очищенные белки вируса папилломы

Формула изобретения

Способ получения композиции очищенного капсидного белка вируса папилломы человека, осуществляемый путем трансформации клетки-хозяина, представляющей собой дрожжевую клетку, рекомбинантной молекулой ДНК, кодирующей белок, выбранный из группы HPV 6a, HPV 11, HPV 16, белка L 1, белка L 2, белка L 1 + L 2, и культивирования трансформированного хозяина при условиях, делающих возможной экспрессию молекулы рекомбинантной ДНК для получения неочищенной композиции белка вируса папилломы, отличающийся тем, что неочищенный белок вируса папилломы очищают на хроматографической колонке со смолой POROS.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается очищенных рекомбинантных белков вирусов папилломы (PV) и способов их получения, измерения, применения и приготовления в виде лекарственных форм.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг. 1 представляет двунаправленный дрожжевой экспрессирующий вектор, применяемый для экспрессии капсидных белков L1 и/или L2 вируса папилломы.

Фиг. 2 - электронная микрофотография VLP L1 HPV6a, экспрессируемых в дрожжах.

Фиг. 3 - электронная микрофотография VLP L1/L2 HPV6a, экспрессируемых в дрожжах.

Фиг. 4 - схематическое представление конструирования штамма 1558 S.cerevisiae.

Фиг. 5 - схематическое представление конструирования штамма 1569 S. cerevisiae.

Фиг. 6 - основные стадии в процедуре очистки.

Фиг. 7 - список штаммов.

Фиг. 8 - ряд анализов при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН L1+L2 HPV16, очищенных из дрожжей. Кроме конечного очищенного VLP, включены удерживаемые белки из промежуточных стадий процесса очистки. Таблица обеспечивает идентификацию пробы в каждой дорожке. Включены гель, окрашенный коллоидным красителем Кумасси, а также Вестерн-блоты, зондированные антисыворотками к белкам L1 и L2.

Фиг. 9 - схема альтернативных процессов очистки L1 вируса папилломы американского кролика.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Инфекции вирусом папилломы (PV) имеют место у множества животных, в том числе у людей, овец, собак, кошек, кроликов, обезьян, змей и коров. Вирусы папилломы инфицируют эпителиальные клетки, индуцируя обычно доброкачественные эпителиальные или фиброэпителиальные опухоли в месте инфекции. PV являются видоспецифическими инфекционными агентами; вирус папилломы человека не может инфицировать другое животное.

Вирусы папилломы могут быть классифицированы на отличающиеся группы на основании хозяина, которого они инфицируют. Вирусы папилломы человека (HPV) классифицируются далее на более чем 70 типов на основе гомологии последовательности ДНК. Типы PV являются, по-видимому, типоспецифическими иммуногенами в том смысле, что нейтрализующий иммунитет к инфекции одним типом вируса папилломы не создает иммунитета против другого типа вируса папилломы.

У людей различные типы HPV 1, 2, 3, 4, 7, 10 и 26-29 вызывают образование доброкачественных бородавок как у здоровых индивидуумов, так и у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы HPV 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 и 46-50 вызывают образование плоских поражений у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы HPV 6, 11, 34, 39, 41-44 и 51-55 вызывают образование незлокачественных кондилом слизистой оболочки половых органов или дыхательных путей. Типы HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 и 58 вызывают эпителиальную дисплазию слизистой оболочки половых органов и ассоциированы с большинством in situ и инвазивных карцином шейки матки, вагины, вульвы и анального канала.

Вирусы папилломы являются небольшими (50-60 нм), не имеющими оболочки, икосаэдральными ДНК-вирусами, которые кодируют до восьми ранних и двух поздних генов. Открытые рамки считывания (ORF) геномов этих вирусов обозначаются как E1-E7 и L1 и L2, где "E" обозначает "early (ранние)" и "L" обозначает "late (поздние)". L1 и L2 кодируют вирусные капсидные белки. Ранние (E) гены ассоциированы с функциями, такими как вирусная репликация и клеточная трансформация.

Белок L 1 является основным капсидным белком и имеет мол.массу 55-60 кДа. Белок L2 является минорным капсидным белком, который имеет предсказанную мол. массу 55-60 кДа и среднюю (кажущуюся) мол.массу 75-100 кДа, как определено при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Иммунологические данные предполагают, что большая часть белка L2 является внутренней по отношению к белку L1. ORF L1 является высококонсервативной среди различных вирусов папилломы. Белки L2 являются менее консервативными среди различных вирусов папилломы.

Было обнаружено, что гены L1 и L2 являются хорошими мишенями для иммунопрофилактики. Было также показано, что некоторые из ранних генов являются потенциальными мишенями разработки вакцин. Исследования в системах вируса папилломы американского кролика (CRPV) и бычьего вируса папилломы (BPV) показали, что иммунизация этими белками, экспрессированными в бактериях или с использованием векторов на основе вируса осповакцины, защищали животных от вирусной инфекции. Экспрессия генов L1 вируса папилломы в бакуловирусных системах или с использованием векторов на основе вируса осповакцины приводила к сборке вирус-подобных частиц (VLP), которые были использованы для индуцирования ответов в виде высокого титра вирус-нейтрализующих антител, которые коррелируют с защитой от вирусного заражения. Кроме того, гены L1 и L2 использовали для создания вакцин для предотвращения и лечения инфекций вируса папилломы у животных. Гены L1 и L2 HPV типа 16 были клонированы в вектор на основе вируса осповакцины; полученный вектор применяли для инфекции клеток млекопитающего CV-1 для получения вирус-подобных частиц (VLP).

Разработка и коммерциализация профилактических и терапевтических вакцин от инфекции и заболевания pv, содержащих белок L1, белки L1+L2 или модифицированные белки L1 или L1+L2, тормозились отсутствием больших количеств очищенного вируса и очищенного белка. Поскольку PV не легко культивировать in vitro, трудно получить белки L1 и L2 размножением PV in vitro. Вытекающие из этого проблемы восполнения создают трудности в характеристике PV и белков PV. Поэтому важным было бы создание легко восполняемого источника неочищенных белков PV, в частности белков L1 и L2 PV или модифицированных белков L1 и L2. Была бы также ценной разработка способов очистки больших количеств неочищенных белков вируса папилломы до уровня чистоты, пригодной для иммунологических исследований и создания вакцин. Важным было бы также получение больших количеств белков вируса папилломы, имеющих создающие иммунитет свойства нативных белков, такие как конформация нативного белка. Кроме того, ценной была бы разработка способов анализа белков PV и способов определения относительной чистоты этих белков, а также композиций, содержащих эти белки. Такие высокоочищенные белки были бы также важны в приготовлении множества реагентов, применимых в исследовании инфекции PV; к таким реагентам относятся (но не только) поликлональные антитела, моноклональные антитела и аналитические стандарты.

Данное изобретение касается высокоочищенных белков L1 и L2 PV. Изобретение также касается способов, при помощи которых получают и очищают рекомбинантные белки вируса папилломы, имеющие создающие иммунитет свойства нативных белков вируса папилломы. Данное изобретение касается получения профилактических и терапевтических вакцин для инфекции вируса папилломы. Рекомбинантные белки по данному изобретению способны к образованию вирусподобных частиц. Эти VLP являются иммуногенными и предотвращают образование бородавок в модели животного. Данное изобретение иллюстрируется в виде примеров полученными из рекомбинантных дрожжей белками L1 и L1+L2 вируса папилломы американского кролика (CRPV), HPV типа 6 (подтипа 6a) и HPV типа 16 в качестве модельных систем. Способы очистки и аналитические способы данной заявки могут быть адаптированы к другим типам HPV, другим белкам HPV и другим рекомбинантным экспрессионным системам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение касается очищенных рекомбинантных белков вирусов папилломы (PV) и способов их получения, измерения, применения и приготовления в виде лекарственных форм.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение касается очищенных рекомбинантных белков вирусов папилломы (PV) и способов их получения, измерения, применения и приготовления в виде лекарственных форм. Данное изобретение иллюстрируется в виде примеров (но не только) полученными из рекомбинантных дрожжей белками CRPV, HPV6a и HPV16. Различные варианты данного изобретения включают (но не ограничиваются ими) рекомбинантные молекулы ДНК HPV, РНК, комплементарные этим рекомбинантным молекулам ДНК HPV, белки, кодируемые рекомбинантными молекулами ДНК, антитела к рекомбинантным молекулам ДНК и относящимся к ним белкам, композиции, содержащие эти ДНК, РНК, белки или антитела, способы применения этих ДНК, РНК, белков и антител, а также их производных. К таким производным относятся (но не только) пептиды и белки, кодируемые этой ДНК, антитела к этой ДНК или антитела к белкам, кодируемым этой ДНК, вакцины, содержащие эту ДНК, или вакцины, содержащие белки, кодируемые этой ДНК, иммунологические композиции, содержащие эту ДНК или белки, кодируемые этой ДНК, наборы, содержащие эту ДНК или РНК, полученную из этой ДНК, или белки, кодируемые этой ДНК.

Были получены синтезированные в бактериях L1 и L2 бычьего вируса папилломы. Нейтрализующие сыворотки к этим рекомбинантным бактериальным белкам перекрестно реагировали с нативным вирусом при низких уровнях, что, вероятно, обусловлено различиями в конформациях нативных и полученных в бактериях белков.

Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие ORF L1 HPV16 или 12 HPV16, использовали для инфицирования клеток насекомых SF9 и получения белков L1 и L2. Вестерн-блоттинги показали, что полученные из бакуловирусов белки L1 и L2 реагировали с антителами к HPV16. L1, произведенный бакуловирусом, образует VLP.

Сообщалось о получении неочищенных белков L1 и L2 HPV16 при помощи рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Эти рекомбинантные белки получали в виде внутриклеточных и в виде секретируемых продуктов. При внутриклеточной экспрессии этих белков было обнаружено, что большая часть белка является нерастворимой при лизисе клеток в отсутствии денатурирующих агентов. О чистоте этих белков не сообщалось.

Было показано, что рекомбинантные белки, секретируемые из дрожжей, содержат произведенные дрожжами углеводы. Присутствие этих N-связанных олигосахаридов может маскировать нативные эпитопы. Кроме того, секретируемые рекомбинантные белки могут содержать другие модификации, такие как удерживание секреторной лидерной последовательности. Процесс секреции также может быть менее эффективным.

Разработка и коммерциализация профилактических и терапевтических вакцин для инфекции и заболевания PV, содержащих белок L1, белки L1+L2 или модифицированные белки L1 или L1+L2, тормозились отсутствием больших количеств очищенного вируса и очищенного белка. Поскольку PV нелегко культивировать in vitro, трудно получить требуемые количества белков L1 и L2 размножением in vitro PV. Трудности, связанные с культивированием PV in vitro, приводят также к трудностям в химической, иммунологической и биологической характеристике PV и белков PV. Поэтому было бы важным создание легко восполняемого источника неочищенных белков PV, в частности белков L1 и L2 PV или модифицированных белков L1 и L2. Ценной была бы также разработка способов очистки больших количеств неочищенных белков вируса папилломы до уровней чистоты, пригодной для иммунологических исследований и разработки вакцин. Было бы также важно получение больших количеств белков вируса папилломы, имеющих создающие иммунитет свойства нативных белков, такие как конформация нативного белка. Кроме того, важным является создание способов анализа белков PV и способов определения относительной чистоты этих белков, а также композиций, содержащих эти белки. Такие высокоочищенные белки были бы также важны в приготовлении множества реагентов, применимых в исследовании инфекции PV; такими реагентами являются (но не только) поликлональные антитела, моноклональные антитела и аналитические стандарты.

Фармацевтически применимые композиции, содержащие эту ДНК или белки, кодируемые этой ДНК, могут быть приготовлены в соответствии с известными способами, такими как смешивание с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и способов приготовления могут быть найдены в Remington"s Pharmaceutical Sciences. Для образования фармацевтически приемлемой композиции, пригодной для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество белка или VLP. Такие композиции могут содержать белки или VLP, произведенные из более чем одного типа HPV.

Терапевтические или диагностические композиции этого изобретения вводят индивидууму в количествах, достаточных для лечения или диагностики инфекций PV. Это эффективное количество может изменяться в соответствии с различными факторами, такими как состояние, вес, пол и возраст индивидуума. К другим факторам относится способ введения. Обычно композиции должны вводиться в дозах, находящихся в пределах от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1 мг.

