способ получения полипептидов в бесклеточной системе (варианты) и устройство для его осуществления

Формула изобретения

1. Способ получения полипептидов в бесклеточной системе, предусматривающий приготовление реакционной смеси и питающей смеси, установку внутри реакционного модуля двух пористых барьеров, определяющих границы реакционного объема, введение реакционной смеси в реакционный объем и проведением синтеза при заданных условиях, поддержание синтеза введением питающей смеси, в процессе синтеза выводят из реакционного объема или оставляют внутри реактора синтезируемые целевые полипептиды, отличающийся тем, что перед проведение синтеза подготавливают смесь расходуемых высокомолекулярных компонентов, выбирают соотношение объема питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов к объему фракции, содержащей целевой полипептид, устанавливают режим ввода питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционный объем, в процессе синтеза продукты синтеза разделяют на фракцию, содержащую низкомолекулярные компоненты, и фракцию, содержащую высокомолекулярные компоненты синтеза, включая целевой полипептид, а основную часть фракции, содержащей низкомолекулярные компоненты, выводят из реакционного объема через одну или обе части второго пористого барьера.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вывод целевого полипептида осуществляют через первый пористый барьер с размером пор до 100 кД, а низкомолекулярную фракцию выводят из реакционного объема по крайней мере через одну часть второго пористого барьера с размером пор до 30 кД.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в режиме, при котором целевой полипептид оставляют в реакционной смеси, фракцию низкомолекулярных компонентов одновременно выводят через первый и второй пористые барьеры с размером пор до 30 кД.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что питающую смесь вводят в реакционный объем через его вход, или через поры одной части второго барьера, или через вход в реакционный объем и поры барьера.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что фракцию высокомолекулярных компонентов вместе с целевым полипептидом выводят из реактора постоянно или периодически.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты выбирают из группы, состоящей из рибосомной фракции, или бесклеточного экстракта (S30, S100 или их модификаций), или полимераз, или плазмид, или tRNA.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты вводят в реакционную смесь вместе с питающей смесью по отдельности или в комбинации друг с другом.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракцию расходуемых высокомолекулярных компонентов вводят в реакционную смесь до синтеза, или один раз в течение синтеза, или периодически в течение синтеза, или непрерывно в течение синтеза.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение объема питающей смеси, вводимой в реакционный объем, к объему фракции, содержащей высокомолекулярные компоненты синтеза, включающие целевой полипептид, которые выводят из реакционной смеси, выбирают в соотношении от 1 до 100.

10. Способ получения полипептидов в бесклеточной системе, предусматривающий приготовление реакционной смеси и питающей смеси, установку внутри реакционного модуля двух пористых барьеров, определяющих границы реакционного объема, введение реакционной смеси в реакционный объем и проведение синтеза при заданных условиях, поддержание синтеза введением питающей смеси, в процессе синтеза синтезируемые целевые полипептиды оставляют внутри реактора, отличающийся тем, что перед проведением синтеза подготавливают смесь расходуемых высокомолекулярных компонентов, устанавливают режим ввода питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов, фракцию низкомолекулярных компонентов реакционной смеси и синтеза выводят из реакционного объема через второй пористый барьер, а по крайней мере часть питающей смеси и/или часть расходуемых высокомолекулярных компонентов вводят через первый пористый барьер.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что питающую смесь вводят в реакционный объем через поры первого пористого барьера или одну часть питающей смеси вводят через вход в реакционный объем, а другую часть вводят через поры первого пористого барьера.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты вводят в реакционный объем через его вход или через поры первого пористого барьера, или одну часть расходуемых высокомолекулярных компонентов вводят через вход в реакционный объем, а другую часть поры первого пористого барьера.

13. Способ по п.10, отличающийся тем, что размеры пор первого пористого барьера выбирают до 1000 кД, а размеры пор второго пористого барьера выбирают до 30 кД.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты выбирают из группы, состоящей из рибосомной фракции, или бесклеточного экстракта (S30, S100 или их модификаций), или полимераз, или плазмид, или tRNA.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты вводят в реакционную смесь вместе с питающей смесью по отдельности или в комбинации друг с другом.

16. Способ по п.10, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты вводят в реакционную смесь до синтеза, или один раз в течение синтеза, или периодически в течение синтеза, или непрерывно в течение синтеза.

17. Способ получения полипептидов в бесклеточной системе, предусматривающий приготовление реакционной смеси и питающей смеси, установку внутри реакционного модуля двух пористых барьеров, определяющих границы реакционного объема, введение реакционной смеси в реакционный объем и проведение синтеза при заданных условиях, поддержание синтеза введением питающей смеси, в процессе синтеза оставляют внутри реактора или выводят из реакционного объема синтезируемые целевые полипептиды, отличающийся тем, что перед проведением синтеза устанавливают режим ввода питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционный объем, в течение синтеза формируют N циклов, каждый из которых состоит из двух шагов, на первом шаге низкомолекулярные компоненты питающей смеси вводят в реактор через первый пористый барьер, а фракцию низкомолекулярных продуктов синтеза и компонентов реакционной смеси выводят через второй пористый барьер, на втором шаге переключают каналы подачи питающей смеси и вывода компонентов, низкомолекулярные компоненты питающей смеси вводят в реактор через второй пористый барьер, а низкомолекулярную фракцию или фракцию высокомолекулярных компонентов, содержащую продукты синтеза и компоненты реакционной смеси, выводят из реакционного объема через первый пористый барьер.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что при выводе целевого полипептида из реакционного объема размеры пор первого пористого барьера выбирают до 100 кД, а размеры пор второго пористого барьера - до 30 кД.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что при выводе целевого полипептиды из реакционного объема отношение величины объема питающей смеси вводимой за время N циклов к величине объема выводимой фракции высокомолекулярных компонентов, включающей целевой полипептид, выбирают в пределах от 1 до 100.

20. Способ по п.17, отличающийся тем, что в режиме, когда целевой полипептид оставляют в реакционном объеме, размеры пор первого и второго пористых барьеров выбирают до 30 кД.

21. Способ по п.17, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты выбирают из группы, состоящей из рибосомной фракции, или бесклеточного экстракта (S30, S100 или их модификаций), или полимераз, или плазмид, или tRNA.

22. Способ по п.17, отличающийся тем, что расходуемые высокомолекулярные компоненты вводят в реакционную смесь вместе с питающей смесью по отдельности или в комбинации друг с другом.

23. Способ по п.17, отличающийся тем, что фракцию расходуемых высокомолекулярных компонентов добавляют в реакционную смесь до синтеза, или один раз в течение синтеза, или периодически в течение синтеза, или непрерывно в течение синтеза.

24. Устройство для синтеза полипептидов в бесклеточной системе, включающее реакторный модуль, внутри которого размещен реакционный объем, который снабжен входом и выходом для подключения жидкостных коммуникаций и в котором установлены два пористых барьера, систему подачи потоков расходуемых высокомолекулярных компонентов и/или низкомолекулярных компонентов питающей смеси, состоящей по крайней мере из одного насоса, жидкостных коммуникаций, емкостей для сбора или хранения продуктов или питающей смеси, отличающееся тем, что реакторный модуль содержит по крайней мере один реакционный объем, внешние поверхности которого сопряжены с внешней поверхностью первого и второго пористых барьеров, внутренняя часть второго пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков, внутренняя часть первого пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков и потоков, содержащих высокомолекулярные компоненты.

25. Устройство по п.24, отличающееся тем, что каждый упомянутый реакторный модуль имеет параметры реакционного объема в пределах от 50 мкл до 10 мл и толщины реакционного слоя от 0,1 до 10 мм.

26. Устройство по п.24, отличающееся тем, что форма реакционного слоя выбирается из группы, состоящей из листа прямоугольной или круглой формы или слоя свернутого в спираль или в цилиндр.

27. Устройство по п.24, отличающееся тем, что отношение площади поверхности второго пористого барьера к площади поверхности первого пористого барьера выбирают в пределах от 1 до 10,0.

28. Устройство по п.24, отличающееся тем, что реакционный объем содержит реакционную смесь, или реакционную смесь, в которую вводят магнитную мешалку, или реакционную смесь, в которую вводят пористый сепаратор, или реакционную смесь, в которую вводят пористые гранулы.

29. Устройство по п.26, отличающееся тем, что сепаратор выбирается из группы пористых материалов с размером пор от 200 мкм до 10 нм и материалов, выбираемых из группы, состоящей из слоистых материалов в форме пучков или листов, или из композиции слоистых материалов, внешняя поверхность которых покрыта пористыми частицами или аффинными сорбентами в форме гранул, или из композиции слоистых структур с нанесенными на их поверхность аффинными сорбентами или гранул с иммобилизированными компонентами бесклеточной системы.

30. Устройство по п.1, отличающееся тем, что первый и второй пористые барьеры выполнены из плоских мембран или из полых волокон, или один барьер выполнен из мембраны, а второй - из полых волокон.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам и устройствам для синтеза полипептидов в бесклеточных системах.

Уровень техники.

