применение производных 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты в качестве химиопрофилактических и химиотерапевтических агентов при раке ободочной кишки

Формула изобретения

1. Применение производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты общей формулы



где Х представляет -SO₂- или -СО-группу, а R представляет либо фенильный, либо карбоксиметилфенильный радикал, или представляет радикал формулы -(CH₂)_nУ, где У представляет гидроксильную группу, аминогруппу, моноалкил- или диалкиламиногруппу, алкильные части которых содержат вплоть до 6 атомов углерода, или карбоксильную группу или группу сульфоновой кислоты, и n является целым числом от 1 до 6, и где один или более из атомов водорода в алкиленовом радикале могут быть замещены аминогруппами, моноалкил- или диалкиламиногруппами, алкильные части которых содержат вплоть до 6 атомов углерода, или алкильными радикалами, и в которых радикал -(CH₂)_nУ либо непосредственно присоединен к атому азота или через бензольное кольцо, при условии, что R-NH-X- отличается от радикала -CO-NH-CH₂-COOH; или его сложный эфир, или активный метаболит, или продукт окисления активного метаболита, или его нетоксичную, фармакологически приемлемую соль производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты, или его сложного эфира, или активного метаболита, или продукта окисления активного метаболита при получении лекарственного препарата для использования в способе лечения индивидуума, страдающего раком ободочной кишки, или подверженного риску развития рака ободочной кишки.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанный лекарственный препарат состоит, по существу, из производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты или его сложного эфира, или активного метаболита, или продукта окисления активного метаболита или соли производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты, или его сложного эфира, или активного метаболита, или продукта окисления активного метаболита, в смеси с твердым или жидким фармацевтическим разбавителем или носителем.

3. Применение по п. 1, где производным 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты является бальсалазид.

4. Применение по п.1, где активным метаболитом является 5-ASA.

5. Применение по п.1, где продуктом окисления активного метаболита является продукт окисления 5-ASA.

6. Применение по п.5, где продуктом окисления 5-ASA является гентизиновая кислота.

7. Применение по п.5, где продуктом окисления 5-ASA является 5-нитросалицилат.

8. Применение по п.1, где производное вводят перорально нуждающемуся в таком лечении человеку, в дозе в интервале от 1 до 14 г в расчете на 70 кг веса пациента в день.

9. Применение по п.1, где производное вводят ректально нуждающемуся в таком лечении человеку в дозе в интервале 1 - 14 г в расчете на 70 кг веса тела в день.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к химиопрофилактике и химиотерапии рака ободочной кишки

Предпосылки изобретения

В настоящее время рак ободочной кишки за год в США является причиной 11% смертей, вызванных злокачественными образованиями. С частотой 62 на 100000 и распространенностью в 300 на 100000 это заболевание в настоящее время является третьей по счету причиной смерти у мужчин и четвертой - у женщин. Рак ободочной кишки приводит к гибели в течение менее 5 лет в более 50% случаев, что объясняется наличием поздней стадией развития при постановке диагноза. Разработанное в последнее время лечение, хирургия совместно с химиотерапией, не дает возможности увеличить продолжительность выживания. Что необходимо, так это безопасное и эффективное профилактическое лечение, которое можно начать на ранней стадии у пациентов, которые подвержены возрастающему риску развития рака ободочной кишки.

Эйкозаноиды и дифференцированные функции клеток желудочно-кишечного тракта

Эйкозаноиды являются существенными регуляторами роста эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта, их дифференциации и функционирования. Продукты эйкозаноидов серий простагландинов, как известно, вызывают секрецию слизи (Beckel and Kauffman (1981) Gastroenterology 80:770-776) и секрецию электролитов и жидкости (Miller (1983) Am. J.Physiol. 245:G601 G623). Они также вызывают активный транспорт (bukhave and Rask-Madsen (1980) Qastroenterology 78: 32-37) и увеличение реплекационной способности эпителия (Konturek et al, (1981) Gastroenterology 80:1196-1201). Эти реакции приводят к сохранению дифференцированной, защитной барьерной системы тесно связанных клеток эпителия, апикальная поверхность которых покрыта плотным глико-коньюгатным буфером. В желудке и в верхней части двенадцатиперстной кишки этот барьер защищает от кислотного и протеолитического окружения, вырабатываемого для переваривания, тогда как в ободочной кишке он защищает против проникновения бактерий и токсинов. Поэтому вовсе не удивительно, что экзогенные синтетические простагландины являются активно цитозащитными (Whittle and Vane, (1987); in: Jonson (ed.), Physiology of the gastrointestinal tract, yol 1, 2 nd. ed., New York, Raven ress, pp 143-180) и, как было обнаружено, обладают терапевтической применимостью в качестве вторичных противоязвенных препаратов. Таким образом, желудочно-кишечная система ("GJ") развивается таким образом, чтобы активно продуцировать и полагаться на специфический дифференцированный комплемент продуктов эйкозаноидов, присутствующих в локальном окружении. Так как все эйкозаноиды получены из общего предшественника арахидоновой кислоты, которая, в свою очередь, высвобождается из фосфолипидов мембраны, клетки слизистой желудочно-кишечного тракта обладают относительно высоким базальным уровнем превращения арахидоната, инициируемым энзимом фосфолипазой A₂(PLA₂).

Система желудочно-кишечного тракта является также основным защитным механизмом против бактерий окружающей среды, антигенов и токсинов, и поэтому должна также обладать способностью создавать агрессивную и быструю воспалительную реакцию. Такая реакция также основана на продуктах эйкозаноидов как ряда простагландинов (PG), так и ряда хемотоксических лейкотриенов (LT_s), что приводит к притоку вырабатываемых кровью нейтрофилов, макрофагов и иммунных клеток в ответ на активирующий агент. Каждая из этих вторгающихся клеток привносит с собой способность метаболизировать ее собственные фосфолипиды, а также фосфолипиды слизистой и люминальные фосфолипиды за счет выделения воспалительных (секретируемых) PLA₂, для того, чтобы усилить выделение арахидиновой кислоты, которая затем метаболизируется как в PQ_s, так и в LT_s.

Хотя инфильтрация воспалительных клеток ограничивает и разрушает раздражающие стимулы, степень повреждения, связанная с продуктами, выделяемыми воспалительными клетками, значительна. Нейтрофилы и макрофаги выделяют супероксид (O₂^-) (Kitahora et al., (1988) Dig. Dis. Sci. 33:951-955), а также перекись водорода (H₂O₂) (Tauber and Babior (1985) Free Radic.Biol.Med. 1: 265-307) и протеазы (Ohisson et al., (1977) Hoppe Saylers Z.Physiol.Chem. 358: 361-366). В тех случаях, когда полученная в результате инфильтрация чрезмерна, происходит денудация эпителиального слоя с последующим компромиссом барьерных функций. Тогда требуется прекращение воспалительной реакции для восстановления оптимального эпигелиального барьера.

Хроническое воспаление желудочно-кишечного тракта и индуцирование рака желудочно-кишечного тракта

В настоящее время хорошо документировано, что такие хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта, как язвенные колиты (Lennard - Jones et al. (1977) Gastroenterology 73:1280-1285), Болезнь Крона (Crohn"s disease)(Farmer et al. (1971) Cancer 28:289-295) и хронические атрофические гастриты (Sippon en et.al (1983) Cancer 52:1062-1067) связаны с повышенным риском последующего рака желудочно-кишечного тракта. Хотя механизм до сих пор не доказан, во время множественных эпизодов острых воспалений наблюдаются три важных, представляющих интерес схемы, которые могут привести к последующей трансформации, усиленной пролиферации и злокачественной инвазии. Как будет обсуждено далее, это: (1) увеличение свободных радикалов в ободочной кишке и карциногенов, (2) изменение регуляции трофических эйкозаноидов и (3) индуцирование генных продуктов, за счет которых происходит клеточная инвазия.

Изменение отложения карциногенов за счет актов воспалений

Ободочная кишка может быть подвержена весьма существенному отложению генотоксичных карциногенов и опухолевых промоторов, образующихся в результате метаболизма соединений продуктов питания и таких эндогенных секретов, как желчные кислоты, за счет бактерий ободочной кишки. Связь между фекальными карциногенами и возникновением рака ободочной кишки подтверждается обнаружением усиленного мутагенеза в стулах индивидуумов с высокой степенью риска по сравнению с населением с низкой степенью риска (Reddy et al. (1980) Mut. Res. 72: 511-515). Такая корреляция согласуется также с повторными обнаружениями, демонстрирующими негативную связь между поглощением диетического волокна и случаями рака ободочной кишки (Armstrong and Doll (1975) Int. J. Cancer 15: 617-623). Постулируется, что защитный эффект волокна связан с увеличением объема стула, что приводит к разбавлению карциногенов стула и к уменьшению времени прохождения, что, в свою очередь, приводит к более быстрому удалению карциногенов. Эти результаты увеличивают возможность того, что если уменьшение концентрации карциногенов в стуле может привести к снижению риска ракового заболевания, тогда повышение отложения карциногенов может привести к возрастанию такого риска. Причиной одного из таких увеличений карциногенов в ободочной кишке могут быть последовательные воспалительные акты.

Наиболее уместным примером является продуцирование воспалительными нейтрофилами карциногенных нитрозаминов за счет L -аргинин-зависимого образования окисей азота и окислов азота (Grsham (1993) Gastroenterology 104: A243). Другие продукты окисления, выделяемые воспалительными клетками, включают супероксиды, а также перекись водорода, которые, в присутствии определенных переходных металлов, таких, как железо (Fe), могут вырабатывать в высшей степени реакционноспособный и цитотоксичный гидроксильный радикал (ОН:) (Grshem (1990) Biochem. Pharmacol. 39:2060-2063). Вдобавок к увеличению содержания карциногенов и свободных радикалов, образующемуся за счет притока воспалительных клеток, известно также, что каскад арахидиновой кислоты способен продуцировать мутагенные метаболиты. Метаболит простагландина H2 (PGH2), малондиальдегид (МДА), является мутагеном прямого действия ин витро (Mukai and Goldstein (1976) Science 191:868-869), и карциногеном у животных (Basu and Marnett (1983) Garcinogenesis 4:331-333), и может быть энзиматически получен за счет тромбоксансинтетазы с высоким выходом в клетках с активной схемой циклооксигеназы. Было показано, что МДА осуществляет мутацию со сдвигом рамки, аналогичную той, которая связана с p53 геном ободочной кишки человека (Marnett et.al (1985) Mutat.Res. 129:36-46). Сама PGH синтаза является эффективной пероксидазой, и было показано, что она катализирует активацию широкого круга полициклических углеводородов до мутагенов (Marnett (1981) Life Sci. 29:531-546).

Эти результаты предполагают, что хроническая и аберрантная (отклоняющаяся от нормы - пер.) (управляемая воспалительными клетками) активация каскада арахидоновой кислоты в желудочно-кишечном тракте является одной из схем, которая может привести к повышению содержания карциногенов с потенциальным индуцированием ДНК мутаций в моменты времени максимального синтеза ДНК. Усиление клеточной пролиферации, следствием которой является эпителиальная денудация, индуцируемая вторгающимися воспалительными клетками, может привести к повышенному количеству клеток, подверженных действию таких карциногенов. В другом варианте усиленная пролиферация может служить возрастанию числа мутаций (за счет клональной экспансии), индуцируемой ранее карциногенами.

Измененная регуляция эйкозаноидов может управлять пролиферацией за счет воспалительных актов.

Дополнительным механизмом, связывающим воспаления желудочно-кишечного тракта и развитие рака этого тракта, может быть нарушение нормальной регуляции эйкозаноидов. Как обсуждалось ранее, нормальные дифференцированные функции эпителия слизистой желудочно-кишечного тракта тесно связаны с широким кругом биологических активностей, на которые влияют эндогенные эйкозаноиды. Так как эти агенты действуют локально, а обычно отличаются коротким сроком полу-жизни из-за активной метаболической инактивации, периоды острых воспалительных процессов должны существенно изменять нормальную регуляцию эйкозаноидного гомеостаза.

После вторжения в воспалительный участок нейтрофилов и макрофагов эти нормальные динамики существенно изменяются. Во-первых, воспалительные клетки приносят с собой широкий круг дополнительных агонистов, таких как цитокины, протеазы и факторы роста (Adams and Hamilton (1984) Ann.Rev. Immunol 2: 283-318, Ohisson et. al (1977) Physiol. Chem. 358:361-366, Nathan and Cohn (1980) в Kelly et.al (ed) Textbook of Rheumatology, NewYork: W.B. Saunders, pp 186-215), которые сами постоянно активируют PLA₂ (cPLA₂) для выделения арахидоновой кислоты. Во-вторых, воспалительные клетки являются богатым источником дополнительных форм PLA₂, известных как секреторные, или _sPLA₂ (Seilhamer et.al (1989) J.Biol. 264:5335-5338), активности которых в воспалительных процессах желудочно-кишечного тракта были недавно документированы (Minami et al. (1992) Gut 33:914-921).

В отличие от cPLA₂, _sPLA₂ выделяется из воспалительных клеток (Wright et. al (1990). J. Brol. Chem. 265:6675-6681), тромбоцитов (Hayakawa et al. (1988) J. Biochem. 104-767-778), xoндроцитов (Lyons-Goirdano et al. (1989). Biochem Biophys. Pes. Commun. 164:488-495) и клеток гладкой мускулатуры желудка (Nakano et al.(1990) FEBS Lett 261:171-174) за счет цитокинов (Pfeilscifter et. al, (1989) Biophys. Res. Commun 159:385-394) и, особенно, эндотоксинов (Oka and Arita (1991) J.Biol. Chem. 266:9956-9960). Кроме того, так как внеклеточная среда содержит максимальную концентрацию кальция, _sPLA₂ оказывается разрегулированными после выделения. Поэтому после выделения они активно гидролизуют арахидоновую кислоту и другие жирные кислоты по sh-2 положению фосфолипидов, которые находятся в клеточных и бактериальных мембранах, а также из продуктов питания и липопротеиновых источников. Лизофосфолипид, получающийся после удаления sh-2-жирной кислоты из многих таких фосфолипидов, является потенциально лизогенным для окружающих клеток (Okada and Cyong (1975) Jpn. J. Exp.Med. 45:533-534). Таким образом, эта реакция может также привести к лизису эпителиальных клеток и денудации в нефильтрующих участках, что, в конечном счете, требует усиления пролиферации для сохранения барьерных функций.