Фармацевтические композиции могут вводиться индивидууму различными способами, такими как подкожное, местное, пероральное, трансмукозное, внутривенное и внутримышечное введение.

Вакцины данного изобретения содержат ДНК, РНК или белки, кодируемые этой ДНК, которые содержат антигенные детерминанты, необходимые для индукции образования нейтрализующих антител в хозяине. Такие вакцины являются также достаточно безопасными для введения без риска клинической инфекции; не имеют побочных токсических действий; могут вводиться эффективным способом; стабильны и совместимы с вакцинными носителями.

Вакцины могут вводиться различными путями, например перорально, парентерально, подкожно, через слизистую оболочку, внутривенно или внутримышечно. Вводимая доза изменяется в зависимости от состояния, пола, веса и возраста индивидуума; способа введения и типа PV конкретной вакцины. Вакцину можно использовать в виде дозированных лекарственных форм, таких как капсулы, суспензии, эликсиры или жидкие растворы. Вакцина может быть приготовлена с иммунологически приемлемым носителем.

Вакцины вводят в терапевтически эффективных количествах, то есть в количествах, достаточных для генерирования иммунологически защитного ответа. Терапевтически эффективное количество может изменяться в соответствии с типом PV. Вакцину можно вводить в виде одной дозы или в виде множественных доз.

Очищенные белки данного изобретения можно применять в приготовлении иммуногенных композиций. Такие композиции при введении в подходящего хозяина способны индуцировать иммунный ответ в этом хозяине.

Очищенные белки данного изобретения или их производные можно использовать для генерирования антител. Термин "антитело" в применении здесь включает в себя как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также их фрагменты, такие как Fv, Fab и F(ab)2, которые способны связывать антиген или гаптен.

Белки и белковые производные данного изобретения можно использовать для серотипирования инфекции PV и скрининга HPV. Очищенные белки, VLP и антитела пригодны для приготовления наборов для обнаружения и серотипирования HPV. Такой набор должен содержать компартментализованный носитель, пригодный для удерживания в тесных границах по меньшей мере одного контейнера. Носитель может содержать, кроме того, реагенты, такие как рекомбинантные белки L1, или VLP, или HPV6a, или антитела против HPV6a, или рекомбинантные белки L1, или L2, или VLP HPV16 или антитела против HPV16, пригодные для обнаружения различных типов HPV. Носитель может также содержать средства для детектирования, такие как меченый антиген или субстраты ферментов или т.п.

Очищенные белки применимы также в качестве иммунологических стандартов, маркеров молекулярной массы и маркеров молекулярного размера.

Поскольку генетический код является вырожденным, более чем один кодон может использоваться для кодирования конкретной аминокислоты и, следовательно, аминокислотная последовательность может кодироваться любым из набора сходных ДНК-олигонуклеотидов. Только один член этого набора будет идентичен последовательностям HPV6a или HPV16, но будет способен гибридизоваться с ДНК HPV6a или HPV16 даже в присутствии ДНК-олигонуклеотидов с неправильными спариваниями оснований при соответствующих условиях. При других условиях неправильно спаренные ДНК-олигонуклеотиды могут все еще гибридизоваться с ДНК HPV6a или HPV16, что позволяет идентифицировать и выделять кодирующую ДНК HPV6a или HPV16.

Очищенную ДНК HP V6a или HPV16 по этому изобретению или ее фрагменты можно использовать для выделения и очистки гомологов и фрагментов HPV6a из других источников. Для выполнения этого первую ДНК HPV6a можно смешать с пробой, содержащей ДНК, кодирующую гомологи HPV6a, при подходящих условиях гибридизации. Гибридизованный ДНК-комплекс можно выделить и из него можно очистить ДНК, кодирующую эту гомологичную ДНК.

Известно, что имеется значительное количество избыточности в различных кодонах, кодирующих специфические аминокислоты. Таким образом, данное изобретение касается также тех последовательностей ДНК, которые содержат альтернативные кодоны, кодирующие возможную при некоторых обстоятельствах трансляцию идентичной аминокислоты. Для целей этой заявки последовательность, несущая один или несколько замененных кодонов, будет называться вырожденной вариацией. В сфере действия данного изобретения находятся также мутации либо в ДНК-последовательности, либо в транслированном белке, которые по существу не изменяют конечные физические свойства экспрессируемого белка. Например, замена лейцина валином, лизина аргинином или глутамина аспарагином может не вызывать изменения в функциональности данного полипептида.

Известно, что последовательности ДНК, кодирующие пептид, могут быть изменены таким образом, что они будут кодировать пептид, имеющий свойства, отличающиеся от свойств природно встречающегося пептида. Способы изменения последовательностей ДНК включают в себя сайт-специфический мутагенез (но не ограничиваются им).

В применении здесь "функциональным производным" HPV6a является соединение, которое обладает биологической активностью (функциональной или структурной), которая в основном сходна с биологической активностью HPV6a. Термин "функциональные производные" предназначен для "фрагментов", "вариантов", "вырожденных вариантов", "аналогов" и "гомологов" или "химических производных" HPV6a. Термин "фрагмент" относится к любой полипептидной подсерии HPV6a. Термин "вариант" относится к молекуле, в основном сходной по структуре и функции либо со всей молекулой HPV6a, либо с ее фрагментом. Молекула "в основном сходна" с HPV6a, если обе эти молекулы имеют по существу сходные структуры или если обе молекулы обладают одинаковой биологической активностью. Таким образом, если две молекулы обладают по существу одинаковой активностью, они рассматриваются как варианты, даже если структура одной из этих молекул не обнаружена в другой и даже если эти две аминокислотные последовательности не являются идентичными. Термин "функциональное производное" не включает в себя HPV6a.

Термин "аналог" относится к молекуле, в основном сходной по функции либо со всей молекулой HPV6a, либо с ее фрагментом.

Многие способы, известные в данной области, можно применять для молекулярного клонирования ДНК HPV6a. К этим способам относится (но они не ограничиваются этим) прямая функциональная экспрессия генов HPV6a после конструирования библиотеки HPV6a-содержащей кДНК или геномной ДНК в подходящей системе экспрессирующего вектора. Другим способом является скрининг библиотеки HPV6a, содержащей кДНК или геномную ДНК, сконструированной в бактериофаге или плазмидном челночном векторе, меченым олигонуклеотидным зондом, построенным на основе аминокислотной последовательности HPV6a. Дополнительный способ состоит из скрининга библиотеки HPV6a, содержащей кДНК или геномную ДНК, сконструированной в бактериофаге или плазмидном челночном векторе, при помощи частичной ДНК, кодирующей HPV6a. Эту частичную ДНК получают амплификацией при помощи специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК-фрагментов HPV6a посредством конструирования вырожденных олигонуклеотидных праймеров на основе аминокислотной последовательности очищенного HPV6a. Другой способ заключается в выделении РНК из продуцирующих HPV6a клеток и трансляции этой РНК в белок при помощи системы трансляции in vitro или in vivo. Трансляция этой РНК в пептид или белок приведет к образованию по меньшей мере части белка HPV6a, который можно идентифицировать, например, по активности белка HPV6a или по иммунологической реактивности с антителами против HPV6a. В этом способе пулы РНК, выделенной из продуцирующих HPV6a клеток, могут быть анализированы на присутствие РНК, которая кодирует по меньшей мере часть HPV6a. Дальнейшее фракционирование этого пула РНК может быть осуществлено для очистки РНК HPV6a от РНК, не относящейся к HPV6a. Пептид или белок, продуцируемый по этому способу, можно анализировать для обеспечения аминокислотных последовательностей, которые, в свою очередь, используют для создания праймеров для получения кДНК HPV6a, или РНК, используемую для трансляции, можно анализировать для обеспечения нуклеотидных последовательностей, кодирующих HPV6a, и получения зондов для скрининга библиотеки кДНК HPV6a. Эти способы известны в данной области и их можно найти, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY. 1989.

Специалистам в данной области понятно, что для выделения HPV6a-кодирующей ДНК можно использовать другие типы библиотек, а также библиотеки, сконструированные из других клеток или типов клеток. Другие типы библиотек включают в себя (но не ограничиваются ими) библиотеки кДНК, полученные из других клеток или клеточных линий, содержащих HPV типа 6a, и библиотеки геномной ДНК.

Получение библиотек кДНК может быть осуществлено стандартными способами, хорошо известными в данной области. Способы конструирования библиотек кДНК можно найти, например, в Sambrook, J., et al., supra. Специалистам в этой области ясно, что ДНК, кодирующего HPV6a, можно также выделить из соответствующей библиотеки геномной ДНК. Конструирование библиотек геномных ДНК можно выполнять стандартными способами, известными в данной области. Способы конструирования библиотек геномных ДНК можно найти в Sambrook, et al., supra.

Клонированные ДНК HPV6a или их фрагменты, полученные описанными здесь способами, могут рекомбинантно экспрессироваться молекулярным клонированием в экспрессирующий вектор, содержащий подходящий промотор и другие подходящие регуляторные элементы транскрипции, и переноситься в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева для продуцирования рекомбинантного HPV6a. Способы таких манипуляций полно описаны в Sambrook, J., et al., supra и известны в этой области.

Экспрессирующие векторы определяются здесь как ДНК-последовательности, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в соответствующем хозяине. Такие векторы можно использовать для экспрессии эукариотических генов в многочисленных хозяевах, таких как бактерии, сине-зеленые водоросли, клетки растений, клетки насекомых, клетки грибов и клетки животных. Специально сконструированные векторы позволяют перемещать ДНК между такими хозяевами, как бактерии-дрожжи, или бактерии-клетки животных, или бактерии-клетки грибов, или бактерии-клетки позвоночных животных. Правильно сконструированный экспрессирующий вектор должен содержать затравку репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах, селектируемые маркеры, ограниченное число применимых сайтов рестриктаз, потенциал для высокой копийности и активные промоторы. Промотор определяется как ДНК-последовательность, которая направляет РНК-полимеразу на связывание с ДНК и инициирует синтез РНК. Сильным промотором является такой промотор, который обусловливает высокую частоту инициации мРНК. Экспрессирующие векторы могут быть (но не только) клонирующими векторами, модифицированными клонирующими векторами, специально сконструированными плазмидами или вирусами.

Разнообразные экспрессирующие векторы млекопитающих можно использовать для экспрессии ДНК HPV6a или ее фрагментов в клетках млекопитающих. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы млекопитающих, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и ZD35 (ATCC 37565).

Множество бактериальных экспрессирующих векторов можно использовать для экспрессии ДНК HPV6a и ее фрагментов в бактериальных клетках. Коммерчески доступные бактериальные экспрессирующие векторы, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pET11a (Novagen), лямбда gt11 (Invitrogen), pcDNA11 (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Множество экспрессирующих векторов грибных клеток можно использовать для экспрессии HPV6a или его фрагментов в грибных клетках. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы грибных клеток, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pYES2 (Invitrogen), экспрессирующий вектор Pichia (Invitrogen).

Множество экспрессирующих векторов клеток насекомых можно использовать для экспрессии ДНК HPV6a или ее фрагментов в клетках насекомых. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы клеток насекомых, которые могут быть пригодными для рекомбинантной экспрессии HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pBlueBacIII (Invitrogen).

Экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую HPV6a или его фрагменты, может быть использован для экспрессии белков HPV6a или фрагментов белков HPV6a в клетке, ткани, органе или животном. Животным (в применении здесь) может быть и человек. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, в том числе (но не только) бактериями, такими как E.coli, клетками грибов, такими как дрожжи, клетками млекопитающих, в том числе (но не только), клеточными линиями человека, быка, свиньи, обезьяны и грызуна, и клетками насекомых, в том числе (но не только), клеточными линиями, произведенными из Drosophila и тутового шелкопряда. Клеточными линиями, произведенными из видов млекопитающих, которые могут быть пригодными и которые являются коммерчески доступными, являются (но не ограничены ими) L-клетки L-M(TK^-) (ATCC CCL 1.3), L-клетки L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1(ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), N1H/3T3 (ATCC CRL 1658), Hela (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) и MRS-5 (ATCC CCL 171).

Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева посредством одного из ряда способов, таких как (но не только) трансформация, трансфекция, липофекция, слияние протопластов и электропорация. Содержащие экспрессирующий вектор клетки клонально размножают и индивидуально анализируют для определения, продуцируют ли они белок HPV6a. Идентификацию экспрессирующих HPV6a клонов клеток-хозяев можно осуществлять несколькими способами, в том числе (но не только) по иммунологической реактивности с антителами против HPV6a и по присутствию ассоциированной с клеткой-хозяином активности HPV6a, такой как связывание HPV6a-специфического лиганда или трансдукция сигнала, определяемая как ответная реакция, опосредованная взаимодействием HPV6a-специфических лигандов при HPV6a.

Экспрессия ДНК-фрагментов HPV6a может также осуществляться с использованием продуцируемой in vitro синтетической мРНК или нативной мРНК. Синтетическая мРНК или мРНК, выделенная из продуцирующих HPV6a клеток, может эффективно транслироваться в различных бесклеточных системах, таких как (но не только) экстракты зародышей пшеницы и экстракт ретикулоцитов, а также может эффективно транслироваться в системах на основе клеток, в том числе (но не только), посредством микроинъекции в ооциты лягушки, причем этот способ является предпочтительным.

После экспрессии белков HPV6a в клетке-хозяине белок HPV6a может быть извлечен для обеспечения HPV6a в очищенном виде. Доступны и пригодны несколько способов очистки HPV6a. Как описано здесь, рекомбинантный белок HPV6a может быть очищен из клеточных лизатов и экстрактов различными сочетаниями или отдельным применением солевого фракционирования, ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите и хроматографии гидрофобного взаимодействия.

Кроме того, рекомбинантный HPV6a может быть отделен от других клеточных белков при помощи иммуноаффинной колонки, приготовленной с моноклональными или поликлональными антителами, специфическими для полноразмерного насцентного (строящегося) HPV6a или полипептидных фрагментов HPV6a. Моноклональные и поликлональные антитела могут быть получены в соответствии со множеством способов, известных в данной области. Моноклональные или моноспецифические антитела, в применении здесь, определяются как молекулы одного антитела или молекулы множественных антител с однородными характеристиками связывания в отношении HPV6a. Однородным связыванием здесь называют способность молекул антитела связываться со специфическим антигеном или эпитопом.

Специалистам в данной области ясно, что способы получения моноспецифических антител могут быть использованы для получения антител, специфических для полипептидных фрагментов HPV или полноразмерных полипептидов HPV. В частности, специалистам в данной области ясно, что могут быть получены моноспецифические антитела, которые являются специфическими для полностью функциональных белков HPV или их фрагментов.

Данное изобретение касается также способов скрининга на соединения, которые модулируют экспрессию ДНК или РНК, кодирующих HPV, а также функцию (функции) белка (белков) HPV6a in vivo. Соединениями, которые модулируют эти активности, могут быть ДНК, РНК, пептиды, белки или небелковые органические молекулы. Соединения могут модулировать эти активности увеличением или аттенюированием экспрессии ДНК или РНК, кодирующих HPV6a, или функции белка HPV6a. Соединения, способные модулировать экспрессию ДНК или РНК, кодирующих HPV6a, или функцию белка HPV6a, могут быть обнаружены различными тестами. Такой тест может быть простым тестом "нет/да" для определения, имеется ли изменение в экспрессии или функции. Тест может быть сделан количественным путем сравнения экспрессии или функции испытуемой пробы с уровнями экспрессии или функции в стандартной пробе.

Могут быть приготовлены наборы, содержащие ДНК HPV6a, фрагменты ДНК HPV6a, антитела к ДНК HPV6a или к белку HPV6a, РНК HPV6a или белок HPV6a. Такие наборы используют для обнаружения ДНК, которая гибридизуется с ДНК HPV6a, или для обнаружения присутствия белка (белков) HPV6a или пептидных фрагментов этих белков в пробе. Такая характеристика является ценной для многочисленных целей, в том числе (но не только) для судебных анализов и эпидемиологических исследований.

Нуклеотидные последовательности, комплементарные кодирующей последовательности ДНК HPV6a, могут быть синтезированы для терапии при помощи антисмысловых последовательностей. Такими антисмысловыми молекулами могут быть ДНК, стабильные производные ДНК, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, РНК, стабильные производные РНК, такие как 2"-O-алкилРНК, или другие антисмысловые олигонуклеотидные миметики HPV6a. Антисмысловые молекулы HPV6a могут быть введены в клетки микроинъекций, инкапсулированием в липосомы или экспрессией из векторов, несущих эту антисмысловую последовательность. Терапия при помощи антисмысловых молекул HPV6a может быть, в частности, применима для лечения заболеваний, при которых выгодно уменьшение активности HPV6a.

Термин "химическое производное" относится к молекуле, которая содержит дополнительные химические части молекулы, которые в норме не являются частью основной молекулы. Такие части молекулы могут улучшать растворимость, продолжительность жизни, абсорбцию и т.д. основной молекулы. Альтернативно, эти части молекулы могут ослаблять нежелательные побочные эффекты основной молекулы или снижать токсичность основной молекулы. Примеры таких частей молекул описаны во многих руководствах, таких как Remington"s Pharmaceutical Sciences.

Соединения, идентифицированные согласно описанным здесь способам, можно использовать отдельно при подходящих дозах, определяемых рутинным тестированием, для получения оптимального ингибирования HPV6a или его активности при минимизации любой потенциальной токсичности. Кроме того, может быть желательным совместное введение или последовательное введение других агентов.

Предпочтительно соединения по данному изобретению могут быть введены в виде одной суточной дозы или общая суточная доза может вводиться в виде нескольких разделенных доз. Кроме того, соединения по данному изобретению могут вводиться посредством таких способов, как (но не только) интраназальный, трансдермальный способы, при помощи суппозиториев, перорально и т.д.

Для комбинированного лечения более чем одним активным агентом, когда активные агенты находятся в раздельных дозированных готовых формах, активные агенты могут вводиться совместно или каждый может быть введен отдельно.

Схему введения соединений по данному изобретению выбирают в соответствии с различными факторами, такими как тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; тяжесть состояния, которое должно быть подвергнуто лечению, способ введения; функционирование почек и печени пациента; и конкретное применяемое соединение. Врач с обычной квалификацией может легко определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для предотвращения, противодействия или остановки прогрессирования данного состояния. Оптимальная точность в достижении концентраций лекарственного средства в пределах, которые дают эффективность без токсичности, требует схемы, основанной на кинетике доступности данного лекарственного средства для сайтов-мишеней. Это включает в себя рассмотрение распределения, равновесия и элиминации лекарственного средства.

В способах по данному изобретению описанные здесь подробно соединения могут образовать активный ингредиент и их обычно вводят в смеси с подходящими фармацевтическими разбавителями, наполнителями или носителями (называемыми здесь в общем виде материалами - "носителями"), выбранными в соответствии с предполагаемой формой введения, т.е. введения в виде пероральных таблеток, капсул, эликсиров, сиропа, суппозиториев, гелей и т.п., и соответствующими обычной фармацевтической практике.

Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы активный лекарственный компонент может комбинироваться с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т.п. Кроме того, при желании или при необходимости, в эту смесь могут быть включены подходящие связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и красители. К подходящим связующим веществам (без ограничения) относятся крахмал, желатина, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, сахаристые вещества из кукурузы, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, воски и т.п. К смачивающим веществам, используемым в таких лекарственных формах, относятся (без ограничения) олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. Дезинтеграторы включают в себя (без ограничения) крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.

Для жидких форм активный лекарственный компонент может комбинироваться с подходящими содержащими корригент суспендирующими или диспергирующими агентами, такими как синтетические и природные камеди, например трагакант, аравийская камедь, метилцеллюлоза и т.п. Другими диспергирующими агентами, которые могут применяться, являются глицерин и т.п. Для парентерального введения желательны стерильные суспензии и растворы. В случае внутривенного введения желательно использование изотонических препаратов, которые обычно содержат подходящие консерванты.

Препараты для местного нанесения, содержащие активный лекарственный компонент, могут быть смешаны с различными материалами-носителями, хорошо известными в данной области, такими как, например, спирты, гель Aloe vera, аллантоин, глицерин, масла с витаминами A и E, минеральное масло, PPG2 миристилпропионат и т.п., для образования, например, спиртовых растворов, очищающих средств для местного применения, очищающих кремов, кожных гелей, кожных лосьонов и шампуней в виде крема или геля.

Соединения по данному изобретению могут также вводиться в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стериламин или фосфатидилхолины.

Соединения по данному изобретению могут также доставляться с использованием моноклональных антител в качестве индивидуальных носителей, с которыми соединены молекулы конкретного соединения. Соединения по данному изобретению могут быть также связаны с растворимыми полимерами в качестве нацеливаемых носителей лекарственного средства. К таким полимерам относятся поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксиметакрил-амидфенол, полигидроксиэтиласпартамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный остатками пальмитоила. Кроме того, соединения по данному изобретению могут быть соединены с классом биодеградируемых полимеров, применимых в достижении контролируемого высвобождения лекарственного средства, например с полимолочной кислотой, полиэпсилон-капролактаном, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полигидропиранами, полиакрилатами и перекрестно-сшитыми или амфипатическими блок-сополимерами гидрогелей.

Следующие далее примеры иллюстрируют данное изобретение без его ограничения только этими примерами.

ПРИМЕР 1

Получение штамма U9 дрожжей

Штамм 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04,adel, cir^o) Saccharomyces cerevisiae был получен от др. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Клетки штамма 2150-2-3 размножали в течение ночи при 30^oC в 5 мл Среды YEHD (Carty et al. , J. Ind Micro 2 (1987) 117-121). Клетки промывали 3 раза в стерильной дистиллированной воде, ресуспендировали в 2 мл стерильной дистиллированной воды и 0,1 мл клеточной суспензии высевали на каждую из шести чашек с 5-фтороротовой кислотой (FOA) для отбора на мутанты ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Чашки инкубировали при 30^oC. Среда содержала на 250 мл дистиллированной воды: 3,5 г азотистого основания дрожжей Difco без аминокислот и сульфата аммония; 0,5 г 5-фтороротовой кислоты; 25 мг урацила и 10,0 г декстрозы.

Среду стерилизовали фильтрованием через мембраны 0,2 мкм и затем смешивали с 250 мл 4% бактоагара (Difco), поддерживаемого при 50^oC, 10 мл раствора аденина 1,2 мг/мл и 5 мл раствора L-лейцина (180 мг/50 мл). Полученную среду распределяли по 20 мл на чашку Петри.

После 5 дней инкубирования появились многочисленные колонии. Отдельные колонии выделяли путем повторного посева штрихом из исходных чашек с FOA на свежие чашки с FOA, которые затем инкубировали при 30^oC. Ряд колоний из второй серии чашек с FOA тестировали на присутствие мутации ura3 при помощи посева методом реплик (отпечатков) как на чашки со средой YEHD, так и на урацил-минус-чашки. Желательным результатом был хороший рост на YEHD и отсутствие роста на урацил-минус-среде. Был получен один изолят (U9), который обнаружил эти свойства. Его хранили в виде замороженного раствора в глицерине (штамм N 325) при -70^oC для последующего использования.

ПРИМЕР 2

Получение вектора для разрыва гена MNN9 дрожжей

Для получения вектора для разрыва гена MNN9 необходимо было сначала клонировать ген MNN9 из геномной ДНК S.cerevisiae. Это достигалось при помощи стандартной технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). 5"-смысловой праймер и 3"-антисмысловой праймер для ПЦР полноразмерной кодирующей последовательности MNN9 конструировали на основе опубликованной последовательности для гена дрожжей MNN9 (Zymogenetics: EPO Patent Application N 88117834.7, Publication N 0314096-A2). Использовали следующие олигодезоксинуклеотидные праймеры, содержащие фланкирующие сайты HindIII (подчеркнутые):

смысловой праймер: 5"-CCT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3"

антисмысловой праймер: 5 TGA TAA GCT TGC TCA ATG CTT CTC TTC CTC-3".

Инициирующий кодон метионина для гена MNN9 выделен жирными буквами. ПЦР проводили с использованием геномной ДНК из штамма JRY188 (Rine et al.) S. cerevisiae в качестве матрицы, ДНК-полимеразы Tag (Perkin Elmer) и 25 циклов амплификации (94^oC 1 мин, 37^oC 2 мин, 72^oC 3 мин). Полученный ПЦР фрагмент 1,2 т. п.н. расщепляли HindIII, очищали на геле и лигировали с расщепленной HindIII, обработанной щелочной фосфатазой плазмидой pUC13 (Pharmacia). Полученная плазмида была названа p1183.

