способ радиоиммунохимического анализа

Формула изобретения

Способ радиоиммунохимического анализа с использованием трития, включающий приготовление реакционной смеси, ее инкубацию, выделение продуктов реакции и их перенос в жидкий сцинтиллятор, регистрацию информационного параметра с помощью трех фотоприемников, построение калибровочной зависимости и с ее учетом определение количественного содержания исследуемого вещества в пробе, отличающийся тем, что с использованием трех фотоприемников определяют интенсивность мажоритарных (М) и тройных (Т) совпадений сигналов фотоприемников, соединенных со схемой отбора мажоритарных и тройных совпадений для проб с различным известным содержанием исследуемого вещества, рассчитывают параметр А по формуле А = (М + 2Т)³/27Е² для каждой измеренной пробы, строят калибровочную зависимость по рассчитанным значениям, а в качестве информационного параметра для пробы с неизвестным содержанием исследуемого вещества используют величину А, определенную для этой пробы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам количественного анализа биологически (физиологически) активных веществ в пробах различной природы, а именно к способам радиоиммунохимического анализа с использованием тритиевой метки.

Способы радиоиммунохимического анализа известны и для их реализации многими фирмами выпускаются готовые наборы реагентов. Так, известно множество сходных по процедуре выполнения способов радиоиммунохимического анализа стероидов с использованием тритиевой метки, систематизированных в справочном пособии "Методы определения гормонов" (Резников А.Г., Киев: Наукова думка, 1980 г. ). Например, известен описанный на стр. 319 указанной книги способ определения тестостерона, суть которого заключается в приготовлении реакционной смеси (в данном примере этот этап состоит из эфирной экстракции исследуемого вещества (антигена) из плазмы или сыворотки крови, смешивании в отдельных реакционных сосудах определенных количеств экстракта исследуемых проб, проб, содержащих известное количество антигена (стандартов), с антигеном, меченным тритием и антисывороткой), инкубации реакционной смеси (в течение 30 мин при встряхивании на водяной бане при 37^oC и затем в течение часа при 2-4^oC), выделения продуктов реакции (путем сорбции активированным углем, покрытым декстраном не связавшегося с антителом антигена с последующим осаждением сорбента посредством центрифугирования), переносе выделенных продуктов реакции в жидкий сцинтиллятор (0,5 см супернатанта из каждого реакционного сосуда переносят в соответствующий флакон, содержащий 10 мл жидкого сцинтиллятора ЖС8), регистрации информационного параметра (измеряют в каждом флаконе частоту (скорость счета) сцинтилляций, вызванных тритием, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика), производят построение калибровочной зависимости анализа (например, путем определения зависимости процента связывания меченого антигена в пробах стандартах от содержания исследуемого вещества в этих пробах), по которой определяют содержание исследуемого вещества в анализируемых пробах.

Еще известен способ радиоиммунохимического анализа 25-ОН-витамина Д3 (диагностический набор реагентов для этого анализа выпускается фирмой "BYK", Германия, каталожный N 1800, копия каталожного описания прилагается), суть которого также заключается в приготовлении реакционной смеси, ее инкубации, выделении продуктов реакции и их переносе в жидкий сцинтиллятор, регистрации информационного параметра, построении калибровочной зависимости, с помощью которой определяют содержание исследуемого вещества в пробе.

В этом способе приготовление реакционной смеси заключается во внесении в реакционные сосуды 25 мкл экстракта исследуемых проб или стандартных образцов, входящих в количестве 6 шт. в комплект набора, добавлении в каждый из сосудов 10 мкл меченного тритием 25-ОН-витамина Д3 и 100 мкл связывающего белка (антител против 25-ОН-витамина Д3 в фосфатном буфере). Инкубация приготовленной реакционной смеси осуществляется в течение часа при температуре 4^oC. Выделение продуктов реакции производится в течение 4 мин при температуре 4^oC с помощью суспензии активированного угля, внесенной в количестве 100 мкл в каждый из реакционных сосудов, с последующим отделением активированного угля связавшего непрореагировавшие продукты посредством центрифугирования реакционных сосудов. Затем 400 мкл супернатанта, содержащего продукты реакции (комплексы антиген-антитело), из каждого реакционного сосуда переносят соответственно во флаконы, содержащие жидкий сцинтиллятор, и далее регистрируют информационный параметр - измеряют частоту сцинтилляций, вызванных тритием в каждом из флаконов. После этого производят построение калибровочной зависимости анализа - например, зависимости частоты сцинтилляций от содержания определяемого вещества в пробе, используя для этой цели результаты измерения частоты сцинтилляций в пробах стандартах, содержащих известное количество определяемого вещества. Затем с помощью калибровочной зависимости определяют содержание исследуемого вещества в анализируемых пробах.

