применение соединений карбазолил-(4)-оксипропаноламина для ингибирования пролиферации клеток гладких мышц

Формула изобретения

1. Применение карведилола в качестве ингибитора пролиферации и миграции клеток гладких мышц у млекопитающих.

2. Применение карведилола в качестве средства для предотвращения рестеноза после чрескожной внутрипросветной (транслуминальной) коронарной ангиопластики у млекопитающих.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается нового применения в медицине соединений карбазолил-(4)-оксипропаноламина формулы I, в частности карведилола, для ингибирования пролиферации клеток гладких мышц. В частности, данное изобретение обеспечивает новое применение карведилола для приготовления фармацевтических композиций, применимых в предотвращении рестеноза после чрескожной транслуминальной реконструкции сосудов сердца (РТСА), для ослабления прогрессирования васкулярной гипертрофии, связанной с гипертензией, и предотвращения развития атеросклероза.

где R₁ обозначает водород, низший алканоил до 6 атомов углерода или ароил, выбранный из бензоила и нафтоила;

R₂ обозначает водород, низший алкил до 6 атомов углерода или арилалкил, выбранный из бензила, фенилэтила и фенилпропила;

R₃ обозначает водород или низший алкил до 6 атомов углерода;

R₄ обозначает водород или низший алкил до 6 атомов углерода или, если X обозначает кислород, R₄ вместе с R₅ могут обозначать -CH₂-O-;

X обозначает валентную связь, -CH₂, кислород или серу;

Ar выбран из фенила, нафтила, инданила и тетрагидронафтила;

R₅ и R₆ отдельно выбраны из водорода, фтора, хлора, брома, гидроксила, низшего алкила до 6 атомов углерода, -CONH₂-группы, низшей алкоксигруппы до 6 атомов углерода, бензилоксигруппы, низшей алкилтиогруппы до 6 атомов углерода, низшего алкилсульфинила до 6 атомов углерода и низшего алкилсульфонила до 6 атомов углерода; или

R₅ и R₆ вместе обозначают метилендиоксигруппу.

Аномальная пролиферация васкулярных гладких мышц связана с сердечно-сосудистыми нарушениями, такими как атеросклероз, гипертония, и с большинством эндоваскулярных процедур. Аномальная пролиферация васкулярных гладких мышц является обычным осложнением чрескожной транслуминальной пластической операции на сосудах сердца (РСТА). Сообщалось, что частота хронического рестеноза, происходящего вследствие пролиферации клеток васкулярных гладких мышц после РТСА, составляет 40-45% в пределах 3 - 6 месяцев (Capron, L., Heudes, D., Chajara, A. & Bruneval, P. (1991) J.Cardiovasc. Pharmacol., 18, 207 - 211; Bourassa, M. (1992) J. Am. Coll. Cardiol., 19, 1410-1411). Некоторые нейрогуморальные факторы, в том числе ангиотензин 11 и норэпинефрин, а также факторы роста, в том числе происходящий из тромбоцитов фактор роста (P_DGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF) были причастны к развитию рестеноза сосудов in vito (Bourassa, М., et al. supra; Powell. J.S., Clozel, J. -P. , Muller, R.K.M., Kuhn, H., Hefti, F., Hosang, M. & Baumgartner, H.R. (1989) Science, 245, 186-198; Clozel, J.-P., Hess, P., Michael, C., Schietinger, K. & Baumgartner, H.R. (1991) Hypertension, 18 (Suppl. 11), 1155-1159; Fingerle, J. , Sanders, K.H. & Fotev, Z. (1991) Basic Res. Cardiol., 86, 75-81; Forney-Prescott, M. , Webb, R.L. & Reidy, M.A. (1991) Am. J. Pathol., 139, 1291-1296; Kauffman, P.F., Been, J.S., Zimmerman, K.M., Brown, R. F. & Steinberg, M.l. (1991) hife Sci., 49, 223-228; Aruma, H., Y. & Hamasaki, H. (1992) Br. J. Pharmacol., 106, 665-671; Ferns, G.A.A., Raines, E. W., Sprugel, K.H., Motani, A.S., Reidy, M.A. & Noss, R. (1991) Science, 253, 1129-1132; и Linder, V. & Reidy M.A. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88, 3739-3743).