Для разрыва гена MNN9 геном дрожжей URA3 плазмиду pBR322-URA3 (которая содержит фрагмент HindIII 1,1 т.п.н, кодирующий ген URA3 S.cerevisiae, субклонированный в сайт HindIII pBR322) расщепляли HindIII и фрагмент ДНК 1,1 т. п. н. очищали на геле, концы затупляли ДНК-полимеразой T4 и затем лигировали этот фрагмент с расщепленной Pm11 плазмидой p1183 (Pm11 разрезает внутри кодирующей последовательности MNN9). Полученная плазмида p1199 содержит разрыв гена MNN9 функциональным геном URA3.

ПРИМЕР 3

Конструирование U9-производного штамма 1372, содержащего разрыв гена MNN9

Для разрыва гена MNN9 в штамме U9 (N 325) 30 мкг плазмиды p1199 расщепляли HindIII для создания линейной кассеты с разрывом mnn9::URA3. Клетки штамма 325 трансформировали расщепленной HindIII ДНК p1199 при помощи сферопластного метода (Hinnen et al. , 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933) и трансформанты отбирали на синтетической среде с агаром без урацила, содержащей 1,0 М сорбит. Синтетическая среда содержала на литр дистиллированной воды: Агар, 20 г; азотистое основание дрожжей без аминокислот, 6,7 г; Аденин, 0,04 г; L-тирозин, 0,05 г; Сорбит, 182 г; Глюкоза, 20 г; Лейцин-минус раствор N 2, 10 мл. Лейцин-минус-раствор N 2 содержит на литр дистиллированной воды: L-аргинин, 2 г; L-гистидин, 1 г; L-лейцин, 6 г; L-изолейцин, 6 г; L-лизин, 4 г; L-метионин, 1 г; L-фенилаланин, 6 г; L-треонин, 6 г; L-триптофан, 4 г.

Чашки инкубировали при 30^oC в течение 5 дней, когда появились многочисленные колонии. Препараты хромосомной ДНК получали из 10 колоний и затем расщепляли EcoR 1 плюс HindIII. Затем расщепленный ДНК-продукт оценивали при помощи блотов по Саузерну (J.Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) с использованием фрагмента HindIII 1,2 т. п.н., несущего ген MNM9 (выделенный из плазмиды p1199), в качестве зонда. Идентифицировали изолят (штамм N1372), который обнаруживал ожидаемые смешения полос ДНК на блоте по Саузерну, а также чрезвычайную агрегацию, обычно обнаруживаемую мутантами mnn9.

ПРИМЕР 4

Конструирование вектора для разрыва гена HIS3 дрожжей

Для конструирования кассеты с разрывом, в которой ген HIS3 S.cerevisiae разорван геном URA3, плазмиду YEp6 (K. Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci.,USA76:1035) расщепляли BamHI и фрагмент BamHI 1,7 т.п.н., несущий ген HIS3, очищали на геле, концы его затупляли ДНК-полимеразой T4 и лигировали этот фрагмент с pUC18, которую предварительно расщепляли BamHI и обрабатывали ДНК-полимеразой T4. Полученную плазмиду (названную p1501 или pUC18-HIS3) расщепляли Nhel (которая разрезает в кодирующей последовательности HIS3) и фрагмент вектора очищали на геле, концы затупляли ДНК-полимеразой T4 и затем фрагмент обрабатывали щелочной фосфатазой кишечника теленка. Ген URA3 выделяли из плазмиды pBR 322-URA3 расщеплением HindIII и фрагмент 1,1 т. п. н., несущий ген URA3, очищали на геле, концы затупляли ДНК-полимеразой T4 и лигировали фрагмент с описанным выше фрагментом Nhe1 pUC18-HIS3. Полученная плазмида (названная pUC18:His3::URA3 или p1505) содержит кассету с разрывом, в которой ген дрожжей HIS3 разорван функциональным геном URA3.

ПРИМЕР 5

Конструирование вектора для разрыва гена PR B1 геном HIS3

Плазмиду FP8H, несущую ген PRB1 S.cerevisiae, получали от др. E. Jones Carnegie-Mellon Univ. (C.M.Moehle et al., 1987, Genetics, 115:255-263). Ее расщепляли HindIII плюс Xho1 и фрагмент ДНК 3,2 т.п.н., несущий ген PRB1, очищали на геле, концы затупляли обработкой ДНК-полимеразой T4. Плазмиду pUC18 расщепляли BamHI, очищали на геле и затупляли концы обработкой ДНК-полимеразой T4. Полученный векторный фрагмент лигировали с указанным выше фрагментом гена PR B1 с получением плазмиды pUC18-PRB1. Плазмиду YEp6, которая содержит ген HIS3, расщепляли BamHI. Полученный фрагмент BamHI 1,7 т.п. н. , несущий функциональный ген HIS3, очищали на геле и затем затупляли его концы при помощи ДНК- полимеразы T4. Плазмиду pUC18-PR81 расщепляли EcoRV плюс Nco1, которые разрезают в кодирующей последовательности PR B1 и удаляют активный сайт протеазы B и фланкирующую последовательность. Фрагмент EcoRV-Nco1, несущий оставшиеся 5"- и 3" - части кодирующей последовательности PR B1 в pUC18, очищали на геле, концы затупляли обработкой ДНК-полимеразы T4, дефосфорилировали фрагмент щелочной фосфатазой

кишечника теленка и лигировали с имеющим тупые концы фрагментом HIS3, описанным выше. Полученная плазмида (названная pUC18::HIS3, группа (штамм) N 1245)) содержит функциональный ген HIS3 вместо части гена PR B1, которая была делетирована, как описано выше.

ПРИМЕР 6

Конструирование родственного U9 штамма дрожжей, содержащего разрывы генов MNN9 и PR B1

Родственный U9 штамм 1372, который содержит разрыв гена MNN9, был описан в Примере 3. Клональные изоляты штамма 1372 пассировали на чашках с FOA (как описано в Примере 1) для отбора мутантов ura3. Получали ряд изолятов ura3 штамма 1372 и один конкретный изолят (штамм 12930-190-S1-1) был отобран для последующего разрыва гена HIS3. Вектор с разрывом гена pUC18::URA3 (p1505) расщепляли Xba1 плюс EcoR1 с образованием линейной кассеты с разрывом his3:: URA3 и использовали ее для трансформации штамма 12930-190-S1-1 по методу с ацетатом лития (Methods in Enzymology, 194:290 (1991). URA⁺ -трансформанты отбирали на синтетической среде с агаром, не содержащей урацила, пересевали методом штриха для получения клональных изолятов на той же самой среде и затем высевали методом реплик на среду, не содержащую ни урацила, ни гистидина, для скрининга тех изолятов, которые были как Ura⁺, так и His^-. Один изолят (штамм 12930-230-1) был отобран для последующего разрыва гена PRB1. Вектор с разрывом гена PRB1 (pUC18 -prb1::HIS3, группа (штамм) 1245)) расщепляли Sac1 плюс Sba1 для образования линейной кассеты с разрывом prb1::HIS3 и использовали ее для трансформации штамма 12930-230-1 по методу с ацетатом лития. His⁺-трансформанты отбирали на среде с агаром, не содержащей гистидина, и пересевали штрихом на ту же самую среду для получения клональных изолятов. Геномную ДНК получали из ряда полученных His⁺-изолятов, расщепляли ее EcoR1 и затем подвергали электрофорезу на 0,8% агарозных гелях. Затем проводили блоттинг по Саузерну с использованием радиоактивно меченого зонда 617 п.н. для гена PR B1, который был получен с применением следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров:

5" TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3"

5" CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3"

Получали 11 изолятов, которые обнаруживали ожидаемую гибридизацию зонда с фрагментом ДНК 2,44 т.п.н. prb1::HIS3. В противоположность этому, не было гибридизации этого зонда с фрагментом 1,59 т.п.н. для гена PRB1 дикого типа. Один из этих изолятов, содержащий желаемый разрыв prb1::HIS3, был отобран для дальнейшего использования и назван штаммом N 1558.

ПРИМЕР 7

Конструирование вектора для разрыва гена PEP4 дрожжей

Ген PEP4 S. cerevisiae клонировали из геномной библиотеки дрожжей следующим образом. Клетки E. coli, содержащие геномную библиотеку дрожжей, pLS101 (Schulz and Friesen 1983, J. Bacteriol 155:9-14)), размножали в течение ночи в 5 мл LB-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Из этой культуры разведения 10^-4 и 10^-5 высевали на LB плюс ампициллин-чашки. Колонии снимали с чашек при помощи нитроцеллюлозных фильтров (методом подъема (lifting) колоний). Зонд 600 п.н. для гена pep4 дрожжей получали при помощи ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Taq, общей плазмидной ДНК из библиотеки pLS101 дрожжей и следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров, сконструированных на основе опубликованной последовательности для PEP4 (C.A. Wool ford et al., Mol.Cell.Biol. 6: 2500 (1986)).

Смысловой праймер: 5" -GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3"

Антисмысловой праймер: 5"-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3"

ПЦР проводили с 25 циклами амплификации (94^oC 1 мин, 37^oC 2 мин, 72^oC 3 мин). Зонд ПЦР очищали на геле, радиоактивно метили и гибридизовали с описанными выше фильтрами с колониями. Несколько колоний были положительными в отношении гибридизации с зондом PEP4 и их пересевали штрихом на чашки с LB плюс ампициллин для получения отдельных колоний. Плазмидную ДНК получали щелочным-ДСН-лизисом (Sambrook et al., supra) из нескольких из этих изолятов и расщепляли BamHI. Наблюдали ожидаемые полосу вектора 14 т.п.н. и полосу вставки PEP4 6,9 т.п.н. При двойном расщеплении с EcoR1 плюс Xho1 наблюдали ожидаемую полосу 1,5 т.п.н. для PEP4. Один изолят (штамм N 860 E.coli), обнаруживший ожидаемые результаты, был отобран для дальнейшего использования. Плазмидную ДНК из штамма N 860 расщепляли BamHI и ДНК-фрагмент BamHI 6,9 т. п.н., несущий хромосомный ген PEP4, субклонировали в сайт BamHI рUC13 с получением плазмиды p890. Затем плазмидную ДНК p890 расщепляли NcoI (которая разрезает в кодирующей последовательности PEP4), очищали на геле, концы затупляли обработкой ДНК-полимеразой T4 и лигировали с фрагментом с тупыми концами 1,1 т. п.н., несущим функциональный ген URA3 (полученный, как в Примере 2). Полученная плазмида, содержащая ген PEP4, разорванный геном URA3, была названа pUC13-pep4:: URA3 (штамм N 906).

ПРИМЕР 8

Конструирование штаммов дрожжей N 1569, N 1538 и N 1592, которые являются производными штамма U9, содержащими мутации как prb1, так и pep4

Для разрыва гена HIS3 в штамме U9 вектор с разрывом pUC18-his3::URA3 расщепляли EcoP1 плюс Xba1 и затем использовали для трансформации штамма U9 по методу с ацетатом лития. Ura⁺-трансформанты отбирали на среде с агаром, не содержащей урацила, и пересевали штрихом на ту же среду для клональных изолятов. Затем ряд полученных Ura⁺-изолятов высевали методом реплик на агаровую среду, не содержащую урацила или гистидина, и скринировали на колонии, которые были как Ura⁺, так и His^-. Один изолят (штамм N 1524) был отобран для последующего разрыва гена PR B1. Вектор с разрывом гена PRB1 pUC18-prb1: : HIS3 расщепляли Sac1 плюс Xha1 и затем использовали для трансформации штамма N 1524 по методу с ацетатом лития. His⁺-трансформанты отбирали на агаровой среде, не содержащей гистидина и пересевали штрихом для получения клональных изолятов на ту же самую среду. Геномную ДНК получали из ряда His⁺-изолятов и оценивали блоттингом по Саузерну с радиоактивно меченым PRB1-зондом. Один из изолятов (штамм N 1537), обнаруживший желательный разрыв гена PRB1 геном HIS3 (т.е. prb1::HIS3), был отобран для последующего разрыва гена PEP4. Штамм N 1537 пассировали на FOA-чашках для получения ura3-изолятов и один изолят (штамм N 1541) был отобран для дальнейшего использования.

