способ скрининга невропатологии
Классы МПК: | G01N33/557 с использованием кинетических измерений, те времени взаимодействия антиген-антитело C12N15/12 гены, кодирующие животные белки C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии C07K14/705 рецепторы; клеточные антигены; клеточные поверхностные детерминаторы |
Автор(ы): | КИЛГЭННОН Патрик Д. (US), ГЭЛЛАТИН У. Майкл (US) |
Патентообладатель(и): | АЙКОС КОРПОРЕЙШН (US) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1996-06-06 публикация патента:
27.08.2000 |
Изобретение предназначено для диагностики невропатологических состояний, например церебральной ишемии, эпилепсии. Способ скрининга для невропатологии включает в себя несколько стадий. Получают образец жидкости от первого индивидуума. Соединяют его с антителом, специфически иммунореактивным с IСАМ-4. Проводят количественный анализ связывания IСАМ-4/антитело в образце. Сравнивают связывание IСАМ/антитело в указанном образце с таким же связыванием в образце от второго индивидуума, не имеющего неврологических заболеваний. Очищенная и выделенная ДНК содержит промотор для IСАМ-4 млекопитающих. Химерный полинуклеотид содержит промотор для гена человеческого IСАМ-4. Вектор экспрессии содержит указанную ДНК. Клетка-хозяин трансформирована указанным вектором экспрессии. Полипептид, обозначенный как "IСАМ-4", относится к факторам клеточной адгезии. Он обладает структурным родством с факторами межклеточной адгезии IСАМ-1, IСАМ-2 и IСАМ-R. Изобретение позволит определить уровни растворимого IСАМ-4 в жидкостях человека в здоровом и больном состоянии. 4 з.п. ф-лы, 5 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45
Формула изобретения
1. Способ скрининга невропатологии, отличающийся тем, что получают образец жидкости от первого индивидуума, проводят его в контактирование с антителом, специфически иммунореактивным с ICAM-4, причем ICAM-4 кодируется полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 27, и полинуклеотидов, кодирующих ICAM-4, которые гибридизируются с полинуклеотидом SEQ ID NO: 27, проводят количественный анализ связывания ICAM-4/антитело в образце и сравнивают связывание ICAM-4/антитело в указанном образце с таким же связыванием в образце второго индивидуума, не имеющего невропатологии. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве образца жидкости используют сыворотку крови. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве образца жидкости используют цереброспинальную жидкость. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественный анализ связывания проводят посредством радиоиммуноанализа (RIA). 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественный анализ связывания проводят посредством иммуноферментного иммуносорбентного анализа (ELISA).Описание изобретения к патенту
Эта заявка частично продолжает патентную заявку США N 08/481130, поданную 7 июня 1995 г., которая частично продолжает заявку США N 08/245295, поданную 18 мая 1994 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки США N 08/102852, поданной 5 августа 1993 г. как частичное продолжение заявки США N 08/009266, поданной 22 января 1993 г. как частичное продолжение заявки США N 07/894061, поданной 5 июня 1992 г. как частичное продолжение заявки США N 07/889724, поданной 26 мая 1992 г. как частичное продолжение одновременно рассматриваемой заявки США N 07/827689, поданной 27 января 1992 г. Настоящее изобретение относится, в основном, к факторам клеточной адгезии, а более конкретно к клонированию и экспрессии ДНК, кодирующей ранее неизвестный полипептид, обозначенный как "ICAM-4", который обладает структурным родством с факторами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R. Исследования последнего десятилетия в значительной степени пролили свет на молекулярные явления, сопутствующие межклеточным взаимодействиям в теле, в особенности на явления, имеющие место при перемещении и активации клеток в иммунной системе, и на явления, сопутствующие развитию и нормальной физиологической функции клеток в нервной системе. См., в основном, Springer, Nature, 346: 425-434(1990) - относительно клеток иммунной системы; Yochihara et al., Neurosci. Res., 10: 83-105 (1991), а также Sonderegger and Rathjen, J. Cell Biol., 119: 1387-1394 (1992) - относительно клеток нервной системы. Белки поверхности клеток и, особенно, так называемые факторы клеточной адгезии (CAM) соответственно были предметом фармацевтических исследований и разработок, имеющих своей целью вмешательство в процессы проникновения лейкоцитов в области воспаления и перемещения лейкоцитов в точно определенные ткани, а также дифференциация и образование сложных нейронных цепей. Выделение и исследование факторов клеточной адгезии, клонирование и экспрессия последовательностей ДНК, кодирующих такие факторы, и получение терапевтических и диагностических средств для воспалительных процессов, а также развития и деятельности нервной системы также было предметом изобретения многочисленных американских и зарубежных патентных заявок. См. Edwards, Current, Opinion in Therapeutic Patents, 1(11): 1617-1630 (1991) и особенно приведенные здесь "ссылки на патентную литературу". Основной интерес с точки зрения предпосылок настоящего изобретения представляет известная идентификация и исследование некоторых медиаторов явлений клеточной адгезии, "лейкоинтегринов", LFA-1, MAC-1 и gp 150.95 (известных в номенклатуре ВОЗ как CD18/CD11a, CD18/CD11b и CD18/CD11c соответственно), которые образуют подсемейство белков поверхности клеток гетеродимерных "интегринов", присутствующих на B-лимфоцитах, T-лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах. См., например, Springer, табл. 1 на стр. 429. Также представляют интерес другие адгезивные молекулы простой цепи (CAM), которые участвовали в активации лейкоцитов, адгезии, подвижности и т.п., то-есть явлениях, присущих воспалительному процессу. Например, в настоящее время считается, что перед выделением лейкоцитов, что характерно для воспалительных процессов, происходит активация интегринов, существенно выраженных на лейкоцитах, за которой следует тесное лиганд/рецепторное взаимодействие между интегринами (например, LFA-1) и одним из двух или обоими отдельными факторами межклеточной адгезии (ICAM), обозначенными ICAM-1 и ICAM-2, которые выражены на поверхностях эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и на других лейкоцитах. Как другие CAM, исследованные в настоящее время [например, васкулярная адгезивная молекула (VCAM-1), описанная в заявке PCT WO 90/13300, опубликованной 15 ноября 1990 г., и адгезивная молекула эндотелиальных клеток тромбоцита (PECAM-1), как описано в работе Newman et al., Science, 247: 1219-1222 (1990) и заявке PCT WO 91/10683, опубликованной 25 июля 1991 г.], ICAM-1 и ICAM-2 являются структурно гомологическими по отношению к другим элементам суперсемейства генов иммуноглобулина в том, что внеклеточная часть каждой из них содержит ряд доменов, разделяющих подобный карбоксиконцевой рисунок. "Типичный" иммуноглобулинподобный домен содержит петельную структуру, обычно прикрепленную посредством дисульфидной связи между двумя цистеинами на конце каждой петли. ICAM-1 включает пять иммуноглобулинподобных доменов; ICAM-2, который отличается от ICAM-1 распределением клеток, включает два таких домена; PECAM-1 - шесть; VCAM - шесть или семь, в зависимости от вариантов соединения, и т. д. Более того, CAM обычно включают гидрофобную "трансмембранную" область, которая, как считают, участвует в ориентации молекулы у поверхности клетки, и карбоксиконцевую "цитоплазматическую" область. Графические модели расположения CAM в действии обычно показывают молекулу, прикрепленную в клеточной мембране у трансмембранной области к цитоплазматическому концевому сегменту, проходящему в клеточную цитоплазму, и одной или более иммуноглобулиноподобных петель, выходящих за пределы поверхности клетки. Количество нейронных клеток выражает поверхностные рецепторы с внеклеточными Ig-подобными доменами, структурно схожими с ICAM. См., например, Yoshihara et al. В дополнение к Ig-подобным доменам многие адгезивные молекулы нервной системы также содержат тандемно повторяющиеся фибронектинподобные последовательности во внеклеточном домене. Использование в терапевтических целях факторов межклеточной адгезии было расширено вследствие способности ICAM-1 связывать "H"-риновирусы. Например, в европейской патентной заявке N 468257 A, опубликованной 29 января 1992 г., описывается развитие многочисленных конфигураций и форм ICAM-1 (включая полномерные и процессированные формы молекул), предложенных для достижения улучшенной лиганд/рецепторной связывающей активности, особенно при связывании с вирусами, лимфоцит-ассоциированными антигенами и патогенами, такими как Plasmodium falciparum. Подобным образом было расширено использование протеинов, иммунологически связанных с факторами межклеточной адгезии. Например, в заявке WO 91/16928, опубликованной 14 ноября 1991 г., описаны гуманизированные химерные антитела анти-ICAM-1 и их использование при лечении специфического и неспецифического воспаления, вирусной инфекции и астмы. Антитела анти-ICAM-1 и их фрагменты описаны как полезные при лечении эндотоксинового бактериально-токсического шока в заявке WO 92/04034, опубликованной 19 марта 1992 г. Ингибирование ICAM-1-эависимых воспалительных реакций антиидиотипическими антителами анти-ICAM-1 и фрагментами антител описано в заявке WO 92/06119, опубликованной 16 апреля 1992 г. Несмотря на значительные успехи, достигнутые при проникновении в сущность явлений клеточной адгезии в результате идентификации и исследования белков межклеточной адгезии, таких как ICAM-1, и взаимодействующих с лимфоцитами интегринов, таких как LFA-1, общая картина далека от завершенности. Обычно считают, что множество других белков участвует в воспалительных процессах и в направленном движении лимфоцитов в теле. Например, в патентных заявках США NN 07/827689, 07/889724, 07/894061 и 08/009266 и соответствующей опубликованной заявке PCT WO 93/14776 (опубликованной 5 августа 1993 г.) описано клонирование и экспрессия ICAM-ассоциированного белка, ICAM-R. Описания изобретений этих заявок частично включены как ссылочный материал в данную заявку, и ДНК и аминокислотные последовательности ICAM-R представлены в ней в SEQ ID N 4. Было обнаружено, что этот новый лиганд был выражен на человеческих лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах. Особый интерес для настоящей заявки представляет другой идентифицированный ICAM-подобный поверхностный фактор, тканевая специфическая экспрессия которого отличает его от других известных факторов ICAM. В работе Mori et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84: 3921-3925 (1987)] приводится идентификация антигена конечного мозга кролика, обладающего специфической иммунореактивностью с моноклональным антителом 271A6. Этот поверхностный антиген получил название теленцефалин. В работе Imamura et al. [Neurosci. Letts., 119: 118-121 (1990)] при использовании поликлонального антитела для определения локализованной экспрессии утверждалось, что экспрессия теленцефалина в зрительной зоне коры головного мозга кошек показывает изменение в слоях ткани, а также сообщалось, что экспрессия теленцефалина изменяется как функция развития. Затем в работе Oka et al. [Neuroscience, 35: 93-103 (1990)] сообщалось о выделении теленцефалина при использовании моноклонального антитела 271A6. В публикации сообщается, что молекулярная масса поверхностной молекулы около 500 kD и что молекула состоит из четырех субъединиц, каждая с нативной молекулярной массой 130 kD, и примерно 100 kD - последующая обработка N-глюканазой. В работе Yoshihiro et al. [Neuroscience, Research Supplement, 18, p. S83 (1994)] сообщается о кДНК и аминокислотных последовательностях для теленцефалина кролика на 17-й ежегодной встрече Японского неврологического общества в Нагойе, Япония, 7-9 декабря 1993 г., и на 23-й ежегодной встрече неврологического общества в Вашингтоне, 9 ноября 1993 г. [Society for Neuroscience Abstracts 19 (1-3), p.646 (1993)]. Установленная аминокислотная последовательность позволяла предположить, что теленцефалин с молекулярной массой 130 kD является интегральным белком мембраны с девятью внеклеточными иммуноглобулин(Ig)подобными доменами. Из них восемь периферических доменов показали гомологию к другим Ig-подобным доменам ICAM. Такие же данные содержатся в работе Yoshihara et al., Neuron 12: 543-553 (1994). Таким образом, возникла необходимость в выявлении дополнительных белков, участвующих в межклеточных взаимодействиях человеческого организма, и, в особенности, необходимость в информации, служащей для специфической идентификации и исследования таких белков в том, что касается их аминокислотной последовательности. Более того, исходя из факта, что такие молекулы могут образовать основу для развития терапевтических и диагностических средств, важно, чтобы получила разъяснение кодирующая их ДНК. Такая конструктивная информация обеспечила бы, между прочим, крупномасштабное производство белков, позволила бы идентифицировать клетки, продуцирующие их естественным путем, и подготовить антитела или другие новые связывающие белки, специфически реактивные с ними и/или тормозящие лиганд/рецепторные связывающие реакции, в которых они задействованы. В одном из этих аспектов настоящее изобретение направлено на получение очищенных и выделенных полинуклеотидов (например, последовательностей ДНК, транскриптов РНК и их десенсибилизирующих олигонуклеотидов), кодирующих новый полипептид, ICAM-4, а также его полипептидные варианты (включая фрагменты и аналоги делеции, замены и присоединения), которые воспроизводят одну или более лиганд/рецепторные связывающие биологические активности и/или иммунологические свойства, характерные для ICAM-4. Присущие ICAM-4 лиганд/рецепторные связывающие биологические активности включают в себя взаимодействия как внеклеточных, так и цитоплазматических доменов ICAM-4 с другими молекулами (например, в процессе межклеточной адгезии и/или сигнальной трансдукции). Предпочтительные последовательности ДНК по настоящему изобретению включают геномные и кДНК-последовательности, а также последовательности полностью или частично химически синтезированных ДНК. Предпочтительный в настоящее время полинуклеотид представлен в SEQ ID N 1 и кодирует крысиный видовой ICAM-4. Рассматриваются биологические реплики (т.