Воспалительная реакция и активация генов, управляющих клеточной инвазией.

Воспалительная реакция не только нарушает нормальную регуляцию эйкозаноидов, но также приводит к активации генных продуктов, требуемых для клеточной инвазии. Один из таких продуктов, рецептор активатора плазминогена урокиназы _uPAR), обычно экспрессируется эпителиальными клетками кишечника. Его прикрепление к клеточной поверхности может быть важной детерминантой нормальной миграции и десквамации клеток крипты за счет протеолиза поверхностных клеток (Kristensen et al. (1991) J.Cell. Biol. 115:1763-1771). В воспалительных клетках _uPAR ген индуцируется за счет активаторов протеин-киназы C такими опухолевыми промоторами, как форболэфир ТРА (Lund et al. (1991), J.Biol. Chem, 266:5177-5181) и за счет различных цитокинов (Lund et. al, (1991) EMBO J. 10:3399-3401), которые индуцируют инвазивный фенотип, необходимый для инфильтрации тканей (Stoppelli et al. (1985) Natl Acad. Sci USA 82:4939-4943). Поэтому неудивительно, что высокие уровни _uPAR экспрессии также были обнаружены в некоторых опухолевых клеточных линиях с метастатическим потенциалом, включая клетки, получаемые за счет рака ободочной кишки (Pyke et al. (1991) Am. J. Pathol. 138:1059-1067). Особый интерес представляют эксперименты по совместному культивированию, которые демонстрируют, что инвазивный потенциал гораздо более тесно связан с экспрессией _uPAR, нежели с его активатором лигандного плазминогена (Ossowski et al. (1991) J.Cell.Bшol. 115: 1107-1112). Таким образом, множественные циклы воспалительных реакций также могут внести вклад в _uPAR сверх экспрессию в клетках слизистой ободочной кишки, что приводит к накоплению инвазивного фенотипа в ранее доброкачественной опухоли.

Клетки слизистой желудочно-кишечного тракта поэтому оказываются крайне чувствительными к случаям хронических воспалений из-за трех интересующих нас схем: (1) эпителиальные клетки расположены в окружении с высоким содержанием карциногена, что может в дальнейшем еще увеличиться при воспалительных процессах; (2) продукты как эндогенных, так и инфильтрационных эйкозаноидных каскадов являются трофическими агентами; и (3) их собственная дифференцированная реакция на воспалительные агенты включает экспрессию генных продуктов для накопления инвазивного фенотипа. Взятые вместе эти три схемы могут привести к акту трансформации и в результате - к индуцированию, развитию и инвазии опухоли. Поэтому агенты, которые блокируют некоторые ветви эйкозаноидного каскада, являются полезными в химиопрофилактике рака ободочной кишки.

Полипы и центры аберрантных криптов как предшественники рака ободочной кишки.

В настоящее время широко известно, что аденомообразные полипы являются предшественниками рака ободочной и прямой кишки, и их появление, размер и количество могут предсказать степень относительного риска развития рака ободочной кишки (см. Lotfi et al. (1986) Mayo Clinic Proc., 61-337-343). Хотя аденомообразные полипы являются предшественниками очагов рака ободочной кишки, в настоящее время также принято, что ранние патологические очаги, называемые центрами аберрантных криптов, являются предшественниками аденомообразных полипов. Центры аберрантных криптов (ACF) могут быть идентифицированы в нормального вида слизи ободочной кишки, и было показано, что они присутствуют в большом количестве и крупного размера в образцах от пациентов со спорадическим раком ободочной кишки или генетически унаследованным семейным аденомообразным полипозом (Ronuсucci et al. (1991) Human Pathol. 22(3):287-294; Pret-low et al. (1991) Cancer Res. 51:1564-1567).

NSAIDs и химиопрофилактика рака ободочной кишки

Существует доказательство того, что некоторые нестероидные противовоспалительные лекарства (NSAIDs) являются эффективными в плане снижения числа животных с опухолями и случаев появления опухолей на животном в опытах с крысами (карциногенез ободочной кишки) (Narisawa et al. (1981) Cancer Res. 41:1954-1957), (Pollard et al. (1983) Cancer Lett. 1:57-61) (Moorghen et al. (1988) J. Pathol. 156: 341-347) (Reddy et al. (1993) Gastroenterology 104: A443), когда вплоть до 70% уменьшения числа опухолей отмечалось для доз в 80% от максимальной толерантной дозы. В исследованиях вызванного диметилгидразином карциногенеза ободочной кишки отмечалось, что сулиндак (Sulindac.) уменьшает число случаев образования опухоли только если он присутствует во время введения карциногена, но эффекта не наблюдается, если его вводят через 17 недель после введения карциногена (Moorghen et al. (1988) J. Pathol. 156: 341-347).

В нескольких ретроспективных исследованиях оказалось, что прием аспирина оценивается как химиопрофилактическая терапия, вытекающая из случаев рака ободочной кишки. Результаты этих исследований дают разброс от снижения наполовину риска развития рака ободочной кишки (Kune et al. (1988) Cancer Res. 48: 4399-4404) до 50% повышения риска (Paganini-Hill et al. (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83:1182-1183). Однако следует отметить, что любые исследования на людях, включающие аспирин и другие NSAIDs особенно ретроспективные исследования, могут быть опровергнуты вызванной частотой ЖКТ кровотечения, которое может позволить раннее обнаружение полипа или опухоли в NSAID группе с помощью скрининга скрытого кровотечения и сигмоидоскопии.

Хотя ретроспективные исследования в отношении аспирина дают двусмысленные результаты, начальные результаты для ряда NSAISs, полученные в исследованиях на животных, суммированные ранее, были повторены в исследованиях с участием людей. NSAID, сулиндак, как было показано в статистических, контролируемых плацебо, дважды перекрестных исследованиях, вызывает регрессию полипов у девяти пациентов с семейным полипозом менее чем за 4 месяца (Labayle et al. (1991) Gastroenterology 101:635-639). Кроме того, рост полипа возобновляется после снятия сулиндака. Этот факт имеет значение, так как аналогичное исследование с использованием индометацина не обнаружило влияния на регрессию полипа (Klein et al. (1987) Cancer 60:2863-2868). Хотя оба этих NSAIDs проявляют свою противовоспалительную активность за счет ингибирования циклооксигеназы, сулиндак является предшественником лекарства (пролекаротвом), которое превращается в свой активный метаболит, сулиндаксульфид, за счет бактерий ободочной кишки. (Shen and Winter. (1975) Adv. Drug. Res. 12:89-245). Напротив, индометацин поглощается в его активной форме, где он абсорбируется, главным образом, из верхней части желудочно-кишечного тракта для системной доставки (Hucker et al. (1966). J.Pharmacol.Exp.Ther. 153: 237-249). Поэтому вероятно, что концентрации активного метаболита, поставляемые в ободочную кишку за счет сулиндака, значительно выше, чем за счет индометацина. Этот результат дает возможность предположить, что значительная часть наблюдаемых NSAID химиопрофилактических эффектов возникает за счет локального действия лекарства на поверхности раздела силизистая-люмен.