Для разрыва гена PEP4 в штамме N 1541 вектор с разрывом гена PEP4 pUC13-pep4: : URA3 расщепляли Xho1 для получения линейной кассеты с разрывом pep4: : URA3 и использовали для трансформации штамма N 1541 по методу с ацетатом лития. Ura⁺-трансформанты отбирали на агаровой урацил-минус-среде и высевали штрихом для получения клональных изолятов на ту же самую среду. Геномную ДНК получали из ряда Ura⁺-трансформантов и оценивали при помощи блотов по Саузерну с использованием радиоактивного зонда для гена PEP4. Один изолят (штамм N 1569), обнаруживший желаемый разрыв гена PEP4 геном URA3, был отобран для дальнейшего использования. В независимом эксперименте, после практически той же самой последовательности стадий, был сконструирован штамм N 1538. Штамм N 1538 является производным штамма U9. Штамм N 1538 содержит мутации как prb1, так и pep4. Кроме того, ura3-производное штамма N 1569 получали пассажем на FOA-чашках. Полученное ura3- производное штамма N 1569 было названо штаммом N 1592.

ПРИМЕР 9

Экстракция нуклеиновой кислоты из биопсии

Большое поражение остроконечной кондиломы наружных половых органов получали из 25-летней пациентки после деторождения. Фрагмент этого поражения замораживали в жидком азоте, затем обрабатывали при помощи микродисмембратора 11 Брауна (В. Braun Instruments, Melsungen, Germany).

Полученный материал солюбилизировали 0,6% (м/об.) додецилсульфатом натрия (ДСН), обрабатывали протеиназой K (50 мкг/мл) и экстрагировали смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. ДНК осаждали этанолом и количество ее определяли при помощи УФ-спектрофотометрии. Присутствие высокомолекулярной ДНК устанавливали при помощи электрофореза в агарозном геле с последующим окрашиванием бромидом этидия.

ПРИМЕР 10

Типирование ДНК HPV

Тип ДНК HPV определяли с применением анализа улавливания гибрида, продаваемого как ViraTypePlus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). Используемые HPV-зонды разделяли на два пула, состав которых основан на ассоциации каждого типа со злокачественными заболеваниями половых путей. Группа A зондов содержала типы "низкого риска" HPV6, 11, 42, 43 и 44, тогда как группа B зондов содержала типы "высокого риска" 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 и 56. Общую ДНК расщепляли Pst1, BamHI и HindIII и выполняли блоттинг по Саузерну при условиях высокой строгости (T_m -15^oC) для определения подтипа HPV.

ПРИМЕР 11

Клонирование генома HPV6a

Общую ДНК, экстрагированную из HPV6a-положительной пробы биопсии, расщепляли эндонуклеазой HindIII. После фракционирования по размеру на 0,8% агарозном препаративном геле с низкой температурой плавления зону, соответствующую ДНК ~8 т.п.н. вырезали из геля и эту агарозу расщепляли ферментом Гелаза^TM (Epicentre Technologies, Inc., Madison, W1). Пробу лигировали с pUC18 (Pharmacia, Inc. , Piscataway, NY), которая была расщеплена HindIII и дефосфорилирована. После трансформации компетентных клеток DH5 E.coli (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD), плазмидную библиотеку подвергали скринингу на HPV6a-положительные клоны посредством гибридизации колоний с использованием антисмыслового ³²P-меченого олигодезоксинуклеотида, который был комплементарен 3"-концу гена L1. HPV6a (5"-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3"). Плазмиду pUC18, содержащую геном HPV6a 8,1 т.п.н., выделяли и характеризовали рестрикционным анализом и блоттинг-анализом по Саузерну. Эта плазмида была названа pUC18-HPV6a. Плазмидную ДНК получали с применением набора Qiagen^TM Plasmid Maxi (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).

ПРИМЕР 12

Анализ последовательности pUC18-HPV6a

Для определения полной последовательности HPV6a, секвенирующие праймеры были синтезированы на основе опубликованной последовательности HPV6a. Обе цепи полного генома 8,1 т.п.н. HPV6a секвенировали по методу дидезокси-терминации цепи с применением набора PRISM^TM и автоматизированного секвенатора Applied Biosystems (AB1) (N 373A) согласно инструкциям изготовителей (AB1, Inc. , Foster City, CA). В случаях, когда смысловая и антисмысловая последовательности не спаривались, синтезировали дополнительные специфические праймеры HPV6a для повторного секвенирования в обоих направлениях в зоне, о которой идет речь, для получения консенсуса.

Последовательности ДНК HPV6a и HPV6b обнаружили более 97% идентичности в целом при изменениях 229 п.н., идентифицированных из 8010 п.н. Наиболее значительные различия, по сравнению с последовательностью HPV6b, были обнаружены в длинном регуляторном районе (LCR; nt 7205 - nt 106). Кроме нескольких изменений отдельных нуклеотидов (nt) в LCR HPV6b, были обнаружены вставка из 94 п.н. при nt 7350 и другая вставка из 19 п.н. при nt 7804. При nt 7616 шесть п.н. были делетированы из генома HPV6a.

ПРИМЕР 13

Конструирование дрожжевого экспрессирующего вектора L1 HPV6a

ДНК HPV типа 6a использовали в качестве матрицы для ПЦР. Ген L1 HPV6a амплифицировали при помощи ПЦР с применением полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc. ), 35 циклов амплификации (94^oC 1 мин, 48^oC 1 мин, 72^oC 1 мин 45 с) и следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров, которые содержат фланкирующие сайты Bgl 11 (подчеркнуты):

Смысловой праймер: 5"-CTC CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3"

Антисмысловой праймер: 5"-GAG TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3"

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность непосредственно против хода транскрипции по отношению к инициирующему кодону метионина L1 HPV6a (выделенному жирными буквами). Продукт ПЦР L1,5 т. п. н. расщепляли Bgl 11 и очищали на геле. Экспрессирующий вектор pGAL10 конструировали выделением фрагмента Sph1 1,4 т.п.н. из двунаправленного содержащего GAL-промотор вектора pUC18-GAL1p-GAL10p, который содержит дивергентный промотор GAL1/GAL10 из плазмиды pBM272 (полученный от др. Mark Johnston, Washington University, St Louis), фланкированный на каждой стороне копией терминатора транскрипции ADH1 дрожжей (Bennetzen, J.L. and Hall, B.D. (1982) J. Biol. Chem. 257; 3018- 3025, клонирующим сайтом BamHI, расположенным между промотором GAL1 и первой копией терминатора транскрипции ADH1 и дивергентным промотором GAL10 и второй копией терминатора транскрипции ADH1. Дрожжевой челночный вектор, состоящий из pBR322, гена LEU2-d дрожжей и кольца 2 мкм дрожжей, расщепляли Sph1 и лигировали с фрагментом 1,4 т.п.н. Sph1 GAL-промотора. Полученный вектор, pGAL10, линеаризовали BamHI, которая разрезает между GAL1-промотором и терминатором транскрипции ADH1. Расщепленный BamHI вектор pGAL10 и расщепленный Bgl 11 ПЦР-фрагмент L1 HPV6a лигировали и использовали для трансформации клеток DH5 E.coli (BRL). Выделяли плазмиду pC1/1-GAL, которая содержит ген L1 HPV6a, она была названа p13173-357-6. Ген L1 в 13173-357-6 секвенировали (Секвенатор AB1 N 373A), и было показано, что он идентичен гену L1 в клоне pUC18-HPV6a.

ПРИМЕР 14

Конструирование дрожжевого экспрессирующего вектора L1 и 2HPV6a

Плазмиду p13.173-357-6 (pGAL10+HPV6a L1) расщепляли SmaI, которая разрезает между GAL 10-промотором и терминатором транскрипции ADH1. Ген L2 HPV6a 1,4 т. п. н. амплифицировали при помощи ПЦР с использованием ДНК pUC18-HPV6a в качестве матрицы, полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 циклов амплификации ПЦР (94^oC 1 мин; 48^oC 1 мин; 72^oC 1 мин 45 с) и следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров, которые содержат фланкирующие сайты SmaI (подчеркнуты):

смысловой праймер: 5 TCC CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3"

антисмысловой праймер: 5" TCC CTA GGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GG-3"

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность непосредственно против хода транскрипции по отношению к инициирующему кодону метионина L2 HPV6a (выделенному жирными буквами). Фрагмент ПЦР расщепляли SmaI, очищали на геле и лигировали с расщепленной SmaI плазмидой p13173-357-6. Плазмиду pGAL10, содержащую гены L1 и L2 HPV6a, выделяли, и она была названа p14049-7-2. Ген L2 секвенировали (Секвенатор AB1 N 373A), и было обнаружено, что он идентичен гену L2 в клоне pUC18- HPV6a.

ПРИМЕР 15

Экспрессия L1 HPV6a и ко-экспрессия L1 и L2 в дрожжах

Плазмиды p13173-357-6 (pGAL10+HPV6a L1) и p14049-7-2 (pGAL 10+HPV6a L1 и L2) использовали для трансформации штаммов N 1569 (MATa, Leu2-04, prb1, ade1, pep4, cir^o) и N 1558 (MATa, leu2-04, prb1, mnn9, adel, cir_o) S. cerevisiae. Образующиеся рекомбинантные штаммы, полученные с использованием штамма-хозяина N 1558, были штаммы N 1644 (L1 HPV6a) и N 1670 (L1 и L2 HPV6a), как показано в таблице (фиг.7). Клональные изоляты выращивали при 30^oC в среде YEHD, содержащей 2% галактозу, в течение 68-78 часов. После сбора клеток осадки этих клеток разрушали стеклянными шариками и клеточные лизаты анализировали на экспрессию белка L1 HPV6a или белка L2 HPV6a при помощи иммуноблоттинга. Пробы, содержащие 40 мкг общего клеточного белка, подвергали электрофорезу на 10% гелях с Трис-глицином при восстанавливающих и денатурирующих условиях и электроблоттингу на нитроцеллюлозные фильтры. Белок L1 иммунодетектировали с применением кроличьих антисывороток, индуцированных против слитого белка trpE-HPV11 (Brown, D.R. et al. Virology 201: 46-54), в качестве первичных антител и ослиных связанных с пероксидазой хрена (HRP) полных (двухвалентных) антител против кроличьих IgG (Amersham, Inc) в качестве вторых антител. Фильтры обрабатывали с использованием хемилюминесцентного ECL^TM набора для детектирования (Amersham, Inc). Полоса белка L1 50-55 кДа была обнаружена во всех пробах, за исключением отрицательного контроля (векторный контроль без гена L1 или L2).

Белок L2 обнаруживали в виде полосы белка 70 кДа Вестерн-блоттингом с использованием разведенных 1:250 сывороток из мышей, которые были иммунизированы слитым белком trpE-2HPV6a, полученным по существу согласно методу Carter et al., в качестве первичных антител и связанных с пероксидазой хрена овечьих антимышиных IgG (Amersham, Inc.) в качестве вторых антител (разведение 1:1000).

Для электронно-микроскопического анализа (ЭМ) (Structure Probe, West Chester, PA) аликвоту каждой пробы помещали на медленную сетку с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты (PTA), pH 7.0, помещали на сетку на 20 секунд. Сеткам давали высохнуть на воздухе перед исследованием при помощи трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии (ТЕМ). Вся микроскопия была выполнена с использованием JEOL 100CX трансмиссионного электронного микроскопа (JEOL USA, Inc.) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000X.

Вирус-подобные частицы (VLP) наблюдали в диапазоне размеров диаметра 50-55 нм во всех пробах дрожжей, несущих либо L1 HPV6a, либо L1 и L2 HPV6a ко-экспрессионные плазмиды. В пробах контрольных дрожжей не наблюдали VLP.