Известны способы синтеза полипептидов в бесклеточных системах. Для устранения ограничений, связанных с низким выходом целевого полипептида и малым сроком работы бесклеточных систем, был предложен метод (Spirin et al., 1988), в основе которого заложен принцип непрерывного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного восстановления исходной концентрации низкомолекулярных веществ, расходуемых в процессе синтеза. Этот метод лег в основу нескольких изобретений, связанных с его усовершенствованием для увеличения выхода синтезируемого продукта (Алахов и др., 1991; Баранов и др. , 1993: Alakhov et al., 1995).

По способу ввода питающей смеси и вывода продуктов синтеза известные технические решения можно подразделить на: а) способы, в которых используют процесс диализа для обмена с питающей средой и для вывода из реакционной смеси через диализную мембрану низкомолекулярных продуктов или для одновременного вывода низко- и высокомолекулярных продуктов; б) способы, в которых используют процесс непрерывной ультрафильтрации для одновременного вывода низко- и высокомолекулярных продуктов через мембрану при одновременном принудительном вводе питающей среды непосредственно в объем реакционной смеси или через мембрану; в) способы, в которых применяют периодический ввод питающей смеси внутрь реакционной смеси и последующий вывод низко- и высокомолекулярных продуктов через мембрану. Ввод и вывод потоков осуществляют путем изменения направления жидкостных потоков за счет последовательного создания импульсов положительного или отрицательного давления.

Известен способ (Mozayeny, 1995), в котором совершенствуют отвод продуктов с большой молекулярной массой путем увеличения площади ультрафильтрационной мембраны по отношению к объему реакционной смеси. Одним из главных недостатков данного изобретения является то, что через большую площадь мембраны размером пор от 70 до 100 кД вместе с конечным продуктом удаляются необходимые для работы компоненты бесклеточной системы с молекулярной массой до 100 кД. Это в конечном итоге ограничивает время работы бесклеточной системы. Чем больше площадь мембран, тем больше высокомолекулярных компонентов бесклеточной системы вымываются из объема реактора при большой скорости протока. К другому недостатку можно отнести то, что для создания тангенциального потока вдоль поверхности мембран реакционную смесь выводят за пределы реактора. Во время прохождения реакционной смеси по жидкостным коммуникациям на работу бесклеточной системы оказывают влияние три фактора: а) в нее не поступает питающая смесь; б) из нее не выводятся продукты ингибирования; в) жидкостные коммуникации и насос не термостатируются и реакционная смесь меняет свою температуру в зависимости от окружающей среды. Все это приводит к невоспроизводимости результатов и ограничивает время жизни бесклеточной системы.

Известен способ (Fischer et al., 1990), авторы которого предлагают осуществлять многократный импульсный ввод питающей смеси в реакционный объем и отвод низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов синтеза из реакционного объема в объем с питающей смесью путем изменения направления движения потока жидкости, проходящей через мембрану. Одним из главных недостатков данного изобретения является то, что низкомолекулярные продукты синтеза, ингибирующие работу системы, не выводят за пределы реактора в течение длительного периода времени. Этот период определяется как время, за которое осуществляют многократное перемещение питающей смеси через мембрану в суммарном объеме, равном полному объему реакционной смеси. С этой целью формируют N циклов по созданию положительного и отрицательного давления. За счет модуляции давления ингибирующие продукты вводят обратно в реакционный объем с очередной порцией питающей среды. Другой недостаток предложенного технического решения связан с тем, что во время формирования N циклов из реакционной смеси интенсивно вымывают высокомолекулярные компоненты бесклеточной системы, необходимые для длительного синтеза. Таким образом, многократное возвращение в реакционный объем низкомолекулярных компонентов, ингибирующих работу системы, и вывод из рабочего объема высокомолекулярных компонентов, определяющих эффективный синтез, приводит к ограничению работы системы.

Известен способ (Choi, 1997), по которому осуществляют синтез полипептидов с отводом целевого продукта в диализном режиме работы. С этой целью реактор разгораживают мембраной на две части. С одной стороны мембраны располагают реакционную смесь, с другой стороны мембраны размещают питающую смесь, которую быстро прокачивают вдоль поверхности мембраны в тангенциальном направлении. К недостаткам данного способа можно отнести то, что за счет больших размеров пор из реакционного объема вместе с целевыми продуктами синтеза выводят компоненты системы. Кроме того, хотя через большие поры мембраны диализ проходит более эффективно, его величина недостаточна для работы высокоэффективных бесклеточных систем.

Известен способ (Алахов и др., 1991), по которому в реакционный объем в процессе синтеза подают аминокислоты, GTP, АТР, и отбирают низкомолекулярные продукты: АМР, GDP, Pi, образующиеся в процессе синтеза и ингибирующие систему. Отбор синтезируемого полипептида производят через мембрану. Для более экономичной работы низкомолекулярные продукты проводят через систему регенерации и возвращают в реакционный объем через мембрану. Из текста описания и приведенного рисунка не достаточно ясно, каким образом осуществляют отвод низкомолекулярных продуктов синтеза из реакционного объема и каким образом буферный раствор после отбора полипептида поступает в систему регенерации. Если учитывать описание примеров, то в данном техническом решении используют общий вывод высокомолекулярных (целевого полипептида) и низкомолекулярных продуктов реакции через общую ультрафильтрационную мембрану. Использование ультрафильтрационной мембраны описано в ряде статей (Spirin et al., 1988; Spirin, 1992; Takanori et al., 1991; Erdmann et al., 1994). К недостаткам такого способа можно отнести то, что за счет больших размеров пор из реакционного объема вместе с целевыми продуктами синтеза выводят высокомолекулярные компоненты системы, необходимые для синтеза. Входной поток низкомолекулярной питающей смеси равен по объему выходному потоку низкомолекулярных и высокомолекулярных компонентов, что приводит к быстрому закрытию пор ультрафильтрационной мембраны.

Известны способы подачи питающей смеси в реакционную зону и вывода из нее продуктов реакции для разных типов мембранных реакторов, в которых реакционную зону размещают между двумя мембранами (Wrasidlo et al., 1990; Matson et al., 1988; Dziewulski et al., 1992).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ, описанный в патенте (Alakhov et al., 1995). Для синтеза полипептидов в режиме с отбором продукта используют две плоских мембраны, между которыми размещают реакционную смесь. Мембраны разграничивают потоки низкомолекулярных и высокомолекулярных компонентов и разделяют объем реактора на три зоны: зону ввода питающей смеси; реакционную зону; зону отвода продукта. Первый относительно слабый поток формируют в реакционной зоне. Он обеспечивает перемещение реакционной смеси вдоль внутренней части пористых барьеров, через которые выходят высокомолекулярные продукты (в том числе синтезируемые полипептиды). Второй быстрый поток формируют в зоне ввода питающей смеси. Он обеспечивает подачу через мембрану низкомолекулярных компонентов питания в реакционную систему. Быстрый поток низкомолекулярных компонентов и медленный поток высокомолекулярных компонентов осуществляют, например, за счет создания тангенциального потока вдоль внешней поверхности первого пористого барьера и проникновения низкомолекулярных компонентов питающей среды в зону синтеза. Если высокомолекулярные компоненты выводят из реакционного объема, то размер пор выбирают в пределах 50-100 кД (что подтверждается примером 7). К недостатку способа относится то, что скорость проникновения компонентов питающей смеси в реакционный объем, определяемая в большей степени процессом диализа, недостаточна для обеспечения длительной работы высокоэффективных бесклеточных систем.

Существует разница в требованиях к устройствам для научных исследований и для синтеза в препаративных количествах. Для синтеза небольшого количества полипептидов, в пределах 100-200 мкг, необходим простой и дешевый реактор, который может обеспечить синтез в течение 20-50 часов без применения дорогостоящего оборудования, с возможностью выбора скоростей потоков вручную или с помощью блоков управления.

Во время синтеза полипептидов в препаративных количествах устройство должно позволять контролировать процесс, управлять скоростями потоков внутри реактора, обеспечивать возможность длительной (более 50 часов) работы за счет активного перемешивания или проведения действий, препятствующих забиванию пор в мембранах или полых волокнах, обеспечивать эффективный подвод питающей смеси и эффективный отвод низкомолекулярных продуктов реакции, ингибирующих синтез, а также осуществлять дополнительный ввод расходуемых высокомолекулярных компонентов системы. Известно устройство (Mozayeny, 1995), которое управляет системой для непрерывного синтеза пептидов с помощью компьютера. В состав системы входит сложное и дорогое оборудование (автоматический пробоотборник и др.). Однако недостатки способа управления потоками высокомолекулярных и низкомолекулярных продуктов синтеза и компонентов системы не дают эффективно использовать возможности системы управления и контроля процесса.

Конструкции известных устройств предполагают наличие одного реакционного объема, величина которого колеблется в пределах от 1,0 (Spirin at al., 1988) до 100,0 мл (Spirin, 1992).

Используя принцип разбиения общего объема реактора на ряд реакторов меньшего объема, возможно применить одинаковые решения для устройств, предназначенных для синтеза полипептидов в лабораторных условиях и для препаративного синтеза. В этом случае отработанные технологии синтеза полипептидов в небольших объемах реакционной смеси от 50 мкл до 1-5 мл можно перенести на работу с объемами до 100-200 мл за счет масштабирования и увеличения количества параллельно работающих модулей.

