способы получения композиции тканевого трансплантата; тканевые композиции, способ хирургического восстановления коллагенового мениска, способ стимулирования заживления ран, конструкция тканевого трансплантата, способ индуцирования образования эндогенной ткани, способ усиления функции сфинктера у животного

Формула изобретения

1. Способ получения композиции тканевого трансплантата кишечной подслизистой основы, отличающийся тем, что композиция находится в виде суспензии ткани кишечника, содержащей кишечную подслизистую основу, причем указанный способ включает стадии измельчения ткани кишечника, содержащей кишечную подслизистую основу, и гидратирование полученной измельченной ткани кишечника с получением указанной композиции тканевого трансплантата в виде жидкости, имеющей вязкость от около 2 до 300000 мПа с при 25^oС.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия измельчения включает стадию замораживания ткани кишечника и размалывание замороженной кишечной подслизистой основы.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия измельчения включает стадию сушки вымораживанием ткани кишечника и размалывание высушенной вымороженной ткани кишечника.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадия измельчения включает стадию обработки ткани кишечника в смесителе с высоким сдвигом.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию стерилизации композиции тканевого трансплантата.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что ткань кишечника содержит оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию переваривания измельченной ткани кишечника при помощи протеазы за период времени, достаточный для того, чтобы солюбилизировать указанную ткань с получением композиции тканевого трансплантата в виде, по существу, гомогенного раствора.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию нейтрализации, по существу, гомогенного раствора, чтобы инактивировать протеазу.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что ткань кишечника содержит оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию отделения солюбилизированной ткани от, по существу, гомогенного раствора.

13. Способ получения композиции тканевого трансплантата кишечной подслизистой основы, отличающийся тем, что кишечную подслизистую основу измельчают и/или осуществляют переваривание протеазой в течение периода времени, достаточного для того, чтобы солюбилизировать кишечную подслизистую основу с получением, по существу, гомогенного раствора.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что осуществляют переваривание кишечной подслизистой основы при помощи протеазы.

15. Способ по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию отделения солюбилизированной ткани от, по существу, гомогенного раствора.

16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что ткань кишечника содержит оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника позвоночного животного.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

18. Композиция тканевого трансплантата кишечной подслизистой основы для стимулирования восстановления дефектов ткани, отличающаяся тем, что композиция содержит эффективное количество суспензии измельченной кишечной ткани, включающей оболочку подслизистой основы в водной среде и имеющей вязкость от около 2 до около 300000 мПа с при 25^oС.

19. Композиция по п.18, отличающаяся тем, что ткань кишечника содержит оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

20. Композиция по п.18, отличающаяся тем, что является высушенной и находится в форме порошка.

21. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

22. Композиция по п.21, отличающаяся тем, что является высушенной и находится в форме порошка.

23. Композиция тканевого трансплантата кишечной подслизистой основы для стимулирования восстановления дефектов ткани, отличающаяся тем, что содержит эффективное количество раствора переваренной протеазой ткани кишечника, включающей оболочку подслизистой основы в водном носителе, причем указанная композиция имеет вязкость от около 2 до около 300000 мПа с при 25^oС.

24. Композиция по п.23, отличающаяся тем, что ткань кишечника содержит оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

25. Композиция по п.24, отличающаяся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

26. Композиция по п.23, отличающаяся тем, что композиция практически не содержит протеазы.

27. Конструкция тканевого трансплантата, включающая ткань кишечника, отличающаяся тем, что ткань кишечника сформирована в закрытый мешочек, содержащая композицию тканевого трансплантата, включающую суспензию измельченной ткани кишечника или раствор переваренной ткани кишечника, при этом указанная ткань кишечника включает оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

28. Конструкция тканевого трансплантата по п.27, отличающаяся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

29. Способ хирургического восстановления коллагенового мениска на соприкасающейся поверхности соединяющихся костей, включающий стадию хирургической имплантации в указанную соприкасающуюся поверхность конструкции тканевого трансплантата по п.27.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

