сложные эфиры рапамицина

Формула изобретения

1. Сложные эфиры рапамицина формулы



где R¹ означает радикал -COCH₂-S-CH₂CH₂-O-CH₂(CH₂OCH₂)_n-CH₂-O- CH₂CH₂-O-CH₃;

R² означает водород или имеет значение, указанное выше для R¹;

n = 8 - 200.

2. Соединение по п.1, в котором n = 8 - 135.

3. Соединение по п.1, в котором n = 8 - 20.

4. Соединение по п.1, в котором n = 90 - 120.

5. Соединение по п.1, представляющее собой 31, 42-диэфир с метоксиполиэтиленгликольтиолом 5000.

6. Соединение по п. 1, представляющее собой 42-эфир с метоксиполиэтиленгликольтиолом 5000.

7. Соединение по п. 1, представляющее собой 42-эфир с метоксиполиэтиленгликольтиолом 750.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к водорастворимым метоксиполиэтиленгликолевым эфирам рапамицина и способам их применения для индуцирования иммуносупрессии и в лечении отторжения трансплантатов, реакции несовместимости ("трансплантат против хозяина"), аутоиммунных заболеваний, воспалительных состояний, T-клеточной лимфомы взрослых, твердых опухолей, грибковых инфекций и гиперпролиферативных сосудистых нарушений.

Рапамицин представляет собой макроциклический триеновый антибиотик, продуцируемый Streptomyces hygroscopicus, который, как было обнаружено, обладает противогрибковой активностью, в частности, против Candida albicans как in vitro, так и in vivo [C.Verine et al., J.Antibiot. 28, 721 (1975), S.N. Sehgal et al., J.Antibiot. 28, 727 (1975), H.A.Buker et al., J.Antibiot. 31, 539 (1978), U.S.Patent 3929992 и U.S.Patent 3993749].

Было показано, что рапамицин один (U.S.Patent 4885171) или в комбинации с пицибанилом (U.S.Patent 4401653) обладает противоопухолевой активностью. R.Martel et al., [Can. J.Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1977)] описали, что рапамицин эффективен в экспериментальной модели аллергического анцефаломиелита, модели множественного склероза, в модели адъювантного артрита и эффективно ингибирует образование IgE-подобных антител.

Иммуносупрессивные эффекты рапамицина были описаны в FASEB 3, 3411 (1989). Было показано, что циклоспорин A и FK-506, другие макроциклические молекулы также эффективны в качестве иммуносупрессивных агентов и, следовательно, применимы в предотвращении отторжения трансплантата [FASEB 3, 3411 (1989), FASEB 3, 5256 (1989), R.J.Calne et al., Lancet 1183 (1978), U.S.Patent 5100899].

Было также показано, что рапамицин применен в предотвращении или лечении системной красной волчанки [U.S.Patent 5078999], воспаления легких [U.S.Patent 5080899], инсулинзависимого сахарного диабета [Fifth Int. Conf. Inflamm. Res. Assoc. 121 (Abstract), (1990)], пролиферации клеток гладких мышц и утолщения внутренней оболочки сосудов после повреждения сосудов [Morris, R.J. Heart Lung Transplant 11 (pt. 2): 197 (1192)], T-клеточной лимфомы взрослых [European Patent Application 525960 A1] и воспаления глаз [European Patent Application 532862 A1].