Хотя это доказательство NSAID - индуцированного ингибирования возникновения опухолей ободочной кишки в моделях на животных предполагает механизм ингибирования за счет циклооксигеназы опухолевых клеток, подтверждение такого механизма отсутствует. Опухолевые ткани, иссеченные из NSAID - обработанных животных, как было показано, секретируют крайне пониженные уровни PGE₂, что согласуется с этой гипотезой (Reddy et al. (1992) Garcinogenesis 13: 1019-1923). Однако большинство опухолей ободочной кишки являются гетерогенными в отношении присутствующих в них типов клеток, и в некоторых сообщениях было документировано, что эпителиальные клеточные линии, полученные из аденокарцином ободочной кишки, не являются значительными продьюсерами PGE₂ или других простагландинов (Hubbard et al. (1988) Cancer Res. 48:4770-4775). Сообщение об эйкозаноидном продуцировании клеток, выделенных из тканей ободочной кишки человека, однако, показывает, что опухолевые эпителиальные клетки продуцируют уровни PGE₂, сходные с незатронутыми тканями, тогда как полученные из опухоли моноклональные клетки демонстрируют более значительный синтез эйкозаноидов, нежели их нормальные аналоги (Maxwell et al. (1990) Digestion 47:160-166). Поэтому мишеневыми клетками, чувствительными к NSAID ингибированию, могут и не быть опухолевые эпителиальные клетки, но могут быть какие-либо другие, продуцирующие высокие уровни PG, за которые ответственны эпителиальные клетки.

Схема предпочтительной химиопрофилактической терапии

Все NSAIDs имеют значительные побочные эффекты. NSAIDs не являются тканеспецифическими в плане ингибирования продуктов циклооксигеназы, и как почечная, так и келудочно-кишечная системы, особенно чувствительны к ним. NSAIDs снижают почечную перфузию, что приводит к нефротоксичности (Clive аnd Stoff (1984) N.Engl. J.Med. 310:563-572), и, так как простагландины необходимы для нормальных дифференцированных функций эпителия желудочно-кишечного тракта, NSALD, вызывающие язвы желудка, вносят значительный вклад в заболеваемость и в смертность, связанные с этим классом лекарственных препаратов (Langman (1989) Gastroentrology 96:640-646, Bjarnason et al., (1992) Gastroentrology 104:1832-1847). В нижнем отделе кишечника, как сообщалось, хроническая NSALD терапия приводит к колитам - от проктитов до панклотитов (Tanner and Raghunat (1988) Digestion 41-116-120). В одном из ретроспективных исследований было установлено, что инъекции NSALD проводились 25% пациентов с перфорацией и кровотечением в области крупного и мелкого кишечника (Langman et al. (1985) Br. Med. J. 290:347-349). И наконец, у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями кишечника, которые уже подвержены высокой степени риска развития рака ободочной или прямой кишки, лечение не содержащими 5-ASA NSAID, а также аспирином противопоказано из-за обострения существующего болезненного состояния (Rampton and Sladen (1981) Prostaglandins 21:417-425. поэтому идеальным лекарством для химиопрофилактики рака ободочной кишки должно быть лекарство, обладающее следующими свойствами:

1) специфичностью для ободочной кишки - оно должно быть пролекарством, активность которого не проявляется в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта, не должно превращаться в активную форму после достижения ободочной кишки (подобно сулиндаку);

2) ограниченной абсорбцией - абсорбция исходного соединения метаболитов должна быть минимальной, особенно после превращения его в активную форму;

3) отсутствием системной активности - после абсорбирования метаболическая инактивация должна превращать лекарство в неактивную форму, ограничивая, тем самым, системное действие на почечную и желудочно-кишечную системы;

4) антиокислительными свойствами - специфической для ободочной кишки антиокислительной активностью, которая далее будет служить для снижения возникновения карциногенов; и

5) NSAID - подобным противовоспалительным механизмом - активные метаболиты должны ингибировать вызываемые воспалением схемы, однако предпочтительно ингибирование эйкозаноидов без воздействия на основные схемы сохранения.

Итак, было показано, что некоторые NSAID ингибируют возникновение опухолей ободочной кишки в опытах на животных с индуцированием карциногеном и ингибируют рост полипов у людей. Хотя механизм ингибирования опухолей за счет NSAID не доказан, эти лекарства могут модулировать продуцирование и метаболизм эйкозаноидов желудочно-кишечного тракта. К сожалению, NSAID обладают также раздражающим профилем и побочными эффектами относительно желудочно-кишечного тракта, что может запретить их постоянное применение. Поэтому было бы весьма желательно обнаружить такие NSAID, которые были бы эффективны в качестве химиотерапевтических агентов, но которые не обладали бы их побочными эффектами. Chan в патенте США N 4412992 описывает получение производных 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты и их использование для лечения язвенных колитов.

Описание изобретение

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов настоящего изобретения предложен способ лечения индивидуумов, страдающих раком ободочной кишки или подверженных риску развития рака ободочной кишки, который включает введение человеку эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей производное 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты общей формулы:



где X представляет -SO₂ - или -CO- группу, R представляет либо фенильный, либо карбоксиметилфенильный радикал, или представляет радикал формулы -(CH₂)_n-Y, где Y представляет гидроксильную группу, аминогруппу, моноалкил- или диалкилминогруппу, алкильные части которых содержат вплоть до 6 атомов углерода, или карбоксильную группу, или группу сульфоновой кислоты, а n является целым числом от 1 до 6, в котором один или более из атомов углерода в алкильном радикале может быть замещен аминогруппами, моноалкил- или диалкил-аминогруппами, алкильные фрагменты которых содержат вплоть до 6 атомов углерода, или алкильными радикалами, где радикал -(CH₂)_n - Y либо присоединен непосредственно к атому азота, либо через бензольное кольцо, при условии, что R-NH-X- отличен от -CO-NH-CH₂-COOH радикала; или его сложный эфир, или активный метаболит, или продукт окисления его активного метаболита, или его нетоксичную фармакологически приемлемую соль производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты или его сложного эфира или активного метаболита или продукта окисления активного метаболита его.

В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения фармацевтическая композиция этого способа состоит, в основном, из производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты, или его сложного эфира, или активного метаболита, или продукта окисления активного метаболита, или соли производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты или его сложного эфира или активного метаболита в смеси с твердым или жидким фармацевтическим разбавителем или носителем.