Известны устройства для поддержания синтеза в клетках (Puchinger et al., 1980; Gebhard et al., 1997; Hu et al., 1997), использующие этот принцип. В этих устройствах входы для подачи питающей смеси и выходы для отвода продуктов соединены параллельно для всех N реакционных объемов. Известные устройства ориентированы на поддержание роста клеток и их нельзя применить для синтеза полипептидов, так как каждый из N реакционных модулей ориентирован на обеспечение скорости, давления и других параметров потоков питательных сред и газа, необходимых для нормального функционирования клеток.

Известные модули для биореакторов на основе полых волокон (Gebhard et al. , 1997; Hu et al., 1997) не учитывают специфику работы с бесклеточной системой. Используемые волокна имеют одинаковый размер пор и выполнены в форме склеенного пучка, установленного в цилиндрический объем. При этом значительная часть поверхности полых волокон соприкасается друг с другом и уменьшает рабочую поверхность.

Известно устройство (Yagihashi et al., 1996), при изготовлении которого используют двухслойную конструкцию из полых волокон. Каждый слой сформирован из предварительно склеенных параллельно размещенных полых волокон. Оба слоя полых волокон имеют одинаковый размер пор и значительная часть их поверхности соприкасается друг с другом.

Известно устройство (Pedersen et al., 1994), в котором отдельные модули выполняют в виде однослойных конструкций из полых волокон с одним размером пор. Однако это техническое решение разработано для условий фильтрации жидкостей и не может быть использовано в реакторах без значительного изменения конструкции, так как рассчитано на работу с большими объемами жидкостных потоков.

Известно большое число конструкций, выполненных на основе полых волокон (Hargitay, 1982, Hanai, 1993) и плоских мембран. Они также обладают рядом недостатков, так как ориентированы в основном на фильтрацию или диализ.

Известно устройство для синтеза полипептидов в бесклеточной системе, в состав которого входят две плоские мембраны (Mozayeny, 1995). Это устройство (OMEGA^TM) первоначально было предназначено для фильтрации и обладает большим мертвым объемом в зонах отбора продукта, кроме того, вход и выход в реакционный объем осуществляется из одной точки, что влияет на питание реакционной смеси в зонах, в которых доступность питающей смеси ограничена из-за формирования однонаправленного потока. Кроме того, это устройство не предназначено для сборки в общую конструкцию, состоящую из N модулей.

Наиболее близким к предлагаемому устройству для синтеза полипептидов является устройство, описанное в патенте (Alakhov et al., 1995). Для синтеза полипептидов в режиме с отбором продукта устройство содержит два пористых барьера. Эти барьеры могут быть выполнены в виде плоских мембран или полых волокон. Реакционная смесь может находиться как с внешней, так и с внутренней стороны полых волокон.

Недостатком данного устройства является то, что оно содержит пористые барьеры с одинаковым размером пор и позволяет осуществить вывод из реакционного объема одного потока, состоящего или из низкомолекулярной (при размере пор 7,5 кД), или из высокомолекулярной (при размере пор до 100 кД) фракций.

Сущность изобретения.

Настоящее изобретение описывает метод синтеза полипептидов в бесклеточной системе, в котором продукты синтеза разделяют на фракцию низкомолекулярных компонентов и фракцию высокомолекулярных компонентов, включающую целевой полипептид. Основную часть низкомолекулярной фракции выводят по крайней мере через одну часть второго пористого барьера. Выбирают отношение величины объема фракций питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов к объему фракции, содержащей целевой полипептид, и устанавливают режимы ввода фракций питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционный объем.

Дополнительным объектом данного изобретения является метод синтеза полипептидов в бесклеточной системе, в соответствии с которым фракцию низкомолекулярных компонентов, которая содержит низкомолекулярные компоненты реакционной смеси и низкомолекулярные компоненты синтеза, выводят из реакционного объема только через по крайней мере один второй пористый барьер, выбирают режим ввода питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов.

Другим объектом изобретения является метод для получения полипептидов, в соответствии с которым в течение синтеза формируют N циклов, каждый из которых состоит по крайней мере из двух шагов, на первом шаге низкомолекулярные компоненты питающей смеси вводят в реактор через первый пористый барьер, а фракцию низкомолекулярных продуктов синтеза и компонентов реакционной смеси выводят через второй пористый барьер, на втором шаге переключают каналы подачи питающей смеси и отвода компонентов и низкомолекулярные компоненты питающей смеси вводят в реактор через второй пористый барьер, низкомолекулярную фракцию или фракцию высокомолекулярных компонентов, содержащую продукты синтеза и компоненты реакционной смеси, выводят из реакционного объема через первый пористый барьер, устанавливают режимы ввода питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционный объем.

Следующим объектом настоящего изобретения является реактор, который содержит по крайней мере один реакционный объем, в котором внешние поверхности сопряжены с внешней поверхностью первого и второго пористых барьеров, внутренняя часть второго пористого барьера соединена с зоной ввода или вывода низкомолекулярных потоков, внутренняя часть первого пористого барьера соединена с зоной ввода или вывода низкомолекулярных потоков и потоков, содержащих высокомолекулярные компоненты, включающие целевой полипептид.

Краткое описание чертежей.

В дальнейшем изобретение поясняется примерами выполнения со ссылками на прилагаемые чертежи.

На фиг.1 (а - д) приведены принципы распределения потоков для разных режимов работы.

На фиг. 2 (а - е) приведены структурные схемы реакторных модулей, основанных на заявляемом принципе.

На фиг.3 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме без отбора продукта.

На фиг. 4 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме с отбором продукта.

На фиг. 5 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме с отбором продукта с трехслойным модулем.

На фиг. 6 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме с периодическим отбором продукта.

На фиг.7 изображена гистограмма, отражающая количество GFP во фракциях, собранных в ходе синтеза, описанного в примере 1.

На фиг. 8 изображен график зависимости изменения концентрации синтезируемого GFP от продолжительности времени синтеза в контрольной аликвоте.

На фиг.9 приведена фотография гель-электрофореза по данным примера 1.

На фиг. 10 изображен график зависимости изменения концентрации синтезируемого GFP от продолжительности времени синтеза в контрольной аликвоте для примера 2.

На фиг. 11 приведена фотография гель-электрофореза по данным примера 2.

Перечень сокращений.

1. F1 - поток питающей смеси.

2. F10- F20 - потоки низкомолекулярных продуктов реакционной смеси.

3. P_s - синтезируемый целевой полипептид.

4. P_c - высокомолекулярные компоненты системы.

5. R_M - реакционная смесь.

6. Позиции 100 относятся к конструктивным элементам реактора.

7. Позиции 200 относятся к жидкостным коммуникациям устройства.

8. Позиции 300 относятся к отдельным элементам устройства: кранам, насосам, емкостям для сбора элюата и емкостям для хранения питающей смеси.

9. Позиция 400 относится к блоку управления.

Детальное описание изобретения

В общем случае процесс может содержать все из перечисленных ниже шагов:

1. Создают реакционную смесь на основе бесклеточных лизатов и экстрактов эукариотов или прокариотов. Формируют питающую смесь.

2. Определяют режим работы реактора, который содержит по крайней мере один реакционный объем, в котором внешние поверхности объема формируются внешними поверхностями пористых барьеров, внутренняя часть второго пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков, внутренняя часть первого пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков и потоков, содержащих высокомолекулярные компоненты. Соотношение площадей первого и второго пористых барьеров лежит в пределах от 1 до 10.

3. Помещают реакционную смесь в каждый из реакционных объемов модулей. Реакционный объем выбирают в пределах от 50 мкл до 10 мл и толщину реакционного слоя в пределах от 0,1 мм до 5 мм. В зависимости от условий синтеза в реакционном объеме размещают или реакционную смесь, или реакционную смесь и магнитную мешалку, или реакционную смесь, в которую вводят пористый сепаратор, или размещают реакционную смесь с введенными в нее пористыми гранулами. Тип пористого сепаратора выбирают из группы пористых материалов с размером пор от 200 мкм до 10 нм, выполненных в форме одиночных или многослойных капиллярных структур в форме пучков или листов, или в виде композиции слоистых материалов и пористых частиц, нанесенных на поверхность слоев или волокон, из которых состоят слоистые материалы. В зависимости от условий синтеза тип пористых гранул выбирают или из аффинных сорбентов (которые используют отдельно или иммобилизируют на поверхности слоистых структур), или используют гранулы, внутри которых иммобилизированы компоненты бесклеточной системы.

4. В зависимости от режима работы определяют и устанавливают скорости протока и направление подачи питающей среды в реакционную смесь и в режиме вывода целевого полипептида выбирают соотношение объемов питающей смеси и фракции, включающей целевой полипептид, в пределах от 1 до 100. Определяют направление подачи питающей смеси, которую вводят или непосредственно через вход в реакционный объем, или через поры пористого барьера, или одну часть питающей смеси вводят через вход в реакционный объем, а другую часть вводят через поры пористого барьера.

5. При выборе режима работы с вводом расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционную смесь определяют состав фракции и способы ввода расходуемых высокомолекулярных компонентов. Состав фракции расходуемых высокомолекулярных компонентов выбирают из группы, состоящей из рибосомной фракции, или бесклеточного экстракта (S30, S100 или их модификаций), или полимераз, плазмид, tRNA. Эти компоненты вводят в реакционную смесь вместе с питающей смесью по отдельности или в комбинации друг с другом. В зависимости от способа ввода фракцию расходуемых высокомолекулярных компонентов вводят в реакционную смесь до синтеза, или один раз в течение синтеза, или периодически в течение синтеза, или добавляют непрерывно в течение синтеза.