Высокая частота васкулярной повторной закупорки, ассоциированной с PICA, привело к разработке in vivo моделей-животных рестеноза. Антагонисты рецептора ангиотензина 11, ингибиторы превращающего ангиотензин фермента (ACE), антагонисты а-адреноцептора и интитела к фактору роста давали обычно только умеренное (10-50%) уменьшение рестеноза сосудов в таких моделях животных (Powell, J.S., at al., supra; Fingerle, J., et al., supra; Forney-Prescott, M. , et al., supra; и Kauffman R.F., et al., supra). Клинические исследования с ингибиторами ACE (которые показали лишь слабый защитный эффект в моделях рестеноза на животных) не смогли продемонстрировать значительной эффективности в предотвращении ангиографически выявленного рестеноза у человека (Popma, J.J., Califf, R.M. & Topol, E.J. (1991) Circulation, 84, 1426-1436). Эта ограниченная или незначительная защита против рестеноза сосудов, производимая агентами со специфическими механизмами действия, наиболее вероятно, отражает сложную природу патофизиологии, лежащей в основе рестеноза сосудов. Считают, что множество хемотактических и митогенных факторов участвуют в этом на повреждение стенок сосудов, и маловероятно, что подавление действий только одного из этих факторов окажется благотворным.

Поэтому крайне желательны терапевтические антимитотические средства, уменьшающие или предотвращающие аномальную пролиферацию клеток гладких мышц, ассоциированную с сердечно-сосудистыми нарушениями, такими как атеросклероз и сосудистая гипертрофия, связанная с гипертензией, или возникающую в результате осложнений после РТСА и вызывающую хронический рестеноз.

В первом аспекте данное изобретение обеспечивает новое медицинское применение соединений карбазолил-(4)-оксипропаноламина формулы I в качестве антимитотичесхих средств для ингибирования роста клеток гладких мышц. В частности, данное изобретение предпочтительно обеспечивает новое применение соединения формулы I, в котором R₁ обозначает - H, R₂ обозначает - H, R₃ обозначает - H, R₄ обозначает - H, X - обозначает О, Ar обозначает фенил, R₅ обозначает орто-OCH₃, a R₆ обозначает - H, причем это соединение лучше известно как карведилол (1-(карбазол-4-илокси-3-[[2-(о-метоксифенокси)этил]амино] -2-пропанол), или его фармацевтически приемлемой соли. При этом указанное соединение применяют для приготовления фармацевтических композиций, применимых для предотвращения рестеноза после РТСА, для подавления прогрессирования гипертрофии сосудов, связанной с гипертензией, и предотвращения развития атеросклероза.

Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает также способ лечения для предотвращения рестеноза после РТСА, для подавления прогрессирования гипертрофии сосудов, связанной с гипертензией, и предотвращения развития атеросклероза у млекопитающих, предусматривающий внутреннее введение млекопитающему, предпочтительно человеку, имеющему в этом необходимость, эффективного количества соединения, выбранного из группы, состоящей в основном из соединений формулы I, предпочтительно соединения формулы I, в котором R¹ обозначает - H, R² обозначает - H, R³ обозначает H, R⁴ обозначает - H, X обозначает О, Ar обозначает фенил, R⁵ обозначает орто-OCH₃, и R⁶ обозначает - H, которое представляет собой карведилол, или его фармацевтически приемлемой соли.

Патент США N 4503067 описывает соединения карбазолил-(4)-оксипропаноламина формулы I:



где R₁ обозначает водород, низший алканоил до 6 атомов углерода или ароил, выбранный из бензоила и нафтоила;

R₂ обозначает водород, низший алкил до 6 атомов углерода или арилалкил, выбранный из бензила, фенилэтила и фенилпропила;

R₃ обозначает водород или низший алкил до 6 атомов углерода;

R₄ обозначает водород или низший алкил до 6 атомов углерода или, если X обозначает кислород, R₄ вместе с R₅ могут обозначать -CH₂-O-;

X обозначает валентную связь, -CH₂, кислород или серу;

Ar выбран из фенила, нафтила, инданила и тетрагидронафтила;

R₅ и R₆ отдельно выбраны из водорода, фтора, хлора, брома, гидроксида, низшего алкила до 6 атомов углерода, -CONH₂ группы, низшей алкоксигруппы до 6 атомов углерода, бензилоксигруппы, низшей алкилтиогруппы до 6 атомов углерода, низшего алкилсульфинила до 6 атомов углерода и низшего алкилсульфонила до 6 атомов углерода; или

R₅ и R₆ вместе обозначают метилендиоксигруппу; и их фармацевтически приемлемые соли.