В еще одном варианте настоящего изобретения производным 2-гидрокси-5-фенилабензойной кислоты является бальсалазид.

В еще одном варианте настоящего изобретения активным метаболитом является 5-ASA.

В еще одном варианте настоящего изобретения продуктом окисления активного метаболита является продукт окисления 5-ASA.

В еще одном варианте настоящего изобретения продуктом окисления 5-ASA является гентизиновая кислота или 5-нитро-салицилат.

В еще одном варианте настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят перорально индивидууму, подверженному риску развития рака ободочной кишки, в дневной дозе в интервале от 1 до 14 г, в расчете на 70 кг веса в день, производного 2-гидрокси-5-фенилазбензойной кислоты или сложного эфира или активного метаболита или продукта окисления активного метаболита его, или соли производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты, или сложного эфира или активного метаболита, или продукта окисления активного метаболита ее.

В другом варианте настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят ректально индивидууму, подверженному риску развития рака ободочной кишки в дневной дозе в интервале от 1 до 14 г в расчете на 70 кг веса в день производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты или сложного эфира или активного метаболита или продукта окисления активного метаболита его или соли производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты или сложного эфира или активного метаболита, или продукта окисления активного метаболита ее.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет химическое строение производного 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты под названием бальсалазид. Аминосалицилатный фрагмент, 5-аминосалициловая кислота (5-ASA) связана с молекулой-носителем, 4-аминобензоил- -аланином (4-ABA), азо-связью.

Фиг. 2 представляет влияние 5-ASA на пролиферацию аденокарциномной клеточной линии НТ-29 в дозах 0, 0,1, 1,0 и 10 мМ. Указанное количество клеток является средним из трех экспериментов.

Фиг. 3 представляет влияние 5-ASA на пролиферацию аденокарциномной клеточной линии LS174T в дозах 0, 0,1, 1,0 и 10 мМ. Указанное количество клеток представляет среднее из трех экспериментов.

Фиг. 4 представляет анализ числа аберрантных криптов ободочной кишки, индуцированных за счет обработки групп крыс карциногеном, азоксиметаном, в присутствии или в отсутствии бальсалазида, вводимого с питьевой водой.

Фиг. 5 представляет относительные ингибирующие реакции, возникающие за счет бальсалазида и 5-ASA в низких концентрациях.

Фиг. 6A и 6B представляют распределение центров аберрантных криптов по ободочной кишке контрольных животных и животных, которым инъектировали AOM (20 мг/кг), через 6 недель после второй инъекции, соответственно. Количество центров, содержащих 1, 2, 3, 4 или 5 или более представлено (от нижней до верхней кривой на каждой фиг. соответственно).

Фиг. 7 представляет ингибирование пролиферации LS174T клеток различными концентрациями 5-ASA, растворенной в среде за 4 дня до экспонирования клеткам (черный), или 5-ASA в концентрации 10 мМ растворенной в среде непосредственно перед экспонированием клеткам (белый). Клетки выращивают дополнительно в течение 4 дней перед подсчетом.

Фиг. 8A и 8B демонстрируют ингибирование клеточной пролиферации рака ободочной кишки за счет различных концентраций двух продуктов окисления 5-ASA, гентизата и 5-нитросалицилата, соответственно.

Способы осуществления настоящего изобретения

Производные 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты, в частности бальсалазид и его активные метаболиты, как было обнаружено, эффективны для химиопрофилактики рака ободочной кишки. Эти производные 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты имеют следующую формулу:



где X представляет -SO₂ - или -CO- группу; a R представляет либо фенильный, либо карбоксиметилфенильный радикал, или представляет радикал формулы -(CH₂)_n-Y, где Y представляет гидроксильную группу, аминогруппу, моноалкил- или диалкиламиногруппу, алкильные части которых содержат вплоть до 6 атомов углерода, или карбоксильную группу или группу сульфоновой кислоты, и n является целым числом от 1 до 6, в котором один из атомов водорода в алкиленовом радикале может быть замещен аминогруппами, моноалкил- или диалкил-аминогруппами, алкильные части которых содержат вплоть до 6 атомов углерода, или алкильными радикалами; и где -(CH₂))_n-Y радикал либо присоединен непосредственно к атому азота, либо через бензольное кольцо, при условии, что R-NH-X- отличается от -CO-NH-CH₂COOH радикала.

В том смысле, как здесь использован, термин "производное 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты" включает также сложные эфиры или активные метаболиты соединения, или нетоксичные фармакологически приемлемые соли соединения или их сложные эфиры или активные метаболиты.

Термин "активный метаболит" относится к продуктам метаболизма производных 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты в организме человека, то есть за счет действия бактерий ободочной кишки, которые ингибируют пролиферацию раковых клеток ободочной кишки. Так, например, как будет обсуждаться далее, 5-ASA является активным метаболитом бальсалазида.

Термин "продукт окисления" относится к продуктам, которые образуются при экспонировании активных метаболитов производных 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты, например 5-ASA, таким условиям окисления, как гипохлорит или перекись водорода.

Бальсалазиднатрий является специфическим для ободочной кишки нестероидным противовоспалительным аминосалицилатом, который годится для лечения активных язвенных колитов. Бальсалазид, а также один из его первичных метаболитов ингибируют рост культивируемых раковых клеток ободочной кишки человека, и бальсалазид ингибирует образование аберрантных криптов у животных, обработанных карциногеном, азоксиметаном. Подобно другим NSAID бальсалазид эффективен для химиопрофилактики рака ободочной кишки человека. Однако бальсалазид имеет три важных преимущества безопасности: (1) поставка лекарства специфична для ободочной кишки; (2) до сих пор не наблюдалось язвенных поражений желудка или двенадцатиперстной кишки; и (3) среди более 500 пациентов, которым до настоящего времени вводили это лекарство, нет сообщений о нефротоксичности, причем некоторые пациенты принимали это лекарство в течение трех лет. Поэтому бальсалазид обладает идеальной комбинацией эффективности и безопасности для химиопрофилактики рака ободочной кишки.

Введение, специфическое для ободочной кишки

Бальсалазид является пролекарством, неактивная форма которого, подобно сулиндаку, превращается в активное противовоспалительное лекарство под действием бактерий ободочной кишки. Как представлено на фиг. 1, бальсалазид связывает аминосалицилат 5-аминосалициловой кислоты (5-ASA) с инертной молекулой-носителем, 4-аминобензоил- -аланином (4-ABA) за счет азо-связи. Бактериальная азоредуктаза гидролирует эту связь, высвобождая 5-ASA для локального действия.