е. копии выделенных последовательностей ДНК, осуществленных in vivo или in vitro) последовательностей ДНК по данному изобретению. Также рассматриваются автономно реплицирующиеся рекомбинантные конструкции, такие как векторы плазмиды и вирусной ДНК, включающие последовательности ICAM-4 и, особенно, векторы, в которых ДНК, кодирующая ICAM-4 или вариант ICAM-4, соединена в действии с ДНК-последовательностью контроля эндогенной или экзогенной экспрессии. В соответствии с другим аспектом изобретения клетки-хозяева, особенно одноклеточные клетки-хозяева, такие как прокариотические или эукариотические клетки, устойчиво трансформируются последовательностями ДНК по данному изобретению таким образом, чтобы в них были выражены нужные полипептиды. Клетки-хозяева, выражающие такие продукты ICAM-4 и вариантов ICAM-4, могут использоваться в самых различных целях. В той степени, в какой выраженные продукты "отображены" на поверхностях клеток, клетки могут образовывать полезный иммуноген для развития антител, специфически иммунореактивных с ICAM-4 и вариантами ICAM-4. Клетки-хозяева по данному изобретению очень полезны в способах крупномасштабного получения ICAM-4 и вариантов ICAM-4, где клетки выращиваются в соответствующей культурной среде и нужные продукты полипептида выделяются из клеток или из среды, в которой выращиваются клетки. Новые ICAM-4 по данному изобретению могут быть получены как изоляты из источников естественных клеток, но, наряду с продуктами вариантов ICAM-4, их предпочтительно получают посредством рекомбинантных методов с участием клеток-хозяев по данному изобретению. Предпочтительная в настоящее время аминокислотная последовательность для полипептида IСAM-4 представлена в SEQ ID N 2. Продукты могут быть получены в полностью или частично гликозилированной, частично или полностью дегликозилированной или негликозилированной форме, в зависимости от клетки-хозяина, выбранной для рекомбинантного получения и/или процессирования после выделения. Варианты ICAM-4 по данному изобретению могут содержать водорастворимые или нерастворимые мономерные, мультимерные или циклические фрагменты ICAM-4, которые включают все или часть одной или более областей доменов, описанных выше и имеющих биологическое или иммунологическое свойство ICAM-4, включая, например, способность связываться со связывающим партнером ICAM-4 и/или ингибировать связывание ICAM-4 с естественным связывающим партнером. Варианты ICAM-4 по данному изобретению могут также содержать аналоги полипептида, в которых одна или более определенных аминокислот исключается или заменяется: (1) без утраты и преимущественно с улучшением одной или более биологических активностей или иммунологических характеристик, специфических для ICAM-4, или (2) с конкретной утратой определенной функции лиганд/рецепторного связывания. Рассматриваются аналогичные полипептиды, включая дополнительные аминокислотные (например, лизина или цистеина) остатки, которые облегчают мультимерное образование. В настоящем изобретении рассматриваются также антитела (например, моноклональные и поликлональные антитела, фрагменты антител, антитела простой цепи, химерные антитела, антитела с транслантированным CDR и т.п.) и другие связывающие белки (например, полипептиды и пептиды), которые являются специфическими (т.е. нереактивными с факторами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R, которым ICAM-4 структурно близок) для ICAM-4 или вариантов ICAM-4. Изобретение затрагивает также клеточные линии гибридомы, которые выделяют моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением. Предпочтительными гибридомами по данному изобретению являются 127A, 127H, 173E, 179I и 179H. Антитела могут быть развиты при использовании выделенных естественных или рекомбинантных ICAM-4 или вариантов ICAM-4, или клеток, выражающих такие продукты на их поверхностях. Связывающие белки по данному изобретению дополнительно используются для исследования структур(ы) связывающего сайта (например, эпитопов и/или восприимчивости связывающих свойств к модификациям в аминокислотной последовательности ICAM-4). Связывающие белки используются, в свою очередь, в составах для иммунизации, а также для очистки полипептидов по данному изобретению и идентификации клеток, воспроизводящих полипептиды на их поверхностях. Они также используются при модулировании (в т.ч. блокировании, торможении или стимулировании) лиганд/рецепторных связывающих биологических активностей с участием ICAM-4, в особенности тех эффекторных функций ICAM-4, которые связаны со специфическими и неспецифическими ответами иммунной системы. Рассматриваются также антиидиотипические антитела, специфические для антител анти-ICAM-4, и применение таких антиидиотипических антител в модулировании иммунных ответов. При анализе для обнаружения и количественного определения ICAM-4 на поверхностях клеток и в жидкостях организма, например в серозной или цереброспинальной жидкостях, может быть использовано, например, единственное антитело или множество антител в форме многослойного иммуносэндвича. При обнаружении ICAM-4 в жидкости организма антитела по данному изобретению также используются для анализа проявления невропатологий, которые могут соотноситься с повышенными уровнями циркулирующего ICAM-4. Такие нейропатологии включают (но не ограничиваются) церебральную ишемию (т.е. приступ), являющуюся результатом различных нарушений, включающих, например, тромбоз, эмболию и т.п. Очевидна научная ценность информации, полученной при раскрытии сущности ДНК- и аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению. Как показано на ряде примеров, знание последовательности кДНК для ICAM-4 делает возможным выделение, посредством гибридизации ДНК/ДНК, последовательностей геномных ДНК, кодирующих ICAM-4, и определение регуляторных последовательностей контроля экспрессии ICAM-4, таких как промоторы, операторы и т.п. Ожидается, что методы гибридизации ДНК/ДНК, осуществляемые при помощи последовательностей ДНК по данному изобретению и при соблюдении жестких условий, позволят выделять ДНК, кодирующие аллельные варианты ICAM-4, другие структурно родственные белки, обладающие одним или более биологическими и/или иммунологическими свойствами, специфическими для ICAM-4, и белки, гомологичные ICAM-4, из других видов. ДНК по данному изобретению используются при анализе гибридизации ДНК/РНК для определения способности клеток к синтезированию ICAM-4. Данным изобретением обеспечивается также наличие десенсибилизирующих полинуклеотидов, релевантных регулированию экспрессии ICAM-4 такими клетками, которые первоначально выражали то же самое. Как видно из другого ряда примеров, знание ДНК- и аминокислотных последовательностей ICAM-4 делает возможным образование посредством рекомбинантных средств вариантов ICAM-4, таких как гибридные слитые белки (которые иногда относят к "иммуноадгезивам"), характеризующиеся наличием последовательностей белков ICAM-4 и константных областей тяжелых цепей иммуноглобулина и/или шарнирных областей. [См. Capon tn al. , Nature, 337: 525-531 (1989); Ashkenazi et al., P.N.A.S.