Этот патент описывает далее соединение формулы I, более известное как карведилол (1-(карбазол-4-илокси-3-[[2-(o-мeтoкcифeнoкcи)этил]амино]-2- пропанол), имеющее структуру, показанную в формуле II:



Эти соединения, примером которых является карведилол, являются новыми лекарственными средствами множественного действия, применимыми в лечении легкой и умеренной гипертензии и имеющими применение в случае ангины и застойной сердечной недостаточности (CHF) Известно, что карведилол является как конкурентным антагонистом b-адреноцептора, так и вазодилататором, а также антагонистом кальциевых каналов при высоких концентрациях. Сосудорасширяющее действие карведилола происходит первично из блокады а₁-адреноцептора, тогда как блокирующая b-адреноцептор активность этого лекарственного средства предотвращает рефлекторную тахикардию при применении в лечении гипертензии. Эти множественные действия карведилола ответственны за антигипертензивную эффективность этого лекарственного средства в животных, в частности, в человеке, а также за его применимость в лечении ангины и CHF (C^M, Willette, R.N., Sauermelch, C.F. & Ruffolo, R.R., Jr. (1990) Eur. J. Pharmacol., 176, 237-240, Nichols, A.J., Gellai, M. & Ruffolo, R.R., Jr., (1991) Fundam. Clin. Pharmacol., 5, 25-38; Ruffolo, R.R., Jr., Gellai, M., Hieble, J.P., Willetee, R.N. & Nichols, A.J. (1990) Eur. J. Clin. Pharmacol. , 38, 582-588; Ruffolo, R.R., Jr., Boyle, D.A., Venuti, R.P. & Lucas, M.A. (1991) Drugs of Today, 27, 465-492; и Yue, T.-L., Cheng, H., Lysko, P.G., Mckenna, P.J., Feuerstein, R, Gu, J, Lysko, K.A., Davis, L.L. & Feverstein, G. (1992) J. Pharmacol. Exp. Ther., 263, 92-98).

Антигипертензивное действие карведилола опосредовано первично снижением общей устойчивости периферических сосудов без сопутствующих рефлекторных изменений в частоте сердечных сокращений, связанных с другими антигипертензивными средствами (Willette, R.N., et al. supra; Nichols, A.J., et al. supra; Ruffolo, R.R., Jr., Gellai, M., Hieble, J.P., Willette, R.N. & Nichols, A. J. (1990) Eur. J. Clin. Pharmacol., 38, 582-588). Карведилол также заметно уменьшает объем инфаркта у крыс, собак и свиней (в модельных системах инфаркта миокарда) Ruffolo, R.R., Jr., et al. Drugs of Today, supra, возможно вследствие его действия в качестве антиоксиданта в ослаблении инициируемого свободными радикалами кислорода перокисления липидов (Yue, T.-L., et al. supra).

Обнаружено, что соединения формулы I, в частности карведилол, способны блокировать стимулируемую митогеном пролиферацию культивируемых клеток гладких мышц аорты крысы in vitro. Наиболее поразительным наблюдением в этих исследованиях является то, что указанные соединения, в частности карведилол, способны блокировать пролиферативные действия некоторых фармакологически неродственных митогенов, в том числе тромбина, PDGF, эпидермального фактора роста (EGF), ангиотензина 11 и эндотелина-1, с IC₅₀ приблизительно 1 мкМ в случае карведилола. Это действие не является общим с другими антагонистами - адреноцептора, такими как лабеталол, целипролол или соталол. Поскольку указанные соединения, в частности карведилол, ингибируют пролиферативные действия множественных митогенных стимулов, применение этих соединений, в частности карведилола, для ингибирования пролиферации клеток гладких мышц и, следовательно, для предотвращения терапевтически нежелательных последствий такой пролиферации имеет явное преимущество по сравнению с применением специфических антагонистов факторов роста.

Далее обнаружено, что соединения формулы I, в частности карведилол, демонстрируют превосходные защитные эффекты против пролиферации гладких мышц в кровеносных сосудах. Более конкретно, соединения формулы I, в том числе карведилол, сильно ингибируют пролиферацию клеток гладких мышц сосудов, миграцию и неоинтимальную (во внутренней оболочке сосудов, интиме) пролиферацию в артериях, подвергнутых острому повреждению, индуцируемому балонной пластикой сосудов.