ПРИМЕР 16

Ферментация L1+L2 HPV6a (штамма N 1670)

Поверхностную культуру на чашках штамма 1670 асептически переносили на не содержащую лейцина среду, содержащую (на л): 8,5 г Difco дрожжевого азотистого основания без аминокислот и сульфата аммония; 0,2 г урацила; 10 г янтарной кислоты; 5 г сульфата аммония; и 0,25 г L-тирозина; эту среду доводили до pH 5,0-5,3 NaOH перед стерилизацией. После роста в течение 25 часов при 28^oC, при 250 об./мин, на ротационном шейкере готовили флаконы с замороженной культурой путем добавления стерильного глицерина до конечной концентрации 17% (м/об. ) перед хранением при -70^oC (1 мл на криофлакон). Инокулят для ферментации штамма 1670 получали в той же самой среде (500 мл на 2-литровую колбу) и заквашивали перенесением оттаянного содержимого двух замороженных культуральных флаконов в 2-литровые колбы и инкубированием при 280^oC при 250 об/мин, на ротационном шейкере в течение 25 часов. Для ферментации штамма 1670 использовали ферментер New Brunswick SF-116 с рабочим объемом 10 л после инокуляции. Использованная продукционная среда содержала (на л): 20 г дрожжевого экстракта Difco; 10 г пептона (Sheffield HySoy); 20 г глюкозы; 20 г галактозы; среду доводили до pH 5,3 перед стерилизацией. Все содержимое (500 мл) 2-литровой колбы с инокулятом переносили в ферментер, который инкубировали при 28^oC, 5 л воздуха в минуту, 400 об/мин, давлении 3,5 psi (24131,6 Па). Перемешивание увеличивали по необходимости для поддержания уровней растворенного кислорода более 40% от насыщения. Развитие ферментации подвергали мониторингу посредством автономных измерений глюкозы (Beckman Glucose 2 Analyzer) и неавтономной масс-спектрометрии (Perkin-Elmar 1200). После 69 часов инкубации клеточная плотность достигала 9,9 г сухого веса клеток на л. Эту культуру концентрировали при помощи фильтрования через полые волокна (Amicon H5MPO1-43 kartridge в системе фильтрования Amicon DC-10) до приблизительно 2 л, диафильтровали с 2 л забуференного фосфатом солевого раствора и концентрировали далее (приблизительно до 1 л) перед разливом в 500-миллилитровые центрифужные склянки. Осадки клеток собирали центрифугированием при 8000 об/мин (ротор Sorval GS3) в течение 20 минут при 4^oC. После декантации супернатанта осадки (всего 225 г сырых клеток) хранили при -70^oC до использования.

ПРИМЕР 17

Очистка капсидных белков L1+L2 рекомбинантного HPV6a

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний.

Клетки штамма N 1670 хранили в замороженном виде при -70^oC. Замороженные клетки (сырой вес = 38,0 г) оттаивали при 20-23^oC и ресуспендировали в 50 мл "L1-буфера" (20 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА). Ингибиторы протеаз ПМСФ и пепстатин А добавляли до конечных концентраций 2 мМ и 1,7 мкМ, соответственно. Суспензию клеток разрушали при давлении приблизительно 8000 psi (55158056 Па) посредством трех проходов в Микрофлюидизаторе М110 (Microfluidics Corp. , Newton, МА). Разрушенную клеточную суспензию центрифугировали при 5000 х g в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса (остатков клеток). Супернатант, содержащий антиген L1+L2, извлекали.

Жидкий супернатант разводили 1:5 добавлением Буфера A (20 мМ MOPS, pH 7,0) и наносили на анионообменную улавливающую колонку (5,0 см внутр. диаметр х 4.0 см) со смолой Fractogel^R EMD TMAE-650(S) (ЕМ Separations, Gibbstown, NJ), уравновешенную в Буфере A. После промывания Буфером A антиген элюировали градиентом 0-1,0 М NaCl в Буфере A. Иммунодот-блоттинг проводили для определения, какие фракции из колонки содержали белок L1.

Фракции, содержащие белок L1, согласно определению при помощи иммунодот-блоттинга, анализировали на общий белок по методу Бредфорда с последующим электрофорезом в ПААГ-ДСН с применением окрашивания серебром и Вестерн-блоттинга.

TMAE-фракции, обнаруживающие сравнимые чистоту и обогащение белка L1, объединяли. Антиген концентрировали фракционированием при помощи сульфата аммония. Раствор доводили до 63% насыщения путем добавления твердого сульфата аммония при осторожном перемешивании в течение более 30 минут. Пробу помещали на лед и давали образоваться осадку в течение 30 минут. Пробу центрифугировали при 12000 х g. Осадок суспендировали в 20,0 мл PBS (забуференного фосфатом солевого раствора) (6,25 мМ фосфата Na, pH 7,2, 150 мМ NaCl).

Ресуспендированный осадок хроматографировали на гель-фильтрационной колонке (2,6 см внутр. диаметр х 89 см) со смолой Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Подвижным буфером был PBS. Хроматографию проводили при 20-23^oC. Фракции анализировали электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром и обнаружением при помощи Вестерн-блоттинга. Самые чистые фракции объединяли. Полученный пул концентрировали.

Конечный продукт анализировали при помощи ПААГ-ДСН с окрашиванием коллоидным Кумасси. Белки L1 и L2 обнаружили 85% гомогенность. Идентичность белков L1 и L2 подтверждали Вестерн-блоттингом с использованием подходящих антисывороток. Конечный продукт разделяли на аликвоты и хранили при -70^oC. Этот процесс давал в целом 3,0 мг белка.

Электронно-микроскопический анализ выполняли посредством Structure Probe (West Chester, PA). Аликвоту пробы помещали на медную сетку с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты, pH 7,0, помещали на сетку на 20 секунд. Сетке давали высохнуть на воздухе перед исследованием под ТЭМ. Всю микроскопию выполняли с применением трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000X. Было подтверждено присутствие вирус-подобных частиц в диапазоне размеров 50-55 нм.

ПРИМЕР 18

Конструирование экспрессирующего вектора L1 CRPV.

Ген L1 CRPV амплифицировали ПЦР из плазмиды pLA11, которая содержит полный вирусный геном CRPV (Dr. Peter Howley, NCl), с использованием полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc.); 35 циклов амплификации (94^oC 1 мин; 50^oC 1 мин; 72^oC 2 мин) и следующих олигонуклеодитных праймеров, содержащих фланкирующие сайты Bgl 11 (подчеркнуты):

Смысловой праймер: 5" CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC-3"

антисмысловой праймер: 5" TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTA G-3"

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность непосредственно против хода транскрипции по отношению к инициирующему кодону метионина L1 CRPV (выделенному жирными буквами). ПЦP-пpoдукт L1 1 1,6 т.п.н. расщепляли Bgl 11, очищали на геле и субклонировали в сайт Bgl 11 вектора pSP72 (Promega) для получения плазмиды pSP72- CRPV-L1 (p12930-314-4-1).

Один субклон секвенировали полностью, и было обнаружено, что он отличается по 4 нуклеотидам от опубликованной последовательности L1 CRPV. Эти изменения не приводят к изменениям аминокислот. Ген L1 вырезали из pSP72-CRPV-1 в виде фрагмента Bgl 11 и субклонировали в уникальный сайт BamHI, расположенный между дрожжевым CAL10-промотором и терминатором транскрипции ADH1 в дрожжевом экспрессирующем векторе, который содержит GAL10-промотор из Yep528 (Broach et al., Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83:81-116) и терминатор транскрипции ADH1 в одном и том же векторном каркасе. Полученная плазмида была названа p12930-323-6-1.

ПРИМЕР 19

Конструирование экспрессирующего вектора L2 CRPV

Ген L2 CRPV амплифицировали ПЦР с использованием полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc. ) из плазмиды pLA11 после расщепления этой плазмиды Sall, очищали на геле фрагмент 7,9 т. п.н. и лигировали его с таким же фрагментом. Использовали тридцать пять циклов амплификации (90^oC 1 мин; 50^oC 1 мин; 72^oC 2 мин) и олигонуклеотидные праймеры, которые содержат фланкирующие сайты EcoR1 (подчеркнуты):

смысловой праймер: 5" CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGT CAC GAA AAC-3"

антисмысловой праймер: 5" CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3"

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность непосредственно против хода транскрипции относительно инициирующего кодона метионина L2 CRPV (выделенного жирными буквами). Продукт ПЦР 1,5 т. п.н. расщепляли EcoR1, очищали на геле и субклонировали в сайт EcoR1 вектора с двунаправленным промотором pUC18-GAL1p-GAL10p, содержащего дивергентный промотор GAL1/GAL10. Этот вектор содержит уникальный сайт BamHI между промотором GAL1 и первой копией терминатора транскрипции ADH1, уникальные сайты EcoR1 и SmaI, расположенные между промотором GAL10 и второй копией терминатора транскрипции ADH1. Полученную экспрессионную кассету несет фрагмент Sph1 1,4 т.п.н. Один клон (p12930-295-2-2), содержащий желаемую вставку L2 рядом с промотором GAL10, был полностью секвенирован и, как было показано, содержит 6 нуклеотидных изменений по сравнению с опубликованной последовательностью, 4 из которых приводят к изменениям аминокислот. Анализ последовательности исходной матрицы ДНК подтвердил, что эти изменения присутствуют также в pLA11, а не вводятся полимеразной цепной реакцией. Вектор pUC18-GAL1p-GAL10p, содержащий ген L2, разрезали Sph1 и фрагмент 2,9 т.п.н., несущий экспрессионную кассету ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t, лигировали с большим фрагментом Sph1 дрожжевого челночного вектора. Полученная плазмида была названа p12930-323-2-3.

ПРИМЕР 20

Экспрессия капсидных белков L1 и L2 CRPV в дрожжах

Плазмиды p12930-323-6-1 и p12930-323-2-3 использовали для трансформации штаммов N 1569, N 1538, BJ5462 (E. W. Jones, Methods in Enzymology 194 (1991) 428-453) и BJ1995 (Jones, ibid.]. Клональные изоляты росли при 30^oC в среде YEHD, содержащей 2% галактозу, в течение 48-72 часов. После сбора клеток осадки клеток разрушали стеклянными шариками, добавляли Тритон X-100 до 0,5% конечной концентрации и полученные лизаты клеток оценивали на экспрессию L1 и L2 CRPV при помощи иммуноблоттинга. Пробы, содержащие 40 мкг общего клеточного белка, подвергали электрофорезу на 12% Трис-Глициновых гелях (Novex) при восстанавливающих и денатурирующих условиях и электроблоттингу на мембраны ПВДФ (Novex). Белки L1 и L2 CRPV детектировали с использованием поликлональных кроличьих антисывороток против L1 или L2 (подарок от Dr. Jonn Kreider, Hershey Medical Center) в качестве первичных антител и белка A, связанного с пероксидазой хрена, (Amersham, Inc.) в качестве второго антитела. Мембраны обрабатывали с применением хемилюминесцентного набора ECL^TM Detection Kit (Amersham, Inc.). Полоса белка L1 55-61 кДа была обнаружена во всех пробах, несущих плазмиду экспрессирующую L1, а полоса белка L2 ~ 90 кДа была обнаружена во всех пробах из клонов дрожжей, несущих плазмиду экспрессирующую L2.

Сигнал не обнаруживали в пробах, полученных из клонов дрожжей, несущих плазмиду экспрессирующую L1, с антисыворотками против L2, или наоборот (Фиг. 6).

На основе этих результатов экспрессии следующие рекомбинантные штаммы были выбраны для дальнейших исследований: штамм N 1582, который представляет собой штамм-хозяин N 1569, содержащий плазмиду p12930-323-6-1; и штамм N 1583, который представляет собой штамм-хозяин N 1538, несущий плазмиду p12930-323-2-3.

ПРИМЕР 21

A. Очистка рекомбинантного капсидного белка L1 CRPV

Клетки штамма N 1582, хранящиеся при -70^oC, оттаивали и суспендировали в равном объеме Разрушающего буфера (20 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА). Ингибиторы протеаз ПМСФ и Пепстатин A добавляли к суспензии до конечной концентрации 2 мМ и 1,7 мкм соответственно. Клетки лизировали 10 проходами в микрофлюидизаторе. Затем этот лизат осветляли центрифугированием при 5000 х g в течение 10 минут. Супернатант наслаивали на верхнюю часть 5-сантиметровой подушки из 45% сахарозы (м/об.) в L1-буфере и L1 осаждали центрифугированием при 100000 х g в течение 4 часов. Осадок ресуспендировали в 1/10 объема L1-буфере. Ресуспендированный осадок осветляли центрифугированием при 5000 х g в течение 10 минут. К супернатанту добавляли Твин-80 до конечной концентрации 0,01% и супернатант фракционировали при комнатной температуре гель-фильтрационной хроматографией на колонке 1700 мл (5 см внутр. диаметр) смолы Sephacryl S-1000 (Pharmacia). Подвижным буфером для этой колонки был 10 мМ фосфат натрия, pH 7.2, 150 мМ NaCl, 0,01% Твин-80. Фракции, содержащие иммунореактивный материал согласно иммунодот-блот-анализу, объединяли и концентрировали до 1/6 объема ультрафильтрацией с использованием перемешиваемой ячейки Amicon с плоскослойной мембраной Y М-100 с диаметром 76 мм. Продукт стерильно фильтровали через мембрану 0,22 мкм (Millipore) Millex-GV.