Было показано, что моно- и диацилированные производные рапамицина (этерифицированные в положениях 28 и 43) применимы в качестве противогрибковых агентов (U.S.Patent 4316885) и использовались для приготовления водорастворимых аминоацильных пролекарств рапацина (U.S.Patent 4650803). Недавно соглашение о нумерации для рапамицина было изменено; поэтому согласно Chemical Abstracts nomenclature описанные выше сложные эфиры будут иметь место этерификации в положениях 31 и 42. В U.S.Patent 5023263 описано получение и использование 42-оксорапамицина и в U.S.Patent 5023264 описано получение и использование 27-оксимов рапамицина.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является линейным или разветвленным нейтральным полимером различной молекулярной массы, который растворим в воде и в большинстве органических растворителей. При молекулярных массах менее 1000 ПЭГ представляют собой вязкие бесцветные жидкости, ПЭГ высокой молекулярной массы представляют собой воскообразные белые твердые вещества. Точка плавления такого вещества пропорциональна молекулярной массе, достигая плато при 67^oC. Молекулярные массы в пределах от нескольких сотен до приблизительно 20000 обычно применяют в биологических и биотехнологических приложениях. В области биомедицины большой интерес представляет тот факт, что ПЭГ является нетоксичным и был сдобрен (FDA) Правительственной Комиссией по продуктам и медикаментам (США) для внутреннего потребления.

Данное изобретение относится к метоксиполиэтиленгликолевым эфирам рапамицина, имеющим структуру.

где R¹ и R², каждый независимо, представляют собой водород или -COCH₂-S-CH₂CH₂-O-CH₂- (CH₂OCH₂) -CH₂-O-CH₂CH₂-OCH₃, и n= 8-450, при условии, что R¹ и R² не оба являются водородом.

Соединения этого изобретения является водорастворимыми пролекарствами рапамицина, применимыми в качестве иммуносупрессивных, противовоспалительных, противогрибковых, антипролиферативных и противоопухолевых агентов. Из соединений этого изобретения предпочтительны соединения, в которых n=8-200, более предпочтительны соединения c n=8-135. Наиболее предпочтительными членами являются те, в которых n=8-20, и те, в которых n=90-120.

Соединения этого изобретения, которые этерифицированы в положениях 42 или 31 и 42 рапамицина, можно получить ацилированием сначала положений 42 или 31 и 42 рапамицина ацилирующим агентом, имеющим общую формулу X-CH₂ CO₂H, где X обозначает подходящую уходящую (отщепляемую) группу, такую как иод, в присутствии сопрягающего реагента, такого как дициклогексилкарбодиимид (ДЦК), и основания, такого как диметиламинопиридин (ДМАП), для обеспечения либо 42-, либо 31,42-ацилированного рапамицина следующей структуры:



Смеси 42- и 31,42-эфиров можно разделить при помощи хроматографии. Реакция ацилированного рапамицина с монометоксиполиэтиленгликольтиолом в присутствии основания, ткого как PRO-TON SPONGE ([1,8-(бис(диметиламино)нафталин, N, N,N",N"-тетраметил-1,8-нафталиндиамин]), или бикарбоната натрия дает желаемые 42- или 31,42-эфиры этого изобретения.

31-эфиры этого изобретения могут быть получены защитой 42-спирта рапамицина защитной группой, такой как трет-бутилдиметилсилил, с последующей этерификацией положения 31 описанным выше способом. Получение 42-силиловых эфиров рапамицина описано в U.S.Petent B1 5120842, приведенном здесь в качестве ссылки. Удаление защитной группы дает 31-этерифицированные соединения. В случае трет-бутилдиметилсилильной защитной группы удаление этой группы можно выполнять при слабокислых условиях, например в присутствии уксусной кислоты/воды/тетрагидрофурана (ТГФ). Процедура удаления защитной группы описана в примере 15 U. S. Patent 5118678, приведенном здесь в качестве ссылки.

При этерифицированном положении 31 и удаления защитной группы из положения 42 положение 42 можно этерифицировать с использованием другого ацилирующего агента по сравнению с примененным для реакции с 31-спиртом, получая соединения, имеющие различные эфиры при положениях 31 и 42. Альтернативно этерифицированные в положении 42 соединения, полученные, как описано выше, могут подвергаться реакции с другим ацилирующим агентом, образуя соединения, имеющие различные эфиры при положениях 31 и 42.