В результате данное изобретение обеспечивает применение соединения, выбранного из группы, состоящей в основном из соединений формулы I, предпочтительно карведилола, или их фармацевтически приемлемых солей для ингибирования пролиферации и миграции клеток гладких мышц в млекопитающих, предпочтительно в человеке, в частности, для предотвращения рестеноза вследствие индуцируемой хирургией сосудов неоинтимальной пролиферации (пролиферации внутренней оболочки) в кровеносных сосудах больных, перенесших РТСА; для ингибирования развития атеросклероза; или для подавления прогрессирования гипертрофии сосудов, связанной с гипертензией.

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения для ингибирования пролиферации и миграции клеток гладких мышц в млекопитающих, предпочтительно в человеке, в частности, способ лечения для предотвращения рестеноза индуцируемой пластикой сосудов неоинтимальной пролиферации в кровеносных сосудах больных, перенесших РТСА; для подавления прогрессирования гипертрофии сосудов, связанной с гипертензией, причем этот способ предусматривает введение больному, имеющему необходимость в таком лечении, эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей соединение согласно пункту 1 формулы изобретения, предпочтительно карведилола, или его фармацевтически приемлемой соли.

Как показано далее в приведенных ниже примерах, карведилол дает мощную защиту (т. е. 84% уменьшение поперечной площади интимы (внутренней оболочки сосудов)) против индуцируемой баллонной пластикой сосудов пролиферации неоинтимальных гладких мышц, миграции и стеноза в крысиной общей модели сонной артерии. Кроме того, карведилол значительно ингибирует миграцию клеток гладких мышц сосудов in vitro и ингибирует митогенез человеческих васкулярных гладких мышц, опосредованный широким разнообразием различных митогенов, что, без ограничения какими бы то ни было объяснениями механизма или теорией действия, является причиной резко выраженной защиты от рестеноза сосудов после баллонной реконструкции сосудов in vivo.

Антипролиферативный защитный механизм карведилола согласно данному изобретению не является результатом блокады кальциевых каналов или рецепторов ангиотензина 11, которые (оба фактора) причастны к стенозу, вызываемому баллонной реконструкцией сосудов, т.к. гемодинамические эксперименты показали, что существующие схемы дозирования карведилола не оказывают значительных воздействий на кальциевые каналы или рецепторы ангиотензина 11. Кроме того, в сходной модели животного, подобной модели, примененной в данном изобретении, блокатор кальциевых каналов нифедипин давал менее чем 40% защиту в бедренной артерии кроликов после реконструкции сосудов (Jackson, C.L., Bush, R.C. & Bowyer, D.E. (1988) Artheroscler, 69, 115-122).

Хотя блокада -адреноцептора не может быть исключена как механизм, которым карведилол защищает против ответной реакции васкулярных гладких мышц на реконструкцию сосудов, не существует доказательства, чтобы предположить, что эти рецепторы способны медиировать митогенез гладких мышц. Однако в противоположность этому существует доказательство, позволяющее предположить, что активация а₁-адреноцептора циркулирующим норепинефрином может участвовать в сужении просветов сосудов после реконструкции сосудов. Однако антагонист а₁-адреноцептора, празосин (1 мг/кг, перорально) дает только 16% ингибирование пролиферации васкулярных гладких мышц, наблюдаемой после реконструкции сонной артерии крысы (Fingerle, J., et al., supra). Кроме того, маловероятно, что гипотензивные действия карведилола способствуют наблюдаемым антипролиферативным действиям ввиду того, что другие гипотензивные агенты не оказывают заметных действий на васкулярный рестеноз, наблюдаемых с карведилолом. Кроме того, непрерывное введение антагониста рецептора ангиотензина 11, лосартана, в течение сходного периода времени давало сходное снижение общего кровяного давления по сравнению с уменьшением давления, наблюдаемым с карведилолом в крысиной модели данного изобретения, но дало только 48% уменьшение в пролиферации неоинтимы (внутренней оболочки сосуда) (Kauffman, R. F. , et al., supra). Также равные гипотензивные дозы некоторых других гипотензивных агентов, таких как миноксидил или гидралазин, не давали значительной защиты против васкулярного рестеноза (Rowell, J.S., Muller, R.K.M. & Baungartner, H.R. (1991) J. Am. Coll. Cardiol., 17, 137B-142B).