Известен также способ радиоиммунохимического анализа дегидроэпиандростерона-сульфата (DHEA-S) (прототип).

Диагностический набор реагентов для этого анализа (копия описания набора и процедуры анализа прилагаются) выпускается фирмой Radioassay Systems Laboratories Inc. (США).

Этот анализ также включает приготовление реакционной смеси, ее инкубацию, выделение продуктов реакции и их перенос в жидкий сцинтиллятор, регистрацию информационного параметра, построение калибровочной зависимости, с помощью которой определяют количественное содержание исследуемого вещества в пробе.

Приготовление реакционной смеси в данном случае заключается во внесении в реакционные сосуды 0,5 мл предварительно разбавленной в 4000 раз сыворотки или плазмы исследуемой крови или стандартных образцов, входящих в количестве 7 шт. в комплект набора, добавлении 0,1 мл антисыворотки к дегидроэпиандростерону-сульфату и добавлении 0,1 мл меченного тритием дегидроэпиандростерона-сульфата во все сосуды.

Подготавливают также пробу, не содержащую связывающую систему (антисыворотку), для учета неспецифического связывания (NSB) меченого дегидроэпиандростерона-сульфата, что позволяет в дальнейшем учесть это неспецифическое связывание при построении калибровочной зависимости и улучшить точность анализа. Инкубация выполняется в течение от 1 до 24 ч в водяной бане при температуре 4^oC при периодическом перемешивании.

Выделение продуктов реакции осуществляется после инкубации путем добавления в реакционные сосуды 0,2 мл охлажденной до 4^oC суспензии активированного угля, покрытого декстраном, интенсивного перемешивания в течение 20 с и выдержки полученной смеси в течение 20 мин при температуре 4^oC с последующим осаждением сорбента центрифугированием в течение 15 мин.

Далее весь супернатант из реакционных сосудов декантируют соответственно во флаконы с жидким сцинтиллятором и производят в каждом из флаконов регистрацию информационного параметра - частоты сцинтилляций - CPM (счет за минуту) с помощью жидкостного сцинтилляционного бета-счетчика.

После этого по данным измерения частоты сцинтилляций в пробах-стандартах производят построение калибровочной зависимости анализа - зависимости процента связывания меченого дегидроэпиандростерона-сульфата от содержания дегидроэпиандростерона-сульфата в исследуемой пробе (процент связывания - отношение частоты сцинтилляций в пробе к частоте сцинтилляций в пробе с отсутствием исследуемого вещества (нулевой стандарт). При расчете процента связывания учитывается неспецифическое связывание (NSB) путем вычитания из величины частоты сцинтилляций для какой-либо пробы величины частоты сцинтилляций для пробы неспецифического связывания. Учет NSB позволяет улучшить точность анализа, если при построении калибровочной кривой используется та или иная гипотеза о ходе реакций, происходящих при анализе, например, гипотеза о соответствии реакций закону масс-действия.

Далее по данным измерения частоты сцинтилляций в исследуемых пробах определяют процент связывания метки для этих проб и с помощью построенной калибровочной зависимости определяют содержание дегидроэпиандростерона-сульфата в этих пробах.

Все способы радиоиммунохимического анализа с использованием трития чувствительны к явлению, обусловленному тем, что сцинтилляционная эффективность жидкого сцинтиллятора существенно зависит от состава вводимой в сцинтиллятор пробы. Это явление называется тушением (гашением) сцинтилляций и заключается в том, что количество фотонов в световых вспышках (сцинтилляциях), возникающих при возбуждении сцинтиллятора бета-частицами, излучаемыми в ходе распада радионуклида, содержащегося в меченых пробах, существенно зависит от состава пробы. Обычно при отсутствии тушения сцинтиллянионная эффективность составляет 5-20 фотонов на кэВ поглощенной энергии в зависимости от качества сцинтиллятора. Таким образом, для бета-частиц трития, который является низкоэнергетическим излучателем (максимальная энергия 18,6 кэВ. средняя энергия 5,6 кэВ) наиболее яркие сцинтилляции сопровождаются изотропным излучением примерно 100-400 фотонов в телесный угол 4 .