Это изобретение охватывает также аналогичные сложные эфиры других рапамицинов, таких как (но не только) 29-деметоксирапамицин [U.S. Patent 4375464, 32-деметоксирапамицин согласно С.А.-номенклатуре], производные рапамицина, в которых двойные связи в положениях 1, 3 и/или 5 были восстановлены [U.S. Patent 5023262] , 29-дезметилрапамицин [U.S. Ratent 5093339, 32-дезметилрапамицин согласно С. А.-номенклатуре], 7,29-бисдезметилрапамицин [U.S. Ratent 5093338, 7:32-дезметилрапамицин согласно С.А.-номенклатуре], 27-гидроксирапамицин [U.S. Patent 5256790] и 15-гидроксирапамицин [U.S. Patent 5102876]. Это изобретение охватывает также сложные эфиры при положении 42-оксорапамицин [U.S. Patent 5023263]. Все указанные выше патенты США приведены в качестве ссылок.

Реагенты, используемые в получении соединений данного изобретения, могут быть либо получены покупкой их в фирмах либо получены стандартными процедурами, описанными с литературе.

Иммуносупрессивная активность характерных соединений этого изобретения была установлена в стандартном фармакологическом тесте in vivo с кусочковыми кожными трансплантатами, в котором измеряют иммуносупрессивную активность тестируемого соединения, а также способность этого соединения ингибировать или лечить отторжение трансплантата. Процедура этого стандартного фармакологического теста и полученные результаты представлены ниже.

Характерные соединения этого соединения оценивали в тест-способе in vivo, предназначенном для определения времени выживания кусочкового кожного трансплантата из самцов BALB/с-доноров, трансплантированного самцам C₃H(H-2K)-реципиентам. Этот способ был взят из Billingham R.E. and Medawar P.B., J.Exp. Biol. 28:385-402, (1951). В частности, кусочковый кожный трансплантат из донора трансплантировали на спину реципиента в качестве аллотрансплантата, а изотрансплантат использовали в качестве контроля в той же области тела. Реципиентов обрабатывали либо внутрибрюшинным введением различных концентраций тестируемых соединений, либо эти соединения вводили перорально. Рапамицин использовали в качестве тест-контроля. Не получающие тест-соединения реципиенты служили в качестве контроля отторжения трансплантата. Трансплантат наблюдали ежедневно и наблюдения регистрировали до тех пор, пока трансплантат не становился сухим и не образовывал почерневшую корку. Этот день считали днем отторжения. Среднее время выживания трансплантата (число дней S. D. (стандартное отклонение)) группы, получавшей тест-соединение, сравнивали с контрольной группой. Результаты выражали в виде среднего времени выживания в днях. Необработанные (не получавшие тест-соединения) кусочковые кожные трансплантаты обычно отторгались в интервале 6 - 7 дней. Время выживания 11,670,63 дней получили для рапамицина при концентрации 4 мг/кг при внутрибрюшинном введении (i.p.). Поскольку соединения этого изобретения являются пролекарствами рапамицина, дозы, представленные ниже, даются в дозах эквивалента рапамицина (6,2 мг соединения примера 2 содержит эквивалент 1 мг рапамицина). Результаты, полученные для соединения примера 2, ПЭГ-5000 и необработанной контрольной группы, представлены в таблице ниже.

Результаты этого стандартного фармакологического теста демонстрируют иммуносупрессивную активность соединений этого изобретения. Кроме того, результаты, полученные в кусочковом кожном тесте, демонстрируют способность соединений этого изобретения лечить или ингибировать отторжение трансплантата.

На основании результатов этих стандартных фармакологических тест-процедур эти соединения применимы в лечении или ингибировании отторжения трансплантатов, таких как почки, сердце, печень, легкое, костный мозг, поджелудочная железа (клетки панкреатических островков), роговица, тонкая кишка и кожные аллотрансплантаты и ксенотрансплантаты сердечных клапанов, в лечении или ингибировании реакции "трансплантат против хозяина", в лечении или ингибировании аутоимунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, сахарный диабет, тяжелая псевдопаралитическая миастения и множественный склероз, и воспалительных заболеваний, таких как псориаз, дерматит, экзема, себоррея, воспалительное заболевание тонкого кишечника, воспаление легких (в том числе астма, хроническое закупоривающее легочное заболевание, эмфизема, острый респираторный дистресс-синдром, бронхит и т.п.) и увеит глазного яблока.

На основании полученного профиля активности можно считать, что соединения этого изобретения обладают также противоопухолевой активностью, противогрибковой активностью и антипролиферативными активностями. Таким образом, соединения этого изобретения применимы также в лечении твердых опухолей, в том числе сарком и карцином, таких как астроцитома, рак представленной железы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легких и рак яичников, T-клеточной лимфомы взрослых, грибковых инфекций, и гиперпролиферативных сосудистых заболеваний, таких как рестеноз и атеросклероз. При использовании в случае рестеноза предпочтительно использовать соединения этого изобретения для лечения рестеноза после пластических операций на сосудах. При использовании для этой цели соединения данного изобретения можно вводить перед процедурой, во время процедуры и после процедуры операции или любым комбинированием этих способов.

При лечении или ингибировании описанных выше патологических состояний соединения этого изобретения можно вводить млекопитающим перорально, парентерально, интраназально, интрабронхиально, трансдермально, топическим путем, интравагинально или ректально.

Соединения этого изобретения, в частности, особенно благоприятны в качестве иммуносупрессивных, противогрибковых, антипролиферативных и противоопухолевых агентов вследствие их растворимости в воде. Например, рапамицин имеет растворимость 1,2 мкг/мл в воде, тогда как соединение примера 2 имеет растворимость более 100 мг/мл, что облегчает приготовление готовых лекарственных форм и введение.

Предполагается, что при использовании соединений данного изобретения в качестве иммуносупрессивных или противовоспалительных агентов они могут вводиться в сочетании с одним или более другими иммунорегуляторными агентами. Такие другие иммунорегуляторные агенты включают в себя (но не только) азатиоприн, кортикостероиды, такие как преднизон и метилпреднизолон, циклофосфамид, рапамицин, циклоспорин A, FK-506, OKT-3 и ATG. Благодаря комбинированию соединений этого изобретения с такими другими лекарственными средствами или агентами для индуцирования иммуносупрессии или лечения воспалительных состояний требуются меньшие количества каждого из агентов для достижения желаемого эффекта. Основа для такой комбинаторной терапии была установлена Strepkowski, результаты которого показали, что использование комбинации рапамицина и циклоспорина A при субтерапевтических дозах значительно пролонгирует время выживания сердечного аллотрансплантата [Transplantation Proc. 23:507 (1991)].

Соединения этого изобретения могут быть приготовлены в чистом виде в готовой форме или с фармацевтическим носителем для млекопитающего, нуждающегося в лечении ими. Фармацевтический носитель может быть твердым веществом или жидкостью.

Твердый носитель может включать в себя одно или более веществ, которые могут действовать как улучшающие вкус и запах агенты (корригенты), смачивающие вещества, солюбилизаторы, суспендирующие агенты, наполнители, смазывающие вещества, способствующие прессованию вещества, связующие вещества или дезинтегрирующие таблетку агенты; он может быть также инкапсулирующим материалом. В порошках носитель представляет собой мелкоизмеченное твердое вещество, которое находится в смеси с мелкоизмельченным активным ингредиентом. В таблетках активный ингредиент смешивают с носителем, имеющим необходимые для прессования свойства, в подходящих соотношениях и уплотняют в желаемой форме и размере. Предпочтительно порошки и таблетки содержат до 99% активного ингредиента. Подходящие твердые носители включают в себя, например, фосфат кальция, стеарат магния, тальк, сахара, лактозу, декстрин, крахмал, желатин, целлюлозу, метилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воски с низкой точкой плавления и ионообменные смолы.

Жидкие носители используют в приготовлении растворов, суспензий, эмульсий, сиропов, эликсиров и находящихся под давлением композиций. Активный ингредиент может быть растворенным или суспендированным в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода, органический растворитель, смесь воды и органического растворителя или фармацевтически приемлемые масла или жиры. Жидкий носитель может содержать другие подходящие фармацевтические добавки, такие как солюбилизаторы, эмульгаторы, буферы, консерванты, подслащивающие вещества, улучшающие вкус и запах агенты (корригенты), суспендирующие агенты, загустители, красители, регуляторы вязкости, стабилизаторы или осморегуляторы. Подходящие примеры жидких носителей для перорального и парентерального введения включает в себя воду (частично содержащую указанные выше добавки, например производные целлюлозы, предпочтительно натрий-карбоксиметилметилцеллюлозу в виде раствора), спирты (в том числе одноатомные спирты и многоатомные спирты, например гликоли) и их производные, лецитины и масла (например, фракционированные масло коксового ореха и арахисовое масло). Для парентерального введения носитель может также представлять собой маслянистый сложный эфир, такой как этилолеат и изопропилмиристат. Стериальные жидкие носители применимы в стерильных композициях в жидкой форме для парентерального введения. Жидким носителем для находящихся под давлением композиций могут быть галогенированный углеводород или другой фармацевтически приемлемый газ-вытеснитель.

Жидкие фармацевтические композиции, представляющие собой стерильные растворы или суспензии, можно использовать, например, посредством внутримышечной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции. Стерильные растворы можно также вводить внутривенно. Соединение данного изобретения можно также вводить перорально в форме либо жидкой, либо твердой композиции.

Соединения этого изобретения можно вводить ректально в форме обычного суппозитория. Для введения интраназальной или интрабронхиальной ингаляцией или инсуффляцией соединения этого изобретения могут быть приготовлены в виде водного или частично водного раствора, который можно затем использовать в форме аэрозоля. Соединения этого изобретения можно также вводить трансдермально путем применения трансдерамального пластыря, содержащего активное соединение и носитель, который инертен относительно активного соединения, нетоксичен для кожи и делает возможной доставку этого агента для системного всасывания в кровоток через кожу. Носитель может быть в любой форме, такой как кремы и мази, пасты, гели и закрывающие (герметические) приспособления. Кремы и мази могут быть вязкими, жидкими или полутвердыми эмульсиями типа масло в воде или типа вода в масле. Могут использоваться также пасты, содержащие абсорбирующие порошки, диспергированные в нефти или гидрофильной нефти, содержащей активный ингредиент. Множество герметических приспособлений можно использовать для высвобождения активного ингредиента в кровоток, таких как полупроницаемая мембрана, закрепляющая резервуар, содержащий активный ингредиент с носителем или без носителя, или матрикс, содержащий активный ингредиент. Другие закрывающие (герметические) приспособления известны в литературе.

Кроме того, соединения этого изобретения можно использовать в виде раствора, крема или лосьона путем приготовления с фармацевтически приемлемыми носителями, содержащими 0,1 - 5%, предпочтительно 2%, активного соединения, которые можно вводить на пораженную грибками зону.

Требования к дозам варьируют в зависимости от конкретных используемых композиций, от способа введения, тяжести обнаруживаемых симптомов и от конкретного подвергаемого лечению субъекта. На основании результатов, полученных в процедурах стандартного фармакологического теста, предполагаемые суточные дозы активного соединения равны 0,1 мкг/кг - 100 мг/кг, предпочтительно между 0,001 - 25 мг/кг и более предпочтительно между 0,01 - 5 мг/кг. Лечение обычно инициируется малыми дозами, меньшими, чем оптимальная доза соединения. После этого дозу увеличивают до тех пор, пока не достигается оптимальный эффект для данных условий, точные дозы для перорального, парентерального, назального или внутрибрюшинного введения должны определяться вводимым эти соединения врачом на основании его опыта с конкретным субъектом, проходящим лечение. Предпочтительно фармацевтическая композиция находится в форме стандартных доз, например в виде таблеток или капсул. В такой форме композиция подразделена на подходящие стандартные дозы, содержащие пригодные количества активного ингредиента, формы стандартных доз могут быть упакованными композициями, например упакованными порошками, флаконами, ампулами, заранее заполненными шприцами или мешочками, содержащих жидкости. Форма стандартной дозы может быть, например, самой капсулой или таблеткой или она может быть в виде подходящего количества любой из таких композиций в упакованном виде.

