способ приготовления клеточного трансплантата из фетальных тканей

Формула изобретения

1. Способ приготовления клеточного трансплантата из фетальных тканей, характеризующийся тем, что из фетальных тканей абортивного плода 17 - 21 недели внутриутробного развития весом 150 - 450 г выделяют клетки различных органов, суспендируют их, отбирают суспензии с повышенным содержанием региональных стволовых клеток, отдельные идентифицированные культуры региональных стволовых клеток, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы) и биологически активные вещества из фетальных тканей, при этом количество клеток в трансплантате от 25 х 10⁴ до 10 х 10⁷, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат, не менее 80 - 90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8 - 15%; спонтанная активность Са²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы не менее 0,1 условной ед.; индуцированная активность Са²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы от 0,3 до 9 условных ед.; представленность маркера СД 95 - не более 5%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточный трансплантат дополнительно включает ростовые факторы, и/или факторы миграции, и/или специфические белки, и/или антиоксиданты, и/или переносчики активных форм кислорода, и/или адаптогены, а также вещества, обладающие противовоспалительным, бактериостатическим действием.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что клеточный трансплантат, полученный предложенным способом, может быть использован при исследовании на контаминацию донора абортивного плода, исследовании на контаминацию абортивного плода, контроле стерильности тканевых суспензий.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при составлении трансплантатов подбирают ткани и клетки, которые в наибольшей степени утратили свою функцию.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что трансплантаты для лечения молодых пациентов должны содержать больше дифференцированных клеток и/или композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных региональных стволовых клеток.

6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в трансплантате для старых и пожилых пациентов должны преобладать региональные стволовые клетки.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансплантаты для лечения больных ишемической болезнью сердца должны содержать миоциты, бластные клетки печени, легкого, селезенки, сосудистого эндотелия.

8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что трансплантаты для лечения рассеянного склероза должны содержать преимущественно клетки промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции.

9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что трансплантат для лечения анемий должен состоять преимущественно из региональных гемопоэтических клеток.

10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что клеточные трансплантаты могут быть использованы при лечении заболеваний нервной системы, болезнях эндокринной системы, нарушениях обмена веществ, болезнях крови, кроветворных органов и отдельных нарушениях, вовлекающих иммунные механизмы, для лечения новообразований, болезней глаз и его придаточного аппарата, болезней уха и сосцевидного отростка, болезней системы кровообращения , болезней органов дыхания, болезней органов пищеварения, болезней кожи и подкожной клетчатки, болезней костно-мышечной системы и соединительной ткани, состояний, возникающих в перинатальном периоде, травмах, отравлениях и других последствиях воздействия внешних причин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и касается приготовления клеточного трансплантата из фетальных тканей для лечения широкого круга заболеваний.

В современной медицине отчетливо сформировалось отдельное направление, использующее тканевые и клеточные трансплантаты в терапевтических целях. Одним из научно-практических результатов этого направления является признание того, что фетальные ткани и клетки и их ассоциаты, а также биологически активные вещества из них обладают большей терапевтической эффективностью, чем зрелые ткани и дифференцированные клетки взрослого человека. Это обусловлено особыми свойствами клеток в период эмбриогенеза.

Прежде всего, в клетках II триместра гестации еще не экспрессированы белки гистосовместимости I и II класса и поэтому при трансплантации они не вызывают иммунной реакции отторжения.

Во-вторых, эти клетки в значительно большей степени способны использовать эволюционно более древний энергетический путь - гликолиз и в связи с этим обладают большей устойчивостью к гипоксии, чем дифференцированные клетки взрослого человека. С терапевтической точки зрения это свойство важно в случаях, связанных с лечением ишемии органов и тканей реципиента, с технологической - для создания банков клеток и их ассоциатов с глубоким замораживанием, которое влечет за собой резкое снижение концентрации кислорода.

В-третьих, фетальные клетки очень пластичны и способны направленно изменять свои функции и свойства в зависимости от сигналов из окружающей среды, в том числе и от сигналов клеток реципиента. Последнее заставляет клетки мигрировать из области трансплантации в область конечной локализации и дифференцироваться в клетки соответствующей ткани. Именно это свойство высокой морфно-функциональной пластичности лежит в основе так называемой терапевтической полипатентности фетальных клеток и тканей.