6. Проводят синтез, осуществляя разделение потоков низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов, в процессе синтеза непрерывно или периодически отбирают через пористый барьер высокомолекулярные продукты или оставляют их в реакционном объеме.

7. В процессе синтеза анализируют уровень выхода синтезируемого продукта, корректируют параметры, определяющие скорости потоков питающей смеси и синтезируемого продукта.

На фиг.1 (а-д) показаны структурные схемы, объясняющие принцип разделения потоков между фракцией низкомолекулярных компонентов и фракцией, содержащей высокомолекулярные компоненты вместе с целевым полипептидом, для разных режимов работы.

На фиг.1a приведена структурная схема разделения потоков внутри модуля в режиме непрерывного отбора целевого полипептида. Реакционный модуль содержит корпус 100, внутри которого с помощью первого пористого барьера 110 и второго пористого барьера 120 формируют три зоны. Перед началом синтеза в реакционную зону 130 вводят реакционную смесь R_M. Поток питающей смеси F1 проходит через вход 151 в зону 130 и вытесняет высоко- и низкомолекулярные компоненты синтеза из реакционной смеси через первый и второй пористые барьеры. Основная часть низкомолекулярной фракции проходит через второй пористый барьер 120 с малым размером пор, формируя поток F20, который удаляют из реактора через выход 142. Одновременно с этим высокомолекулярные продукты синтеза P_s, часть высокомолекулярных компонентов бесклеточной системы P_c и часть низкомолекулярных компонентов F10 формируют суммарный поток P_c+P_s+F10, который вытесняется через пористый барьер 110 с большим размером пор и выводится из реактора через выход 162. Перед началом синтеза выбирают соотношение между общей величиной объема питающей смеси, которую вводят в реактор, и величиной объема суммарного потока P_c+P_s+F10 в пределах от 1 до 100. Предпочтительно, если это соотношение лежит в пределах от 10 до 50. Снижение скорости потока через первый барьер 110 приводит к ослаблению процесса формирования слоя высокомолекулярных компонентов над поверхностью пористого барьера 110, приводящего к закрытию пор высокомолекулярными и низкомолекулярными продуктами синтеза. Кроме того, снижение величины потока P_c+P_s+F10 приводит к уменьшению отбора из реакционной смеси высокомолекулярных компонентов P_c, необходимых для синтеза, и способствует повышению концентрации синтезируемого полипептида P_s в реакционной смеси. Это позволяет вести отбор более концентрированного продукта, что способствует его очистке. Размеры пор первого барьера 110 выбирают в зависимости от величины молекулярного веса синтезируемого полипептида и его пространственной организации.

На фиг. 1б приведена структурная схема формирования низкомолекулярных и высокомолекулярных потоков внутри модуля в режиме периодического отбора продукта. Реакционный модуль содержит корпус 100, внутри которого с помощью первого пористого барьера 110 и второго пористого барьера 120 формируют три зоны. Перед началом синтеза в реакционную зону 130 через вход 151 вводят реакционную смесь R_M. В процессе синтеза формируют N циклов ввода/вывода потоков через пористые барьеры 110, 120. Каждый цикл состоит из двух шагов. Во время первого шага через вход 161 и первый барьер 110 в реакционный объем 130 вводят поток питающей смеси F1. Низкомолекулярные компоненты питающей смеси проникают в реакционную смесь и вытесняют из объема реакционной смеси низкомолекулярные продукты синтеза, которые формируют поток F20, проходящий через пористый барьер 120 и выход 142. Во время второго шага переключают направление ввода/вывода потоков через пористые барьеры 110, 120. Через вход 141 и второй барьер 120 в зону 130 вводят поток питающей смеси F2. Низкомолекулярные компоненты питающей смеси проникают в реакционную смесь и вытесняют из объема реакционной смеси высокомолекулярные и низкомолекулярные продукты синтеза и часть компонентов системы, которые проходят через пористый барьер 110, выход 162 и формируют поток P_c+P_s+F10. По окончании второго шага цикл заканчивается и начинается следующий или синтез останавливают. Соотношение между общим объемом питающей смеси, которую вводят в реактор в течение N циклов, к величине объема суммарного потока P_c+P_s+F10 выбирают в пределах от 1 до 100. Предпочтительно, если это соотношение лежит в пределах от 10 до 50.

Снижение скорости потока через первый барьер 110 приводит к ослаблению процесса формирования слоя высокомолекулярных компонентов над поверхностью пористого барьера 110, что приводит к снижению процесса закрытия пор высокомолекулярными и низкомолекулярными продуктами синтеза. Концентрация синтезируемого полипептида P_S в реакционной смеси возрастает, что способствует следующему шагу очистки полипептида. Размеры пор первого барьера 110 выбирают в зависимости от величины молекулярного веса синтезируемого полипептида и его пространственной организации. Первый и второй пористые барьеры очищаются благодаря изменению направления потоков через пористые барьеры. Длительность цикла и временные соотношения между длительностью первого и второго шага сохраняют постоянными в ходе всего синтеза или меняют в зависимости от условий эксперимента синтеза. Если синтез идет активно и концентрация полипептидов в объеме реакционной смеси быстро возрастает, то для предотвращения закрытия пор снижают длительность каждого цикла, что автоматически приводит к более частой очистке пор.

На фиг.1в показана схема направления потоков в режиме работы без отбора продуктов. В процессе синтеза все высокомолекулярные компоненты остаются внутри реакционной смеси. Поток питающей смеси F1 вводят через первый пористый барьер 110, который имеет размеры пор до 1000 кД. При этом поток низкомолекулярных продуктов синтеза F10, ингибирующих систему, выводят через второй пористый барьер 120. Первый пористый барьер играет роль распределителя потока F1 и обеспечивает равномерный ввод питающей смеси во все точки реакционной смеси.

На фиг.1г показана схема направлений потоков в режиме работы без вывода отбора целевого продукта из реакторного модуля, который имеет по крайней мере один первый пористый барьер и два вторых пористых барьера. В течение синтеза поток питающей смеси F1 и/или часть расходуемых высокомолекулярных компонентов проникают через поры первого пористого барьера 110, который имеет размер пор до 1000 кД. Этот пористый барьер используется как распределитель потока F1 и обеспечивает ввод питающей смеси во все точки реакционной смеси. Поток F10 низкомолекулярных продуктов, которые ингибируют работу бесклеточной системы, выводят через две части второго пористого барьера 121-122, который имеет размер пор до 30 кД.

На фиг. 1д приведены направления потоков в режиме с выводом целевого продукта из реакционного модуля, который имеет по крайней мере один пористый барьер и две части второго пористого барьера. В процессе синтеза все высокомолекулярные компоненты, включая целевой полипептид, выводят из реакционной смеси через первый пористый барьер 110, который имеет размер пор до 100 кД. Поток питающей смеси F1 вводят через одну часть второго пористого барьера 121, который имеет размер пор до 30 кД. Этот пористый барьер используется как распределитель потока F1 и обеспечивает равномерный ввод питающей смеси во все точки реакционной смеси. Поток F10 низкомолекулярных продуктов, которые ингибируют работу бесклеточной системы, выводят через вторую часть второго пористого барьера 122, который имеет размер пор до 30 кД.

Для реализации рассмотренного способа предлагается несколько вариантов устройства реакторного модуля, который может обеспечивать работу реакторной системы в разных режимах. Устройство модуля должно позволять выполнение нескольких условий:

1. В каждой точке реакционного объема должно одновременно осуществляться два процесса: а) ввод питающей среды, б) отвод низкомолекулярных продуктов, ингибирующих процесс синтеза.

2. Ввод питающей среды и отвод низкомолекулярных продуктов должен осуществляться за время, в течение которого синтез не снижается ниже допустимого значения.

3. Устройство должно позволять эффективную очистку пор мембран или полых волокон и содержать минимум мертвых объемов в жидкостных коммуникациях для ввода/вывода высоко- и/или низкомолекулярных компонентов и/или продуктов синтеза.

Для выполнения первого и второго условий предпочтительной является конструкция модуля реактора, в которой осуществляют формирование тонких слоев реакционной смеси любой формы. Толщину слоя выбирают в пределах от 0,1 до 10 мм из условия того, что при заданных площадях первого и второго пористых барьеров и выбранных размеров пор барьеров средняя скорость ввода питающей среды в реакционный объем обеспечивает ввод компонентов питающей смеси в максимально удаленные точки реакционной смеси за время, в течение которого концентрация питающей среды в удаленных точках снижается до допустимого уровня, а концентрация низкомолекулярных компонентов, ингибирующих процесс синтеза, не превышает допустимый уровень.

Для устройств, работающих в режиме непрерывного отбора продукта, в которых питающая смесь и/или расходуемые высокомолекулярные компоненты подаются непосредственно в реакционный объем через по крайней мере один вход, предпочтительно использовать дополнительное перемешивание в зоне реакционного объема. Такое перемешивание может быть обеспечено с помощью вращения магнитной мешалки или перемещения реакционной смеси через внешнюю замкнутую петлю или другими методами.