Ограниченная системная абсорбция

Бальсалазид при пероральном приеме проходит нерасщепленным и практически неабсорбированным через верхний отдел желудочно-кишечного тракта. В плазме или урине обнаруживают лишь 0,3% переваренной дозы пролекарственной формы, и 99% лекарства достигает ободочной кишки в нетронутом виде. В ободочной кишке лекарство претерпевает гидролиз с образованием 5-ASA и 4-ABA, которые взаимодействуют со слизистой ободочной кишки и превращаются в их N-ацетильные формы. Основная часть 5-ASA, образующаяся из единичной дозы бальсалазида, превращается за промежуток времени 96 часов в N-ацетил-5-ASA (Nac 5ASA) и выделяется с уриной, тогда как 4-ABA и его N-ацетильный метаболит плохо абсорбируются. Так как N-ацетильный метаболит 5-ASA является неактивным, системная активность вводимого 5-ASA также понижена (Chan et al. (1983) Dig. Dis. Sci. 28:609-615).

Противоокислительные свойства

Как обсуждалось ранее, химиотерапевтический агент, который обладает эффективными противоокислительными свойствами, может также внести вклад в уменьшение карциногенов в ободочной кишке, а также снизить повреждения, наносимые свободными радикалами, которые выделяются из вторгающихся воспалительных клеток. 5-ASA ингибирует образование нитрозамина из аргинин-зависимых окислов азота (Grishman (1993) Gastroenterology 104:A243). Кроме того, как интактный бальсалазид, так и 5-ASA являются эффективными акцепторами свободных радикалов против O₂- и OH: Бальсалазид и 5-ASA при инкубировании с образцами ректальной биопсии от пациентов с язвенными колитами, уменьшают образование реакционноспособных метаболитов кислорода ректальной слизистой более чем на 90%. Оба агента также более эффективны, чем антиоксиданты таурин, аскорбат или N-ацетилцистеин, при использовании в одинаковых концентрациях (Simmonds et al. (1992) Gastroenterology 102:A696).

Противовоспалительная активность в ободочной кишке без влияния на верхний отдел желудочно-кишечного тракта

Бальсалазид обладает противовоспалительной активностью в нескольких типах опытов на животных с воспалениями ободочной кишки, а также у пациентов с активными (Green et al. (1993) Gastroenterology 104:A709) и спокойной (Gaiffer et. al (1992) Ailment. Pharmacol. Ther. 6:479-485) формах язвенного колита. Важно, что лекарство демонстрирует прекрасную желудочно-кишечную толерантность.

Бальсалазид и 5-ASA ингибируют пролиферацию раковых клеток ободочной кишки ин витро.

5-ASA, также как и бальсалазид, демонстрируют значительный рост ингибирующей активности против раковых клеток ободочной кишки человека.

Продукты окисления 5-ASA ингибируют пролиферацию раковых клеток ободочной кишки. Продукты окисления 5-ASA неожиданно демонстрируют рост ингибирующей активности против раковых клеток ободочной кишки человека по сравнению с 5-ASA.

Способы химиопрофилактики и химиотерапии рака ободочной кишки

Производные 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты настоящего изобретения, особенно бальсалазид и его метаболиты, являются поэтому полезными агентами для химиотерапии рака ободочной кишки. Их, предпочтительно, вводят пациентам, страдающим раком ободочной кишки или подверженным риску возникновения развития рака ободочной кишки в форме фармацевтических композиций, содержащих производное (производные) 2-гидрокси-5-фенилазобензойной кислоты. Такая фармацевтическая композиция может также содержать один или более из фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов и/или разбавителей. Предпочтителен пероральный прием. Используют такие стандартные фармацевтические формы, как те, которые раскрыты в книге Remington"s Pharmaciutical Science, Mack, Publishing Co, Easton, PA, последнее издание.

Композиции могут иметь форму таблеток, капсул, порошков, гранул, облаток, жидкостей или гелеобразных препаратов. Таблетки и капсулы для перорального приема могут быть в форме входящей для представления единичной дозы и могут содержать обычные добавки. Примерами могут служить такие связующие агенты, как сироп, аравийская камедь, желатин, сорбит, трагакант и поливинилпирролидон; такие наполнители, как лактоза, сахар, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин; такие скользящие, как стеарат магния, двуокись кремния, тальк, полиэтиленгликоль или двуокись кремния, такие разрыхлители, как картофельный крахмал; или такие приемлемые смачивающие агенты, как натрийлаурилсульфат. Таблетки могут быть с нанесенным покрытием в соответствии с хорошо известными способами нормальной фармацевтической практики. Жидкие препараты для перорального приема могут быть в форме, например, водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров, или могут быть представлены как сухой продукт, предназначенный для восстановления перед употреблением водой или другим подходящим носителем. Такие жидкие препараты могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие агенты, например сорбит, сироп, метилцеллюлозу, сироп глюкозы, желатин, гидрированные пищевые жиры, эмульгирующие агенты, например лецитин, сорбинатмоноолеат или акацию; неводные носители (включая пищевые масла), например миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, сложные эфиры масел, такие как глицерин, пропиленгликоль или этиловый спирт; такие консерванты, как метил или пропилпарагидроксибензоат или сорбиновая кислота, и, при желании, обычные вкусовые агенты или красители.

Процент активного материала в фармацевтической композиции может изменяться, причем необходимо, чтобы он составлял такую часть, чтобы можно было получить подходящую дозу для нужного терапевтического эффекта. Обычно препараты по настоящему изобретению следует вводить перорально или ректально людям с тем, чтобы они обеспечивали от 1 до 14 г активного вещества в день в расчете на вес тела 70 кг.

Нижеследующие примеры приводятся лишь с целью иллюстрации и никоим образом не ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Бальсалазид и 5-ASA ингибируют пролиферацию клеток рака ободочной кишки ин витро.

Активность Бальсалазида и его метаболита 5-ASA в отношении клеток рака ободочной кишки человека демонстрируют ин витро, используя клетки аденомы человека HT-29 и LS174T. Клетки выращивают в Дюльбекко модифицированной среде Игла, дополненной 10% сывороткой теленка в атмосфере 5% CO₂ при 37^oC. Для экспериментов роста клетки высевают в чашки для культуры тканей с 24-ячейками (2 см²) ячейку (с плотностью 20000 клеток) ячейку и оставляют для прикрепления на 12 часов. Затем ростовую среду изменяют и заменяют свежей средой, содержащей тестовое лекарство.

Тестовые лекарства растворяют в тканевой культуральной среде до нужной концентрации и добавляют в отдельные ячейки. Для определения числа клеток на ячейку среду удаляют из ячеек, а клетки промывают фосфатным буферированным физиологическим раствором. Затем клетки инкубируют в течение 15 минут с трипсин-ЕДТА раствором до нарушения прикрепления. Затем отделившиеся клетки удаляют из ячеек и подсчитывают, используя счетчик Coulter Caunter (Model ZBI). Как представлено на фиг. 2 и 3, как клеточная линия рака ободочной кишки человека HT-29, так и LS17HT ингибируют рост в прогрессивно возрастающих концентрациях 5-ASA. В дозе 10 мМ 5-ASA ингибирование достигает 82% и 85%, соответственно.