В. Характеристика рекомбинантного капсидного белка L1 C RPV

Идентичность конечного продукта подтверждали Вестерн-блоттингом и анализом N-концевой последовательности. Чистоту оценивали при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН с окрашиванием Кумасси и серебром и при помощи капиллярного электрофореза (Solution Sieving Capillary Electrophoresis (SSCE)) с оптическим детектированием при 215 нм. L1 имел 75% чистоту согласно SSCE. Электронная микроскопия показала, что присутствовали VLP в диапазоне размеров диаметра 50-55 мм.

C. Аналитическая гель-фильтрационная ЖХВР

Для определения VLP пробы фракционировали по размеру при помощи гель-фильтрационной хроматографии. Хроматографию проводили при помощи ЖХВР (Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC) с автоинжектором ISS 100, снабженным инжекционной петлей на 200 мкл. Использовали колонку TSK-gel G-5000PW, 7,5 х 600 мм (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA). Для мониторинга элюции белка из колонки оптическое детектирование при 280 нм осуществляли при помощи детектора с диодной матрицей Perkin-Elmer LC-235. Подвижной фазой был 0,5 М NaCl в 10 мМ буфере из фосфата Na, pH 7,2. Скорость тока была 0,5 мл/мин и собирали фракции по 1 мл. Калибровку колонки осуществляли с белковыми стандартами из Sigma, a также рекомбинантным поверхностным антигеном вируса гепатита В (Recombivax^TM, Merck and Co., West Point, PA). Детектирование антигена в собранных во время элюции фракциях выполняли при помощи иммунодот-блот-анализа.

D. Иммунодот-блот-анализ

Пробу 10 мкл каждой фракции наносили на полоску ПВДФ-мембраны (Immunobilon-P, Villipore Corp., Bedford, MA), которая была предварительно увлажнена и помещена на увлажненную промокательную бумагу. Пробе давали впитаться в мембрану и эту мембрану помещали в Блокирующий раствор (5% (м/об.) нежирного сухого молока, растворенного в 0,15 М NaCl, 0,02% (м/об.) азиде натрия и 0,01 М фосфате натрия, pH 7,2)) и инкубировали при комнатной температуре с осторожным перемешиванием в течение (как минимум) трех часов. Блокирующий раствор декантировали и заменяли раствором первичных антител.

Применяемые первичные антитела изменялись в зависимости от детектируемого антигена.

L1 CRPV зондировали кроличьей сывороткой против CRPV "позднего ответа" (Biodesign International, Kennebunk, ME). L2 CRPV зондировали кроличьей сывороткой против L2 CRPV. L1 HPV6a зондировали моноклональными антителами MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). L2 HPV6a зондировали мышиной сывороткой против слитого белка L2-trpE HPV6a.

Визуализацию иммунных комплексов осуществляли стандартными способами с применением второго антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой, и хромогенного субстрата NBT/BC1P.

E. Приготовление вакцины из рекомбинантного капсидного белка L1 CRPV

Очищенный капсидный белок L1 CRPV адсорбировали на Al(OH)₃ при концентрации 100 мкг/мл.

ПРИМЕР 22

Очистка рекомбинантного капсидного белка L1 CRPV - Схема 2

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний.

Клетки штамма N 1582, хранящиеся при -70^oC, оттаивали и суспендировали в равном объеме разрушающего буфера (20 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА). Ингибиторы протеаз ПМСФ и Пепстатин A добавляли к суспензии до конечной концентрации 2 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Клетки лизировали с использованием системы BioNeb Cell Disrupter (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, 1N). Лизат осветляли центрифугированием при 5000 x g в течение 10 минут.

Супернатант наслаивали на верхнюю часть 5-сантиметровой подушки 45% (м/об.) сахарозы в L1-буфере и L1 осаждали центрифугированием при 100000 x g в течение 4 часов. Осадок ресуспендировали в 1/10 объема L1 - буфера. Ресуспендированный осадок осветляли центрифугированием при 5000 х g в течение 10 минут.

Супернатант разводили 1:5 при помощи PBS, повторно осветляли центрифугированием в роторе Sorvall SA-600 при 6500 об/мин в течение 10 минут при 4^oC. Супернатант фильтровали через фильтрующий шприц 0,22 микрон и фракционировали при помощи анионообменной хроматографии.

Анионообменную хроматографию проводили с применением Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC с инжекционной петлей на 5 мл. Хроматографической средой были смола Fractogel EMF TMAE-650 (S) 25-40 микрон (EM Separa-tions, Gibbstown, NJ) в стеклянной колонке 150 мм х 10 мм внутр. диаметр. Для мониторинга элюции белка из колонки оптическое детектирование при 280 нм выполняли с использованием детектора с диодной матрицей Perkin-Elmer LC-235. Колонку предварительно уравновешивали 0,15 М NaCl в 0,01 М буфере из фосфата натрия, pH 7,2 (Буфер A). Скорость тока была 0,75 мл/мин. Пробу наносили на колонку и колонку промывали Буфером A для удаления несвязавшегося материала. Связанный материал элюировали линейным концентрационным градиентом хлорида натрия, 0,15 М - 0,65 М, в течение 5 минут с последующим линейным градиентом 0,65 М - 1,15 М в течение 30 минут. Детектирование антигена в собранных во время элюции фракциях осуществляли при помощи иммунодот-блот-анализа. Фракции, содержащие иммунореактивный материал (т.е. фракции, элюирующиеся между 0,81 М и 1,05 М NaCl) объединяли.

Объединенные фракции концентрировали в центрифужных устройствах для концентрирования Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) до 1/5 объема.

Концентрат фракционировали гель-фильтрационной хроматографией с применением смолы Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) в колонке 87 см x 27 мм внут. диам. Скорость тока колонки была 2,5 мл/мин. Элюцию белков наблюдали по A₂₈₀. Антиген детектировали при помощи иммуноблоттинга.

Фракции, содержащие иммунореактивный материал, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией с применением перемешиваемой ячейки (Amicon, Inc., Beverly, MA) с плоскослойной мембраной Ж-100 с диаметром 43 мм (Amicon, Inc. , Beverly, Ма) в атмосфере азота при давлении 10 psi (68947, 57 Па).

Конечный продукт характеризовали при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН с окрашиванием Кумасси и капиллярного электрофореза (SSCE). Конечный продукт из Схемы 2 имел чистоту 88% согласно SSCE.

ПРИМЕР 23

A. Очистка рекомбинантного капсидного белка L1 CRPV - Схема 3

(Фиг. 17)

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний.

Клетки штамма N 1582, хранящиеся при -70^oC, оттаивали и суспендировали в равном объеме Разрушающего буфера (20 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА). Ингибиторы протеаз ПМСФ и Пепстатин A добавляли к суспензии до конечной концентрации 2 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Клетки лизировали с использованием системы BioNeb Cell Disrupter (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, 1N). Лизат осветляли центрифугированием при 5000 x g в течение 10 минут.

Супернатант экстрагировали 1/2 объема хлороформа. Водный слой удаляли и осветляли центрифугированием при 12000 об/мин в микрофуге Бекмана в течение 5 минут при комнатной температуре.

Супернатант разводили 1:5 при помощи PBS, повторно осветляли центрифугированием в роторе Sorvall SA-600 при 6500 об/мин в течение 10 минут при 4^oC. Супернатант фильтровали через фильтрующий шприц 0,22 микрон и фракционировали при помощи анионообменной хроматографии.

Анионообменную хроматографию проводили с применением Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC с инжекционной петлей на 5 мл. Хроматографической средой была смола Fractogel EMF ТМАЕ-650 (S) 25-40 микрон (ЕМ Separations, Gibbstown, NJ) в стеклянной колонке 150 мм x 10 мм внутр. диаметр. Для мониторинга элюции белка из колонки оптическое детектирование при 280 нм выполняли с использованием детектора с диодной матрицей Perkin-Elmer LC-235. Колонку предварительно уравновешивали 0,15 М NaCl в 0,01 М буфере из фосфата натрия, pH 7,2 (Буфер A). Скорость тока была 0,75 мл/мин. Пробу наносили на колонку и колонку промывали Буфером A для удаления несвязавшегося материала. Связанный материал элюировали линейным концентрационным градиентом хлорида натрия, 0,15 М - 0,65 М, в течение 5 минут с последующим линейным градиентом 0,65 М - 1,15 М в течение 30 минут. Детектирование антигена в собранных во время элюции фракциях осуществляли при помощи иммунодот-блот-анализа. Фракции, содержащие иммунореактивный материал (т.е. фракции, элюирующиеся между 0,81 М и 1,05 М NaCl), объединяли.

Объединенные фракции концентрировали в центрифужных устройствах для концентрирования Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) до 1/5 объема.

Концентрат фракционировали гель-фильтрационной хроматографией с применением смолы Sephacryl S-10000 SF (Pharmacia, Piscafcaway, NJ) в колонке 87 см x 27 мм внутр. диам. Скорость тока колонки была 2,5 мл/мин. Элюцию белков наблюдали по A₂₈₀. Антиген детектировали при помощи иммуноблоттинга.

Фракции, содержащие иммунореактивный материал, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией с применением перемешиваемой ячейки (Amicon, Inc., Beverly, MA) с плоскослойной мембраной М-100 с диаметром 43 мм (Amicon, Inc, Beverly, Ma) в атмосфере азота при давлении 10 psi (68947, 57 Па).

Конечный продукт характеризовали при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН с окрашиванием Кумасси и капиллярного электрофореза (SSCE). Конечный продукт из Схемы 3 имел чистоту 95% согласно SSCE.

Капиллярный электрофорез (Solution Sieving Capillary Electrophoresis (SSCE).

Пробы VLP CRPV (~0,2 мг/мл) нагревали в течение 15 минут при 100^oC в 1% 2-меркаптоэтанола и 1% (об/об) ДСН. Пробу наносили электрокинетически вместе со стандартным (ссылочным) маркером, меллитовой кислотой, на сплавленный капилляр из диоксида кремния, 42 см (22 см до детектора) х 0,05 мм (внутр. диаметр), предварительно уравновешенный 10 объемами просвета 0,1 н. NaOH, водой и "просеивающим" реагентом ProSort (Applied Biosystems, Foster City, CA). Напряжение разделения 300 В/см подавали при помощи прибора Applied Biosystems model 270A-HT CE. Элюцию пробы наблюдали по поглощению при 215 нм и эти данные регистрировали при помощи программного обеспечения Nelson Turbochrom 3.

ПРИМЕР 24

Защита против развития папилломы, вызываемой CRPV, путем вакцинации полученных из дрожжей вирус-подобных частиц (VLP) L1 CRPV

5 Ново-Зеландских белых кроликов иммунизировали внутримышечно либо 135 мкг VLP L1 (75% чистоты), адсорбированными на квасцах, либо 100 мкг рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В (99% чистоты), адсорбированного на гидроксиде алюминия, в качестве отрицательного контроля. Животные получали еще две повторные инъекции в течение более 8 недель, перед тем как их заражали CRPV через 10 дней после последней бустер-инъекции. Сыворотки, взятые перед иммунизацией, при каждой бустер-инъекции и перед заражением, анализировали посредством L1-специфического твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). 96-луночные микротитрационные планшеты покрывали 5 мкг неочищенного лизата полученных из дрожжей L1 CRPV или L2 CRPV. Белок удаляли и планшеты блокировали в 10% сухом молоке (Carnation) +TTBS (20 мМ Трис, pH 7,4, 500 мМ NaCl, 0,1% Твин) в течение 2 часов при 4^oC. После промывания планшетов ТТВ добавляли кроличьи сыворотки в 1% молоке+TTBS и инкубировали в течение 2 часов при 4^oC. Планшеты промывали TTBS и инкубировали с разведением 1:1000 антикроличьих IgG -щелочной фосфатазы (Kirkegaard and Perry Labs., Inc. ) в 1% молоке+TTBS в течение 2 часов при 4^oC. Планшеты промывали TTBS и проявляли добавлением п-нитрофенилфосфата (Kirkegaard and Perry Labs., Inc. ). Реакцию останавливали добавлением 5% ЭДТА. Поглощение измеряли при 405 нм. Титр считали положительным, если отношение поглощения L1/L2 было 2:1.