Отсутствие тушения случай редкий, поскольку насыщение сцинтиллятора кислородом воздуха, происходящее при обычных условиях работы, существенно снижает сцинтилляционную эффективность. Иногда различают химическое и цветовое тушение. Первое обусловлено уменьшением вероятности излучательных переходов в сцинтилляторе под влиянием тех или иных веществ, содержащихся в пробе, а второе - поглощением излучаемых сцинтиллятором фотонов окрашенными примесями в пробе. В результате на практике акт сцинтилляции, вызванной тритием, сопровождается излучением от одного до нескольких десятков фотонов. В случае сцинтиллятора на основе толуола сцинтилляционная эффективность несколько выше, чем у сцинтиллятора на основе диоксана, но в толуоловые сцинтилляторы сложно вводить водосодержащие пробы из-за образования суспензий. В диоксановые сцинтилляторы можно вводить до 10-15% воды без опасности разделения фаз. Сильнейшими тушителями сцинтилляций являются ароматические галлоиды (хлороформ, трихлорэтан, хлор-n-ксилон), спирты, кетоны.

Регистрацию информационного параметра в пробах осуществляют либо с помощью одного фотоприемника, либо с помощью двух, соединенных со схемой отбора совпадений, либо с помощью трех - соединенных со схемой отбора мажоритарных совпадений (сигнал на выходе этой схемы возникает в случае, когда хотя бы два из трех фотоприемников зарегистрировали фотоны сцинтилляции).

Для регистрации сцинтилляций при реализации радиоиммунохимического анализа с использованием трития в качестве фотоприемников применяют исключительно фотоэлектронные умножители (ФЭУ) особо высокого качества - тритиевые ФЭУ, на основе которых создают тот или иной жидкостной сцинтилляционный счетчик.

Счетчики с применением одного фотоприемника после разработки корреляционных методов, основанных на анализе совпадений, реально не используются и представляют исторический интерес, поскольку, хотя и обладают самой высокой эффективностью регистрации, но имеют плохую помехоустойчивость и наряду с полезными сигналами регистрируют шумы фотоприемника, которые могут быть на несколько порядков более интенсивными, чем сигналы, вызванные пробой, регистрируются также паразитные однофотонные процессы в пробе, которые зачастую присутствуют из-за окислительных или других процессов, сопровождающихся хемилюминисценцией. Сегодня в мире промышленно выпускается только один прибор такого типа - "TRIATLER".

Счетчики на основе двух фотоумножителей с отбором совпадений нашли наиболее широкое применение - все некоррелированные процессы (в т.ч. шумы фотоумножителей, хемилюминесценция пробы) при такой регистрации сцинтилляций исключаются, а частота сигналов на выходе схемы отбора совпадений отражает только те процессы, которые были зарегистрированы одновременно обоими фотоумножителями, т.е. те процессы, в которых было излучено более одного фотона, эти фотоны попали на оба фотоумножителя и были зарегистрированы обоими фотоумножителями. Такой прием позволяет свести все паразитные процессы к пренебрежению малым величинам, но эффективность регистрации сцинтилляций (доля сцинтилляций зарегистрированной прибором от числа распадов трития в пробе) оказывается ниже, чем при регистрации с помощью одного фотоприемника и составляет для нетушенных проб (стандартов на основе меченного тритием толуолового сцинтиллятора, барботированного азотом) 60-62%.

В таком счетчике все сцинтилляции, в которых был излучен один фотон, принципиально не могут быть зарегистрированы, кроме того, поскольку самые лучшие из известных фотоумножителей имеют квантовую эффективность фотокатода около 20% (т. е. в среднем для образования одного фотоэлектрона, который вызовет сигнал на выходе фотоумножителя, надо 5 фотонов), то не регистрируется и часть многофотонных сцинтилляций. При наличии тушителей в пробе среднее количество фотонов в сцинтилляции уменьшается и вероятность ее регистрации тоже уменьшается, причем уменьшается гораздо быстрее, чем в случае регистрации сцинтилляций одним фотоприемником.

