способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами
Классы МПК: | A61K31/01 углеводороды A61K35/55 железы, не отнесенные ни к одной из предшествующих подгрупп этой группы A61K38/19 цитокины; лимфокины; интерфероны |
Автор(ы): | Эдвард БЭРАЛ (CA), Иштван БЕРЦИ (CA), Ева НЕЙДЖИ (CA), Лаури КАНГАС (FI) |
Патентообладатель(и): | ОРИОН КОРПОРЕЙШН (FI) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1994-08-02 публикация патента:
27.07.2000 |
Изобретение относится к медицине, а именно к способу сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, и продукту. Способ включает в себя введение пациенту эффективного количества антиэстрогена и клеток-киллеров совместно или последовательно, причем клетки-киллеры выбирают из группы клеток ЕКК, ЛАКК и ЦТЛ, а антиэстроген выбирают из группы антиэстрогенов класса трифенилэтилена, таких как тамоксифен, или торемифен, или их фармацевтически приемлемые соли. Способ позволяет замедлить рост опухоли. 3 с. и 10 з.п. ф-лы, 3 табл., 10 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14
Формула изобретения
1. Способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, который включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком воздействии, эффективного количества антиэстрогена и клеток-киллеров совместно или последовательно, причем клетки-киллеры выбирают из группы естественных клеток-киллеров (ЕКК), лимфоактивированных клеток-киллеров (ЛАКК) и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), а антиэстроген выбирают из группы трифенилэтиленовых антиэстрогенов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки-киллеры вводят в количестве от 1![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
Описание изобретения к патенту
Настоящее изобретение относится к лечению рака путем сенсибилизации раковых клеток антиэстрогенами к лизису клетками-киллерами, в частности естественными клетками-киллерами (ЕКК), лимфокинактивированными клетками-киллерами ЛАКК) и цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Попытки лечения рака человека аутологическими лимфокинактивированными клетками-киллерами (ЛАКК) в сочетании с рекомбинантным лимфокином и инторлейкином-2 уже предпринимались и принесли обнадеживающие результаты (Rosenberg, 1987), так же, как попытки лечения активированными цитоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) (Fujimoto, 1992). Нестероидные антиэстрогены тамоксифен и торемифен, относящиеся к классу трифенилэтилена, получили широкое распространение при лечении эстрогенположительного рака молочной железы. Тамоксифен и торемифен ингибируют эстрогениндуцированный рост путем конкурентного антагонизма по отношению к эстрогеновым рецепторам опухоли. Антиэстрогенная терапия является эффективной в пролонгировании периода без заболевания и общего выживания женщин посло первичного хирургического вмешательства. Другими хорошо известными антиэстрогенами класса трифенилэтилена являются например, кломифен и дролоксифен (3-гидрокситамоксифен). В настоящее время мы обнаружили, что раковые клетки, не имеющие эстрогеновых рецепторов, сенсибилизируются антиэстрогенами класса трифенилэтилена к лизису эффекторами ЕКК, ЛАКК и ЦТЛ. Таким образом, этот сенсибилизирующий эффект не зависит от присутствия классических рецепторов эстрогенов. Ожидается, что применение комбинации антиэстрогенового лечения и терапии клетками-киллерами, согласно настоящему изобретению, значительно повысит процент опухолевой ремиссии и излечения, что уже достигалось авторами настоящего изобретения при использовании только клеток-киллеров у небольшого количества пациентов. РезюмеНастоящее изобретение относится к способу сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, который включает в себя введение пациенту эффективного количества антиэстрогена и клеток-киллеров совместно или последовательно; клетки-киллеры выбирают из группы ЕКК, ЛАКК и ЦТЛ, а антиэстроген выбирают из антиэстрогенов класса трифенилэтилена, таких как тамоксифен или торемифен или их фармацевтически приемлемые соли. При другом варианте образование клеток-киллеров может быть индуцировано у пациента одним из известных иммуностимулирующих способов в течение первого периода лечения, после чего вводится эффективное количество антиэстрогена в течение второго периода лечения. Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой график исследования Уинна с необработанными, обработанными тамоксифеном (ТКС) и обработанными торемифеном (ТО) клетками опухоли Р815. Фиг. 2a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 1. Фиг. 3 представляет график воздействия перорального приема ТКС и ТО в отдельности или с лечением ЛАКК на рост опухоли Р815. Фиг. 4a, b и с представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 3. Фиг. 5 представляет график исследования Уинна с необработанными, обработанными тамоксифеном (ТКС) и обработанными торемифеном (ТО) клетками опухоли Р815. Фиг. 6a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 5. Фиг. 7 представляет график, иллюстрирующий результаты иммунотерапии мастоцитомы Р815 ТКС или ТО и ЛАКК. Фиг. 8a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 7. Фиг. 9 представляет график, иллюстрирующий результаты иммунотерапии мастоцитомы Р815 ТКС или ТО, вводившихся через желудочный зонд, и ЛАКК. Фиг. 10a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 9. 1. Выявление клеток-киллеров