31. Способ ускорения заживления ран, включающий стадию наложения на рану, нуждающуюся в заживлении, эффективного количества композиции тканевого трансплантата, содержащей суспензию измельченной ткани кишечника в водной среде или раствор переваренной ткани кишечника в водном носителе, в котором указанная ткань кишечника включает оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что ткань кишечника состоит по существу из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

33. Способ стимулирования образования эндогенной ткани у теплокровного позвоночного в очаге, в котором желательно образование эндогенной ткани, включающий доставку в очаг композиции тканевого трансплантата, отличающийся тем, что композиция содержит суспензию измельченной ткани кишечника, включающей оболочку подслизистой основы или эту ткань в переваренном виде, в количестве, эффективном для того, чтобы стимулировать рост эндогенной ткани в очаге.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что ткань кишечника содержит оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы, мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

36. Способ по п.33, отличающийся тем, что эндогенная ткань, рост которой стимулируется, представляет собой костную или соединительную ткань, включающую коллаген, эластин или мышечную ткань.

37. Способ по п.33, отличающийся тем, что композиция тканевого трансплантата вводится при помощи инъекции в ткань, образующую сфинктер у теплокровного млекопитающего, и что ткань, рост которой стимулируется, представляет собой ткань, образующую сфинктер.

38. Способ усиления функции сфинктера у теплокровного млекопитающего, включающий стадию введения при помощи инъекции в ткань, образующую указанный сфинктер, эффективного количества композиции тканевого трансплантата, содержащей суспензию измельченной ткани кишечника, включающей оболочку подслизистой основы или переваренную ткань кишечника, включающую оболочку подслизистой основы.

39. Способ по п.38, отличающийся тем, что ткань кишечника содержит оболочку подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки, причем указанные оболочка подслизистой основы и базальные части слизистой оболочки отслаиваются от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки кишечника теплокровного позвоночного животного.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что ткань кишечника состоит, по существу, из оболочки подслизистой основы мышечной пластины слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к инъекционной композиции тканевого трансплантата, способам ее получения и использования. Более конкретно, изобретение направлено на инъекционные неиммунногенные композиции тканевого трансплантата, полученные из кишечной подслизистой основы. При введении ин виво в области тканевого поражения данные разжиженные композиции тканевого трансплантата способствуют росту эндогенной ткани и восстановлению поражения.

Известно, что композиции, содержащие подслизистую основу и базилярные части слизистой оболочки кишечника теплокровных позвоночных, можно использовать в качестве материалов тканевого трансплантата в форме слоя. См. патент США N 4902508. Предпочтительные триламинатные слойные композиции, описанные и заявленные в этом патенте, характеризуются отличными механическими свойствами, включая высокую эластичность, высокий показатель давления на разрыв и хороший показатель пористости, которые позволяют благоприятно использовать такие композиции для сосудистых трансплантатов. Материалы трансплантатов, раскрытые в этом патенте, также полезны для замены связок и сухожилий. При таких использованиях предпочтительные триламинантные трансплантаты служат в качестве матрицы для возрождения тканей, замененных трансплантатами. Предполагают, что такие свойства придают уникальные триламинантные слойные структуры трансплантатов, полученных из кишечной ткани.

Неожиданно было выявлено, что кишечная подслизистая основа может быть разжижена измельчением и/или перевариванием протеазой без потери ее очевидных биотропных свойств для использования в менее инвазивных способах назначения (например, инъекция или наружное применение) к ткани-хозяину, которая нуждается в восстановлении.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается инъекционная неиммуногенная композиция тканевого трансплантата. В одном варианте композиция включает измельченную (толченую) крупную или мелкую кишечную подслизистую основу, предпочтительно в водной суспензии. В другом аспекте изобретения предлагается композиция, включая переваренную протеазой кишечную подслизистую основу.

Разжиженная композиция преимущественно используется в способе для стимулирования образования эндогенной ткани, включая костную и мягкую ткани, такие как мышечные и соединительные ткани и теплокровных позвоночных. Способ включает стадию введения с помощью инъекции в организм позвоночного композиции, содержащей суспензию толченой кишечной подслизистой основы или ее в виде, переваренном протеазой, в количестве, эффективном для стимуляции роста эндогенной ткани в месте введения разжиженной композиции тканевого трансплантата. Эндогенные соединительные ткани, рост которых индуцируется в соответствии с этим изобретением, включают коллаген, эластин и мышцы.