Наконец, фетальные клетки в большей степени, чем клетки взрослого человека, содержат ростовые факторы, факторы миграции, стадиоспецифические белки, антиоксиданты и перехватчики активных форм кислорода, адаптогены, противовоспалительные бактериостатические соединения.

Таким образом, терапевтический эффект фетальных трансплантатов зависит не только от количества имплантированных фетальных тканей, клеток и их ассоциатов, но и от строгого соблюдения условий, обеспечивающих содержание в трансплантате клеток, обладающих всеми перечисленными выше уникальными свойствами.

Сегодня трудно перечислить все области применения фетальных тканей, клеток или препаратов на их основе. Достаточно сказать, что уже в настоящее время ряд клиник США и Европы успешно применяют фетальные клетки и ткани дефектов метаболизма печени, системных врожденных иммунодефицитов, нарушение гемопоэза, а также для лечения пациентов с мышечной дистрофией, дегенеративными заболеваниями нервной ткани, нарушениями репродуктивной системы, костной и хрящевой тканей, кожных покровов и т.д. Применение фетальных клеток в терапевтических целях стало возможным в связи с прогрессом в молекулярной и клеточной биологии, иммунологии, генной инженерии и других, смежных с перечисленными областях науки. В настоящее время не остается сомнений в эффективности фетальных клеток человека и вопрос их широкого применения в клинической практике больше связан с по меньшей мере двумя проблемами: во-первых, с разработкой технологий обеспечения безопасности трансплантата и технологий управления его эффективностью или терапевтической полипатентностью, во-вторых, с разработкой технологий получения нозологически специфических форм трансплантата.

Технической задачей настоящего изобретения является способ приготовления клеточного трансплантата с использованием биоматериалов из абортивного плода, позволяющий сохранить терапевтическую полипатентность этих биоматериалов и обеспечить безопасность метода, управляя качеством трансплантата на всех стадиях и этапах. Этот способ включает в себя подготовку трансплантата из фетальных тканей, получение суспензий для последующего получения компонентов клеточных трансплантатов и составление композиций трансплантата. Обеспечение безопасности трансплантата реализуется на основе комплексного подхода с исследованием на контаминацию донора плода, окончательной инъекционной формы трансплантата, а также с учетом условий сохранения антиканцерогенных свойств и гистосовместимости клеток трансплантата с клетками реципиента.

Установлены объективные количественные критерии качества трансплантата с учетом количества клеток в трансплантате, оценки жизнеспособности всех клеток, составляющих трансплантат, экспрессии антигенов гистосовместимости II класса, спонтанной активности Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы, индуцированной активности Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы, а также представленности маркера CD 95.

Для решения поставленной задачи предлагается способ приготовления клеточного трансплантата, согласно которому из фетальных тканей абортивного плода 17-21 недели внутриутробного развития весом 150-450 грамм выделяют клетки различных органов, их суспендируют, затем отбирают суспензии с повышенным содержанием региональных стволовых клеток, отдельные идентифицированные культуры региональных стволовых клеток, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы) и биологически-активные вещества из фетальных тканей, при этом количество клеток в трансплантате от 2510⁴ до 1010⁷, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат, не менее 80-90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8-15%; спонтанная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы не менее 0,1 условной ед.; индуцированная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы от 0,3 до 9 условных ед.; представленность маркера CD 95 - не более 5%. Клеточный трансплантат может дополнительно включать ростовые факторы и/или факторы миграции, и/или специфические белки, и/или антиоксиданты, и/или переносчики активных форм кислорода, и/или адаптогены, а также вещества, обладающие противовоспалительным, бактериостатическим действием. Клеточный трансплантат может быть использован при исследовании на контаминацию донора абортивного плода, исследований на контаминацию абортивного плода, контроле стерильности тканевых суспензий.

При составлении трансплантатов подбирают ткани и клетки, которые в наибольшей степени утратили свою функцию.

При лечении молодых пациентов трансплантаты содержат больше дифференцированных клеток и/или композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных региональных стволовых клеток. Для старых и пожилых пациентов в трансплантате преобладают региональные стволовые клетки.

При лечении рассеянного склероза трансплантат должен содержать преимущественно клетки промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции.

