способ лечения ожоговых ран

Формула изобретения

Способ лечения гранулирующих ожоговых ран с использованием культивированных вне организма диплоидных эмбриональных фибробластов человека, отличающийся тем, что для предтрансплантационной обработки клеток используется низкоинтенсивное магнитно-лазерное облучение инфракрасного диапазона при экспозиции 4 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для лечения ожоговых ран.

Известен способ лечения ожоговых ран с использованием диплоидных эмбриональных фибробластов (ДЭФ) (Д. С. Саркисов с соавт., 1991 г., а. с. N 1699047). При реализации данного метода конечный результат лечения зависит от способности трансплантируемых клеток синтезировать компоненты внеклеточного матрикса с одной стороны, а с другой - от реакции раневой поверхности на трансплантируемые клетки. Очевидно, что в ряде случаев результаты лечения по данному способу труднопрогнозируемы (до 17,6% отрицательных результатов).

Известно, что развитие и течение воспалительных реакций в значительной мере определяется гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ- 6, ИЛ-8). Среди последних наибольшим провоспалительным потенциалом обладает ФНО. Поэтому разработка способов ограничения продукции данного цитокина является актуальной для оптимизации местного противовоспалительного лечения ран. Предположили, что воздействие на трансплантируемые клетки, приводящее к появлению желаемых свойств у этих клеток, будет способствовать оптимизации течения раневого процесса. Среди возможных способов обработки клеток нами предлагается использование низкоинтенсивного магнитно-лазерного облучения (МЛО). Основанием для этого послужили данные о его высокой биологической активности (А.С.Крюк, В.А.Мостовников и др., 1986; В.Е.Илларионов, 1990).

Задачей изобретения является ускорение процесса заживления гранулирующих ожоговых ран.

Поставленная задача достигается тем, что культивируемые вне организма диплоидные эмбриональные фибробласты, используемые для лечения ожоговых ран, перед трансплантацией подвергают низкоинтенсивному магнитно-лазерному облучению инфракрасного диапазона при экспозиции 4 мин.

Способ осуществляется следующим образом.

Перевиваемые линии ДЭФ получали стандартными методами ферментативной дезагрегации тканей трипсином, с последующим культивированием в питательной среде ТС 199, дополненной 10% сыворотки крупного рогатого скота, в стандартных условиях. За 24 часа до основного опыта клетки высевали в лунки 24-луночного планшета при плотности посева 210⁶ клеток/см² в той же питательной среде. В день основного опыта из периферической крови здоровых доноров выделяли фракцию мононуклеарных клеток (МНК) с использованием сепарирующей среды "Limphoprep". МНК трижды отмывали центрифугированием при 3000 об/мин по 10 мин, средой ТС 199 без сыворотки. После последнего центрифугирования клетки подсчитывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 5% сыворотки АВ, инактивированной нагреванием при 56^oC, 30 мин. Конечная концентрация клеток 210⁶ /мл.

ДЭФ подвергали МЛО непосредственно в лунках панели, аппаратом "Узор", производства Калужского радиолампового завода, в инфракрасном диапазоне с длиной волны 0,89 мкм, с импульсным режимом излучения при частоте 150 Гц и выходной мощности не более 2 Вт. Постоянное магнитное поле использовалось одновременно с лазерным облучением, при этом магнитная насадка крепилась к излучателю и имела напряженность магнитного поля 25-35 мТл. Время облучения (экспозиция) составляло 2, 4 и 8 минут. После облучения и замены среды в лунки вносили 1 мл взвеси МНК. В качестве индуктора продукции ФНО использовали липополисахарид (ЛПС) E. coli (Calbiochem, USA) в концентрации 50 мкг/мл. Клетки культивировали 12 часов в CO₂ инкубаторе и по окончании культивирования определяли содержание ФНО в супернатанте в биологическом тесте с использованием клеток L-929.

Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 1.

Установлено, что МЛО при экспозиции 2 и 4 мин способствует ингибиции продукции ФНО в смешанной культуре ДЭФ и МНК. Предположили, что предварительное МЛО трансплантируемых на рану ДЭФ будет способствовать купированию местного воспалительного процесса и тем самым оптимизировать заживление ожоговых ран.

Клиническая апробация предлагаемого метода проведена нами у 31 человека, которые составили 3 группы: 1-я традиционное лечение; 2-я с использованием необработанных ДЭФ; 3-я с использованием ДЭФ, подвергнутых МЛО в течении 4 мин, за 5-10 мин до трансплантации ДЭФ.

С целью стандартизировать условия проводимого исследования и избежать последствий тяжелой ожоговой травмы, затрудняющих трактовку результатов, нами отбирались больные с ожогами IIIб - IV степени, не превышающими в среднем 9,2 0,9% поверхности тела. Все больные не имели тяжелой сопутствующей патологии. Трансплантация ДЭФ осуществлялась на 3-5 сутки после отхождения струпа на чистые, созревшие грануляции. На 1-3 сутки после трансплантации ДЭФ выполнялась аутодермопластика расщепленным (1:4) сетчатым кожным лоскутом с одномоментным закрытием всей площади раны.

Выраженность воспалительной реакции в ране оценивали по клеточному составу мазков-отпечатков грануляционной ткани, окрашенных гематоксилин-эозином. Мазки-отпечатки получали до трансплантации ДЭФ и непосредственно перед закрытием раны расщепленным кожным лоскутом.

Результаты цитологического исследования представлены в таблице 2.

Из представленных данных можно видеть, что предварительное МЛО трансплантируемых ДЭФ приводит к более полному купированию воспалительного процесса в гранулирующей ожоговой ране, по сравнению с группой сравнения (группа 2).

Анализ клинической эффективности предлагаемого метода включал оценку времени полной эпителизации раны и площади неприжившихся сетчатых трансплантатов аутокожи на 5-7 сутки после аутодермопластики.

Результаты анализа этих показателей представлены в таблице 3.

Из таблицы видно, что в 3 группе, где использовались ДЭФ, обработанные МЛО, площадь лизировавшегося трансплантанта и время эпителизации значительно меньше.

Пример клинического выполнения.

Больной П.,37 лет, история болезни N 5416, поступил в ожоговое отделение 23.02.98 г. с диагнозом термический контактный ожог IIIб-IV ст. (S-20%) грудной клетки. Больному при поступлении произведена субфасциальная некрэктомия, затем имплантация диплоидных эмбриональных фибробластов, предварительно подвергнутых магнитно-лазерному облучению в течение 4 мин. Через 1 сутки произведена кожная пластика расщепленным перфорированным (1:4) кожным лоскутом. На 4 сутки после операции ячейки перфорированного лоскута на всей площади закрылись эпителием. По цитограммам и клинически отмечено уменьшение воспалительного процесса, активизация иммунных реакций и ускорение эпителизации. Приживление лоскута 100%, реакции отторжения трансплантанта не было.

Таким образом, поставленная задача решена за счет купирования воспалительного процесса в ожоговой ране, что приводит к уменьшению площади лизирования кожного трансплантанта и сокращению времени полной эпителизации.