В другом более специфичном аспекте настоящего изобретения предлагается способ для усиления функции сфинктера у теплокровных млекопитающих, при этом способ включает стадию введения в ткань, образующую указанный сфинктер, эффективного количества композиции тканевого трансплантата, содержащей водную суспензию толченой кишечной подслизистой основы. И еще один аспект настоящего изобретения предусматривает способ усиления функции сфинктера, в котором инъекционная композиция содержит кишечную подслизистую основу, переваренную протеазой.

Инъекционные или "разжиженные" композиции по изобретению можно использовать во множестве применений при заживлении или восстановлении ткани. Их можно использовать в чистом виде или в комбинации с трансплантатным материалом, описанным в патенте США 4902308. Например, композиции настоящего изобретения можно использовать для хирургической реконструкции коллагенового мениска на внутренней поверхности сочленяющихся костей. В такой реконструкции слой первой композиции тканевого трансплантата, включающий предпочтительно кишечную подслизистую основу теплокровного позвоночного, формируется в герметичный мешочек и заполняется разжиженной композицией тканевого трансплантата данного изобретения.

Дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения будут очевидны специалистам данной области техники после ознакомления со следующим подробным описанием предпочтительных вариантов, демонстрирующих наилучший способ реализации изобретения.

Один предпочтительный исходный материал для композиций в соответствии с настоящим изобретением включает оболочку подслизистой основы вместе с базальными частями слизистой оболочки сегмента кишечной ткани теплокровного позвоночного. В частности, предпочтительный исходный материал включает оболочку подслизистой основы вместе с мышечной пластиной слизистой оболочки и компактного слоя слизистой сегмента кишечника позвоночного животного, причем указанные слои отделены от мышечной оболочки и части слизистой оболочки, обращенной к просвету кишки сегмента. Такой материал именуется здесь подслизистой основой тонкого кишечника ("SIS") или триламрнатом SIS.

Получение SIS из сегмента тонкой кишки подробно описано в патенте США N 4902508, раскрытие которого включено сюда ссылкой. Сегмент кишки сначала подвергается выскабливанию движением в продольном направлении, чтобы удалить как наружные слои (в частности, серозную оболочку и мышечную оболочку), так и внутренние слои (просветные части слизистой оболочки). Обычно SIS промывается физраствором и может храниться в гидрированном или обезвоженном состоянии до использования, как описано ниже.

Настоящие жидкие композиции готовятся в виде растворов или суспензий кишечной подслизистой основы толчением и/или перевариванием подслизистой основы протеазой, такой как трипсин или пепсин в течение времени, достаточного, чтобы растворить ткань и образовать гомогенный раствор. Исходный материал кишечной подслизистой основы измельчается разрывом, нарезкой, перемалыванием и другими способами. Желательно измельчать подслизистую основу в замороженном или высушенном замораживанием состоянии, хотя хорошие результаты можно получить, если подвергнуть суспензию из кусочков подслизистой оболочки обработке в высокоскоростной мешалке и, при необходимости, обезвоживанию центрифугированием и декантированием избыточной воды. Истолченную кишечную подслизистую основу можно высушить с получением порошка. После этого ее можно гидрировать, т.е. соединить с водой или буферным физраствором, а также с другими фармацевтически приемлемыми наполнителями, чтобы получить композицию тканевого трансплантата в виде жидкости с вязкостью от 2 до около 300000 сПа при 25^oC. Трансплантатные композиции с более высокой вязкостью могут иметь консистенцию геля или пасты. Композиции настоящего изобретения можно стерилизовать с использованием в данной области техники стерилизации, такой как подвержение ионизирующей радиации.

Разжиженные композиции кишечной подслизистой основы этого изобретения можно использовать для получения антител к материалу тканевого трансплантата, описанному в патенте США 4902508, с использованием технологии гибридомы, известной в этой области. Разжиженная подслизистая основа, полученная из SIS, вводится посредством инъекции иммунологически компетентному животному, чтобы вызвать продуцирование лимфоцитов в селезенке животного, производящих антитела. Лимфоциты сливаются с клетками миеломы и образуют гибридные клетки (гибридомы), которые отбираются на продуцирование антитела подслизистой основы. Моноклональные антитела, продуцируемые выращиванием отобранных гибридов, изолируются и используются для обнаружения подслизистой ткани ин виво и ин витро.

Разжиженная подслизистая основа этого изобретения также находит использование в качестве инъекционного гетеротрансплантата для тканей, например костной или мягкой ткани, которая нуждается в заживлении или наращивании, в основном для того, чтобы залечить травму или повреждение ткани вследствие болезни. Данные композиции разжиженной подслизистой основы находят себе применение также в качестве наполнителя для имплантированных конструкций, включающих один или несколько слоев SIS, сформированных в закрытый (защитный) мешок или "подушку" для использования в косметических или хирургических процедурах, залечивающих травмы.

Пример 1 - SIS суспензия

Образцы SIS, полученные, как описано выше, измельчаются или крошатся на небольшие кусочки произвольного размера с использованием тканевых ножниц, бритвенного лезвия с одним заостренным краем или другого режущего инструмента. Образцы помещаются в стальной контейнер из нержавеющей стали с плоским дном, и в контейнер вводится жидкий азот, чтобы заморозить образцы и подготовить их для измельчения.

Затем замороженные SIS образцы измельчаются до образования крупного порошка. Такую обработку можно проводить, например, ручным деревянным прессом с цилиндрической медной вставкой. Вставка служит промежуточной поверхностью между образцами и деревянным прессом. Чтобы поддерживать образцы SIS замороженными, необходимо периодически добавлять жидкий азот.

Для получения SIS порошка, используемого в изобретении, могут использоваться другие способы измельчения образцов. Например, образцы SIS можно высушить замораживанием и затем измельчить с использованием ручного деревянного пресса или других дробильных средств. В другом случае SIS сможно подвергнуть обработке в смесителе с высоким сдвигом и после обезвоживания и высушивания получить SIS порошок.

Можно еще больше измельчить SIS порошок с использованием предварительно охлажденных ступки и пестика с получением более тонкого консистентного порошка. И опять по необходимости используется жидкий азот, чтобы поддерживать в замороженном состоянии твердые частицы при окончательном размоле. Порошок можно легко гидрировать, используя, например, буферный физраствор, чтобы получить разжиженный материал тканевого трансплантата с нужной вязкостью.

Пример 2 - SIS раствор

SIS порошок просеивается через проволочную сетку в любую удобную емкость. Затем порошок подвергается протеолитическому перевариванию, чтобы образовать фактически гомогенный раствор. В одном варианте порошок переваривается 1 мг/мл пепсина (Sigma Chemical Co., St, Louis, M.O) в 0,1 М уксусной кислоты, доведенной с помощью HCl до pH 2,5, в течение 48 часов при комнатной температуре. Реакционная среда нейтрализуется гидроксидом натрия, чтобы инактивировать активность пепсина. Затем растворенная подслизистая основа может концентрироваться солевым осаждением раствора и отделяться для дальнейшей очистки и/или высушивания замораживанием с получением растворенной протеазой кишечной подслизистой основы в порошковой форме.

Вязкость разжиженных композиций подслизистой основы в соответствии с изобретением можно контролировать концентрацией компонента подслизистой основы и степенью гидрирования. Вязкость можно регулировать в диапазоне от 2 до 300000 сПа при 25^oC. Композиции подслизистой основы с низкой вязкостью лучше приемлемы для внутрисуставных применений или применений внутрь полостей тела. Препараты с более высокой вязкостью, например гели, можно получить из SIS растворов, приготовленных перевариванием и доведением pH таких растворов до 6,0 или 7,0. Гелевые формы настоящих композиций в виде суспензий подслизистой основы или растворов переваривания подслизистой основы обычно предпочтительны для подкожных или внутримышечных применений с использованием шприцов или катетеров.