Трансплантаты для лечения больных ишемической болезнью сердца должны содержать миоциты, бластные клетки печени, легкого, селезенки, сосудистого эндотелия. При лечении анемий - региональные гемопоэтические клетки.

Клеточные трансплантаты могут быть использованы при лечении заболеваний нервной, эндокринной систем, нарушениях обмена веществ, болезнях крови, кроветворных органов и отдельных нарушениях, вовлекающих иммунные механизмы, для лечения новообразований, болезней глаз и его придаточного аппарата, уха и сосцевидного отростка, системы кровообращения, органов дыхания, органов пищеварения, болезней кожи и подкожной клетчатки, костно- мышечной системы и соединительной ткани, отдельных состояний, возникающих в перинатальном периоде, травм, отравлений.

Для приготовления трансплантата необходимы абортивные плоды 17-21 недели внутриутробного развития весом 150-450 г. Допускается хранить в холодильнике при 4^oC не более 4 ч. Это обеспечивает выход клеток с жизнеспособностью не ниже 85% (в тесте с трипановым синим). Абортивные плоды содержащие менее 70% жизнеспособных клеток, не могут быть использованы для подготовки трансплантата.

Ограничивающие условия определены нами опытным путем в результате анализа жизнеспособности клеток от 112 плодов (p<0,05). В работу принимаются плоды без генетических аномалий и без нарушений целостности кожных покровов.

Плод тщательно обрабатывают раствором детергента и отмывают дистиллированной водой. Пуповину отделяют. Затем забирают следующие органы: тимус, сердце, легкие, печень, селезенка, поджелудочную железу, надпочечники, почки, гонады, желудок, тонкий кишечник, брыжейка, спинной мозг, щитовидную железу, глаза. Кроме того, выделяют хрящи из всех суставов плода и снимается кожа с живота и спины. Перед разделением тканей мозга мозговые оболочки обязательно отделяются и в дальнейшем используются для получения клеточных культур. Из головного мозга забирают: мозжечок, мозговой ствол, эпифиз, гипоталамус, таламус, базальные ядра, затылочные доли, теменные доли, височные доли, лобные доли. Гипофиз не изолируется вместе со всем мозгом и может быть отделен в последнюю очередь.

Органы измельчают в стерильной чашке Петри стерильными, острыми ножницами до визуально гомогенного состояния, затем в гомогенат, добавляют 10 - 15 мл охлажденного (+4^oC) стерильного физраствора и суспендируют стерильной пипеткой. После этого одноразовым шприцом через иглу 0,8х38 производят дополнительную гомогенизацию. Полученный гомогенат переносят в стерильные центрифужные пробирки, содержащие 5-кратный объем охлажденного (+4^oC) стерильного физраствора. Пробирку оставляют на 3-5 мин для осаждения недезагрегированных кусочков ткани, затем надосадочную жидкость, содержащую отдельные клетки, отбирают и переносят в другую стерильную центрифужную пробирку. Осадок, содержащий кусочки ткани, подвергают дополнительной механической или энзиматической дезагрегации. Суспензию клеток центрифугируют в течение 10 мин при 1000 оборотах в мин, после чего надосадочную жидкость сливают.

Суспензии, прошедшие контроль стерильности, могут использоваться сразу в виде трансплантата из отдельных тканей, композиций тканей, передаваться на хранение в банк либо служить исходным биоматериалом для получения клеточных трансплантатов.

Проверенный на стерильность материал суспендируют в среде для замораживания - 10% DMSO (в качестве криопротектора) и 90% эмбриональной сыворотки теленка, затем помещают в криопробирки (Costar), по 1,5 мл (2-5010⁶ клеток/пробирку) и замораживают в парах жидкого азота со скоростью 1^oC/мин до -40^oC и 5^oC/мин - 70^oC. После этого охлажденные криопробирки с суспензией помещают в жидкий азот в сосуды Дьюара (35 литров, Sigma), либо в хранилища для биопродуктов (ХБ-0.5, Свердловский завод кислородного машиностроения).

Хранящиеся в банке суспензии находятся в криопробирке емкостью 2 мл или 4 мл, содержащую стерильную гомогенную жидкость от светло-желтого до розово-оранжевого цвета с концентрацией клеток от 1 млн. в мл до 50 млн. в мл.