(USA), 88: 10535-10539 (1991) и заявка PCT WO 89/02922, опубликованная 6 апреля 1989 г. ] Слитые белки могут также включать, например, выбранные внеклеточные домены ICAM-4 и части других факторов клеточной адгезии. ДНК по настоящему изобретению также позволяет осуществлять идентификацию нетранслированных последовательностей ДНК, которые специфически стимулируют экспрессию полинуклеотидов, соединенных в действии с промоторными областями. Идентификация и использование таких промоторных последовательностей особенно желательны в случаях, например, переноса генов, который может требовать конкретно гетерогенной экспрессии в ограниченной нейронной среде. В изобретении также рассматриваются векторы, содержащие промоторы по данному изобретению, а также конструкции рекомбинантных генов, в которых промотор по данному изобретению связан в действии с гетерогенной полинуклеотидной последовательностью и сигналом терминации транскрипции. Информация о ДНК- и аминокислотных последовательностях, полученная в соответствии с данным изобретением, также дает возможность систематического анализа структуры и функции ICAM-4 и определения тех молекул, с которыми он будет взаимодействовать на внеклеточном и внутриклеточном уровнях. Идиотипы моноклональных антител ICAM-4 по настоящему изобретению характерны для таких молекул и могут имитировать естественные связывающие белки (пептиды и полипептиды), посредством которых модулируются межклеточные и внутриклеточные активности ICAM-4, или при помощи которых ICAM-4 модулирует межклеточные и внутриклеточные явления. В альтернативном варианте они могут представлять новые классы модуляторов активностей ICAM-4. Антиидиотипические антитела, в свою очередь, могут представлять новые классы биологически активных эквивалентов ICAM-4. Анализ in vivo для идентификации антител или других соединений, которые модулируют активность ICAM-4, может включать, например, иммобилизацию ICAM-4 или естественного лиганда, с которым связан ICAM-4, маркирование при выявлении неиммобилизированного связывающего партнера, совместное инкубирование связывающих партнеров и определение влияния соединения, полученного при исследовании, на величину границы метки, когда уменьшение границы метки в присутствии полученного соединения, по сравнению с величиной границы метки в отсутствие полученного соединения, указывает на то, что испытываемое вещество является ингибитором связывания ICAM-4. Информация о последовательностях ДНК, полученная в соответствии с данным изобретением, делает также возможным развитие посредством гомологической рекомбинации или принципа ударной сепарации частиц [см. Kapecchi, Science, 244: 1288-1292 (1989)] родентов, которые не могут выражать белок функционального ICAM-4 или которые выражают белок вариантного ICAM-4. Такие роденты используются как модели для изучения активностей ICAM-4 или модуляторов ICAM-4 in vivo. В описание включены ссылки на родовую патентную заявку США N 08/102852, поданную 5 августа 1993 г. Примеры этой заявки касаются, в числе прочего, следующего: разработка и конструкция олигонуклеотидных зондов для PCR-амплификации ICAM-ассоциированных ДНК; использование зондов для амплификации геномного фрагмента человека, гомологичного, но отличающегося от ДНК, кодирующих ICAM-1 и ICAM-2; скрининг библиотек кДНК с геномными фрагментами для выделения дополнительных кодирующих ICAM-R последовательностей; скрининг библиотек кДНК для выделения полномерной последовательности человеческой кДНК, кодирующей ICAM-R; исследование информации о ДНК- и аминокислотных последовательностях для ICAM-R, особенно в отношении ICAM-1 и ICAM-2; развитие клеток-хозяев млекопитающего, выражающих ICAM-R; оценка указаний об участии ICAM-R в явлениях адгезии с участием CD18-зависимых и CD18-независимых путей; подавление клеточной адгезии с ICAM-R посредством извлеченных из ICAM-R пептидов; экспрессия вариантов ICAM-R; подготовка и исследование антител анти-ICAM-R и их фрагментов; картирование эпитопов ICAM-R, распознанных моноклональными антителами анти-ICAM-R; оценка распределения и биологическое исследование ICAM-R и РНК, кодирующих одно и то же; оценка ICAM-R в гомотипической межклеточной адгезии и иммунной клеточной активации/пролиферации; исследование моноклональных антител ICAM-R; оценка различных фосфориляционных и цитоскелетных ассоциаций цитоплазматического домена ICAM-R. Также была описана идентификация кодирующей родентный ICAM ДНК, которая оказалась на этот раз крысиным гомологом человеческого ICAM-R, и использование этой ДНК для конструирования и выражения ДНК, кодирующих слитые белки глутатион-S-трансферазы. Подробное описание идентификации этой родентной ДНК можно найти в родовой заявке (U. S.S. N 08/102852) в примере 6, и оно воспроизводится здесь в примере 1. Когда были идентифицированы другие последовательности, кодирующие родентный ICAM, стало очевидно, что ДНК родентного ICAM не кодирует крысиный гомолог человеческого ICAM-R, но, фактически, кодирует новый полипептид ICAM, названный ICAM-4. Чтобы оценить явления, которые привели к идентификации ICAM-4, соблюдается хронология, сопровождаемая детальным описанием изобретения. Была идентифицирована первая последовательность родентного геномного ICAM-4, которая кодировала область, гомологичную домену 2 (здесь SEQ ID N 3 и SEQ ID N 23 в U.S.S. N 08/102852) человеческого ICAM-R (здесь SEQ ID N 4). Была также идентифицирована вторая, перекрывающая геномная ДНК (здесь SEQ ID N 5 и SEQ ID N 26 в U.S.S. N 08/102852), которая кодировала как область домена 2 в соответствии с SEQ ID N 3, так и последовательности для ICAM-1. Используя SEQ ID N 3 как зонд, была идентифицирована родентная кДНК селезенки (здесь SEQ ID N 6, SEQ ID N 25 U.S.S. N 08/102852), которая кодировала домены 2-5, а также пятый домен, ранее не наблюдавшийся как домен ICAM. На этот раз вновь идентифицированные родентные ДНК кодировали родентный гомолог человеческого ICAM-R, однако сравнительный анализ 3" областей этих ДНК с другими ICAM оказался затруднительным. Последующее выделение клона ДНК в 1 kb из библиотеки крысиной селезенки и амплификация фрагмента RT-PCR показали, что часть как клонов кДНК, так и геномных клонов не были секвенированы. Другой продукт амплификации RT-PCR (SEQ ID N 7) подтвердил это. Было установлено, что фрагмент из 177 bp был удален из геномных клонов и клонов кДНК посредством EcoRI-гидролиза клонов, чтобы выделить эти последовательности из![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155120/955.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155120/955.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155028/945.gif)
CCATAAGCTTTATTCCACCGTGACAGCCAC (SEQ ID N 15)
Сравнительный анализ этих двух ДНК ясно показал, что в клонах ДНК и геномном был утерян фрагмент перед секвенированием; это предположение нашло дальнейшее подтверждение в ходе секвенирования ДНК RT-PCR (описано ниже). Был сделан вывод, что гидролиз с EcoRI для удаления кДНК- и геномного фрагментов перед секвенированием имел своим результатом удаление фрагмента из 177 bp, который не был определен визуально при выделении клонов агарозным гелем из последовательностей
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155120/955.gif)
(В полностью выделенном продукте RT-PCR (SEQ ID N 7, приведенная ниже) праймер RRD2 3-1 соответствовал нуклеотидам 719-736). Подобным образом, различные 3" десенсибилизирующие праймеры спаривались с 5" праймером, комплементарным другой внутренней кодирующей последовательности; 5" праймер в этих реакциях был обозначен RGen3900S и представлен в SEQ ID N 17. ACGGAATTCGAAGCCATCAACGCCAGG (SEQ ID N 17)
(В SEQ ID N 7 праймер RGen3900S соответствовал нуклеотидам 1719-1736.) На основе размера продуктов амплификации и способности этих продуктов к гибридизации с частичным клоном кДНК, одна пара праймеров была определена как наиболее эффективная, и она была использована в последующих амплификациях PCR. Праймер 5" был обозначен RGen 780S (SEQ ID N 18) и праймер 3" был обозначен RGen 4550AS (SEQ ID N 19). CATGAATTCCGAATCTTGAGTGGGATG (SEQ ID N 18)
ATAGAATTCCTCGGGACACCTGTAGCC (SEQ ID N 19)
(В SEQ ID N 7, приведенной ниже, праймер RGen780S соответствовал нуклеотидам 1-18, а праймер RGen4550AS соответствовал нуклеотидам 2197-2214.)