Непременным условием успеха лечения согласно настоящему изобретению является наличие клеток-киллеров (например, ЕКК, ЛАКК или ЦТЛ), способных разрушать раковые клетки в организме пациента, к моменту начала дополнительной терапии антиэстрогеном, например тамоксифеном (ТКС) или торемифеном (ТО). В идеале клеточная суспензия должна быть приготовлена из опухоли пациента посредством воздействия коллагеназы, как описано Freshney (1976), и использована в качестве клеток-мишеней. Некоторые из клеток-мишеней затем подвергают предварительной обработке в течение 4 часов ТКС или ТО, а остальные оставляют необработанными, и оба препарата метят 51Cr. Мононуклеарные клетки периферической крови пациента, очищенные от ненужных клеток, используют в исследовании высвобождения 51Cr в качестве эффекторов. Лишние опухолевые клетки можно хранить в культуральной среде, такой как RPM1-1640, в которую добавлено 10% сыворотки (предпочтительно, аутологической) и 10% диметилсульфоксида в жидком азоте, для использования в последующих процедурах. Если этот подход невыполним, в качестве мишеней можно использовать клеточные линии, такие как К652, подходящие для выявления активности ЕКК, или линии, выделенные из раковой опухоли того же типа другого человека. Наличие в биопсийном образце лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО), может служить показателем присутствия собственных клеток-киллеров. Дополнительными исследованиями, которые используются для выявления клеточного иммунитета и могут также применяться, являются: кожные реакции гиперчувствительности замедленного типа, вызванные экстрактом опухолевого антигена; ингибирование миграции периферических лейкоцитов экстрактом опухолевого антигена и пролиферативная реакция CD8 + T-лимфоциты на экстракт опухолевого антигена. Как только с помощью какой-либо из вышеназванных методик удается установить, что собственные клерки-киллеры пациента способны убивать клетки его опухоли, необходимо начинать терапию антиэстрогенами, пока не будет достигнута регрессия опухоли. Если клетки-киллеры не выявлены, их образование должно быть индуцировано в организме методами иммуностимуляции или снижения тяжести опухолевого поражения, как описано ниже. 2. Снижения тяжести опухолевого поражения
Большинство пациентов с тяжелыми опухолевыми поражениями не имеют циркулирующих клеток-киллеров, которые можно обнаружить. Поэтому первой задачей терапии является снижение тяжести опухолевого поражения, если это возможно, путем хирургического вмешательства, облучения или химиотерапии. Множество экспериментов на животных и наблюдений пациентов свидетельствует о том, что снижение тяжести опухолевых поражений часто приводит к появлению клеток-киллеров как в циркулирующей крови, так и в самой опухоли. Как только клетки-киллеры обнаруживаются, необходимо начинать терапию антиэстрогенами. 3. Иммуностимуляция
Если снижение тяжести опухолевых поражений не привело к спонтанному появлению в организме пациента клеток-киллеров, можно предпринять попытку стимуляции появления этих клеток. Ниже перечислены некоторые из подходов к этой проблеме, которые могут быть использованы. (a) Вакцинация. (b) Лечение циклофосфамидом, который ингибирует супрессорные иммунные механизмы и усиливает, таким образом, клеточный иммунитет. Подобно этому, индометацин препятствует супрессорной функции макрофагов. (с) Применение цитокинов, таких как интерлейкин-2. (d) Применение адъювантов, стимулирующих клеточный иммунитет, таких как мурамилпептид и синтетические аналоги бактериальной стенки (Utsygi и др., 1991). (c) Применение пищевых, факторов, таких как витамин A (Gergely и др., 1988). Подходящие процедуры вакцинации описаны Livingston, 1992; Chang и др., 1993, и Hoover и др., 1993. Лечение циклофосфамидом описано, например, Kamatsumoto и др. , 1991 и Kassabov и Stoychkov, 1991. Лечение индометацином описано, например, Saarloos и др., 1993 и Aso и др., 1992. Обычная терапевтическая доза циклофосфамида составляет 50 мг ежедневно, для индометацина - также 50 мг ежедневно. Цитокины, такие как интерлейкин-2 (ИЛ-2), также могут применяться для иммуностимуляции, как описано, например, Yoshino и др. , 1991. Yoshino и др. лечили пациентов малыми дозами ИЛ-2 (2
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