Хемотактическая миграция медиальных клеток гладких мышц в интиму является важным первым шагом в патогенезе образования неоинтимы после баллонной реконструкции сосудов. Считают, что PDGF является ключевым веществом для усиления миграции и пролиферации клеток гладких мышц (Ferns, G.A.A., et al, supra; Ross, R. (1986) N. Engl. J. Med. 314, 488-500). Согласно данному изобретению карведилол ингибирует миграцию клеток гладких мышц, индуцируемую FDGF, с величиной 10₅₀, сравнимой с активностями, наблюдаемыми для ингибирования пролиферации гладких мышц и антиоксидантной активностью. Без ограничения каким-либо объяснением механизма или теорией действия способность карведилола ингибировать образование миоинтимы in vivo может быть отчасти связана с прямым ингибированием физической миграции васкулярной гладкой мышцы из среды наружной оболочки в среду интимы (внутренней оболочки), а также отчасти с антиоксидантной активностью карведилола, которая может ингибировать привлечение макрофагов и моноцитов к месту повреждения. Поскольку окисленный липопротеин низкой плотности (LDL) является также хемотактическим в васкулярной гладкой мышце и карведилол ингибирует окисление LDL, это могло бы быть дополнительным механизмом, способствующим значительному ингибированию образования неоинтимы in vivo.

В то время как точные молекулярные события, приводящие к антипролиферативным и антимиграторным действиям карведилола ожидают дальнейшего выяснения, новое медицинское (лечебное) применение карведилола и способ лечения с применением карведилола согласно данному изобретению дает ярко выраженную защиту в модели животного от образования неоинтимы и стеноза после пластической операции на сосудах. Степень защиты, продуцируемой карведилолом, сравнима только с недавним сообщением об экспериментальном c-my в антисмысловом олигонуклеотиде (Simons, М., Edelman, E.R., Dekeyser, J.-L., Langer, R. & Rosenberg, R.D. (1992) Nature, 359, 67-70). Эта защита достигалась только через прямое помещение антисмысловой конструкции на поврежденную поверхность сосуда в противоположность данному применению и способу лечения, в котором антистенотические эффекты легко достигаются путем системного введения, которое более соответствует общепринятой медицинской практике. Степень индуцируемой карведилолом защиты от рестеноза (до 84%) с применением общей дневной дозы 2 мг/кг далеко превышала степень защиты, которая сообщалась для других соединений на некоторых моделях, животных.

Соединения формулы I могут быть легко приготовлены, как описано в патенте США 4503067. Карведилол коммерчески производится из Smithkline Beecham Corporation (KREDEX^R) и Boeringer Manngeim GmbH (Germany).

Фармацевтические композиции соединений формулы I, в том числе карведилол, могут вводиться больным в соответствии с данным изобретением любым приемлемым в медицине способом, предпочтительно парентерально. Для парентерального введения фармацевтическая композиция должна быть в форме стерильной инъецируемой жидкости, хранящейся в подходящем контейнере, таком как ампула, или в форме водной или неводной жидкой суспензии. Природа и состав фармацевтического носителя, разбавителя или наполнителя, будут, конечно зависеть от предполагаемого способа введения, например, от того, предполагается ли внутривенная или внутримышечная инъекция.

Фармацевтические композиции соединений формулы I для применения согласно данному изобретению могут быть приготовлены в виде растворов или лиофилизированных порошков для парентерального введения. Порошки могут быть реконституированы добавлением подходящего разбавителя или другого фармацевтически приемлемого носителя перед использованием. Жидкая композиция обычно представляет собой забуференный, изотонический водный раствор. Примерами подходящих разбавителей являются нормальный изотонический солевой раствор, стандартная 5% декстроза в воде или буферном растворе ацетата натрия или аммония. Такая композиция особенно пригодна для парентерального введения, но может быть также использована для перорального введения или содержаться в ингаляторе или распылителе с отмеренными дозами для инсуффляции. Может быть желательным добавление наполнителей, таких как этанол, поливинилпирролидон, желатин, гидроксицеллюлоза, акация, полиэтиленгликоль, маннит, хлорид натрия или цитрат натрия.