Эта пара праймеров была использована в PCR при различных условиях для оптимизации амплификации. Все 15 различных буферов PCR, которые варьировались в концентрации pH и Mg++, были использованы при двух различных температурах отжига, и образец продукта каждой реакции был разделен на 1% агарозном геле. Так как никакой продукт амплификации не мог быть определен при визуальном осмотре окрашенного этидным бромидом геля при любых условиях реакции, была применена более чувствительная саузерн-гибридизация для определения продуктов PCR. Слои амплифицированной ДНК были разделены электрофорезом, перенесены на Hybond+ найлоновую мембрану при использовании обычных методов саузерн-блоттинга и гибридизированы с полной крысиной кДНК, которая была [32P]-меченой. Условия гибридизации были, в основном, такими, как описанные выше для метода скрининга библиотеки в Секции A. Авторадиография показала, что небольшое количество ДНК (приблизительно 2,2 kb) было получено в двух из этих реакций, а остальной продукт амплификации от этих двух реакций был разделен на агарозном геле. Область из 2,2 kb была выделена из геля, хотя при визуальном осмотре никакого бэнда не было заметно, и использована как темплат в другой реакции PCR с применением тех же праймеров (SEQ ID N 18 и 19), буфера Tris-HCl, pH 8,0, с содержанием 1 mM Mg++, и при температуре отжига 55oC. Продукт амплификации после вторичной PCR был видимым в геле, и он был выделен и клонирован в плазмиду pBS+ (Stratagene, La Jolla, CA) для анализа последовательности. Было определено, что полученный в результате PT-PCR клон содержал 2214 bp, как представлено в SEQ ID N 7. Клон кодировал домены 2-6, обнаруженные в клоне кДНК крысиной селезенки, дополнительный аминоконцевой домен 1, дополнительный карбоксиконцевой домен 7 и 164 bp, которые оказались еще одним карбоксиконцевым доменом 8. Непосредственно 5" к домену 1 была дополнительная последовательность из 144 bp, предположительно, извлеченная из интрона между лидерной последовательностью и первым доменом. Этот клон не содержал 5" лидерную последовательность или 3" трансмембранную и цитоплазматическую области. В дополнение к предварительно идентифицированному домену 6 в клоне кДНК селезенки 7-й и 8-й домены в клоне RT-PCR подтвердили гипотезу о том, что этот клон был новым родентным ICAM. ПРИМЕР 2. Анализ методом назерн-блоттинга. Для дальнейшего исследования возможности того факта, что ICAM-ассоциированные клоны, идентифицированные в примере 1, кодировали новый полипептид ICAM, как предполагалось по уникальным Ig-подобным доменам, тканевая специфическая экспрессия была обследована при помощи метода назерн-блоттинга для возможности сравнения с ранее известными типами экспрессии человеческих ICAM. [ICAM-1, Dustin et al. , J.Immunol., 137: 245-254 (1986); ICAM-2, Staunton et al. , Nature, 339: 61-64 (1989); ICAM-R, de Fourgerolles and Springer, J.Exp.Med., 174: 185-190(1992)]. Полная клеточная РНК из крысиных легкого, головного мозга, спинного мозга, печени, пищеварительного тракта, вилочковой железы, лимфатических узлов и селезенки была приготовлена с использованием реагентов выделения РНК STAT60 (Tel-test "B", Inc. Friendswood, Texas) в соответствии с протоколом, предложенным предводителем. Поли- A+ РНК была очищена от полной РНК с использованием колонок с олиго-dT-целлюлозой. Приблизительно 5 мкг РНК, извлеченной из каждой ткани, было разделено на 1% формальдегидном агарозном геле и перенесено на hybond-C нитроцеллюлозные мембраны (Amersham). Фрагмент кДНК крысиной селезенки из примера 1, соответствующий доменам 2-4 (нуклеотиды 1-724 в SEQ ID N 6), был субклонирован в pBluescript SK+ (Strategene), и десенсибилизирующий рибозонд был образован посредством транскрипции in vitro с использованием [32P]-меченого UTP и приблизительно 500 ng линеаризированного темплата в соответствии с протоколом, предложенным производителем (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Связанная с мембраной РНК была предварительно гибридизирована в растворе, содержащем 50% формамида, 5X SSC, 1X PE (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% пирофосфата натрия, 0,2% поливинилпирролидона, 0,2% фиколла, 5 mM EDTA, 1% SDS) и 150 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Меченный радиоактивным изотопом зонд был денатурирован при кипении и добавлен к раствору предгибридизации до окончательной концентрации 1
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155017/183.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155120/955.gif)
Продукт амплификации, полученный от этой пары праймеров, был затем подвергнут вторичной PCR с использованием того же праймера 5" набора, спаренного с 3" праймером, комплементарным области в домене 1 ICAM-4. Второй 3" праймер был обозначен RRACE2 и представлен в SEQ ID N 21. TATGAATTCAGTTGAGCCACCAGCGAGC (SEQ ID N 21)
Каждый праймер, использованный во вторичной PCR, содержал сайт EcoRI для облегчения клонирования полученных продуктов амплификации в pBS (Stratagene). Полученная плазмидная ДНК, которая содержала 5" конец гена, была идентифицирована гибридизацией к зонду доменов 1 и 2 крысиного ICAM-4, соответствующему нуклеотидам 1-736 в SEQ ID N 7. Информация о частичной последовательности для домена 1 и гидрофобной лидерной последовательности была определена из полученного продукта амплификации. Продукт, полученный методом 5" RACE, был фрагментом ДНК длиной 222 bp, содержащим 60 bp в обратном направлении от инициирующей метиониновой группы, лидерную последовательность из 82 bp и последовательность из 80 bp из домена 1. Продукт амплификации представлен в SEQ ID N 11. C. Полномерная последовательность крысиного ICAM-4. Композиционный клон полномерного ICAM-4 был сконструирован при помощи информации последовательности, полученной из метода 5" RACE (SEQ ID N 11), клона RT-PCR (SEQ ID N 7) и клона 7 кДНК головного мозга (SEQ ID N 10). Было определено, что полномерный ген крысиного ICAM-4 содержит 2985 bp с единственной открытой рамкой считывания, кодирующей установленный белок аминокислоты 917. Предполагаемая последовательность Козака расположена в обратном направлении от метиониновой группы в лидерной последовательности. Гидрофобная лидерная последовательность аминокислоты 27 сопровождается девятью Ig-подобными доменами, трансмембранной областью и цитоплазматическим концевым сегментом аминокислоты 58. кДНК композиционного ICAM-4 представлена в SEQ ID N 1, а установленная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID N 2. Как другие полипептиды ICAM, ICAM-4 содержит внеклеточные, трансмембранные и цитоплазматические домены. Во внеклеточном домене амино-конец ICAM-4 является лидерной последовательностью, содержащей аминокислоты 1-27, которая сопровождается девятью иммуноглобулин(Ig)подобными доменами; это признак, свойственный только ICAM-4, так как ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R содержат пять, два и пять внеклеточных Ig-подобных доменов соответственно. В ICAM-4 домен 1 содержит аминокислоты 28-118; домен 2 содержит аминокислоты 119- 224; домен 3 содержит аминокислоты 225-321; домен 4 содержит аминокислоты 322-405; домен 5 содержит аминокислоты 406-488; домен 6 содержит аминокислоты 489-569; домен 7 