Срок хранения суспензии в жидком азоте - 3 года.

Ограничивающее условие определено нами опытным путем на основе анализа жизнеспособности 167 образцов суспензий (p<0,05).

Замороженную суспензию (по 1 ампуле из каждой партии) быстро размораживают при 60^oC, отмывают физраствором для удаления среды для замораживания (центрифугирование в течение 1-2 минут при 1000 об/мин) и окрашивают витальным красителем трипановым синим по стандартной методике. Жизнеспособность клеток должна составлять не ниже 80%. Если этот показатель ниже, то такие образцы отбраковывают. При строгом соблюдении режима замораживания и последующем быстром размораживании жизнеспособность, как правило, составляет 80-95% (общая статистика 70, уровень значимости p<0,05).

Теоретически идеальным трансплантатом является тот, который содержит 100% РСК. Однако простой расчет показывает, что для получения достаточного только для одной трансплантации РСК необходимо в сотни раз увеличить количество исходного абортного материала. Поэтому практически, для подготовки трансплантата, используют абортный материал более поздних чем 15 недель сроков гестации, когда количество РСК резко возрастает, применяют культивирование РСК, добавляют частично дифференцированные клетки, а также стимулируют "спящие" камбиальные РСК реципиента ростовыми факторами, цитокинами или другими биологически активными веществами, содержащимися в фетальных тканях.

Таким образом, основными компонентами трансплантата являются РСК, частично дифференцированные, специализированные клетки и биологически активные вещества, стимулирующие регенерацию собственных РСК реципиента.

В настоящее время уже установлено место первичной локализации РСК для разных органов и тканей. Это было сделано с применением тонких дорогостоящих методов, что затрудняет использование их в технологическом процессе при широкой практике подготовки и применения трансплантата.

Предлагается к патентованию технологически более подходящий способ определения наибольшей плотности: региональных стволовых клеток. Способ заключается в том, что в образцах суспензий, полученных из областей первичной локализации РСК, определяют уровень аноптотической активности по CD 95 и наличие на поверхности этих клеток антигенов гистосовместимости II-класса HLA-DR. Опыт применения этих двух методов одновременно для определения образца суспензий с наибольшей плотностью РСК позволяет получить от 75 до 85% жизнеспособных РСК, что достаточно для дальнейшего их культивирования

Общая статистика - 87 измерений. Вариабельность по тканям от 6 до 8 измерении. Уровень значимости - p<0,05 - 0,001.

Культивирование РСК проводят в специальных условиях, не позволяющих, им дифференцироваться.

При выращивании клеток в недифференцирующих условиях, культура РСК может поддерживаться не более одного года.

Ограничивающее условие получено нами опытным путем на основании анализа жизнеспособности 8 образцов РСК (p<0,05)
Если РСК поместить в условия, позволяющие ей дифференцироваться, то через примерно 3 недели можно получить специализированные клетки, практически не отличающиеся от клеток из области окончательной их локализации. При этом все они будут нести антигены гистосовместимости II-класса (HLA-DR). Такого рода клетки добавляют в трансплантат в качестве источника композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных репаративных механизмов реципиента, поскольку они распознаются и уничтожаются иммунной системой больного, в результате чего высвобождаются эти биологически активные вещества.

Опытным путем нами получено, что терапевтическая эффективность такого рода клеток резко падает после 3-5 пассажей.

Ограничивающее условие получено при N =12 (p<0,05)

Ограничивающее условие получено при N = 47 (p<0,05)
Все процедуры производятся при 0^oC. В максимально "мягких" условиях из ткани готовится гомогенат на дистиллированной воде и (или) изотоническом растворе хлорного калия (11,5 г на 1 литр дистиллированной воды - 15% раствор). В последнем случае гомогенат центрифугируют при 600g 10 мин и осадок из неразрушенных клеток и обрывков разрушенных клеток используют для тестирования. Далее следует этап центрифугирования при 12000g в течение 15 мин - оседают митохондрии - осадок используется так же, как и первый, т.е. как осадок 600g. Следующий этап центрифугирование постмигохондриальной надосадочной жидкости при 105000g в течение часа - получение осадка мембран эндоплазматического ретикулума. Фракции осадка, кроме осадка 600g, ресуспендируют в дистиллированной воде и (или) дополнительно могут быть "озвучены" на 3 ДН с целью солюбилизации периферического белка мембран и разрушения компонентов субклеточных структур, содержащих растворимые белки и биоактивные пептиды.