Альтернативно эти соединения могут быть капсулированы, таблетированы или приготовлены в виде эмульсии или сиропа для перорального введения. Фармацевтически приемлемые твердые или жидкие носители могут быть добавлены для усиления или стабилизации композиции или для облегчения приготовления композиции. Жидкими носителями могут быть сироп, масло земляного ореха, оливковое масло, глицерин, солевой раствор, этанол и вода. Твердыми носителями могут быть крахмал, лактоза, дигидрат сульфата кальция, terra alba, стеарат магния или стеариновая кислота, тальк, пектин, акация, агар или желатин. Носитель может также содержать материал для пролонгированного выделения активного вещества, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, отдельно или с воском. Количество твердого носителя варьирует, но предпочтительно должно быть между приблизительно 20 мг и приблизительно 1 г на единицу дозы. Эти фармацевтические препараты готовят в соответствии с обычными способами, принятыми в фармации, включающими размалывание, смешивание, гранулирование и компрессию (сжатие), если требуется, для таблеток; или размалывание, смешивание и заполнение для твердых желатиновых капсул. При применении жидкого носителя препарат будет в форме сиропа, эликсира, эмульсии или водной, или неводной суспензии. Такую жидкую композицию можно вводить непосредственно перорально или наполнять ею мягкую желатиновую капсулу.

Дозы для людей для лечения заболевания согласно данному изобретению не должно превышать приблизительно 100 мг/день соединений формулы I, в том числе карведилола. Для предотвращения повторной закупорки после РТСА предпочтительной схемой дозирования является введение приблизительно от 12,5 мг/день до приблизительно 100 мг/день соединения формулы I, предпочтительно карведилола, в виде однократной дозы или множественных доз до трех раз в день перед реконструкцией сосудов, во время реконструкции и до 6 месяцев после реконструкции сосудов; наиболее предпочтительной дозой является 25 мг/день 3 раза ежедневно. Понятно, что фактические предпочтительные дозы этих соединений, применяемых в композициях данного изобретения, будут варьировать в соответствии с конкретной приготовленной композицией, способом введения, конкретным местом введения, подвергнутым лечению хозяином и конкретным заболеванием.

При применении соединений формулы I, в том числе соединения формулы II, согласно данному изобретению не ожидаются неприемлемые токсикологические эффекты.

В следующих примерах все температуры даны в ^oC. Если нет других указаний, все исходные материалы были получены из коммерческих источников. Специалист в данной области может, используя предшествующее описание, использовать это изобретение в самой полной степени. Примеры даны для иллюстрации изобретения, но не для ограничения объема изобретения.

Примеры

Материалы

Человеческий эпидермальный фактор роста и полученный из тромбоцитов фактор роста А/В были куплены в Boehringer Mannheim Corporation (Indianapolis, IN), [³H] тимидин (удельная активность=110 Км/ммоль; New England Nuclear, Boston, MA) и человеческий тромбин были куплены в Sigma (St. houis, МО). Карведилол был получен из Boehringer Mannheim (Germany). Растворы карведилола были приготовлены для инъекции непосредственно перед каждым введением путем растворения 5 мг соединения в носителе, состоящем из 0,3 мл кислоты-этанола (равные объемы 100% этанола и 1 М HCl) в 4,7 мл стерильной дистиллированной воды. Все другие химикалии были реагентной чистоты из коммерческих источников и их применяли без дальнейшей очистки.

Статистика

Величины выражали в виде среднего S.B.M. и n обозначает количество животных или отдельных экспериментов, исследованных в конкретной группе. Статистические сравнения проводили однофакторным дисперсионным анализом с величиной p менее 0,05, принятой как значимая величина.

Культура клеток васкулярных гладких мышц

Первичные культуры гладкой мышцы аорты крысы для применения в исследованиях миграции получали способом эксплантатов, описанным ранее в Ohlstein, E.H., Arleth, A., Bryan, Н., Elliott, J.D. & Sung, C.-Р. (1992) Eur. J. Pharmacol. , 225, 347-350. Криоконсервированные первичные культуры человеческих клеток гладких мышц легочной артерии (пассаж 3) для применения в исследованиях синтеза ДНК получали из Clonetics Corp. (San Diego, CA). Клетки росли в модифицированной среде MCDB 131, содержащей 5% фетальную бычью сыворотку, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 2 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 1 мкМ дексаметазон, 10 мкг/мл сульфата гентамицина и 10 нг/мл амфотерицина В (Clonetics Corp.).