Для устройств, в которых формируют тонкий слой реакционной смеси, предпочтительной является конструкция модуля, в которой используют прокладку между пористыми барьерами. Разный тип прокладок может быть использован и выбран из группы одиночных или многослойных слоев, капиллярных материалов, комбинации слоев из капиллярных материалов и пористых частиц, это могут быть одно- и многослойные листы из органических, синтетических или керамических материалов, металлов или их композиций с пористыми частицами, расположенными между слоями. Другие типы прокладок могут быть выбраны из полых волокон. Фильтры, широко используемые для фильтрации и выполненные из разных сортов целлюлозы, и фильтры, выполненные из синтетических полимерных материалов, керамики, пористых металлов или их композиций, могут быть также использованы как прокладки. Роль слоистых капиллярных материалов состоит не только в функции разделения двух пористых барьеров, но и в увеличении площади, на которой происходит соударение молекул, что ведет к возрастанию скорости реакций, связанных с синтезом (Alberts et al., 1983).

Более дредпочтительно использовать иммобилизированные пористые частицы, которые нанесены на поверхность слоистых, капиллярных структур. Диаметр волокон выбирают от 0,1 до 0,001 по отношению к диаметру полых волокон. На волокна наносят частицы из пористых материалов с размерами пор от 200 мкм до 10 нм. В случае, когда в качестве первого и/или второго пористых барьеров используют полые волокна, размещение направления волокон слоистых материалов осуществляют либо вдоль полых волокон, занимая пространство между ними, или под углом к центральным осям полых волокон в диапазоне до 90^o (т.е. поперек слоев полых волокон). В группу материалов, из которых могут быть изготовлены пористые частицы, входят (Choi et al., 1997): полимерные материалы (целлюлоза, желатин, коллаген), металлические компаунды и неорганические оксиды (алюминий, кремнезем, титан, цирконий, молибден, ванадий, кобальт) и различные цеолиты. Пористые частицы могут быть использованы в виде гранул (Ovodov et al. , 1995) на основе отрицательно заряженных полисахаридов и положительно заряженных полимеров, образующих с полисахаридами полиэлектролитные комплексы. Такие комплексы могут быть образованы, например, альгинатом Na и поли-L-лизином, альгинатом Na и хитозаном, пектином и полиимином, пектином и хитозаном. В качестве материалов могут быть использованы пористые частицы, используемые в хроматографии, в частности афинные сорбенты могут быть использованы для создания пористой среды в реакционном объеме и отбора из реакционной смеси целевого полипептида в течение синтеза. Ограничения в использовании пористых материалов связаны с их химической активностью и возможностью ингибирования синтеза.

В варианте, когда бесклеточную систему иммобилизируют в гранулы (Ovodov et al. , 1995; Alakhov et al., 1995), предпочтительной является конструкция реакторного модуля, которая позволяет нанесение на поверхность пористого барьера нескольких слоев микрокапсул с иммобилизированной бесклеточной системой для заполнения ими всего реакционного объема. В этом случае формируется достаточно тонкий слой микрокапсул, определяемый высотой реакционного объема, что позволяет вводить питающую смесь в зону синтеза и выводить низкомолекулярные продукты с оптимальной скоростью.

На фиг. 2а-2е показаны варианты формирования тонких слоев внутри объема модуля реактора с использованием в качестве пористых барьеров плоских полупроницаемых мембран и полых волокон.

На фиг.2а приведен вариант, когда тонкие слои реакционной смеси формируют: между плоской поверхностью мембраны 120 и цилиндрическими поверхностями полых волокон, которые выполняют роль первого барьера 110 и сформированы в виде как минимум одного слоя параллельных полых волокон. Количество полых волокон зависит от размеров пор первого и второго барьеров, а также диаметра полых волокон, определяющего их площадь. При соотношении размеров пор первого и второго барьеров в пределах от 3 до 10 площадь первого барьера выбирается в пределах от 0,2 до 1,0 от площади второго барьера.

На фиг.2б приведен вариант, когда реакционный слой формируют между двумя слоями полых волокон, выполняющих функции первого 110 и второго 120 барьеров. Причем в каждом из слоев полые волокна размещены параллельно друг другу или под углом от 70 до 110 градусов. Соотношение количества полых волокон в первом слое к количеству полых волокон во втором слое выбирают в пределах от 1 до 0,1 в зависимости от соотношения размеров пор. Более предпочтительна конструкция модуля, когда общий объем реактора собирают из нескольких модулей. В этом случае модули располагают таким образом, чтобы слои полых волокон, относящихся к первому и второму барьерам, чередовались, что позволяет осуществить равномерное распределение потоков низко- и высокомолекулярных компонентов по всему объему реактора.

В тех случаях, когда синтез проводят с бесклеточными системами, в которых эффективность синтеза в 2-4 раза превышает известный уровень в 100-200 мкг (например, когда используется концентрированная реакционная смесь), необходимо усовершенствовать ввод питающей смеси в реакционный объем и снизить степень влияния процесса закрытия пор продуктами синтеза. Для того чтобы обеспечить равномерное распределение питающей смеси по всему объему реакционной смеси и снизить процесс закрытия пор, используют вариант модуля с тремя пористыми барьерами. В этом случае в качестве первого пористого барьера используют слой параллельных друг относительно друга полых волокон. Этот слой размещают в средней части модуля между двумя пористыми барьерами, которые выполняют функции второго пористого барьера с малым размером пор. В этом варианте площадь второго пористого барьера удваивается, что положительно влияет на отвод низкомолекулярных продуктов, ингибирующих систему, и позволяет снизить давление при формировании потока выводимых низкомолекулярных продуктов.

На фиг.2в приведен вариант, когда реакционный слой размещен между двумя плоскими мембранами, между которыми введен слой полых волокон. Эта конструкция модуля более предпочтительна при формировании реактора из нескольких модулей, поскольку при стыковке нескольких модулей объединяют зоны отвода низкомолекулярных продуктов и сокращается длина жидкостных коммуникаций.

На фиг.2г приведена конструкция модуля, выполненного из трех слоев полых волокон. В каждом из слоев полые волокна размещены параллельно друг другу. Средний слой размещен таким образом, что центральные оси его полых волокон размещены по отношению к центральным осям первого и третьего слоя или в пределах от 70 до 110^o, или размещены параллельно. Предпочтительно использовать перпендикулярное размещение осей. В этом случае сокращается площадь зон соприкосновения между поверхностями первого, второго и третьего слоя в случае, если между слоями не применяют слои в виде сеток или пористых, слоистых материалов. Соотношение количества полых волокон в первом и третьем слое к количеству полых волокон во втором слое выбирают в пределах от 1 до 0,1 в зависимости от соотношения размеров пор.

В рассматриваемых версиях реакторных модулей форму плоских мембран и плоских конструкций, выполненных из полых волокон, выбирают или квадратной, или круглой. На фиг.2д и 2е приведены примеры выполнения реакторных модулей в форме цилиндров, в которых форма реакционного объема выполнена в виде спирали или в виде цилиндра. Отличием от известных решений является формирование двухслойной конструкции с разными параметрами размеров пор и диаметров полых волокон, используемых в этих конструкциях.

На фиг. 2д представлена конструкция, в которой центральный элемент, выполненный из полого волокна, играет роль первого пористого барьера с размером пор до 100 кД. Вокруг него размещают волокнистый материал с тем, чтобы предотвратить слипание первого и второго пористых барьеров. После чего размещают полые волокна второго пористого барьера. Количество волокон во втором пористом барьере и их площадь должна превышать площадь первого барьера не менее чем в 5-10 раз. Затем помещают пучок полых волокон в оболочку, в которой предусматривают вход для реакционной смеси, и заклеивают торцы оболочки по известным методикам (Yagihashi et al., 1996), формируя выход одного пористого барьера с одной стороны цилиндрической оболочки, а выход другого пористого барьера с противоположной стороны.

На фиг. 2е приведена двухслойная конструкция, в которой между двумя слоями проложен слой пористого или слоистого материала. Затем предварительно подготовленные листы их однослойных конструкций, выполняющих роль первого и второго барьеров, скручивают в спираль и размещают внутри цилиндрической оболочки, в которой предусмотрены вход 151 в реакционный объем. Выходы первого барьера объединяются в общий выход 161 с одной части цилиндра, а выходы второго барьера объединяются в общий выход на противоположной части цилиндра.

Форму реакционного модуля выбирают из условий, которые позволяют: промывку реакционной зоны; доступный ввод реакционной смеси в объем реакционной зоны без образования воздушных зон; обеспечение минимальных мертвых объемов в зонах ввода/вывода питающей среды и низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов синтеза. Существенную роль играет простота сборки и разборки модуля для последующей очистки пор мембран и полых волокон. Сборную конструкцию (когда используется по крайней мере один модуль) формируют путем установки в каркас модуля мембран, уплотнителей, верхней и нижней крышек. Предпочтительно, когда один из пористых барьеров приклеивается к каркасу модуля, а второй пористый барьер остается съемным. Это обеспечивает возможность открытого доступа к реакционной зоне и дает возможность определить те дефекты мембран или полых волокон, которые могут возникнуть при эксплуатации.

