набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных
Классы МПК: | A61K39/118 Chlamydiaceae, например трахомы или пситтакозы G01N33/569 микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов |
Автор(ы): | Белоусов В.И., Клюкина В.И., Самуйленко А.Я., Груздев К.Н., Бирюков А.Г., Токарик Б.И., Ямникова С.С., Пономарев А.Б., Моисеев А.В. |
Патентообладатель(и): | Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности |
Приоритеты: |
подача заявки:
1998-06-02 публикация патента:
27.09.2000 |
Изобретение предназначено для биотехнологии и ветеринарии. Набор содержит специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из штамма 2-Т . Антиген представляет собой полисахаридно-белковый комплекс в рабочей концентрации 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера. Набор содержит также хламидийную (положительную) и нормальную (отрицательную) контрольные сыворотки в разведении 1: 50-1: 150 в инкубационном буфере и коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой. В состав набора включены калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, твин - 20, или твин - 40, или твин - 80, или тритон Х-305, лимонная кислотa, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа. Изобретение повышает чувствительность и специфичность иммунологической реакции, сокращает время для проведения диагностики и уменьшает расход антигена и сывороток. 2 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2
Формула изобретения
Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, отличающийся тем, что он содержит специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из штамма 2-Т, представляющий собой полисахаридно-белковый комплекс в рабочей концентрации 5 - 15 мкг/мл адсорбционного буфера, хламидийную (положительную) и нормальную (отрицательную) контрольные сыворотки в разведении 1 : 50 - 1 : 150 в инкубационном буфере, коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, твин-20, или твин-40, или твин-80, или тритон Х-305, лимонную кислоту, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.Описание изобретения к патенту
Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для широкомасштабной диагностики хламидиозов животных. Известен набор для диагностики хламидиоза животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), содержащий панели для постановки ИФА, антиген Chlamydia trachomatis, сорбированный на твердый носитель, хламидийную сыворотку, антивидовой коньюгат, субстрат для проведения пероксидазной реакции, буферные растворы, детергент (Твин и др.) и стоп-реагент (HCl) (US 4497899, G 01 N 33/54, опубл. 05.02.85). Однако указанный патент позволяет определять антигены Chlamydia trachomatis в клиническом материале и не позволяет определять антитела. Целью заявляемого изобретения является набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных путем выявления специфических хламидийных антител в сыворотках крови и другом клиническом материале. Указанная цель достигается тем, что в состав набора входят: специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из высокоиммуногенного производственного штамма 2-Т ВГНКИ, представляющий собой полисахаридно-белковый комплекс, обладающий группо- и видоспецифичностью, в рабочей концентрации 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера, хламидийная (положительная) и нормальная (отрицательная) контрольные сыворотки в разведении 1:50-1:150 в инкубационном буфере, коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, Твин-20, -40, -80 или Тритон Х-305, лимонная кислота, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки ИФА. В состав набора входят следующие биологические и химические компоненты:1. Специфический хламидийный антиген лиофилизированный из штамма 2-Т 1 ампула (фл. ), объем 1 см3, рабочее разведение 1:40, титр в ИФА не ниже 1: 320. 2. Хламидийная (положительная) сыворотка лиофилизированная 1 амп. (фл.), объем 1 см3, рабочее разведение 1:100, титр в ИФА не ниже 1:800. 3. Нормальная (отрицательная) сыворотка лиофилизированная 1 амп. (фл.), объем 1 см3, рабочее разведение 1:100
4. Антивидовой коньюгат лиофилизированный 1 амп. (фл.), объем 1 см3, рабочее разведение 1:40. 5. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, K2HPO4
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156001/183.gif)
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156001/183.gif)
Адсорбционный фосфатный буферный раствор предназначен для растворения и сорбции антигена в лунке панелей: 9,12 г K2HPO4
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156001/183.gif)
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156001/183.gif)
Известен способ получения хламидийного антигена для реакции непрямой флуоресценции (Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных. - ТУ 10.19.26-88 утв. ГУВ СССР 22.07.88), включающий культивирование хламидий в куриных эмбрионах, приготовление 20% маточной суспензии, гомогенизацию со стеклянными бусами, инактивацию азидом натрия и 0,1-0,15% формалином, выдерживание при 4oC в течение 72 часов. Однако известный способ позволяет получить антиген, обладающий низкой активностью и специфичностью для использования его в ИФА для определения антител. Обработка суспензии хламидий 0,1-0,15% концентрации формалина существенно снижает специфическую активность антигена, что уменьшает чувствительность ИФА. В заявляемом наборе хламидийный антиген готовят следующим образом: для этого 4-7-дневные куриные эмбрионы после заражения высокоиммуногенным штаммом 2-Т вскрывают, отделяют желточные мешочки и готовят 10% суспензию на физиологическом растворе, забуференном 0,01М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 и частично гомогенизируют. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком на аппарате типа УЗДН-21 мощностью 22 кГц циклично 10-12 раз по 15 секунд. После чего дезинтеграт центрифугируют при 10 тыс. об./мин в течение 25-30 минут. Образовавшийся средний слой (дебрис - нижний и липидный - верхний отбрасывают) переносят в колбу, добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,1% для консервации. Полученный таким способом антиген хламидий является полисахаридно-белковым комплексом следующего состава: 0,20 мг/мл белка, 0,017 мг/% липидов, 0,36 мг/мл сахара. Антиген смешивают со стабилизатором - 1% декстраном T -70 из расчета 1:1, разливают по 1 мл и лиофилизируют. Эффективность обработки ультразвуком в предложенном режиме исследовали шахматным титрованием исходного антигена с хламидийной сывороткой в ИФА (таблица 1). По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация хламидийного антигена 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера при разведении хламидийной сыворотки 1:50-1:150 в инкубационном буфере. 3. Приготовление контрольных сывороток. Известен способ получения сухих диагностических сывороток из крови овец (барана) для серологической диагностики в реакции РСК, РДСК (Патент СССР N 1711898, A 61 K 39/02, 39/18, G 01 N 33/531 "Способ получения хламидийного антигена для реакции непрямой флуоресценции", Бюл. N 6 от 15.02.92). Способ заключается в том, что сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют на водяной бане при 60oC 25 мин. Затем сыворотку консервируют 2% борной кислотой из расчета 2 г борной кислоты на 100 см3 сыворотки, разливают по 1 см3 и лиофилизируют. Существенным недостатком лиофилизированных сывороток крови овец, полученных данным способом, является их неполная растворимость и образование хлопьев, для удаления которых требуется дополнительное центрифугирование. Указанные недостатки уменьшают объем сыворотки и снижают активность и специфичность хламидийных сывороток. Образование труднорастворимых хлопьев связано с образованием комплекса липидов с сывороточными белками в процессе лиофилизации. Известно, что сыворотки крови многих животных содержат большое количество липопротеидов низкой плотности. В заявляемом наборе хламидийную сыворотку крови от каждого вида животных (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др. ) отделяют от сгустка, осветляют, центрифугируют в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют при 60oC 25 мин и охлаждают до 4-5oC. Сыворотку наливают в химический стакан и при медленном перемешивании на магнитной мешалке добавляют 1М раствор CaCl2 и 10% раствор сульфат декстрана - 500 (СД-500) из расчета на 1 см3 сыворотки 0,1 см3 CaCl2 и 0,02 см3 СД-500. Смесь перемешивают в течение 10 мин, затем центрифугируют 25 мин при 10 тыс. об. /мин. Осадок липидов отбрасывают, а надосадок - сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 г борной кислоты на 100 см3 сыворотки, разливают по 1 см3 и лиофилизируют. Эффективность обработки сывороток крови животных растворами CaCl2 и СД-500 контролировали по степени растворимости визуально и в реакции ИФА со специфическим хламидийным антигеном. Использование растворов CaCl2 и СД-500 обеспечивает удаление липидов из нативных сывороток на 85% и обеспечивает полное растворение лиофилизированных сывороток в пределах 2-5 мин без хлопьев. По результатам реакции ИФА оптическая плотность хламидийной сыворотки в разведении 1:100 после обработки была значительно выше, чем до обработки. Отрицательная сыворотка со специфическим антигеном показала отрицательный результат (таблица 2). Таким образом, положительный эффект от использования предлагаемых контрольных сывороток в заявляемом наборе заключается в полной их растворимости и увеличении специфической активности положительной сыворотки, что отражается на чувствительности ИФА. 4. Приготовление нормальной (отрицательной) сыворотки. У животных (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др.), прошедших карантин в течение двух месяцев и отрицательно реагирующих в ИФА с хламидийным антигеном, производят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см3 от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при 37oC, затем делают обводку и для отстаивания сыворотку выдерживают 12-14 час при 4oC. Отстоявшуюся сыворотку сливают во флаконы в асептических условиях и обрабатывают согласно П.З. 5. Получение антивидового коньюгата
Антивидовые иммуноглобулины анти-IgG (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др. ), меченные ферментом пероксидазой, готовят в соответствии с "Временной инструкцией по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой", утв. ГУВ МСХ СССР 19.12.85 ТУ 46-78-85 и укомплектовывают ими набор. 6. Иллюстрация применения набора. 6.1. Подготовка биологических компонентов набора для иммуноферментной диагностики хламидиозов животных. Содержимое каждой ампулы или флакона N 1 со специфическим хламидийным антигеном растворяют в 40 см3 адсорбционного буфера, получая рабочую концентрацию антигена 5-15 мкг/мл. Содержимое ампул (фл.) с антивидовым коньюгатом N 4 растворяют в 40 см3 инкубационного буфера. Положительную и отрицательную (ампулы или фл.) N 2 и N 3 сыворотки растворяют в 1 см3 инкубационного буфера, получая разведение 1:100. Растворенные антиген, сыворотки, антивидовой коньюгат можно хранить при температуре (5
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156003/177.gif)
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156003/177.gif)
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156003/177.gif)
![набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, патент № 2156620](/images/patents/315/2156003/177.gif)
Класс A61K39/118 Chlamydiaceae, например трахомы или пситтакозы
Класс G01N33/569 микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов