. Res 5: 197, 1974.

12. Butler, J.E., ELISA and other Solid Phase Immunoassays, edited by D. M.Kemeny and S.J.Challacombe, John Wiley and Sons Ltd, 1988, pp 1-180.