Предпочтительно использовать материалы, которые могут выполнять две функции, а именно являться опорой для пористых барьеров и выполнять функции, способствующие герметизации слоев. В качестве таких материалов могут быть использованы герметики на основе силикона или других синтетических материалов, имеющих хорошую адгезию к полимерным материалам, из которых изготавливаются полые волокна. Свойства этих материалов должны обеспечивать многократное восстановление формы после снятия сдавливающего усилия.

Пористые барьеры могут быть выполнены из разных материалов. Тем не менее наиболее предпочтительными являются те из них, которые могут позволять регенерацию и очищение пор после проведения синтеза без разборки реактора или при разборке и последующей сборке. Вопросы очистки пор подробно описаны в технических приложениях к мембранам или полым волокнам или в каталогах фирм (Operating Guide, A/G Technology Corporation, 1997).

Размеры пор первого пористого барьера 110 выбирают в пределах от 30 до 300 кД. Для большинства полипептидов с молекулярной массой 20-40 кД более предпочтительно использовать размеры пор в пределах 50-100 кД. Размеры пор второго барьера 120 выбирают в пределах от 1 до 30 кД в зависимости от величины молекулярного веса синтезируемого полипептида и выполнения условий прохождения через этот барьер заданного потока низкомолекулярных компонентов. Предпочтительно для синтеза полипептидов с молекулярной массой 20-40 кД использовать размеры пор барьера 120 в пределах 10-12 кД.

На фиг.3-6 приведены варианты схем установок, предназначенных для разных режимов работы.

Наиболее простое устройство для синтеза полипептидов использует режим без отбора высокомолекулярных продуктов. Оно представлено на фиг.3 и состоит по крайней мере из одного реакционного модуля 100, насоса 312 и двух емкостей для питающей смеси 315 и сбора низкомолекулярных продуктов 316. Реакционную смесь вводят в реакционный объем через вход 151. Насосом 312 подают питающую смесь через вход 161 и первый барьер 110 в реакционную смесь. Низкомолекулярные продукты, ингибирующие работу системы, через второй пористый барьер 120 и выход 142 поступают в емкость для сбора низкомолекулярной фракции 316.

В другом варианте, когда экспериментатор выбирает режим непрерывного отбора продукта, распределение потоков осуществляют следующим образом. Собирают простую установку для синтеза пептидов (фиг. 4) на основе реактора 100, который состоит по крайней мере из одного реакционного модуля с двумя пористыми барьерами, насосов 312 и 314, емкостей для хранения питающей смеси 315, сбора низкомолекулярной фракции 316 и сбора высокомолекулярной (вместе с целевым полипептидом) фракции 317. Установка работает следующим образом: реакционную смесь вводят в реакционную зону модуля через жидкостной коммуникационный узел 150, к следующему входу этого узла 151 через жидкостную коммуникацию 210 и насос 312 подают питающую смесь из емкости 315. Питающая смесь распределяется по всему объему реактора, вытесняя при этом продукты синтеза. Высокомолекулярные продукты синтеза, в том числе и синтезируемый полипептид, проникают через поры первого пористого барьера 110 и отбираются из реакционного объема насосом 314 с заданной скоростью. За счет давления, создаваемого при подаче питающей смеси, из объема выходят низкомолекулярные компоненты через второй пористый барьер 120 и выход 142, который связан непосредственно с емкостью сбора 316. Величина размеров пор первого и второго пористых барьеров, а также параметры скорости насосов зависят от условий синтаза. Конструкция модуля, используемого для этого режима, должна обеспечить наличие двух пористых барьеров, выполненных либо в форме двух плоских мембран (фиг.1а), или полых волокон (фиг.2б, 2д, 2е), или комбинации, когда один из барьеров выполнен в виде мембраны, а другой из полых волокон (фиг. 2а).

В тех случаях, когда по условиям синтеза необходимо обеспечить равномерный ввод питающей среды во все точки реакционной зоны, используют установку с реакторными модулями, выполненными из трех пористых барьеров. Вариант такой установки приведен на фиг.5. Реакционную смесь вводят через вход 151 внутрь реакционного объема. Поток питающей смеси 210 поступает в реактор из емкости 315, жидкостную коммуникацию 230 и вход 142 и пористый барьер 121. Типы пористых барьеров выбираются в зависимости от условий синтеза. Целесообразно выполнить первый пористый барьер 110 из полых волокон, а две части второго пористого барьера 121 и 122 выполнить из плоских мембран или полых волокон. Через пористый барьер 121 питающая смесь поступает в тонкий слой реакционного объема за счет создания отрицательного давления во второй части второго пористого барьера 122, выполненного также из полых волокон. Отрицательное давление создается насосом 312, вход которого подключен к выходу 143 второй части второго пористого барьера 122. Выход насоса 312 подключен к емкости 316 для сбора низкомолекулярных продуктов синтеза. Отбор высокомолекулярных продуктов осуществляют через первый барьер 110, который выполнен из полых волокон, размещенных равномерно по всему тонкому слою реакционной смеси. Внутренняя часть полых волокон объединена в общий выход 161, который подключен к входу насоса 314, выход которого соединен с емкостью 317 для сбора высокомолекулярных фракций.

Для тех случаев, когда проводят препаративный синтез и объем используемой реакционной смеси лежит в пределах от 1 до 500 мл, применяют параллельное соединение N реакционных модулей. Схема устройства, использующего параллельное включение N модулей в режиме периодического отбора продукта, представлена на фиг. 6. Используют режим, по которому отбор высокомолекулярных целевых продуктов осуществляют периодически в конце каждого из N циклов. При этом автоматически осуществляют очистку пор одновременно первого и второго пористых барьеров. Реакционный объем реактора 100 заполняют через вход 151 реакционной смесью. В исходном состоянии краны V3 и V4 открыты, а краны V1 и V2 закрыты. На первом шаге цикла питающая смесь подается из резервуара 315 через насос 312 и кран V3 одновременно на все входы 161 реактора. Далее питающая смесь проходит через внутренние отверстия полых волокон или внутреннюю поверхность мембраны, из которых формируют первый пористый барьер 110. Через поры полых волокон питающая смесь равномерно по всей поверхности соприкосновения полых волокон с реакционной системой проникает в объем реактора. Низкомолекулярные продукты синтеза проходят через второй пористый барьер с малым размером пор и поступают через N выходов 142 и открытый кран V4 в емкость 316 для хранения низкомолекулярных фракций. Во время окончания первого шага цикла и начала второго шага краны V3 и V4 закрываются, а краны V1 и V2 открываются. Насос 313, продолжая непрерывно работать, создает отрицательное давление во втором канале, связанном с краном V2. Через кран V2 и выход 161 из реакционного объема через поры первого барьера 110 под действием отрицательного давления выходят высокомолекулярные компоненты синтеза, включая целевой полипептид, и поступают в коллектор фракций 317 через N выходов 161, кран V2 и насос 313. Одновременно с этим питающая смесь поступает в реактор из емкости 315, вход 141 и второй барьер 120 под действием отрицательного давления, созданного насосом 313. Поток питающей смеси через второй пористый барьер 120 на втором шаге цикла имеет противоположное направление. Поэтому поры второго пористого барьера 120, которые могли закрыться в течение первого шага цикла, открываются во время второго шага цикла и гидравлическое сопротивление второго барьера 120 восстанавливается. После окончания второго шага цикла формируется первый шаг и поток высокомолекулярных компонентов через первый пористый барьер 110 завершается. В течение первого шага цикла поток через первый пористый барьер меняет свое направление и поры первого пористого барьера 110, которые могли закрыться в течение второго шага цикла, открываются и гидравлическое сопротивление первого барьера 120 восстанавливается.

При окончании второго шага цикл заканчивается и устройство управления подает команду на переключение кранов и снова формируется первый шаг цикла. Отношение объема питающей смеси вводимой в реактор к объему фракции высокомолекулярных компонентов, выводимых из реактора, лежит в пределах от 2 до 100 и изменяется путем регулирования временных соотношений между длительностями первого и второго шагов цикла, а также за счет изменения общей длительности цикла.

Известно (Kim et al., 1996), что, концентрируя лизат, можно поднять выход синтезируемого полипептида. Данные, приведенные в работе, относятся к режиму синтеза в пробирке, когда продукты, ингибирующие бесклеточную систему, не выводятся за пределы реакционной смеси. Это снижает выход синтезируемого продукта. Поднять выход полипептидов можно, если осуществлять удаление низкомолекулярных продуктов из реакционного объема и в процессе синтеза вводить высокомолекулярные компоненты бесклеточной системы, которые теряют свою активность в процессе синтеза. В первую очередь это относится к таким компонентам бесклеточной системы, как рибосомы и компоненты экстракта S30. Эксперименты показали, что при наличии отбора из реакционной смеси низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов реакции возможно осуществить ввод не только питающей смеси, но и таких компонентов бесклеточной системы, как рибосомная фракция, экстракты (S30, S100 и др.), полимеразы (Т7, Т5, SP6 и др. ), плаздмиды, tRNA, ферменты или их комбинации. Предлагаемая конструкция реакторного модуля позволяет добавлять питающую смесь и компоненты бесклеточной системы в реактор следующими путями: а) общий объем питающей смеси вводится через вход в реактор; б) часть питающей смеси вводится через первый барьер и другая часть через вход в реактор; в) часть питающей смеси вводится через первый барьер в течение первого шага цикла и другая часть вводится через второй барьер в течение второго шага цикла; общий объем расходуемых высокомолекулярных компонентов вводится в реактор через вход вместе с общим объемом питающей смеси или ее части; г) наибольшие компоненты бесклеточной системы (рибосомы и другие) и часть питающей смеси вводятся через вход в реакционную зону, одновременно другая часть небольших компонентов бесклеточной системы и часть питающей смеси вводятся в реакционную зону через поры по крайней мере одного пористого барьера. На фиг.5 показан пример, когда насос 314 позволяет вводить высокомолекулярные компоненты бесклеточной системы под управлением контроллера из емкости 318.