Следующие далее примеры иллюстрируют получение и биологические активности характерных соединений этого изобретения.

Пример 1. 42-иодоацетатный эфир рапамицина

Рапамицин (0,5 г, 5,510^-4 моль) и ДМАП (3,0 мг) растворяли в 15 мл безводного метиленхлорида. Иодуксусную кислоту (0,123 г, 6,610^-2 моль) и ДЦК (0,136 г, 6,610^-4) растворяли в 20 мл безводного метиленхлорида и эту смесь переносили в капельную воронку, эту смесь медленно добавляли к раствору рапамицина в течение 30 минут при перемешивании. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного дополнительного часа.

Полученный раствор фильтровали через фильтр из спекшегося стекла. Фильтрат переносили в делительную воронку и промывали сначала двумя порциями по 40 мл раствора бикарбоната натрия (5,5 г/100 мл) и затем водой (250 мл). Слой метиленхлорида сушили с 3 г безводного сульфата натрия в течение 5 часов. Затем сульфат натрия удаляли фильтрованием и метиленхлорид выпаривали, получая 0,53 г бледно-желтого твердого соединения. ЖХВР показала присутствие 42-эфира (55%), 31-эфира (9,2%), 31,42-диэфира (17%) и непрореагировавшего рапамицина (17%).

Чистый 42-иодацетат выделяли препаративной ЖХВР на колонке Primesphere (250x50 мм, 10 микрон). Рапамицин-42-иодацетат элюировался при 8,1% мин при использовании 80% метиленхлорида (раствора A) и 20% раствора 8. Раствор B состоял из 85% метиленхлорида и 15% раствора C (смесь 2:1=метанол:изопропанол).

Элюат упаривали и остаток растворяли в метиленхлориде, сушили и упаривали, получая 0,206 г твердого соединения. (+) Ион Ms m/z 1099,5 (M + NH₄)⁺, (-) Ион Ms m/z 1080,5. ¹H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 3,78 (с, 2H, CO-CH₂-1), 4,54 (м, 1H, H-42).

Аналит. рассчитано для C₅₃H₈₀NO₄1: C 58,83, H 7,45, N 1,29.

Найдено: C 58,97, H 7,64, N 1,36.

Пример 2. 42-эфир рапамицина с метоксиполиэтиленгликольтиолом 5000

Способ 1

42-иодацетатный эфир рапамицина (0,1 г, 9,210^-5 моль) растворяли в метиленхлориде (15 мл) и метаноле (15 мл). Затем мПЭГ- H 5000 (0,6 г, 1,210^-4 моль) и PROTON SPONGE (20 мг, 9,310^-5 моль) добавляли к этому реакционному раствору, который перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем опять добавляли 10 мг PROTON SPONGE и реакционный раствор опять перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили добавлением эфира (200 мл). Белый осадок отфильтровывали и промывали эфиром (3х20 мл), получая 0,59 г неочищенного продукта.

Неочищенный продукт очищали далее при помощи препаративной ЖХВР на колонке Zorbax C8 (250х20 мм) с применением градиента раствора A с 30 - 80% раствором B. Раствор A состоял из 90% 0,1 M ТЭАА (ацетат тетраэтиламмония) - буфера pH 4,5 и 90% ацетонитрила. Раствор B состоял из 10% 0,1 M ТЭАА-буфера pH 4,5 и 90% ацетонитрила. 42 мПЭГ-S 5000-ацетатный эфир рапамицина элюировался при 21 мин. Водную фазу экстрагировали метиленхлоридом (2х50 мл). Органический слой сушили безводным сульфатом натрия в течение 14 часов и концентрировали до объема 10 мл при пониженном давлении. Продукт осаждали добавлением 100 мл эфира. Белый осадок собирали на фильтре из спекшегося стекла и промывали эфиром (3х20 мл), получая 109,6 мг продукта.

Способ 2

42-иодацетатный эфир рапамицина (0,5 г, 4,610^-4 моль) растворяли в 130 мл раствора, содержащего 50% ацетонитрила и 50% водного бикарбоната натрия (0,1 М раствора). Этот раствор продували азотом в течение 10 минут. Для проверки исходного состояния реагента брали пробу 20 мкл и добавляли к 1 мл ацетонитрила. Раствор фильтровали и пробу 10 мкл подвергали анализу ЖХВР.

мПЭГ-SH 5000 (3,15 г, 6,310^-4 моль) добавляли к этому реакционному раствору в течение периода 1,5 часов и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре еще в течение 1,5 часов. Брали другую пробу 20 мкл, смешивали с 1 мл ацетонитрила, фильтровали и вводили в систему ЖХВР. Результаты анализа ЖХВР показали, что иодоацетат рапамицина количественно превращался в 42-мПЭГ-S 5000-ацетатный эфир рапамицина.

Реакционную смесь экстрагировали метиленхлоридом (2х500 мл). После высушивания органического слоя безводным Na₂SO₄ и фильтрования фильтрат концентрировали до объема приблизительно 20 мл. Конечный неочищенный продукт осаждали добавлением 250 мл эфира, эту суспензию затем фильтровали и сушили под вакуумом, получая 3,13 г сухого белого материала (вещества).

Непрореагировавший мПЭГ-SH удаляли при помощи препаративной ЖХВР, как описано в способе 1.

MS (MADI/TOF) обнаруживает среднюю мол.массу 5877,47 для этого продукта и 4923,66 для исходного мПЭГ-SH 5000. Различие в массе (953,81) точно совпадает с массой 42-ацетатной части рапамицина (953,6). Эфирная боковая цепь может быть представлена формулой -COOH₂-S-CH₂CH₂-O-CH₂-(CH₂OCH₂)_n -CH₂-O-CH₂2CH₂- OCH₃, где n представляет собой в среднем 108 повторяющихся единиц. ¹H-ЯМР (400 МГЦ, CDCl₃ 2,84) (т, 2H, S-CH₂-CH₂), 3,27 (с, 2H, CO-CH₂-S), 3,36 (с, 3H,-OCH₃), 3,64 (м, 4H, O-CH₂-CH₂-O), 4,69 (м, 1H, H-42).

MS (MALDI/TCF) m/z 5877,47 (средняя мол.масса) УФ (CH₃CN) _макс 268, 278, 290 нм.

Пример 3. 31,42-дииодацетат рапамицина

Рапамицин (0,5 г, 5,510^-2 моль), ДЦК (0,28 г, 1,410^-3 моль) и ДМАП (30 мг) растворяли в безводном метиленхлориде (15 мл). Иодуксусную кислоту (0,25 г, 1,410^-3 моль) добавляли к реакционному раствору и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем этот раствор фильтровали через фильтрат из спекшегося стекла. Фильтрат промывали двумя порциями по 40 мл раствора бикарбоната натрия (5,5 г/200 мл) и водой (2х50 мл). Слой метиленхлорида сушили 3 г безводного сульфата натрия в течение 5 часов. Затем сульфат натрия удаляли фильтрованием и метиленхлорид выпаривали, получая 0,63 г бледно-желтого твердого вещества. Данные ЖХВР показали, что образовалось 99,4х 31,42-дииодацетата рапамицина.