В ЗАО ВНИИМП-ВИТА были разработаны и выпускаются не имеющие аналогов установки для регистрации сцинтилляций на основе трех фотоприемников (Бета-1, Бета-2) с блоком отбора мажоритарных совпадений. Они обеспечивают эффективность регистрации нетушенных проб несколько большую, чем достигается при использовании двух фотоприемников, а главное менее чувствительны к наличию тушителей в пробе, поскольку вероятность регистрации сцинтилляции "хотя бы двумя фотоприемниками из трех" выше, чем двумя фотоприемниками.

При реализации радиоиммунологического анализа тушением, связанным с содержанием в пробе исследуемого вещества, обычно можно пренебречь (если не экстраполировать калибровочную зависимость за пределы, определяемые пробами-стандартами), поскольку на калибровочную зависимость уже "оказало влияние" тушение, вызванное исследуемым веществом при измерении проб стандартов; сходное тушение будет наблюдаться при измерении неизвестных проб. Однако при измерении неизвестных проб в них могут содержаться тушители, отсутствующие в пробах стандартах. Таким образом, различное тушение сцинтилляций в исследуемых пробах приводит к различной доле зарегистрированных сцинтилляций и влияет на точность анализа. Степень этого влияния зависит от того, что за вещества и в каких концентрациях присутствуют в исследуемых пробах. В некоторых случаях тушением можно пренебречь, а в некоторых оно способно привести к полностью недостоверным результатам анализа, как например, в случае исследования гормонального обмена при токсогенных воздействиях липотропными и нервно-паралитическими ядами, при исследованиях танатогенеза.

При разработке конкретных методик радиоиммунохимических анализов и диагностических наборов принимаются меры по снижению влияния неспецифических факторов в пробе на результаты анализа. Так, в первых двух описанных аналогах этому способствует усложнение этапа пробопригоговлелия анализа - экстракция анализируемого вещества из биопробы, однако при этом, как правило, надо определять экстракционный выход, кроме того, многие вещества соэкстрагируются вместе с исследуемым и затем вызывают дополнительное тушение в пробе (в частности, ряд липотропных веществ). В прототипе снижению влияния пробы на результат анализа способствует ее разбавление в 4000 раз. Разбавление снижает чувствительность анализа, не всегда может практиковаться и, кроме того, при наличии сильных тушителей точность все равно может оказаться недостаточной.

Таким образом несмотря на наличие множества известных модификаций способа радиоиммунохимического анализа с использованием трития, касающихся используемых реагентов, последовательности внесения реагентов и проб при приготовлении реакционной смеси, методов инкубации и выделения продуктов реакции, типа жидкого сцинтиллятора, методов регистрации информационного параметра, построения калибровочной зависимости, не изменяющих данный способ анализа по существу, способ имеет недостаток, свойственный всем его модификациям, заключающийся в недостаточной точности из-за зависимости тушения сцинтилляций в исследуемых пробах от их состава.

Предлагаемое изобретение решает задачу повышения точности анализа путем уменьшения (исключения) влияния явления тушения сцинтилляций в исследуемой пробе на результат анализа.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе радиоиммунохимического анализа с использованием трития, включающем приготовление реакционной смеси, ее инкубацию, выделение продуктов реакции и их перенос в жидкий сцинтиллятор, регистрацию информационного параметра, построение калибровочной зависимости, с помощью которой определяют количественное содержание исследуемого вещества в пробе, согласно предлагаемому изобретению с использованием трех фотоприемников, соединенных со схемой отбора мажоритарных и тройных совпадений, определяют для различных проб с известным содержанием исследуемого вещества интенсивности М и Т соответственно мажоритарных и тройных совпадений сигналов фотоприемников, рассчитывают параметр A по формуле A=(М+2Т)³/27Т для каждой измеренной пробы, строят калибровочную зависимость по рассчитанным значениям, а в качестве информационного параметра для пробы с неизвестным содержанием исследуемого вещества используют величину A, определенную для этой пробы.