Испытания фракции проводятся или в виде самой фракции как таковой или после экстракции пептидов по известным (общепринятым) методикам. Экстракты для характеристики пептидного состава подвергаются ВЭЖ хроматографии.

В случае приготовления гомогената ткани на дистиллированной воде, последний готовится в максимально жестких условиях: допустимо повторное замораживание-оттаивание, дополнительное озвучивание на ультразвуковом дезинтеграторе (3 Д) при максимальной мощности и т.д. Гомогенат центрифугируется при 105000g в течение 1 часа. Во всех случаях допустим этап лиофильной сушки осадка или супернатанта с целью концентрации материала.

Инъекционная форма трансплантата готовится из суспензий, полученных сразу после препарирования абортного плода, из замороженных тканевых и клеточных суспензий различных органов, из отдельных идентифицированных культур РСК, региональных бластных клеток, дифференцированных клеток, а также из композиций биологически активных веществ из фетальных тканей. Она представляет собой стерильную пробирку с мутноватой жидкостью от светло-желтого до розово-оранжевого цвета.

Для получения отчетливого эффекта в тансплантате должно содержаться от 2510⁴ до 1010⁷ жизнеспособных клеток.

В настоящее время существует несколько методических подходов к паспортизации. Среди них можно выделить: иммуноцитохимические методы, методы оценки ферментативной активности, метод проточной цитофлуориметрии.

Иммуноцитохимические методы используются только для идентификации клеток, прикрепленных к субстрату (пластик, стекло) и готовых к дифференцировке. Идентификацию проводят по реакции на специфические мембранные маркеры или по наличию специфического биологического продукта этих клеток.

Методы изучения ферментативной активности клеток, входящих в состав трансплантата, дают возможность оценить норму реакции наиболее важных для жизнеспособности и ферментов (в том числе и ядерных ферментов) в ответ на различные индукторы. Примером использования ферментативных методов является оценка индуцированой активности Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы.

На основании накопленного нами опыта впервые для паспортизации предлагается использовать метод проточной цитофлуориметрии, позволяющий одновременно в одном и том же образце трансплантата оценить основные показатели сохранности терапевтической полипатентности водящих в состав трансплантата компонентов. В результате применения этого метода впервые установлено, что трансплантат с оптимальной терапевтической полипатентностью должен отвечать следующим требованиям: количество клеток в трансплантате от 2510⁴ до 1010⁷, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат - не менее 80-90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8- 15%, спонтанная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы не менее - 0,1 условной ед. , индуцированная активность Ca²⁺/Mg²⁺ - зависимой эндонуклеазы - от 0,3 до 9 условных ед., представленность маркера CD 95 не более 5%.

Общая статистика - 375. Вариабельность по показателям от 30 до 85. Уровень значимости p<0,05 - p<0,001.

Немаловажное значение при составлении трансплантата имеет учет возраста больного. При всех прочих равных условиях трансплантат для лечения более молодых пациентов должен содержать больше дифференцированных клеток и/или композицию биологически активных веществ для стимуляции собственных РСК реципиента, в то время как в трансплантате для пожилых и старых пациентов в подавляющем большинстве должны преобладать РСК.

При составлении клеточного трансплантата следует ориентироваться, как на основное заболевание, так и на породившие его причины. Так, например, при ишемической болезни сердца эффективность лечения выше, если в трансплантате присутствуют не только миоциты, но и бластные клетки печени, легкого, селезенки и сосудистого эндотелия. Трансплантат, составленный для лечения рассеянного склероза, должен состоять преимущественно из клеток промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции, а трансплантат для лечения анемий должен состоять из региональных гемопоэтических клеток.

Клеточные трансплантаты могут быть составлены для лечения болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ, болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм, новообразования, болезни глаз и его придаточного аппарата, болезни уха и сосцевидного отростка, системы кровообращения, органов дыхания, органов пищеварения, кожи и подкожной клетчатки, костно-мышечной системы и соединительной ткани, отдельные состояния, возникающие в перинтальном периоде, травмы, отравления.