прямая электрохимия ферментов
Классы МПК: | G01N27/327 биохимические электроды |
Автор(ы): | ДЭЛТОН Ховард (GB), ХИЛЛ Хью Аллен Оливер (GB), КАЗЛАУСКАЙТЕ Юрате (GB), УИЛКИНС Патрисия Каллахан (US) |
Патентообладатель(и): | БИ ДЖИ ПЛС (GB) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1997-05-08 публикация патента:
10.10.2000 |
Область использования - электрохимия ферментов. Способ переноса электронов между электродом и ферментом в электрохимическом процессе предусматривает вызывание адгезии фермента к электроду, причем перенос является прямым. Ферментом является метанмонооксигеназа, а электрохимию проводят в отсутствие медиаторов. Технический результат - упрощение электрохимического определения концентрации образцов. 3 с. и 14 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7
Формула изобретения
1. Способ электрохимии фермента, причем электрохимия является прямой электрохимией, отличающийся тем, что ферментом является метанмонооксигеназа, а электрохимию проводят в отсутствие медиаторов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент содержит активный сайт с двухатомным железным центром. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что фермент содержит порфиринсодержащий активный сайт. 4. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что фермент является Р450 или модифицированным Р450. 5. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что указанная электрохимия включает прямой перенос электронов. 6. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что указанную электрохимию проводят с использованием модифицированного золотого электрода. 7. Способ модифицирования электрода для его подготовки к использованию в электрохимии фермента, отличающийся тем, что ферментом является монооксигеназа, электрохимию проводят в отсутствие медиаторов, а электроды обрабатывают пептидом. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что пептид включает гексапептид. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что гексапептид содержит Цис- и Лиз-радикалы. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что гексапептидом является Лиз-Цис-Тре-Цис-Цис-Ала. 11. Способ по любому из пп.7 - 10, отличающийся тем, что обработка включает вольтамперометрическую циклическую обработку в растворе гексапептида, избегая при этом восстановительного очищения электрода. 12. Способ по любому их пп.7 - 11, отличающийся тем, что фермент является Р450 или модифицированным Р450. 13. Способ окисления субстрата молекулярным кислородом в присутствии фермента, предусматривающий прямую электрохимию, отличающийся тем, что ферментом является монооксигеназа, а электрохимию проводят в отсутствие медиаторов. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что метан окисляют до метанола. 15. Способ по п.13, отличающийся тем, что полициклические ароматические углеводороды окисляют до 5-экзо-гидроксикамфары. 16. Способ по любому из пп.13 - 15, отличающийся тем, что фермент получен из цитохрома Р450cam. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что цистеин удаляют из реакционной среды.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к электрохимии ферментов, в особенности электрохимии выделенных гидроксилаз. Гидроксилазы известны, как катализаторы окисления различных субстратов. Например, метанмонооксигеназа является эффективным катализатором окисления метана молекулярным кислородом для получения метанола в качестве единственного продукта. Исследования структуры и механизма электрохимии гидроксилаз описаны в литературе. Известны две формы фермента метанмонооксигеназы, растворимая (sMMO) и в виде частиц (корпускулярная) (pMMO). Растворимый фермент, продуцируемый Methylococcus capsulatus (Bath), состоит из гидроксилаз (Mr 250.5 кДа), редуктазы (Mr 38.5 кДа) и регуляторного компонента белка В (Mr 15.9 кДа), каждый из которых необходим для активности этого фермента. Гидроксилаза состоит из двух протомеров с расположением a2b2g2, и кристаллическая структура этого компонента была определена рентгеновским исследованием. sMMO Methylosinus trichosporium OB3b имеет очень похожий состав и также хорошо описана. Активным сайтом у sMMO является центр с двумя атомами железа, связанными гидроксигруппой у неактивного фермента, находящийся в субъединице гидроксилазы. Восстанавливающие