Таким образом, сущность настоящего изобретения заключается в том, что благодаря вышеописанному техническому решению повышается точность путем уменьшения (исключения) влияния явления тушения сцинтилляций на результат анализа.

Изложенная сущность изобретения поясняется на примере конкретного анализа дегидроэпиандростерона-сульфата в пробах сыворотки крови с помощью диагностического набора реагентов фирмы RSL DHEA-S(³H)KIT.

Приготовление реакционной смеси выполняется путем внесения в отдельные реакционные сосуды 0,5 мл предварительно разбавленной в 4000 раз сыворотки исследуемой крови (нативную сыворотку крови разбавляют в 200 и затем еще в 20 раз используя разбавитель из комплекта диагностического набора) или стандартных образцов, содержащих соответственно 0,02 нг/мл, 0,05 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,2 нг/мл, 0,5 нг/мл, 1 нг/мл дегидроэпиандростерона-сульфата.

Затем в каждый из реакционных сосудов добавляют 0,1 мл антисыворотки к дегидроэпиандростерону-сульфату из комплекта набора, после чего в каждый из сосудов добавляют 0,1 мл меченного тритием дегидроэпиандростерона-сульфата. Подготавливают также пробу неспецифического связывания путем внесения в реакционный сосуд 0,6 мл разбавителя и 0,1 мл меченного тритием дегидроэпиандростерона-сульфата. Приготавливают "нулевой" стандартный образец (образец, не содержащий исследуемого вещества - 0,0 нг/мл) путем внесения в реакционный сосуд 0,5 мл разбавителя и 0,1 мл антисыворотки к дегидроэпиандростерону-сульфату. Далее выполняют инкубацию приготовленной реакционной смеси в водяной бане при температуре 4^oC при периодическом помешивании. Инкубацию проводят не менее 1 ч, но и не более 24 ч. После инкубации выделяют продукты реакции путем добавления в каждый реакционный сосуд 0,2 мл охлажденной до 4^oC суспензии активированного угля, покрытого декстраном (входит в комплект набора), интенсивного перемешивания в течение 20 с, например, с помощью смешивателя для радиоиммунохимического анализа СВ1, выпускаемого ЗАО "ВНИИМП-ВИТА", выдержки полученной смеси в течение 20 мин при температуре 4^oC, с последующим осаждением сорбента центрифугированием в течение 15 мин (в качестве центрифуги можно использовать центрифугу ЦЛП-3-3,5 с адаптерами на 100 радиоиммунологических пробирок, выпускаемыми ЗАО "ВНИИМП-ВИТА").

Далее весь супернатант из каждого реакционного сосуда декантируют в соответствующий флакон с жидким сцинтиллятором. В качестве жидкого сцинтиллятора используется промышленно выпускаемый сцинтиллятор на основе диоксана марки ЖС8-И в количестве 15 мл. Затем с помощью установки Бета-2, содержащей три фотоприемника (фотоэлектронные умножители ФЭУ-39А, размещенные под углом 120^o друг к другу, фотокатоды которых обращены к флакону с пробой), соединенные со схемой отбора мажоритарных и тройных совпадений (мажоритарный элемент - микросхема КР1533ЛП3, а трехвходовая схема совпадений - микросхема КР1533ЛА4) определяют интенсивности М и Т соответственно мажоритарных и тройных совпадений сигналов фотоприемников для каждой из проб, перенесенных в жидкий сцинтиллятор.

Пусть вероятности регистрации сцинтилляции в пробе равны P₁, P₂, P₃ соответственно для первого, второго и третьего фотоприемников. Тогда вероятность регистрации мажоритарных совпадений сцинтилляций Pм (вероятность регистрации сцинтилляций не менее чем двумя фотоприемниками из трех) равна:

Pм = P₁P₂(1-P₃) + P₁P₃(1-P₂) + P₂P₃(1-P₁) + P₁P₂P₃,

а вероятность регистрации сцинтилляций тремя фотоприемниками (тройных совпадений) Pт равна:

Pт = P₁, P₂, P₃

Если при заводской регулировке установки выполнить условие P₁ = P₂ = P₃ = P (например, путем подбора напряжения питания каждого фотоприемника так, чтобы обеспечивалась равная чувствительность фотоприемников), получим:

Pм = P²(3-2P);

Pт = P³

Если активность трития в исследуемой пробе равна A, то интенсивность мажоритарных М и тройных Т совпадений сигналов фотоприемников соответственно будет:

М = AP²(3-2P) (1)

Т = AP³;

Решение системы уравнений (1) дает:

A = (М+2Т)³/27Т² (2)

Величина параметра A, рассчитанного по формуле (2), не зависит от величины P и, следовательно, не зависит от степени тушения сцинтилляций в пробе.