содержит аминокислоты 570-662; домен 8 содержит аминокислоты 663-742 и домен 9 содержит аминокислоты 743-830. В каждом домене характерная петельная структура сформирована посредством дисульфидной связи между цистеиновыми группами, расположенными обычно на противоположных концах аминокислотной последовательности домена. Другие структурные признаки ICAM-4 включают трансмембранную область, содержащую аминокислоты 831-859, и цитоплазматическую область, содержащую аминокислоты 860-917. Сравнение гомологии аминокислотной последовательности каждого домена в крысином ICAM-4 с другими членами семейства ICAM было ограничено соответствующими последовательностями человеческого ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R, так как информация последовательности для всех трех родентных гомологов не была ранее известна. В первом домене родентный ICAM-4 показывает 21-, 30- и 28-процентную идентичность с человеческим ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R соответственно. Второй домен более консервативен и имеет 60-, 42- и 62-процентную идентичность с ICAM-1, -2 и -3 соответственно. Домены 3-5 показывают процентную идентичность 48, 49 и 50 с ICAM-1 и 60, 59 и 29 соответственно для ICAM-R. Интересно, что домены 6-8 крысиного ICAM-4 являются более гомологичными с доменом 5 (идентичность которого находится в диапазоне 29-42%), что, возможно, является следствием явления дупликации сегмента гена. Девятый и последний внеклеточный домен слабо сравним с другими доменами ICAM, но имеет 22-процентную идентичность с 3-м и 6-м доменами человеческого VCAM-1, другого члена Ig-семейства белка, который участвует в клеточной адгезии. Цитоплазматический концевой сегмент имеет длину 58 аминокислот. Он длиннее, чем другие члены семейства ICAM, в котором человеческие ICAM-1, -2 и -3 содержат 28, 26 и 37 аминокислот соответственно. Что касается девятого домена, цитоплазматический концевой сегмент крысиного ICAM-4 является наиболее гомологичным с цитоплазматическим концевым сегментом человеческого VCAM-1, который содержит только 19 аминокислот. Расположенные ближе к центру мембраны 19 аминокислот крысиного ICAM-4 разделяют 7 аминокислотных остатков с VCAM-1 (37%). Наконец, функциональное связывание карт LFA1 (CD11a/CD18) с первым доменом в ICAM. В работе Vonderheide et al. [J.Cell Biol., 125: 215-222 (1994)] идентифицирован рисунок последовательности, предположительно имеющий место в связывании интегрина. Несмотря на относительно низкую гомологию между крысиным ICAM-4 и другими ICAM в домене 1, этот рисунок последовательности связывания сохранился, что дает возможность предположить, что крысиный ICAM-4 может быть лигандом для LFA-1 и, возможно, других интегринов. ПРИМЕР 4. Гибридизация in situ в ткани головного мозга. Чтобы локализировать специфическую ткань головного мозга, которая выразила ICAM-4, была применена гибридизация in situ с десенсибилизирующими рибозондами домена 1 ICAM-4 и доменов 3-4 ICAM-4. Зонды были мечены посредством транскрипции in vitro с использованием 35S-меченого UTP. Замороженные срезы ткани обычного крысиного мозга были зафиксированы в 4% параформальдегиде в течение 20 минут, промыты и дегидрированы, и фиксированная РНК была денатурирована в течение двух минут в 2X SSC, 70% формамиде при 70oC перед гибридизацией. Срезы ткани были гибридизированы на протяжении ночи при 50oC в растворе, содержащем 50% формамид, 0,3 М NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 10% декстрансульфат, IX Denhardt, 0,5 mg/ml РНК дрожжей, 100 mM DTT и концентрацию зонда 50000 cpm/
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155063/956.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155017/183.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155017/183.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155017/183.gif)
TGCAGTGTCTCCTGGCTCTGGTTC (SEQ ID N 23)
Два клона, обозначенные 1566 и 1567, были идентифицированы и подвергнуты дальнейшему анализу. Оба клона P1 содержали приблизительно 75-95 kb вставок геномной ДНК. Клоны были гидролизированы BamH1, отделены электрофорезом агарозного геля и блотированы на найлоновые мембраны. Саузерн-блоттинг был выполнен либо с низкой степенью точности (30% формамид), либо с высокой степенью точности (60% формамид) при 42oC с меченными радиоактивными изотопами зондами человеческого ICAM-1, ICAM-3 или крысиного ICAM-4; другие компоненты раствора гибридизации были теми же, что описаны в примере 1. При гибридизации с низкой степенью точности была осуществлена промывка при комнатной температуре в 2X SSPE, содержащем 0,1% SDS. При гибридизации с высокой степенью точности была осуществлена промывка при 65oC в 0,2X SSPE, содержащем 0,1% SDS. Промытые мембраны были подвергнуты воздействию рентгеновской пленки в течение 3,5 часов. Различные виды гибридизации показали, что человеческий ICAM-1 содержался на фрагменте BamH1 в 5,5 kb, тогда как человеческий ICAM-3 был расположен на фрагментах BamH1 в 4,0 kb и 1,5 kb. Фрагменты человеческого ICAM-1 и ICAM-R были субклонированы в pBS+, и их идентичность подтвердилась при анализе ограниченной последовательности. Фрагмент BamH1 в 7,0 kb, который гибридизировал с крысиным ICAM-4 в условиях высокой степени точности, был субклонирован и подвержен дальнейшему фрагментированию гидролизом рестрикции RsaI. Три фрагмента RsaI, которые гибридизировали с крысиным ICAM-4, были идентифицированы, и их последовательности определены. Основанные на гомологии крысиному ICAM-4 эти фрагменты содержали домены 2, 3, 4, 5 и часть домена 6. ПРИМЕР 11. Клонирование кДНК человеческого ICAM-4. Фрагменты геномной ДНК, соответствующие доменам 2-5 человеческого ICAM-4 (описанного в примере 10), были использованы в качестве зондов для скрининга библиотеки кДНК человеческого гиппокампа
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155063/956.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155120/955.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155050/946.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155050/946.gif)
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155050/946.gif)
GTACTTACAGGATCCGCGGTCTCGCAGGCCCTTCTGGGCGGACCTACAGCCTGCGTGGCGTTC
H14-D3(AS) (SEQ ID N 30)
ATTTCTCTCGAGGATGGTCACGTTCTCCCGG
H14-D4(S) (SEQ ID N 31)
ATTTCTGGATCCTACAGCTTCCCGGCACCACTC
H14-D8(AS) (SEQ ID N 32)
ATTTCTCTCGAGTTCCACGCCCACAGTGACGG
Реакции PCR проводились в объеме 50 мкл с использованием буферов, предоставленных Perkin Elmer с энзимом AmpliTaq. Праймеры были добавлены к окончательной концентрации 10 мкг/мл, и все четыре dNTP были включены при 2 mM. Реакции продолжались на протяжении 30 циклов денатурирования (94oC в течение 4 минут), отжига (50oC в течение 2 минут) и удлинения (72oC в течение одной минуты). Продукты PCR были видимыми на агарозном геле, и слой каждой реакции был использован для субклонирования продуктов PCR в вектор pCRII (Invitrogrn, SanDlego, CA). Был проведен анализ последовательности, чтобы определить возможные погрешности в результате процесса амплификации и подтвердить нужную ориентацию. Соответствующие клоны были гидролизированы с BamHI и XhoI, и фрагменты выделены посредством электрофореза агарозного геля. Очищенные фрагменты были лигитированы в вектор pDCSI, предварительно гидролизированный с BamHI и XhoI, и полученные в результате плазмиды были секвенированы для подтверждения должной ориентации и рамки считывания. Белки слияния доменов 1-3 и 4-8 человеческого домена и IgG1 были получены после переходной трансфекции плазмидов экспрессии в клетки COS7 и выделения секретированного белка из культурной среды. Трансфекция проводилась следующим образом. Адгезивные клетки COS7 при приблизительно 50-60% слиянии были промыты при помощи CMF-PBS и затем соединены с 10-15 мкг плазмидной ДНК в 7,5 мл не содержащей сыворотки среды MDEM (Gibco, Gaithersburg, MD), включающей 6 мкл 0,25 M хлорохина (Sigma, St. Louis, MO). Было добавлено дополнительно 7,5 мл не содержащей сыворотки среды, включающей 150 мкл DEAE декстрана (50 мг/мл) (Sigma, St. Louis, MO), и планшеты инкубировали 2-3 часа до того, как среда была удалена и замещена на 10% DMSO (Mallinckrodt, McGaw Park, Illinois) в PBS. После одноминутной инкубации раствор DMSO был удален и замещен свежей средой, содержащей 5% FBS. Каждая трансфекция включала множество планшетов, и среды из клеток, выражающих один и тот же белок, были объединены для выделения белка. Среды собирались каждые три дня на протяжении курса из 3-4 сборов. Белки были очищены с использованием 0,4-0,8 мл Procep A колонки (Bioprocessing Ltd, England), предварительно уравновешенной 35 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5. Культурная среда помещалась на колонку два раза при низкой скорости, менее 60 объемов колонки в час. Колонка была промыта один раз при помощи 20 объемов колонки буфера Tris/NaCl, 20 объемов 0,55 М диэтаноламина, pH 8,5, и 20 объемов колонки 50 mМ лимонной кислоты, pH 5,0. Слитые белки были элюированы в 1 мл фракции с использованием 50 mM лимонной кислоты, pH 3,0, и каждая фракция была нейтрализована посредством 1/10 объема 1 М Tris, pH 9,5. Концентрация белков была определена посредством OD280, а чистота была определена при использовании SDS-PAGE. Было отмечено значительное загрязнение из бычьего IgG (присутствующего в FBS). Несмотря на то, что было прогнозировано меньшее количество слитого белка доменов 1-3, чем доменов 4-8, оба мигрировали при приблизительно 90 kD. Одно возможное объяснение этого наблюдения заключается в том, что меньшее количество слитого белка доменов 1-3 могло быть более гликозилировано, чем большее количество слитого белка доменов 4-8. В дополнение к использованию очищенных белков для получения моноклональных антител, как описано выше, белки могут быть также использованы при адгезивном анализе для идентификации лигандов ICAM-4. ПРИМЕР 14. Получение моноклональных антител. Очищенный белок, описанный в примере 13, был использован для получения моноклональных антител с использованием процедуры иммунизации, описанной в примере 6. Селезенка мыши #2250 (иммунизированной HuICAM-4 D1-3/IgG1) была использована для слияния 172 и селезенка мыши #2272 (иммунизированной HuICAM-4 D4-8/IgG1) была использована для слияния 173. Была использована процедура слияния, описанная в примере 6. Планшеты слияний были подвергнуты скринингу посредством ELISA (в основном, как описано в примере 6), с использованием каждого слитого белка HuICAM-4/IgG1. Супернатанты лунок слияния, которые распознали иммуногенный белок, и никакие другие, принимались во внимание для клонирования. Иммуноцитохимический анализ на срезах гиппокампа человека был использован как повторный скрининг. Один первоначальный клон из каждого слияния, был положительным при иммуноцитохимическом анализе и был клонирован. Один из двух клонов не смог развиться при клонировании, оставив только одного кандидата для достижения цели, клон 173E, который был извлечен из мыши, иммунизированной HuICAМ-4 D4-8/IgG1. Гибридома 173E была депонирована 1 июня 1995 г. Американской коллекцией типовых культур, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, и ей был присвоен каталожный номер HB11912. В другом слиянии, полученном из мыши, иммунизированной растворимым фрагментом ICAM-4, соответствующим доменам 1-3, были обнаружены шесть клонов (179A, 179B, 179D, 179H, 179I и 179K), специфических для доменов от 1 до 3 (D1-3) человеческого ICAM-4. Все шесть антител в серии 179 связаны с дендритными процессами в зубчатой извилине, а также полиморфическими и пирамидальными клеточными слоями. Моноклональное антитело 179A окрасило нейронные клеточные тела из этих областей в дополнение к дендритным процессам. Дополнительные слияния выполняются подобным образом, чтобы получить другие антитела, специфически иммунореактивные с определенными областями ICAM-4. ПРИМЕР 15. Проведение анализа методом улавливания. Шесть моноклональных антител из слияния 179 были исследованы в различных сочетаниях на их способность улавливать и выявлять растворимый ICAM-4 в растворах. Был проведен такой же анализ, как описанный выше, чтобы определить уровни растворимого ICAM-4 в жидкостях человека в здоровом и больном состояниях. Покрытие из антител 1791 было нанесено на 96 лунок планшетов с Immulon 4 (Dynatech) при 3 мкг/мл, 125 мкл в каждой лунке, на два часа при 37oC. Раствор антител был удален отсасыванием, и лунки были блокированы на 30 минут при комнатной температуре посредством 300 мкл блокирующего раствора, содержащего 5% желатин Teleostean в несодержащем кальция и магния PBS (CMF-PBS). Блокирующий раствор был удален отсасыванием, 100 мкл жидкости образца, разведенной в Omni-разбавителе (CMF-PBS, 1% желатин и 0,05% Tween 20), было добавлено в каждую лунку, и смесь инкубирована при 37oC в течение 30 минут. Планшеты были промыты три раза при помощи PBST (CMF-PBS, 0,05% Tween 20). Антитело 179H было биотинилировано при 1,5 мг/мл с использованием NHS-LC-Биотина (Pierce) в соответствии с протоколом предполагаемого производителя, разведено в соотношении 1:2000 и добавлено в лунки (100 мкл в лунку). Полученная смесь была инкубирована в течение 30 минут при 37oC, и планшеты промыты три раза в PBST. Стрептавидин-HRP (Pierce) был добавлен (100 мкл, 0,25 g/ml) в каждую лунку, и эта смесь инкубирована при 37oC в течение 30 минут. Планшеты были промыты четыре раза в PBST перед добавлением 100 мкл тетраметилбензидина (Sigma) (биомасса 10 мг/мл в DMSO), разбавленного 1:100 в забуференном субстрате (13,6 g/L тригидрат ацетата натрия, pH до 5,5, с 1 М лимонной кислоты, с 150 мкл/L 30% перекиси водорода, добавленной непосредственно перед развитием). Реакция развивалась в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего реакция была остановлена путем добавления 15% H2SO4 по 50 мкл в каждую лунку. Оптическая плотность прочитывалась при 450 nm. Результаты показали, что при помощи анализа можно определить рекомбинантный белок D1-3 растворимого HuICAM-4 при такой низкой концентрации, как 5-10 ng/ml, с линейной частью кривой в диапазоне 10-100 ng/ml. Не наблюдалось никакой перекрестной реактивности с HuICAM-4 D4-8, когда эта область белка была исследована при 1 и 10 мкг/мл. ПРИМЕР 16. Оценка растворимого ICAM-4 в сыворотке больных припадками. Для оценки роли ICAM-4 при неврологических болезнях и состояниях сыворотку двадцати восьми больных, страдающих тяжелыми припадками, и двадцати восьми молодых здоровых добровольцев (не подобранных