эквиваленты передаются от НАДФ активному центру через Fe2S2 и ФАД центры в редуктазе. Белок В не содержит ионов металлов или кофакторов, и детали его регуляторной роли неясны. У неактивного фермента атомы железа находятся в полностью окисленном состоянии Fe(III)Fe(III). Существует также два других состояния окисления, легко достигаемые в двухатомном железном кластере, а именно со смешанной валентностью Fe(III)Fe(II) и полностью восстановленное Fe(II)Fe(II). Именно Fe(II)Fe(II) форма гидроксилазы вступает в реакцию с кислородом активирует его в холе ферментативного превращения. Окислительно-восстановительные потенциалы двухатомных железных центров у M. capsulatus (Bath) и M.trichosporum OB3b были измерены в трех независимых исследованиях. Значения Eo" для Fe(III)Fe(III)/Fe(III)Fe(II) и Fe(III)Fe(II)/Fe(II)Fe(II) были предметом дебатов. Окислительно-восстановительные свойства гидроксилазного компонента растворимой метанооксигеназы от двух различных микроорганизмов были подробно изучены. В предыдущих исследованиях использовали окислительно-восстановительное титрование с индикатором и спектроскопические методы для определения концентрации восстановленных образцов. В этих исследованиях использовали непрямое титрование гидроксилазных двухатомных железных центров окислительно-восстановительными медиаторами. Концентрации смешанно-валентных и полностью восстановленных гидроксилаз определяли при помощи ЭПР или сочетанием ЭПР со спектроскопией по Мессбауэру при очень низких температурах (4.2 - 18 K). В области электрохимии белков было обнаружено, что тиол- или дисульфидсодержащие органические молекулы являются особенно хорошими модификаторами, поскольку они хемосорбируются золочением, образуя стабильный слой, покрывавший поверхность электрода. Подходящие аминокислоты также могут хемосорбироваться тем же способом и тем самым содействовать электрохимическим белковым превращениям на поверхности электрода. Было исследовано использование цистеинсодержащих пептидов, которые также содержат функциональные аминокислоты (т. е. аргинин, лизин, гистидин), в качестве активаторов электрохимических белковых реакций. Однако в отличие от электрохимии белков осуществление непосредственных электрохимических мероприятий на окислительно-восстановительных ферментах без помощи медиаторов не является тривиальной задачей. Основная трудность состоит в том, что часто окислительно-восстановительные центры расположены глубоко в массе белка, далеко от его поверхности, так, что путь, который необходимо проделать электронам до электрода, может быть достаточно большим, что снижает скорость переноса до крайне малой величины. Также поскольку большинство окислительно-восстановительных ферментов значительно больше и структурно менее прочные по сравнению с другими белками, то они более подвержены деформации и потере активности на поверхности электрода. Электрохимия гидроксилаз в присутствии медиатора усложняется из-за возможности взаимодействия между гидроксилазой и медиатором, при этом медиатор может препятствовать определению концентрации образцов при температурах, отличающихся от температур проведения окислительно-восстановительных реакций. Задача данного изобретения состоит в том, чтобы избежать вышеперечисленных недостатков. Согласно одному из объектов данного изобретения предлагается способ переноса электронов между электродом и ферментом в электрохимическом процессе, предусматривающий вызывание прилипания фермента к электроду. Предпочтительно перенос является прямым (непосредственным). Согласно другому объекту изобретения предлагается способ электрохимии фермента, предусматривающий прямую электрохимию, проводимую в отсутствие медиаторов. В варианте выполнения изобретения фермент является монооксигеназой. В другом варианте изобретения фермент является Р450 или модифицированным Р450. В еще одном варианте изобретения фермент является метанмонооксигеназой. В еще одном выполнении изобретения фермент является гидроксилазой. Гидроксилаза может быть растворимой метилмонооксигеназой. Фермент может содержать двухатомный железный активный сайт или альтернативно фермент может включать порфиринсодержащий активный сайт. Предпочтительно электрохимию проводят при использовании модифицированного золотого электрода. Согласно дополнительному