По результатам определения параметра A для всех проб стандартов определяют их коэффициенты связывания B/Bo (%) (с учетом параметра A_NSB, определенного для пробы неспецифического связывания), используя в качестве CPM для каждой стандартной пробы величину параметра A для этой пробы, и затем строят калибровочную зависимость B/Bo (%) = f(C) коэффициента связывания B/Bo (%) от концентрации C исследуемого вещества. Калибровочная зависимость может быть построена, например, с использованием интерполяционного кубического сплайна (этот широко распространенный метод и его алгоритм приведены, в частности, в инструкции оператора установки Бета-2 тА0.005.012И). С помощью построенной калибровочной зависимости находят содержание определяемого вещества дегидроэпиандростерона-сульфата в каждой из исследуемых проб, вычисляя для каждой из них параметр A на основании величин М и Т, определенных для этой пробы. Далее для исследуемой пробы вычисляют коэффициент связывания B/Bo (%) для этой пробы, используя в качестве CPM для данной пробы величину параметра A для этой пробы. Полученный коэффициент связывания откладывают на оси ординат и считывают с помощью калибровочной зависимости искомое содержание определяемого вещества в пробе на оси абсцисс.

Проведенные испытания полностью подтвердили преимущества заявленного способа перед известными.

Так, в силу практической независимости результата анализа от величины тушения сцинтилляций в пробе существенно повышается точность анализа. Это можно характеризовать следующими значениями.

Образец контрольной сыворотки, содержащей 100 нг/мл дегидроэпиандростерона-сульфата, был разделен на 6 аликвот. В аликвоты был добавлен реальный тушитель - четыреххлористый углерод в концентрациях, обычно наблюдаемых в крови в динамике развития токсогенного шока при отравлении этим веществом.

Далее эти контрольные аликвоты были подвергнуты следующим анализам:

1) традиционным способом с регистрацией в качестве информационного параметра интенсивности мажоритарных совпадений на установке Бета-2;

2) предлагаемым способом с регистрацией мажоритарных М и тройных Т совпадений на установке Бета-2 и расчетом информационного параметра A по формуле A = (М+2Т)³/27Т².

При традиционном способе были получены следующие значения: информационный параметр изменялся в пределах 4041 [CPM] до 151 [CPM] (т.е. в 26 раз) по мере увеличения содержания тушителя в пробе. В тех же пробах при предлагаемом способе параметр A изменялся в пределах 4408 - 5560 (т.е. на 20%). Соответственно этому определение содержания дегидроэпиандростерона-сульфата традиционным способом было совершенно недостоверным (результат колебался от 250 - 4000 нг/мл при истинном содержании 100 нг/мл), в то время как при реализации предлагаемого способа это содержание составило 90-130 нг/мл, т.е. ошибка составила от -10 до 30%, что является высокоточным результатом для подобного измерения.

Дополнительно было проведено сравнительное исследование ряда стероидных гормонов в сыворотке крови при различной патологии с помощью предлагаемого и традиционного методов с использованием промышленных диагностических наборов, меченных тритием, с альтернативными методами на основе диагностических наборов, меченных йодом-125. Методы на основе йода-125 также имея ряд недостатков, свободны от ошибки вызываемой тушением. При этом было установлено, что результаты, полученные известными способами с применением трития, отличаются до 5 раз от результатов, полученных предлагаемым способом. Наибольшее различие было именно в пробах, где наблюдалось тушение: гемолизированных, с метаболическим ацидозом, причем величина тушения, контролируемая по отношению М/Т, для каждой пробы, меченной тритиемб не превышала 4, т.е. тушение было весьма умеренным, а его влияние на результат с учетом формы калибровочной зависимости значительным. Различие результатов предлагаемого способа от альтернативного с использованием йода-125 составило не более 17%, что является небольшой величиной для данных видов анализов.