соответственно по возрасту) подвергали анализу таким образом, как это описано выше, для выявления разницы в концентрации растворимого ICAM-4. Результаты показали, что сыворотка здоровых людей не содержала определяемого уровня ICAM-4. У двадцати из двадцати восьми больных были выявлены определяемые уровни растворимого ICAM-4. Сигнал от таких больных соответствовал диапазону 5-38 ng/ml норматива (рекомбинантный белок доменов 1-3 растворимого ICAM-4). ПРИМЕР 17. Уровни мРНК с ICAM-4 в гиппокампе в крысиной модели эпилепсии. Уровни выраженной мРНК с ICAM-4 были исследованы в гиппокампе крыс, которых обрабатывали таким образом, чтобы создать животную модель активизируемого эпилептогенезиса [Lothman et al., Brain Res., 360: 83-91 (1985)]. В этой модели гиппокамп крысы стимулировали серией субконвульсивных электрических ударов посредством электрода, имплантированного в области головного мозга, что постепенно приводило к сильным эпилептическим припадкам. Процесс активизации включает в себя двадцать стимуляций в день, проводимых через день на протяжении восьми дней. При полной активизации единственный раздражитель может вызывать эпилептические припадки и гистологические изменения, подобные тем, которые имеют место при эпилепсии у человека. Полностью активизированные крысы подвергались двум стимуляциям в день на протяжении двух недель, и после последней стимуляции животных умертвили. Гиппокамп был удален и рассечен для приготовления РНК. Полная РНК была приготовлена из каждого образца при использовании метода экстрагирования гуанидин/фенол/хлороформа [Chomezynski and Sacchi, Anal. Biochem. , 162: 156-159 (1987)]. РНК была отделена на денатурирующем формальдегидном агарозном геле, перенесена на найлоновые мембраны и гибридизирована с меченным радиоактивными изотопами зондом крысиной ICAM-4 и зондом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназной (GAPDH) специфичной ДНК. GAPDH является основным выраженным геном, который общеизвестен как контроль для выявления изменений от полосы к полосе в количестве РНК, помещенной на гель. Колебания в соотношении ICAM-4/GAPDH рассматривались как изменения в уровне экспрессии ICAM-4. Гибридизирующие бэнды для ICAM-4 и GAPDH были подсчитаны при помощи фосфорного формирователя изображения, и определено соотношение ICAM-4/GAPDH. Соотношение ICAM-4/GAPDH было значительно выше у контрольных животных, которые не подвергались стимуляции (n=5), по сравнению с группой животных, прошедших испытание (n=5), что позволяет предположить, что ICAM-4 снижался вследствие процесса активизации. Нужно, однако, отметить, что контрольная группа не подвергалась никакому стимулирующему воздействию, поэтому существует такая вероятность, что уровни мРНК с ICAM-4 были модулированы в ответ на хирургическое вмешательство в соединении с воздействием током. ПРИМЕР 18. Клонирование и анализ регуляторной ДНК обратного направления с человеческим ICAM-4. Экспрессия ICAM-4-гена является регулируемой в пространстве и времени, причем экспрессия ограничена самой передней или вентральной областью головного мозга, конечным мозгом. При попытке идентифицировать последовательности гена, ответственные за ограниченную транскриптивную регуляцию ICAM-4, нуклеотидная область от 5" до кодирующих последовательностей человеческого ICAM-4 была исследована. Фрагмент BamHI/PstI основной пары 2607, извлеченный из фрагмента геномного BamHI в 7,0 kb (описан в примере 10), был секвенирован и обнаружил содержание 1684 нуклеотидов в обратном направлении от старт-кодона ATG. Полная последовательность для этой области обратного направления представлена в SEQ ID N 33. Что касается положения кодирующей области ICAM-4, "A" в старт-кодоне ATG (пронумеровано в SEQ ID N 33 как нуклеотиды 1685-1687) обозначен +1 нуклеотид, а нуклеотид непосредственно 5" к A+1 нуклеотиду обозначен -1. Таким образом, вся последовательность показана простирающейся от нуклеотида -1684 до нуклеотида +3, соответствующих нумерации в Перечне последовательностей от нуклеотида 1 до нуклеотида 1687. На основе геномной последовательности HuICAM-4 олигонуклеотиды были синтезированы и использованы в PCR для получения молекул ДНК различной длины в пределах регуляторной области обратного направления. Каждый олигонуклеотид, представленный в табл. 3, содержал спейсерную область (выделено курсивом), приблизительно 6-10 bp, чтобы обеспечить ферментативный гидролиз продукта PCR, сайт рестрикции NheI или HindIII (выделено жирным шрифтом) и последовательность праймера специфичной гибридизации (подчеркнуто). Названия олигонуклеотидов содержат номера, которые обозначают их расположение в пределах регуляторной области обратного направления. В амплификациях PCR олигонуклеотиды были спарены, как показано в табл. 4, для получения фрагментов ДНК, содержащих специфичные области регуляторной области обратного направления. Сайты рестрикции и спейсерная область, образованная в каждом олигонуклеотиде, обеспечили ферментативный гидролиз и последующее прямое клонирование продуктов отдельной PCR в Основной Вектор pGL3 (Promega, Madison, WI), который содержит ген регистратора люциферазы непосредственно в прямом направлении сайта множественного клонирования (MCS). Промоторная активность, клонированная в область MCS вектора, приводит в действие экспрессию гена регистратора люциферазы в трансфецированных клеточных линиях, и легкая продукция из выраженной люциферазы может быть определена как индикатор промоторной активности. Основной вектор pGL3 не имеет промотора и поэтому служит в качестве отрицательного контроля, тогда как вектор pGL3, содержащий промотор SV40, служит в качестве положительного контроля. Последовательность конструкции каждой экспрессии была проверена посредством рестрикционного анализа и секвенирования ДНК. Плазмиды, содержащие каждую из амплифицированных последовательностей, описанных в табл. 4, были трансфецированы в клетки млекопитающего при использовании Набора для трансфекции млекопитающего при трансфекции MBS (Stratagene, La Jolla, CA) в соответствии с предложенной производителем схемой. Каждая плазмида была введена в две разные клеточные линии, клетки предшественников COS7 и NT2 (Ntera2/D1 из Stratagene). Клетки COS7 представляют собой обычно используемую линию фибробластподобных клеток обезьяны, трансформированную посредством SV40, что сделало их пригодными для приведения в действие экспрессии гена при контроле промотора SV40 в клетках, трансфецированных посредством промоторного вектора pGL3 положительного контроля. Клетки предшественника NT2 представляют собой клеточную линию коммитированных нейронных клеток-предшественников, и хотя они не выражают ICAM-4, они могут быть более характерными для типа клеток, который выражает ICAM-4. Каждая лунка 6-луночного планшета культуры ткани с плоским дном (Falcon) была засеяна 2,5
![способ скрининга невропатологии, патент № 2155345](/images/patents/316/2155017/183.gif)
Класс G01N33/557 с использованием кинетических измерений, те времени взаимодействия антиген-антитело
Класс C12N15/12 гены, кодирующие животные белки
Класс C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии
Класс C07K14/705 рецепторы; клеточные антигены; клеточные поверхностные детерминаторы