объекту изобретения предлагается способ модифицирования электрода для подготовки электрода к использованию в электрохимии фермента при отсутствии медиаторов, который предусматривает обработку электрода белком. Предпочтительным ферментом является монооксигеназа. Подходящий фермент имеет двухатомный железный или порфиринсодержащий активный сайт. Обычно пептид включает гексапептид. Предпочтительно гексапептид содержит Цис и Лиз радикалы. Подходящим гексапептидом является Лиз-Цис-Тре-Цис-Цис-Ала. Обычно обработка включает вольтаметрические циклы работы электрода в растворе гексапептида, избегая при этом восстановительного очищения электрода. Согласно еще одному объекту изобретения предлагается способ окисления субстрата молекулярным кислородом в присутствии фермента, предусматривающий прямую электрохимию, проводимую в отсутствие медиаторов. В варианте выполнения изобретения фермент является монооксигеназой. В другом варианте изобретения фермент имеет двухатомный железный или порфиринсодержащий активный сайт. Субстрат может быть метаном, который окисляют до метанола, или субстрат может быть камфарой, которую окисляют до 5-экзо-гидроксикамфары, или же субстрат может содержать полициклические ароматические углеводороды, которые окисляют до 5-экзо-гидроксикамфары. Гидроксилазу предпочтительно получают из цитохрома Р450cam. Обычно цистеин удаляют из реакционной среды. Мы обнаружили, что электрод, модифицированный пептидами, обеспечивает более благоприятную поверхность для фиксации фермента. Мы полагаем, что для того, чтобы происходил электронный перенос между гидроксилазным компонентом M.capsulatus (Bath) sMMO и электродом, предпочтительна положительно заряженная поверхность: e-аминогруппа лизинового радикала в предпочтительном гексапептиде предположительно выполняет эту роль. Электрохимическая модификация электрода этим конкретным пентилом обеспечивает стабильный монослой и более однородное покрытие поверхности по сравнению с электродом, модифицированным хемосорбцией (т.е. простым погружением электрода в раствор пептида). Электрод может быть модифицированным золотым электродом, например золотым электродом, модифицированным обработкой гексапептидом Лиз-Цис-Тре-Цис-Цис-Ала. Обработка может проводиться циклическим действием электрода в растворе гексапептида, избегая восстановительного очищения электрода. Влияние белка B и белка B" на электрохимию раствора гидролазы очень важно. ЭПР спектроскопия смешанного валентного состояния показала, что белок В, связываясь с гидроксилазой, изменяет окружение двухатомного железного сайта. В каждом из этих предварительных исследований также наблюдалось, что они вызывают сдвиг потенциалов двухатомного железного сайта. Известно, что образование комплекса "гидроксилаза - белок B" изменяет свойства двухатомного железного сайта, влияя на распределение продуктов и увеличение скоростей образования некоторых промежуточных продуктов в sMMO каталитическом цикле. Все эти эффекты могут быть вызваны способностью белка В вызывать конформационные изменения в гидроксилазе при связывании с ней, которые передаются активному сайту. Мы обнаружили, что на окислительно-восстановительные потенциалы гидроксилазы влияет присутствие белка В, что наблюдалось и в предыдущих исследованиях. Предпочтительно отрицательный сдвиг окислительно-восстановительных потенциалов, вызванный связыванием белка В с гидроксилазой, обусловлен изменением в первой координационной сфере атома(ов) железа или состояния протонирования гидроксильного мостика. Другие эффекты, такие как изменения доступности растворителя или структуры окружения активного сайта, вызываемые конформационными изменениями при связывании белка В, также могут являться причиной изменений потенциала. По нашим оценкам Kd для Fe(II)Fe(II) комплекса равна 2.06![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157521/2157521-2t.gif)