(+) Ион MS m/z 1272,3 (N+Na)⁺.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) 3,77 (к, 3H, CO-CH₂-I, 31-эфир), 3,784 (с, 2H, CO-CH₂-I, 42-эфир), 4,31 (д, 1H, H-31), 4,54 (м, 1H, H-42).

Пример 4. 31,42-диэфир рапамицина с метоксиполиэтиленгликольтиолом 5000

31,42-дииодацетат рапамицина (5,99 мг, 4,810^-5 моль) растворяли в 70 мл раствора 50% CH₃CN-50% NaHCO₃ (0,1 М). Раствор продували азотом в течение 10 минут. В реакционный раствор добавляли мПЭГ-SH 5000 (0,778 г, 1,510^-4 моль). После перемешивания реакционного раствора в течение 30 минут брали пробу 30 мкл, смешивали в 1 мл ацетонитрила и фильтровали. Пробу (10 мкл) подвергали анализу ЖХВР. Данные показали, что дииодацетат рапамицина превращался на 100% в 31,42-ди(мПЭГ-5000-ацетатный) эфир рапамицина.

Реакционную смесь экстрагировали сухим метиленхлоридом (2х300 мл). Слой метиленхлорида сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали до объема 20 мл. Продукт осаждали добавлением 250 мл эфира, фильтровали и сушили под вакуумом, получая 0,22 белого твердого вещества. MS (MALDI/TOF) показывает среднюю мол.массу 10983 Д. Эфирные боковые цепи могут быть представлены формулой -COCH₂-S-CH₂-CH₂-O-CH₂-(CH₂OCH₂)_n -CH₂-O-CH₂CH₂-OCH₃, где n представляет собой в среднем 108 повторяющихся единиц.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) 3,23 (к, 2H, CO-CH₂-S, 31-эфир), 3,25 (с. 2H, CO-CH₂-S, 42-эфир), 4,65 (м, 1H, H-42), 5,25 (д, 1H, H-31).

Пример 5. 42-эфир рапамицина с метоксиполиэтиленгликольтиолом 750

42-иодацетатный эфир рапамицина (100 мг, 9,210^-5 моль) растворяли в 30 мл раствора 50% CH₃CN-50% NaHCO₃ (0,1 М раствора). Этот раствор продували азотом в течение 10 минут. В реакционный раствор добавляли мПЭГ-SH-750 (1,25 г, 1,6710^-3 моль). После перемешивания реакционного раствора в течение 30 минут брали пробу 30 мкл, добавляли 1 мл CH₃CN и фильтровали. Пробу (10 мкл) подвергали анализу ЖХВР. Результаты показали, что 42-иодацетат рапамицина количественно превращался в 42-мПЭГ-S-750-ацетатный эфир рапамицина.

Реакционную смесь экстрагировали сухим метиленхлоридом (2х300 мл). Слой метиленхлорида сушили с безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали до объема 20 мл. Продукт осаждали добавлением 250 мл эфира, фильтровали и сушили под вакуумом, получая 80 мг вязкого маслянистого жидкого вещества.

Эфирная боковая цепь может быть представлена формулой COCH₂-S -CH₂CH₂-O-CH₂(CH₂OCH₂)_n -CH₂-O-CH₂CH₂-OCH₃, где n представляет собой в среднем 14 повторяющихся единиц.

ESI-MS (M+NH₄)⁺ m/z 1460,1 (n=10), 1548,1 (n=12), 1592,2 (n=13), 1636,2 (n= 14), 1680,1 (n= 15), 1724,0 (n= 16), 1769,0 (n=17), 1812,9 (n=18); (M+NH₄)²⁺ m/z 871,3 (n=16), 893,5 (n=17), 915,5 (n=18), 937,0 (n=19), 959,4 (n=20), 981,4 (n=21).)т