Синтез ДНК

Клетки гладких мышц сосудов человека высевали в 24-луночные планшеты (Corning, NY) (210⁴ клеток/см², пассаж 6) и выращивали до слияния (3 дня). Затем клетки превращали в покоящиеся (G₀) заменой содержащей сыворотку среды модифицированной по способу Дульбекко средой Игла (DMEM; Gibco haboratories. Grand Island, NY), содержащей инсулин (5 мкг/мл), трансферрин (5 мкг/мл) и селенит натрия (5 нг/мл), в течение 48 часов. Затем клетки пополняли свежей средой один раз в середине и после периода 48 часов покоя. Карведилол добавляли за 15 минут перед добавлением митогена в течение дополнительных 24 часов инкубации. Синтез ДНК оценивали измерением включения радиоактивности (4 часа) [³H] тимидина в нерастворимую в ТСА (ТХУ) фракцию.

Пример 1

Миграция васкулярной гладкой мышцы

Способ оценки миграции клеток васкулярных гладких мышц был описан ранее в Hidaka, Y. , Eda, Т., Yonemoto, М. & Kamei, Т. (1992) Atheroscler. 95, 78-94. Клетки гладкой мышцы аорты крысы (пассаж 3) суспендировал (110⁶ клеток/мл) в бессывороточной DMEM с добавлением 0,2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (Sigma). Миграционные тесты выполняли в камерах Бойдена с применением камер для клеточной культуры Transwell (Costar, Cambridge, MA) с поликарбонатной мембраной с размером пор 8 мкм. РDGF растворяли в DMEM и помещали в нижний компартмент в присутствии или в отсутствии карведилола. Затем клетки васкулярных гладких мышц (5 10⁵) вносили в верхний компартмент и инкубировали в течение 24 часов при 37^oC в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Немигрировавшие клетки на верхней поверхности осторожно соскребали и промывали трижды PBS. Фильтры фиксировали в метаноле и окрашивали biemsa. Под микроскопом определяли число клеток васкулярных гладких мышц на поле зрения под большим увеличением l00х (HPF), которые мигрировали к нижней поверхности фильтров. Считали 4 HPF на один фильтр. Эксперименты проводили в двух или трех повторностях.

PDGF давал зависимые от концентрации увеличения в миграции клеток васкулярных гладких мышц крыс с максимальным эффектом, полученным при концентрации 1 нМ. При помещении карведилола в нижнюю камеру с PDGF миграционный эффект значительно ингибировался зависимым от концентрации образом с величиной 1C₅₀ для карведилола 3 мкМ.

Пример 2

Баллонная реконструкция сонных артерий крыс

Животных, примененных в этом исследовании, разделяли на две группы, (а) применяемых в гемодинамических исследованиях и (b) применяемых для гистопатологического испытания степени пролиферации неоинтимы после баллонной пластики сонной артерии. Затем эти две основные группы подразделяли на животных, которых обрабатывали карведилолом (1 мг/ кг, интраперитонеально, дважды в день; приблизительно 5 мкмолей/кг/день), и животных, которые служили в качестве контролей (получавших равный объем носителя карведилола) Всех животных предобрабатывали либо карведилолом, либо носителем три дня перед началом либо гемодинамических исследований, либо реконструкции сонной артерии (последняя группа получала карведилол или носитель в течение последующих 14 дней после хирургической операции, после чего этих животных убивали для гистологической обработки сонных артерий). Баллонную пластику левой общей сонной артерии проводили при асептических условиях в анестезированных (пентобарбитал натрия; 65 мг/кг) мужских особях Sprague-Dawley крыс (380-420 г), которых предобрабатывали в течение 3 дней либо карведилолом, либо носителем. После надреза по передней средней линии находили левую наружную сонную артерию и очищали ее от прилипших тканей до точки ее начала при ответвлении от общей сонной артерии. Особую осторожность соблюдали, чтобы избежать повреждения блуждающего нерва или ассоциированного с ним верхнего цервикального ганглия и симпатического тяжа при очистке дистальной части сонной артерии. Катетер 2-F Fogarty артериальной эмболэктомии (Baxter Healthcare Corporation, Santa Ana, CA) вводили в просвет левой наружной артерии и проводили на фиксированное расстояние (5 см) вниз по наружной сонной и общей сонной артериям до такой точки, чтобы кончик кататера был рядом с дугой аорты. В этом положении баллон наполняли жидкостью, достаточной для создания слабой резистантности со стенкой сосуда при вытягивании кататера. Затем с наполненным баллоном кататер вытягивали при постоянной скорости (приблизительно 2 см/сек) обратно до точки, рядом с местом введения в наружную сонную артерию. Эту процедуру выполняли всего три раза, затем кататер удаляли и рану закрывали. Животных держали в клетках из плексигласа парами при 12-часовом цикле свет/темнота с доступом к стандартной лабораторной еде и питьевой воде adlibitum.