Фиг. 1 - дифференциальная вольтамперограмма 23.6 мМ растворов гидроксилазы на Лиз-Цис-Тре-Цис-Цис-Ала модифицированном золотом электроде в 40 мМ MOPS, pH 7.0 (фоновый ток был вычтен). Фиг. 2А и 2Б - диаграммы влияния увеличения концентрации белка B (1) или B" (2) на потенциалы электронного переноса первого электрона (а) и второго электрона (б). [Гидроксилаза] = 21 мМ, 40 мМ MOPS, pH 7.0. Электрод проверяли предварительно перед каждым измерением. Фиг. 3А и 3Б - диаграммы влияния увеличения концентрации белка В на потенциалы электронного переноса первого электрона (а) и второго электрона (б) в присутствии белка В". [Гидроксилаза] = 21 мМ, [B"] = 4 мМ, 40 мМ, pH 7.0. Фиг. 4 - циклические вольтамперограммы цитохрома Р450cam. Фиг. 5 - зависимость тока катодного пика от скорости развертки потенциала для цитохрома Р450cam, связанного с камфарой и не содержащего камфары. Примеры. (1) Рост Фермента
Выращивание микроорганизма Methylococcus capsulatus (Bath) проводили, как описано в Pilkington, S.J. & Dalton, H. (1990) "Soluble Methane Monoxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)". Methods in Enzymol. 188, 181-190. При очистке гидроксилазного и B-белкового компонентов были внесены следующие модификации в опубликованные методики: После начальной стадии ионного обмена, гидроксилазу пропускали через Superdex 200 гелевую инфильтрационную колонку. Окончательную очистку проводили элюированием чистой гидроксилазы из Mono Q ионообменной колонны с использованием 0-30%-ного градиента 1 M NaCl. Белок В был очищен сходным способом за исключением того, что гелевой фильтрационный средой была Superdex 75. (II) Модификация электродов
Золотые электроды были модифицированы при циклической работе электродов при пониженных потенциалах в 5 мМ растворе гексапептида Лиз-Цис-Тре-Цис-Цис-Ала. При проведении цикла восстановления особое внимание уделялось тому, чтобы не превышать предела -0.85 В, поскольку восстановление протонов до водорода приводит к восстановительному очищению золотой поверхности. Было обнаружено, что десять циклов приводят к адекватной модификации. Гексапептид, используемый для модифицирования золотого электрода, был приобретен у Sigma Chemical Company, Poole, Dorset. (III) Измерение окислительно-восстановительных потенциалов
В качестве метода измерения окислительно-восстановительных потенциалов гидроксилазных двухатомных железных центров была выбрана дифференциальная пульсационная вольтамперометрия (ДПВ). ДПВ эксперименты с sMMO гидроксилазой дали две волны при 4
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
Кроме того, определяли влияние белков B и B" на окислительно-восстановительные реакции. Дополнительные эксперименты проводили при добавлении регуляторного белка B к раствору, используемому для дифференциальной пульсационной вольтамперометрии для определения его влияния на электрохимию гидроксилазы. В этих экспериментах белок В добавляли к гидроксилазе в минимальном соотношении 2:1 (В: гидроксилаза). Высокие соотношения В:гидроксилаза приводят к уменьшению обоих пиков тока до пренебрежимо малых величин, вероятно, из-за загрязнения электрода. Электрод был модифицирован до измерений каждой из различных концентраций белка В для обеспечения наиболее однородного, свежего покрытия. Как показано на фиг. 2, увеличение концентрации белка B приводит к сдвигу обоих первых и вторых потенциалов пиков волн в область более низких значений. Однако изменения каждого потенциала были различны. Общий сдвиг первого потенциала был 29 мВ, но 47 мВ для второго. Это обусловлено различными константами связывания белка В с двухатомным железным центром гидроксилазы в смешанном и полностью восстановленном состояниях. Константы диссоциации. Kd=2.06
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
Прямая электрохимия sMMO гидроксилазных двухатомных железных центров без медиаторов была проведена при использовании модифицированных золотых электродов. (VI) Использование цитохрома P450cam. На фиг. 4 представлены циклические вольтамперограммы графитового электрода (1) с гладкой кромкой 15 М цитохрома pH 7.4 и (2) 18 М цитохрома P450cam в 40 мМ натрий фосфатном буфере, pH 7,4, содержащий 1 мМ D-(+)-камфары. Форма фермента, связанного с камфарой, показала ответ сходной формы (фиг. 4) при -390
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157521/2157521-3t.gif)
После проведения электрохимии цитохрома P450cam фермент использовали для превращения камфары в 5-экзо-гидроксикамфару. Фермент удерживали на поверхности электрода при помощи мембраны Истмана, AQ420. Потенциал изменялся от
![прямая электрохимия ферментов, патент № 2157521](/images/patents/314/2157024/177.gif)
Класс G01N27/327 биохимические электроды