Проводят также сравнительные исследования для проверки эффективности бальсалазида с двумя его метаболитами, 5-ASA и 4-ABA, а также с ацетилсалициловой кислотой (аспирином) на пролиферацию раковых клеток. Как видно из таблицы 1, ацетилсалициловая кислота, которая ковалентно ингибирует циклооксигеназу, оказывается потенциальным ингибитором в этом анализе, также как исходное лекарство бальсалазид. Однако 4-ABA, молекула-носитель бальсалазида, оказывается неактивной. Число клеток представлено в таблице 1 и является средним для трех культуральных ячеек.

Дальнейшие исследования, предпринятые для определения соотношения доза - реакция, эффекта подавления роста, проведенные для бальсалазида и 5-ASA, показали, что оба соединения дают одинаковые результаты при исследованиях либо на HT-29, либо на LS174T клетках. Для исследования зависимости реакции от дозы чувствительный анализ связывания красителя адаптировали, что позволило одновременно оценивать множество агентов в различных дозах на пластинах с 96 ячейками. Клетки высевают и оставляют для прилипания в течение 24 часов перед добавлением исследуемого лекарства. Клеточную плотность определяют 4 дня спустя за счет фиксации ячеек и окрашивания красителем Сульфорходамин В.

Оптическую плотность окрашенных культур определяют затем, используя считывающее 96 ячеек устройство на длине волны 495 нм /Skehon et.al (1990) 82:1107-1112. Natl. Cancer Inst.

Как представлено на фиг.5, бальсалазид устойчиво вызывает более сильную ингибирующую реакцию при более низких концентрациях, нежели 5-ASA. Используя HT-29 клетки значения IC₅₀(ИК₅₀) (ингибирующая концентрация₅₀), составляют 5,7 мМ и 11,8 мМ, соответственно, а для клеток LS174T соответствующая величина IC₅₀ составляет 5,2 мМ и 11,5 мМ. Для самых низких из использованных концентраций 5-ASA (0,1-1,0 мМ для LS174T и 0,1-4 мМ для НТ-29) увеличение воспроизводимости и статистическая достоверность наблюдается для числа клеток примерно 20% для обоих типов клеток. Это согласуется с ранее опубликованными результатами других исследователей, которые наблюдали увеличение синтеза протеинов, вызываемое другими NSAID при низких концентрациях с последующим ингибированием при более высоких концентрациях (Hial et.al. /1977) J. Pharm. Exp.Therap. 202:446-452).

Пример 2: Влияние бальсалазида и метаболитов на образование аберрантных криптов у крыс.

Аберрантные крипты были исходно описаны для индуцированной карциногеном слизистой ободочной кишки как крипты "увеличивающегося размера, с более толстым эпителиальным слоем и увеличенными перикриптальными зонами" (1989) Bird et al. Cancer Surv. 189-200). NSAID находятся в числе наиболее эффективных ингибиторов образования аберрантных криптов, вызываемых карциногеном, азоксиметаном (АОМ) у крыс. (Wargovich et.al. (1992). J. Cell. Biochem. 16G: 51-54). Противоопухолевая активность некоторых из этих агентов была подтверждена длительными исследованиями АОМ на животных. Поэтому модель аберрантных криптов является идеальной в анализах ин виво для опредлеления эффективности бальсалазида и метаболитов.

Ингибирование индуцирования аберрантных криптов

Эффективность бальсалазида (BSZ) и его метаболитов, 5-аминосалициловой кислоты (5-ASA) и 4-аминобензоил--аланина (4-ABA) в отношении ингибирования образования аберрантных криптов определяют в модели рака ободочной кишки, индуцированного азоксиметаном (АОМ) у крыс.

Используют 4 группы по 5 самцов F344 крыс. Животным было 6-8 недель, когда начали дозирование, причем исходный вес был в интервале 20% от среднего значения. Ожидаемая реакция на обработку АОМ на основании опубликованных исследований состояла в образовании 100-140 аберрантных криптов для каждого животного (Wargovich et. al (1992) J. Cell. Biochem. 16G:51-54). Используя эти значения для реакций и метод наименьших квадратов с 95% пределами надежности, размер образцов от 5 животных на группу позволяет определить статистическую величину ингибирования (для уровня p < 0,05) под действием тестовых лекарств, если наблюдается вплоть до 50-75 аберрантных криптов для животного.

Животным давали акклиматизироваться в течение 10 дней, перед тем как их произвольно разделяли на тестовые группы по весовым классам. Тестовое лекарство растворяли в питьевой воде в концентрации, которая давала нужную дозу на животного в день на основании среднего потребления воды 50 мл в день для каждого животного. Двум группам обеспечивали одну неделю введения лекарства, прежде чем начали вводить инъекции АОМ. Карционогенез вызывают двумя подкожными инъекциями АОМ в дозе 20 мг/кг в начале второй и третьей недели. Затем тестируемое лекарство продолжали вводить до конца 5 недели.

Выбор уровня дозы для балmсалазида основан на обзоре других предклинических исследований эффективности в модели на колитах. Доза 200 мг/кг/день для 500 г крыс соответствует дозе 14 г / день для человека весом 70 кг и приблизительно вдвое превышает терапевтическую дозу для лечения активных язвенных колитов и в 4 раза превышает дозу для поддержания ремиссии. Эти уровни доз приводят к концентрации 5-ASA в ободочной кишке 5-20 мМ. Максимально переносимая доза бальсалазида для крыс превышает 12000 мг/кг/день.

Крыс взвешивают дважды в неделю и потребление воды в каждой клетке с животными измеряют дважды в неделю. Потребление рассчитывают как среднее мл/животное/клетку.

Для анализа аберрантных криптов животных умерщвляют под CO₂ анестезией к концу либо трех либо пяти недель введения доз. Толстый кишечник иссекают по caecum и анусу, удаляют и разрезают вдоль. Ткани освобождают от содержимого, промывают в солевом растворе и фиксируют при 4^oC в течение 2 часов в 2% параформальдегиде, и окрашивают 0,2% метиленовым синим в течение 3-5 минут. После промывания физиологическим раствором подсчитывают число центров аберрантных криптов под микроскопом при 40-100-кратном увеличении. Измеряют также длину ткани ободочной кишки. Представительный образец наиболее сильных поражений помещают в гликольметакрилат при 4^oC; 3-4 мкм срезы каждого центра окрашивают гематоксилином, эозином и азуром (НЕА) для гистологических оценок.

Для анализа эрозии желудка и двенадцатиперстной кишки fundus, antrum и duodenum удаляют и обрабатывают отдельно, как указано ранее. Эрозии желудка оценивают, используя показатель эрозии желудка по длине и серьезности поражений, как описано у (Peskar et al. (1986) 31:283-287. Prostaglondins.)

Полученные результаты представлены на фиг. 4, где среднее число аберрантных криптов на длину в см ткани ободочной кишки представлены для животных, исследованных либо через одну, либо через три недели после двух подкожных инъекций азоксиметана. В оба момента времени животные, которых обрабатывали бальсалазидом, имели гораздо меньшее среднее число аберрантных криптов, чем контрольные животные. Для одной недели это составило 61,8% ингибирования, а для пяти недель - 58,1% ингибирования для среднего числа аберрантных криптов.