Реакторные модули термостатируют в диапазоне температур от 20 до 40^oC, обычно используют диапазон от 25 до 37^oC. Предпочтительно термостатировать температуру питающей смеси в диапазоне от +2 до +7^oC. Управление насосами проходят вручную или с помощью блока управления 400. Блок управления предпочтительно должен обеспечивать программирование режимов работы. Из известных программаторов и систем автоматизации на основе компьютеров очень хорошие результаты показала система, разработанная фирмой Roche Molecular Biochemicals (Simonenko, 1998). С помощью блока управления осуществляют регулировку длительности циклов и соотношений между двумя шагами в цикле. При установке, например, датчиков давления можно отслеживать изменение давления в жидкостных коммуникациях за счет забивания пор и своевременно изменять параметры процесса.

Предлагаемый способ разделения потоков обеспечивает синтез полипептидов с высокой скоростью в течение десятков часов с выходом функционально активного продукта. В качестве примера приведен синтез флюоресцентного белка GFP. Синтез осуществлялся с помощью устройства, структурная схема которого приведена на фиг. 4. В качестве первого и второго пористых барьеров в модуле реактора использовались ультрафильтрационные мембраны с размером пор 50 кД и 10 кД. Объем реакционной зоны 400 мкл.

В данном примере использован способ препаративного синтеза полипептидов в сопряженной системе транскрипции/трансляции (Baranov et al., 1989). Наиболее часто оценку эффективности и продуктивности бесклеточных систем производят по измерению количества включенной в синтезированный полипептид аминокислоты, меченной изотопом радиоактивного элемента (Алахов и др., 1991). В качестве альтернативного метода используют специфические свойства полипептида, например флуоресценцию (Kolb et al., 1996).

S30 экстракт из E.coli готовят по модифицированному методу (Zubay, 1973) следующим образом. Выращивают клетки E.coli A19 до оптической плотности культуры - 0,8 при длине волны излучения 582 нм. Клетки собирают центрифугированием. Полученную биомассу дважды промывают ресуспендированием в буфере A: 10 мМ Tris-Ac pH 8,2, 14 мМ Mg(OAc)₂, 60 мМ KCl, 1 мМ дитиотреитол, центрифугируя 30 мин при 10000 g. Промытую биомассу ресуспендируют в буфере A в соотношении 4 объема буфера на 1 объем клеток. Полученную суспензию разрушают Френч-прессом при перепаде давления 1600 бар. Разрушение проводят при +4^oC. В полученный клеточный экстракт добавляют коммерческие ингибиторы протеаз в концентрациях, рекомендованных их производителями, и центрифугируют 30 мин при 30000 g. Не допуская взбалтывания, отбирают 2/3 объема надосадочной жидкости. Отобранный объем снова центрифугируют 30 мин при 30000 g. Не допуская взбалтывания, отбирают 2/3 объема надосадочной жидкости. Все процедуры проводят при +4^oC. К результирующему объему в соотношении 14/1 добавляют буфер B: 750 мМ Tris-Ac pH 8,2, 21 мМ Mg(OAc)₂, 7,5 мМ дитиотреитол, 6 мМ АТР, 500 мМ ацетилфосфат, 500 мкМ каждой из 20 аминокислот. Полученный раствор подвергают инкубации при 37^oC в течение 80 мин. По окончании инкубации проводят диализ экстракта против буфера C: 10 мМ Tris-Ac pH 8,2, 14 мМ Mg(OAc)₂, 60 мМ KOAc, 0,5 мМ дитиотреитол в течение 16 ч. Диализ проводят при +4^oC 500-кратным объемом буфера C двумя сменами. Результирующий объем после окончания диализа подвергают центрифугированию 30 мин при 10000 g, фасуют на аликвоты и замораживают в жидком азоте для последующего хранения при -70^oC.

Сопряженную систему транскрипции/трансляции готовят следующим образом. 1 мл реакционной смеси содержит 200-400 мкл S30 экстракта из Е. coli, 0,1-0,5 мг суммарного препарата tRNA Е. coli, 0,01-0,03 мг плазмидной суперспирализованной DNA, 2000-3000 U DNA-зависимой RNA полимеразы бактериофага Т7, 10-50 U рибонуклеазного ингибитора плаценты человека в буфере D: 50-100 мМ HEPES-KOH, или 50-100 мМ Tris-Ac, или 50-100 мМ TES-КОН, или 50-100 мМ MOPS-KOH, или 50-100 мМ BES-KOH, pH 7,0-7,6. В ту же реакционную смесь добавляют следующие низкомолекулярные соединения, концентрация которых составляет: 10-20 мМ Mg(OAc)₂ или MgCl₂, 120-230 мМ KOAc или K-L-глутамат, 1,0-2,0 мМ ATP, 1,0-2,0 мМ GTP, 0,8-1,5 мМ CTP, 0,8-1,5 мМ UTP, 25-40 мМ ацетилфосфата, 40 мкг/мл лейковорина, 1 мМ дитиотреитола, 4% глицерина, 0,02% NaN₃ и 150-250 мкМ каждой из 19 аминокислот, за исключением той, с которой проводится контрольный синтез в аликвоте фиксированного объема (batch).

Скомпонованную систему транскрипции/трансляции разделяют на два неравных объема. Меньший объем - 30-50 мкл помещают в микропробирку и добавляют в него аминокислоту, меченную радиоактивным изотопом. В дальнейшем из микропробирки отбирают аликвоты по 5-10 мкл для оценки кинетики синтеза в фиксированном объеме. Количество синтезированного полипептида определяют методом осаждения аликвоты на стеклянный волокнистый фильтр трихлороуксусной кислотой с последующим счетом в жидком стинцилляте испускаемых изотопом частиц. В оставшийся объем добавляют недостающую аминокислоту до концентрации 150-250 мкМ и после легкого и осторожного перемешивания помещают в реакционную ячейку реактора. Синтез проводят в диапазоне температур 26-37^oC, пропуская через реакционную смесь, помещенную в реакторный модуль, питающую смесь.

Питающую смесь готовят следующим образом.

1 мл питающей смеси содержит следующие низкомолекулярные вещества, концентрация которых составляет: 10-20 мМ Mg(OAc)₂ или MgCl₂, 120-230 мМ KOAc или K-L-глутамат, 1,0-2,0 мМ ATP, 1,0-2,0 мМ GTP, 0,8-1,5 мМ CTP, 0,8-1,5 мМ UTP, 25-40 мМ ацетилфосфата, 40 мкг/мл лейковорина, 1 мМ дитиотреитола, 4% глицерина, 0,02% NaN₃ и 150-250 мкМ каждой из 20 аминокислот в буфере D. Буфер D состоит из: 50-100 мМ HEPES-KOH, или 50-100 мМ TES-KOH, или 50-100 мМ MOPS-KOH, или 50-100 мМ BES-KOH, pH 7,0-7,6. В тот же раствор добавляется 200-400 мкл буфера C, который содержит: 10 мМ Tris-Ac pH 8,2, 14 мМ Mg(OAc)₂, 60 мМ KOAc, 0,5 мМ дитиотреитол.

Пример 1.

Сопряженная транскрипция/трансляция мутантного зеленого флуоресцентного белка (GFP) кишечнополостного организма Aequoria victoria (Crameri, 1996) с DNA-матрицы, содержащей ген GFP, в бесклеточной системе непрерывного действия из E.coli, с разделенными потоками.

В качестве матрицы используют плазмидную DNA, содержащую мутантный ген GFP и нуклеотидные последовательности рибосомсвязывающего участка и промотора DNA-зависимой RNA-полимеразы бактериофага Т7.

Сопряженную систему транскрипции/трансляции готовят следующим образом.

1 мл реакционной смеси содержит 200-400 мкл S30 экстракта из Е.coli, 0,1-0,5 мг суммарного препарата tRNA Е. coli, 0,01-0,03 мг плазмидной суперспирализованной DNA, 2000-3000 U DNA-зависимой RNA полимеразы бактериофага Т7, 10-50 U рибонуклеазного ингибитора плаценты человека в буфере E (100 мМ HEPES-KOH, pH 7,6). В ту же реакционную смесь добавляют следующие низкомолекулярные соединения, концентрация которых составляет: 12 мМ Mg(OAc)₂, 220 мМ KOAc, 1,2 мМ ATP, 1,0 мМ GTP, 0,8 мМ CTP, 0,8 мМ UTP, 30 мМ ацетилфосфата, 40 мкг/мл лейковорина, 1 мМ дитиотреитола, 4% глицерина, 0,02% NaN₃ и 160 мкМ каждой из 19 аминокислот, за исключением лейцина.