Введение активированных in vitro ЕКК, ЛАКК или ЦТЛ и антиэстрогена совместно или последовательно также находится в пределах рамок настоящего изобретения. Антиэстроген выбирают из группы трифенилэтилена. Предпочтительными антиэстрогенами являются тамоксифен или торемифен или их фармацевтически приемлемые соли. Наши эксперименты показали, что такая комбинированная терапия имеет определенные преимущества по сравнению с лекарственными средствами или лечением клетками-киллерами по отдельности. Согласно нашим экспериментам, сенсибилизацию клеток-мишеней оптимально предпринимать на стадии, когда клетки-киллеры уже вырабатываются пациентом или же когда клетки-киллеры применяют совместно с лекарственными средствами. Для воспроизводства ЛАКК мононуклеарные лимфоциты пациента культивируют с интерлейкином-2. Мононуклеарные лимфоциты собирают, как описано Rosenberg и др. , 1987. С помощью этой методики у пациента можно изъять от 1
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
(a) Выполнение исследований по выявлению клеток-киллеров в организме пациента;
(b) Если клетки-киллеры в организме пациента отсутствуют, их появление индуцируют известными способами, или
(c) клетки-киллеры воспроизводят in vitro и внутривенно вводят пациенту;
(d) Дополнительная терапия ТКС или ТО начинается, как только клетки-киллеры воспроизведены организмом пациента или введены ему внутривенно, предпочтительно, после определения сенсибилизирующего воздействия этих препаратов на клетки-мишени, т.е. лизиса клеток-мишеней эффекторными клетками;
(e) Во время терапии сенсибилизирующими препаратами тщательно следят за ее эффективностью. Способ терапии настоящего изобретения можно различным образом модифицировать, не отступая от идеи настоящего изобретения и не выходя за его рамки. Варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, служат целям иллюстрации и не должны истолковываться как ограничительные. Пример 1
Изучалось воздействие торемифена (ТО) и тамоксифена (ТКС) на лизис клеток-мишеней естественными клетками-киллерами (ЕКК), лимфокинактивированными клетками-киллерами (ЛАКК) и цитотоксическими T-лимфоцитами (ЦТЛ). Клетки крысиной селезенки использовали в качестве эффекторных клеток без активации (ЕКК) или после обработки ИЛ-2 человека (ЛАКК) или после стимуляции крысиной лимфой Nb2 в смешанных культурах (ЦТЛ). В качестве клеток-мишеней для ЕКК использовали клетки мышиной лимфомы Уac-1, для ЛАКК - клетки мастоцитомы Р815 и для ЦТЛ - клетки Nb2. Клетки-мишени и клетки-эффекторы предварительно обрабатывали ТО и ТКС в концентрациях от 1 нМ до 5
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153004/956.gif)
Для воспроизводства ЛАКК 2
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153004/956.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153004/956.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153004/956.gif)
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153004/956.gif)
Повторили эксперимент примера 2 с увеличенным количеством ЛАКК (соотношение 1:50), смешанных с обработанными лекарственным препаратом и не обработанными опухолевыми клетками и введенных подкожно животным. Результаты представлены на фиг. 5. Кривые выживания представлены на фиг. 6a, b и c. Снова, как в предыдущих экспериментах, в леченных группах было несколько животных с неразвившимися опухолями, особенно в тех, где лекарственное лечение сочеталось с введением клеток-киллеров. Пример 5
В этом иммунотерапевтическом эксперименте все группы получали ту же дозу опухолевых клеток подкожно, а спустя 12 дней, когда опухоль у всех животных отчетливо пальпировалась, начиналось лечение лекарственными препаратами в питьевой воде. Лечение ЛАКК начинали спустя 2 дня, которые вводили 3 раза с интервалом в 4 дня, как указано на фиг. 7. Лечение лекарственными препаратами продолжали в течение всего эксперимента. Как видно из фиг. 7, рост опухолей значительно задерживался лекарственным лечением в сочетании с клетками-киллерами. Это также отражено в кривых выживания, представленных на фиг. 8a, b и c. Все контрольные животные погибли от новообразования к 26 дню, в то время как все животные в группе ТО + ЛАКК к 28 дню были живы. Наблюдалась одна тотальная регрессия в группе ТКС + ЛАКК и одна частичная регрессия в группе ТО + ЛАКК (объем опухоли уменьшился в 10 раз по сравнению с первоначальным). Пример 6
Самкам мышей DBA/2 подкожно инъецировали 104 опухолевых клеток Р815. Когда опухоли достигли приблизительно 0,5 см в диаметре, начали лекарственное лечение (ТКС или ТО, 10 мг/кг в день через желудочный зонд). Спустя два дня интраперитонеально вводили 25
![способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, патент № 2153332](/images/patents/318/2153003/183.gif)
Класс A61K35/55 железы, не отнесенные ни к одной из предшествующих подгрупп этой группы
Класс A61K38/19 цитокины; лимфокины; интерфероны