Развитие ингибирования аберрантных криптов

Данные, представленные на фиг. 4, получены для дистальных 7-8 см тканей ободочной кишки. Для этих ранних временных точек эта площадь составляет более 80% от полного числа центров аберрантных криптов. Поэтому дополнительное исследование было проведено для определения более отдаленной временной точки, оценивая все 25 см ободочной кишки, и определено, можно ли начинать лечение лекарством после второй инъекции АОМ. Эта последняя цель представляет особый интерес, так как важно продемонстрировать, что химиопрофилактический агент ингибирует развитие роста аберрантных криптов после начала трансформации, вызванной карциногеном.

Во втором исследовании группы из 8 животных получали по две инъекции азоксиметана с интервалом в одну неделю. Лечение бальсалазидом начинали для одной группы спустя 24 часа после второй инъекции. Шесть недель спустя животных обрабатывали для проведения анализа аберрантных криптов. Крипты окрашивали ин ситу за счет ректального введения 0,2% раствора метилена синего в течение 15 минут под анестезией. Затем животных обескровливали, и иссекали ткани ободочной кишки от ануса до caecum, очищали и фиксировали в течение 2 часов в 2% параформальдегиде. Крипты подсчитывали визуально при увеличении в 40 раз. В дополнение к полученным данным в отношении количество центров были также получены данные о множестве аберрантных криптов в каждом центре. Эти данные представлены на фиг. 6. Очевидно, что даже если бальсалазид вводили начиная с 24 часов после второй АОМ инъекции, наблюдается резкое ингибирование центров аберрантных криптов, которое сравнимо с предыдущими экспериментами (примерно 60% ингибирования), проиллюстрированными на фиг. 4.

Предыдущие исследования, проведенные Претловым (Pretlov et.al (1992) Carcinogenesis 13:1509-1512), относились к соотношениям между множественностью аберрантных криптов и окончательным развитием опухоли с использованием той же самой модели карциногенезиса. В этих исследованиях число центров аберрантных криптов, содержащих 4 или более из аберрантных криптов, существенно коррелируют с образованием опухолей, что дает возможность предположить, что именно эти крупные центры и наиболее вероятно развиваются в опухоли. Данные из вышеуказанного эксперимента были проанализированы для определения действия бальсалазида на множественность аберрантных криптов. Эти данные представлены далее в таблице 2 и показывают, что бальсалазид демонстрирует более сильное ингибирование тех центров, которые содержат 4 или более из аберрантных криптов, нежели тех, в которых криптов меньше четырех. Для центров с 1-3 криптами среднее ингибирование находится в интервале 57-61% (р < 0,003, точный тест Фишера), тогда как число центров с 4 или более криптами снижается в среднем на 72-76% (р < 0,001). Если сравнивать результаты для числа центров, содержащих 4 или более криптов, с теми, которые содержат 3 или менее, различие остается статистически достоверным для уровня р < 0,022, если использовать точный тест Фишера.

Эти результаты показывают, что центры, содержащие наибольшее число аберрантных криптов, уменьшаются, по крайней мере, в два раза, по сравнению с центрами, содержащими 2-3 аберрантных крипта. Если интерпретировать результат в контексте с результатами Претлова, можно предположить, что это ингибирование будет перенесено в ингибирование образования опухолей, если животных исследовать в более поздние сроки.

Пример 3: Влияние продуктов окисления 5-ASA на ин витро пролиферацию клеток рака ободочной кишки.

Хотя ингибирование, наблюдаемое за счет бальсалазида в предыдущих примерах, было идентичным для обоих типов клеток, клетки LS174T постоянно оказываются более чувствительными к воздействию 5-ASA, нежели клетки HT-29. Кроме того, ингибирующая реакция обоих типов клеток на 5-ASA варьируется между отдельными экспериментами от максимальной 70% до минимальной 10%. В создании экспериментов для определения источника такой изменчивости было определено, что исходный раствор 5-ASA, который был приготовлен минимум за 3 дня до добавления к клеткам, постоянно обнаруживает более высокий ингибирующий эффект. Эта разница продемонстрирована на фиг. 7.

В этом эксперименте рост клеток LS174T, экспонированных свежерастворенному 10 мМ 5-ASA, демонстрирует реакцию роста после 4 дней, которая составляет 82,7% от значения для контрольных клеток. Напротив, рост параллельных культур, экспонированных 10 мМ 5-ASA, которые были растворены за 4 дня до начала эксперимента, демонстирует реакцию роста после 4 дней лишь в 22,9% от значений для контрольных культур. Столь поразительная разница дает возможность предположить, что 5-ASA была превращена в более активный метаболит в присутствии определенных компонентов среды.

Одной из важных активностей, связанных с 5-ASA, являются ее противоокислительные свойства. Действительно, некоторые из ее терапевтических преимуществ при лечении воспалений кишечника, как известно, проистекают из ее способности акцептировать свободные радикалы, включая O₂^-, выделяемые воспалительными клетками, и тем самым уменьшать оксидативное повреждение. Это дает возможность предположить, что изменения, наблюдаемые в ингбирующей активности, связанной с 5-ASA, в случае предварительной инкубации в тканевой культуральной среде, должны быть связаны с актами окисления. Для проверки такой возможности 5-ASA подвергают окислению, используя гипохлорит натрия в различных соотношениях и затем оценивают последующую активность ингибирования роста клеток. Как показано далее в таблице 3, увеличение количества гипохлорита приводит к повышению ингибирующей активности 5-ASA.

Предыдущие исследования других авторов показали, что такие условия окисления, как экспонирование гипохлориту или перекиси водорода, могут привести к образованию нескольких различных метаболитов 5-ASA. Два из таких продуктов окисления: гентизиновая кислота (Dull et al. (1987) Biochem. Pharmacol 36: 2467-2472) и 5-нитросалицилат (Loffafian et.al. (1991) Biochem. Pharmacol 42:1869-1874) были охарактеризованы. Учитывая полученные выше результаты, оба эти продукта окисления 5-ASA были протестированы на предмет ингбирующей активности роста клеток рака ободочной кишки. Как представлено далее в таблице 4, где были использованы четыре различные клеточные линии рака ободочной кишки человека, оба метаболита ингибируют рост клеток, причем, по-видимому, 5-нитропроизводное оказывается более эффективным. Относительные эффективности бальсалазида, его основного метаболита, 5-ASA и двух возможных продуктов окисления 5-ASA по отношению к ингибированию роста каждой из клеточных линий представлены в обсуждении результатов, представленных далее в таблице 4.

Все публикации и патентные заявки, цитированные в этом описании, включены здесь в качестве ссылок, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были конкретно и отдельно предназначены для включения как ссылка.

После подробного описания изобретения специалистам будет понятно, что в него могут быть внесены множество изменений и модификаций, не выходя из объема или сути прилагаемой формулы изобретения.