Пример 3 - Применение

A. SIS в качестве суспензии использовались как мениск у пяти собак. А конкретно, у обычных взрослых собак (кроссбред) удалялся медиальный мениск и затем заменялся заново сформировавшимся SIS мениском. Этот SIS мениск состоял из слоя SIS (со Stratum compactum "внутри"), сформированного в полукруглую подушку. Затем подушка заполнялась суспензией и линия сшивания подушки крепилась к медиальной коллатеральной связке. Таким образом, вещество подушки служило как поглотитель весовой нагрузки между медиальным бедренным мыщелком и верхней суставной поверхностью большеберцовой кости. Трех животных пришлось умертвить. Первое животное было умерщвлено через 4 месяца и 4 дня после операции. Второе животное - через 3 месяца и 21 день после операции и четвертое животное - через 4 месяца и 3 дня после операции. Результаты по всем трем животным были аналогичны. SIS мениск образовал частично организованный материал волокнистой хрящевой ткани, который невозможно отличить гистологическими методами от волокнистого хряща нормального мениска. Форма этого вновь сформированного мениска не была похожа на обычный миниск, но цель исследования заключалась в том, чтобы увидеть, будет ли происходить коррекция соединительной ткани и будет ли иметь место неблагоприятная реакция. Не было абсолютно никаких признаков отторжения, воспаления или заражения. Третья и пятая собаки до сих пор живы. В данных исследованиях на собаках использовались SIS свинок.

B. Раствор SIS вводился подкожно собаке в четырех разных местах. Кроме того, этот раствор (pH = 8.0) вводился в подслизистую основу вагинальной стенки и в область медиальной коллатеральной связки колена. Признаков отторжения, заражения или патологической физиологической реакции со стороны хозяина-животного не наблюдалось. Имеется утолщение в месте инъекции. Контролем служил физраствор, который после инъекции полностью рассасывался, и утолщения соединительной ткани не наблюдалось.

C. Суспензия SIS использовалась с целью наращивания сфинктера мочеиспускательного канала у трех свинок. Суспензия вводилась посредством эндоскопии и лапороскопии в подслизистую и подсерозную области мочевого пузыря. Кроме того, делались инъекции материала (приблизительно 4 мл) в подслизистую область вокруг мочеиспускательного отверстия билатерально и в стенку мочевого пузыря. Одной свинкой пожертвовали через 9 недель после первоначальной инъекции и была выявлена коррекция соединительной ткани с инфильтрацией веретенообразных миофибробластов, которые положительны на действие гладкой мускулатуры. Этот тип реакции соединительной ткани очень напоминает тип, который виден при использовании SIS трубок в области расположения артерий. Контрольные участки, где использовался физраствор в качестве инъекционного материала, не показали никакой реакции. Был сделан вывод, что SIS стимулирует коррекцию соответствующей соединительной ткани таким образом, что с помощью суспендированного SIS материала можно достичь наращения стенки мочевого пузыря и/или сфинктера мочевого пузыря.

Разжиженные композиции подслизистой основы этого изобретения находят широкое применение как в замене ткани, так и в ее восстановлении. Разжиженные композиции подслизистой основы используются в соответствии с настоящим способом для индуцирования повторного роста естественной соединительной ткани или кости в области существующего повреждения. Введением с помощью инъекций эффективного количества разжиженной композиции подслизистой основы в очаг поражения ткани или рану, нуждающуюся в заживлении, можно выгодно использовать биотропные свойства композиций трансплантата, не применяя более инвазивные хирургические методы.

Наиболее примечательным аспектом композиций настоящего изобретения является их способность индуцировать повторный рост естественной ткани в пораженной области. С помощью введения эффективного количества разжиженной композиции подслизистой основы в очаг поражения ткани или раны это удивительное свойство проявляет себя и избавляет от необходимости серьезных инвазивных операций.

Хотя изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные предпочтительные варианты, в объеме и духе изобретения возможны вариации и модификации с учетом прилагаемых пунктов формулы.