Скомпонованную систему транскрипции/трансляции разделяют на два неравных объема. Меньший объем - 30-50 мкл помещают в микропробирку и добавляют в него [¹⁴C]-L-лейцин с удельной радиоактивностью 38 mCu/mmol до концентрации 100 мкМ. В дальнейшем из микропробирки отбирают аликвоты по 5-10 мкл для оценки кинетики синтеза в фиксированном объеме. Количество синтезированного полипептида определяют методом осаждения аликвоты на стеклянный волокнистый фильтр трихлороуксусной кислотой с последующим счетом в жидком стинцилляте испускаемых изотопом частиц. В оставшийся объем добавляют лейцин до концентрации 160 мкМ и после легкого и осторожного перемешивания помещают в реакционную ячейку реактора.

Синтез проводят при температуре 26^oC в реакционной ячейке. Питающую смесь подают в реакционную ячейку со скоростью,составляющей 1,5-2,0 ее внутренних объема за 1 час. Отвод продукта осуществляют со скоростью, составляющей 1/20-1/8 внутреннего объема ячейки за 1 час. В течение всего времени синтеза регистрируется специфическая флуоресценция продукта, выходящего через мембрану с размером пор 50 кД. Продуктивность системы оценивают по флуоресценции всех собранных объемов. На фиг. 7 изображена гистограмма, отражающая количество GFP во фракциях, собранных в ходе синтеза. Количество GFP во фракциях рассчитано по калибровочной кривой, которую строят по данным измерения специфической флюоресценции очищенного препарата GFP от его концентрации. Далее, сравнивают данные по синтезу GFP, полученные в реакторе с продуктивностью контрольного синтеза в фиксированном объеме. На фиг. 8 изображен график зависимости изменения концентрации синтезируемого GFP от продолжительности времени синтеза в контрольной аликвоте, инкубируемой в постоянном объеме. Концентрацию определяют по включению радиоактивной аминокислоты в полипептид. Дополнительно контролируют вновь синтезированный продукт регистрацией флуоресценции после проведения электрофореза всех собранных объемов в полиакриламидном геле. На фиг. 9 приведена фотография гель-электрофореза, на который были нанесены аликвоты, отобранные из фракций, собранных в ходе синтеза. В качестве контроля используют очищенный препарат GFP. Количество нанесенного белка 0,3 мкг.

В ходе синтеза получают 150-200 мкг функционально-активного продукта за 48 ч в расчете на 1 мл сопряженной системы транскрипции/трансляции.

Пример 2.

Сопряженная транскрипция/трансляция мутантного зеленого флуоресцентного белка (GFP) кишечнополостного организма Aequoria victoria с DNA-матрицы, содержащей ген, в бесклеточной системе непрерывного действия из E.coli, с одним потоком.

Получают DNA и готовят сопряженную систему транскрипции/трансляции аналогично примеру 1. Синтез осуществлялся с помощью устройства, структурная схема которого приведена на фиг.3. В качестве первого и второго пористого барьера в модуле реактора использовались полые волокна диаметром 1 мм и размером пор 100 кД. В качестве второго пористого барьера в модуле реактора использовалась ультрафильтрационная мембрана с размером пор 10 кД и площадью 4 см². Объем реакционной зоны 400 мкл.

Питающую смесь подают в реакционную ячейку со скоростью, составляющей 1,5-2,0 ее внутренних объема за 1 час. Отвод продукта не проводят.

Продуктивность системы оценивают по флуоресценции раствора, извлеченного по окончании синтеза из реакционной ячейки реактора, с последующим расчетом количества синтезированного полипептида. Сравнивают с продуктивностью контрольного синтеза в фиксированном объеме. На фиг. 10 изображен график зависимости изменения концентрации синтезируемого GFP от продолжительности времени синтеза в контрольной аликвоте, инкубируемой в постоянном объеме. Концентрацию определяют по включению радиоактивной аминокислоты в полипептид. Дополнительно контролируют вновь синтезированный продукт регистрацией флуоресценции после проведения электрофореза всех собранных объемов в полиакриламидном геле. На фиг. 11 приведена фотография гель-электрофореза, на который были нанесены аликвоты, отобранные из системы сопряженной транскрипции/трансляции в фиксированном объеме и из ячейки реактора после окончания синтеза. В качестве контроля используют очищенный препарат GFP. Количество нанесенного белка 0,3 мкг.

В ходе синтеза получают 60 мкг функционально-активного продукта за 24 ч в расчете на 1 мл сопряженной системы транскрипции/трансляции.

Литература

Статьи:

Spirin A.S. et al., A Continuous Cell-Free Translation System Capable of Producing Polypeptides in High Yeld, Science, 242, 1162-1164 (1988).

Spirin A. S. Cell-Free Protein Synthesis Bioreactor, from Frontiers in Bioprocessing II, 31 - 43, Editors: Todd P. et al., Amer. Chem. Soc. (1992).

Takanori K. Et al., A Continuous Cell-Free Protein Synthesis System for Coupled Transcription-Translation J. Biochem. 110, 166-168 (1991).

Erdmann V. A. et al., The Protein - Bioreactor: Its Potentials for the Synthesis of Proteins in Biotechnology, Medicine and Molecular Biology, First German-Russian Sum-merschool on In vitro Systems, 64-70, Berlin (1994).

Kim D. et al., A highly efficient cell-free protein synthesis from Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 239, 881-886 (1996).

Operating Guide, A/G Technology Corporation "Flux Recovery - Cleaning, Santitization, Storage, Depyrogenation, from UF/MF", 16-20 (1997).

Alberts В. et al., Molecular Biology of a Cell.p.133, New York, London (1983).

Simonenko P. et al., Controlled system for cell free protein expression: Proteinbiosynthesis Reactor (1998).

Baranov V. I. et al., Gene expression in a cell-free system on preparative scale, Gene, vol. 84: 463-466 (1989).

Kolb V.A. et al., Synthesis and maturation of green fluorescent protein in a cell-free translation system, Biotech. Lett. , vol. 18: 1447-1452 (1996).

Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems, Annu. Rev. Genet., vol. 7: 267 (1973).

Crameri A. et al., Improved green protein by molecular evolution using DNA shuffling, Nature Biotech., 14: 315-319 (1996).

Патенты:

Alakhov Yu. В. et al. Method of preparing polypeptides in a cell-free translation system: US Patent 5478730, U.S. Cl. - 435/68.1, Dec. 26 (1995).

Choi C. et al. Method producing protein in a cell-free system: US Patent 5593856, U.S. Cl. - 435/68.1, Jan. 14 (1997).

Mozayeni B.R., Apparatus and process for continuous in vitro synhesis of proteins: US Patent 5434079, U.S. Cl.- 435/311, Jul. 18 (1995).

Fischer K. H. et al. Verfahren zur Beschleunigung des Stoffaustauschs eines kontinuierlichen Bioreaktors und Vorrichtung zur Durchfuhrung dieses Verfahrens: DE Patent 39-4956 A1, Int. Cl. - С 12 M 1/12, Nov. 22 (1990).

Алахов Ю. Б. и др. Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции, Авт. свид. SU 1618761 А1, Int. Cl. - C 12 P 21/02, 07.01.91, Бюл. N1 (1991).

Баранов В.И. и др. Способ получения полипептидов в бесклеточной системе трансляции, Авт. свид. SU 1839191 А1, Int. Cl. - C 12 P 21/02, 30.12.93, Бюл. N48-47 (1993).

Matson S.L., et al. Method and apparatus for conducting catalytic reactions with simultaneous product separation and recovery, US Patent 4786597, U.S. Cl. 435/041, Nov. 22 (1988).

Wrasidlo W. J. et al. Thin film membrane enzyme reactor and method of using same, US Patent 4956289, U.S. Cl. 435/180, Sep. 11 (1990).

Dziewulski D. et al. Three compartment bioreactor and method of use, US Patent 5135853, U.S. Cl. 435-04, Aug. 4 (1992).

Hu W. et al. Bioreactor device with application as a bioartifical liver, US Patent 5605835, U.S. Cl. 435-297, 2, Feb. 25 (1997).

Puchinger H. , et al. Process for the in - vitro biosynthesis of hormones, especialy insulin, US Patent 4225671, U.S. Cl. 435/71, Sep. 30 (1980).

Pedersen S.K. et al. Cartridge of hybrid unitary wafers of hollow fiber membranes and module contaning a stack of post-potted cartridges, US Patent 5366625, U.S. Cl. 210-321.78, Nov. 22 (1994).

Hargitay В. Ultrafiltration and reverse osmosis device comprising plural carbon tubes bonded together. US Patent 4341631, U.S. Cl. 210-323.2, Jul. 27 (1982).

Yagihashi Т. et al. Separation module and bundle unit of hollow thread-type porous membrane elements and methods of producing same, US Patent 5584997, U.S. Cl. 210-321.79, Dec 17 (1997).

Hanai Т. Bundle of permselective hollow fibers and a fluid separator containing the same, US Patent 5198110, U.S. Cl. 210-321.79, Mar. 30 (1993).

Gerbhard Т. et al. Multi-bioreactor hollow fiber cell propagation system and method, US Patent 5656421, U.S. Cl. 435/003. Aug. 12 (1997).

Ovodov S. J. et al. Method for obtaining polypeptides in a cell-free translation system, EP Patent - EP 0485608 B1, Int. Cl. C 12 P 21/00, 22.11.95, Bulletin 95/47 (1995).