Общие сонные артерии удаляли из крыс через 14 дней после баллонной пластики сосудов для использования в гистопатологических исследованиях. Степень образования неоинтимы, видимая на 14-й день, определялась количественно гистологически. Сосуды были фиксированы перфузией при постоянном давлении (95-100 мм Hg) in situ сразу после чрезмерной дозы пентобарбитала натрия. Всю длину общей сонной артерии от дуги аорты до разветвления сонной артерии (приблизительно 5 см в длину) удаляли для гистологической обработки. Артериальные поперечные срезы (8 мкм) отрезали из парфиновых блоков, содержащих среднюю треть этих артерий, и обрабатывали для окрашивания гематоксилином и эозином. Поперечные площади слоев кровеносных сосудов (интима, срединная часть и адвентициальная оболочка) количественно определяли при помощи системы получения изображения клеток Bioscan Optimus (Edmonds, WA).

Все эксперименты проводили в соответствии с инструкциями Animal Care and Use Committee, Smithkline Beecham Pharmaceuticals and AALAC.

Обработка карведилолом не влияла на увеличение веса тела в течение 17 дней периода обработки (3806 г, n = 9, и 377 6 г, n = 10, в группах, обработанных карведилолом и носителем за 3 дня перед хирургией и 425 9 г и 416 7 г через 14 дней после баллонной пластики сосудов, соответственно), Крысы, обработанные карведилолом (1 мг/кг i.p.; два раза в день в течение 3 дней) имели значительно более низкое среднее артериальное давление в покое и частоты сердечных сокращений (102 5 мм Hg 305 9 bpm, соответственно; n = 6), чем животные в группе с обработкой носителем (125 3 мм Hg и 360 21 bpm, соответственно; n = 7)

Балонная пластика левой общей артерии дала заметное утолщение интимы в обработанных носителем крысах, что привело к очень значительному 20-кратному увеличению отношения интима: средняя часть. Противоположные правые общие сонные артерии, которые не подвергались процедуре реконструкции сосудов, были нормальными как в крысах, обработанных карведилолом, так и в крысах, обработанных носителем; т.е. не наблюдали различий между площадями интимы, медиальной и адвентициальной площадями, и эти сосуды имели идентичные отношения интимы к медиальной части. Степень образования неоинтимы в сонных артериях, подвергнутых пластике, была резко ослаблена обработкой карведилолом, который вызывал 84% уменьшение поперечной площади интимы и сравнимое 81% уменьшение отношения интима: медиальная часть. Обработка карведилолом не изменила ни медиальную, ни адвентициальную поперечную площадь. Таким образом, обработка карведилолом дала заметную и высоко значимую защиту от пролиферации миоинтимы и миграции, происходящих из повреждения стенок сосудов после баллонной пластики сосудов.

Пример 3

Ингибирование митогенеза васкулярных гладких мышц человека

Карведилол (0,1-10 мкМ) вызывал зависимое от концентрации ингибирование митогенеза, стимулируемого PDGF (1 нМ), EGF (1 нМ), тромбином (0,1 Е/мл) и фетальной бычьей сывороткой (1%) в культивируемых клетках гладких мышц легочной артерии человека. Величины 1C₅₀ для карведилола против митогенеза стимулируемого факторами роста и сывороткой, были между 0,3 и 2 мкМ. Этот эффект был полностью обратим, т.к. клетки восстанавливали полную восприимчивость к стимуляции роста, если карведилол вымывали из среды после 24 часов инкубирования.

Приведенное выше описание полностью раскрывает, как приготовить и использовать данное изобретение. Однако данное изобретение не ограничено описанным выше конкретным вариантом и включает все его модификации в объеме формулы изобретения.