Титры антител против L1 присутствовали через 4 недели после первой инъекции и они увеличивались с каждой дополнительной бустер-инъекцией. Контрольные животные были отрицательными. Через 6 недель после заражения CRPV вакцинированные животные не имели бородавок в 15 из 15 мест (исходный вирусный раствор, разведенный 1:2 или 1:12), тогда как контрольные животные обнаружили образование бородавок в 12 из 15 мест (вирус с разведением 1:2) или в 9 из 12 мест (вирус с разведением 1:12). После 15 недель вакцинированные животные все еще не имели бородавок.

Проводили тесты нейтрализации вируса (в основном в соответствии с методом Christensen et al., 1991, Virology 181:572-579) путем смешивания кроличьих сывороток с CRPV и последующим заражением кроликов этим обработанным CRPV. Стандартом для определения нейтрализующих антител была полная нейтрализация вируса (3/3 мест, отрицательных относительно образования бородавок. Анализировали сыворотки из 5 вакцинированных животных и 5 контрольных животных. Сыворотки, взятые после 1 дозы VPL L1 CRPV, содержали антитела, которые полностью нейтрализовали неразведенный вирус в 80% кроликов (4/5). После 2 или 3 доз VPL L1 СRPV 100% кроликов (5/5) имели нейтрализующие вирус антитела. Контрольные сыворотки не обнаружили нейтрализующей вирус активности. В зависимости от конечных титров сыворотки выбранных вакцинированных животных можно было разбавлять в 10-1000 раз и они все еще были нейтрализующими на 100%.

ПРИМЕР 25

Конструирование вектора для ко-экспрессии L1/L2 CRPV из одной плазмиды

Плазмиду PSP72-CRPV-L1 (р. 12930-314-4-1) расщепляли Bgl 11 и фрагмент 1,5 т.п.н., Bgl 11, несущий ORF L1 CRPV с дрожжевой 5"-нетранслируемой лидерной последовательностью, очищали на геле. Плазмиду p12930-323-2-3 расщепляли BamHI, которая разрезает между промотором GAL1 и терминатором транскрипции ADH1. Линейный векторный фрагмент очищали на геле и затем лигировали с описанным выше фрагментом Bgl 11 CRPV-L1 с получением плазмиды p12930-366-1-2. Эта полученная плазмида содержит ORF CRPV-L1 под контролем промотора GAL1 и ORF CRPV-L2 под контролем промотора GAL10.

ПРИМЕР 26

Конструирование вектора для ко-экспрессии L1/L2 CRPV из двух плазмид

Вектор pUC18-GAL1p-GAL10p, содержащий ген L2, расщепляли SplI и фрагмент 2,9 т. п. н. , несущий экспрессионную кассету ADH1t- GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t, очищали на геле и затупляли концы обработкой ДНК-полимеразой T4. Челночный вектор дрожжей YEp24 [Botstein et al. Gene, 8:17 (1979)] расщепляли BamHI, затупляли концы обработкой ДНК-полимеразой T4, дефосфорилировали кишечной щелочной фосфатазой теленка и затем лигировали с указанной выше экспрессионной кассетой L2 с тупыми концами с получением плазмиды p1594.

ПРИМЕР 27

Ко-экспрессия L1 и L2 CRPV в дрожжах

Плазмиду p12930-366-1-2 (pC1/1-GAL1/10p-CRPV/L1+L2) использовали для трансформации штаммов N 1569 и BJ5462 S.cerevisiae (одноплазмидная система) и полученные трансформанты отбирали на синтетической агаровой лейцин-минус-среде. В параллельном эксперименте штамм N 1592 ко-трансформировали экспрессирующим вектором CRPV-L1 p12930-323-6-1 плюс экспрессирующим вектором YEp24-GAL10p-L2 (p1594) (двухплазмидная система) и полученные трансформанты, содержащие оба вектора, отбирали на синтетической агаровой среде, не содержащей ни лейцина, ни урацила. Клональные изоляты как для одноплазмидной системы, так и для двухплазмидной системы выращивали при 30^oC в комплексной среде YEHD, содержащей 2% галактозу, в течение 48-72 часов. После сбора

клеток осадки клеток разрушали при помощи стеклянных шариков, добавляли Тритон X-100 до конечной концентрации 0,5% и клеточные лизаты анализировали на экспрессию L1 и L2 CRPV при помощи иммунодот-блокт-анализа. Пробы, содержащие 50 мкг общего клеточного белка, подвергали элекрофорезу на 8-16% Трис-Глициновых градиентных гелях (Novex) при восстанавливающих и денатурирующих условиях и электро-блоттингу на мембраны ПВДФ (Novex). Белки L1 и L2 CRPV детектировали при помощи поликлональных кроличьих антисывороток против L1 или L2 (подарок от доктора Джона Крейдера, Hershy Medical Center) в качестве первичных антител и белка A, связанного с пероксидазой хрена (Amersham, Inc. ), в качестве второго антитела. Мембраны обрабатывали с применением хемилюминесцентного ECL^TM набора для детектирования (Amersham, Inc.). Полосу белка L1 55-61 кДа и полосу белка L2 90 кДа обнаруживали во всех пробах из клонов дрожжей, несущих экспрессионную плазмиду L1+L2. Сигнал для L2 не обнаруживали в пробах, полученных из клонов дрожжей, несущих экспрессионную плазмиду дли L1 (Фиг. 6). Сигнал для L1 не обнаруживали в пробах из клеток, содержащих только вектор экспрессии L2.

ПРИМЕР 28

Очистка L1 CRPV и VPL L1+L2 CRPV для ЭМ-исследований.

Дрожжи, экспрессирующие белки L1 CRPV и L1 и L2 CRPV, частично очищали и концентрировали для исследований при помощи электронной микроскопии (ЭМ). 1-1,5 литров среды YEHD, содержащей 2% галактозу, инокулировали штаммом N 1569 или BJ5462 S.cerevisiae, трансформированным ко-экспрессирующим L1+L2 вектором p12930-366-1-2, и выращивали при 30^oC в течение 48-72 часов. В параллельном эксперименте клетки штамма N 1569, ко-трансформированного экспрессирующим вектором CRPV-L1 p12930-323-6-1 плюс YEp24-GAL 10p-L2 плазмидой p1594, выращивали подобным образом. Клетки собирали и осадки клеток замораживали при -70^oC. Все последующие стадии проводили при 4^oC. Клеточные осадки оттаивали и суспендировали в равном объеме "L1-буфера" (20 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА). Ингибиторы протеаз ПМСФ и Пепстатин A добавляли к суспензии при конечной концентрации 2 мкМ и 1,7 мкМ соответственно. Клетки лизировали 3-5 проходами в микрофлюидизаторе. Лизаты осветляли центрифугированием при 5000 х g в течение 10 минут. Супернатант наносили на 5-сантиметровую подушку 45% (об./об.) сахарозы в L1-буфере и белки L1, L2 или L1 и L2 осаждали центрифугированием при 100000 х g в течение 4 часов. Осадок ресуспендировали в 1/10 объема L1-буфера. Ресуспендированный осадок осветляли центрифугированием при 5000 х g в течение 10 минут.

Для ЭМ-анализа (Structure Probe, West Chester, PA) аликвоту каждой пробы помещали на медные сетки с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты (PTA), pH 7,0, помещали на сетку на 20 секунд. Сеткам давали высохнуть на воздухе перед исследованием при помощи ТЭМ. Всю микроскопию выполняли с применением трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 100CX (JEOL USA, Inc. ) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000X.

Во всех пробах дрожжей, несущих либо экспрессирующую плазмиду L1 CRPV, либо плазмиды для ко-экспрессии L1 и L2 CRPV, были обнаружены VLP в диапазоне размеров диаметра < или = 25 нм. VLP не наблюдались в пробах контрольных дрожжей или в пробах дрожжей, несущих только экспрессирующую плазмиду L2.

ПРИМЕР 29

Экспрессия L1 CRPV (штамма 1582) и L1 HPV типа 6a (штамма 1644) в обогащенных комплексных и химически определенных средах

Инокуляты для этих штаммов получали в не содержащей лейцина синтетической среде, как описано выше, для перенесения во встряхиваемые культуры в колбах. Применяемые встряхиваемые колбы были экранированы от высокой способности аэрации (70 мл жидкости на колбу на 300 мл, Tunair Labware) и к средам добавляли примерно 0,5 мл/л противовспенивателя (UCON LB-625, Union Carbide). Обогащенная комплексная среда содержала (на л): 40 г дрожжевого экстракта Difco; 20 г пептона (Sheffield Hy-Soy); 30 г глюкозы; 50 г галактозы; среду доводили до pH 5.3 перед стерилизацией. Химически определенная среда была подобна среде, описанной Oura (Biotechnol. Bijengineer. 16: 1197-12126 1974), не была дополнена (на л): 0,1 г холина C1; 0,4 г аденина; 30 г глутамата мононатрия в качестве источника азота; 0,2 г урацила; 20 г глюкозы; 40 г галактозы. Колбы инокулировали 3 мл инокулята и инкубировали в течение 66 часов при 28^oC, 250 об/мин на ротационном шейкере. Из колб брали пробы для проверки экспрессии посредством иммуноблоттинга с использованием антисывороток против L1 CRPV и против L1 HPV6a.

ПРИМЕР 30

Клонирование генов L1 и L2 HPV16

Общую геномную ДНК экстрагировали из клеток Caski (ATCC N CRL 1550) стандартными способами (Sambrook et al., supra). ДНК расщепляли Bst 11071 и Sph1 и подвергали электрофорезу на 0,8% агарозном препаративном геле с низкой температурой плавления. Зону, соответствующую ДНК ~3,5 т.п.н., вырезали из геля и эту агарозу расщепляли ферментом Gelase^TM (Epicentre Technologies, Inc. ). Концы гель-очищенной ДНК затупляли обработкой ДНК-полимеразой T4 и эту ДНК лигировали с фосфорилированными, имеющими тупые концы олигодезоксинуклеотидными линкерами, которые содержат скрытый сайт Hind III. Смесь для лигирования расщепляли для завершения с HindIII и ДНК ~3,5 т.п.н. фракционировали по размеру на агарозном геле, как описано выше. Очищенную на геле ДНК лигировали с ДНК плазмиды pUCIS, которая была расщеплена HindIII и дефосфорилирована. После трансформации компетентных клеток DH5 E.coli (BRL) эту плазмидную библиотеку подвергали скринингу на HPV16-положительные клоны гибридизацией колоний с применением антисмыслового ³²P-меченого олигодезоксинуклеотида, который комплементарен 3" -концу гена L1 HPV16 (5" GAG AGA TCT TAG AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3"). Плазмиду pLUC18, содержащую геномный фрагмент 3,3 т.п.н. HPV16, выделяли и характеризовали рестрикционным анализом и блоттингом по Саузерну. Эта плазмида была названа pUC18-HPV16 L1/L2 и она содержит кодирующие ДНК- последовательности L1 и L2. Плазмидную ДНК получали с применением набора Qiagen^TM Plasmid Maxi kit (Qiagen, Inc.).

ПРИМЕР 31

Конструирование L1 HPV16 экспрессирующего вектора дрожжей

Клон pUC18-HPV16 L1/L2 использовали в качестве матрицы для ПЦР. Ген L1 HPV16 амплифицировали при помощи ПЦР с применением полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 циклов амплификации (94^oC 1 мин; 48^oC 1 мин; 72^oC 1 мин 45 с) и следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров, содержащих фланкирующие сайты Bgl 11 (подчеркнуты):

смысловой праймер: 5" CTC CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC-3"

антисмысловой праймер: 5"-GAG TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3"

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность непосредственно против хода транскрипции относительно инициирующего кодона метионина L1 HPV16 (выделенного жирными буквами). ПЦР-продукт L1 1,5 т.п.н. расщепляли Bgl 11, очищали на геле и лигировали с расщепленным BamH1 вектором pGAL10. Выделяли плазмиду pGAL10, содержащую ген L1 HPV16, которая была названа p14049-37-1 секвенировали с применением набора PRISM^TM (AB1, Inc. ) и секвенатора AB1 Model N 373A согласно инструкциям изготовителя. Было показано, что ген L1 в этом изоляте содержит 3 нуклеотидных замены по сравнению с корректированной опубликованной последовательностью прототипа (Kirnbauer, R. et al. (1993) J.Virol. 67:6929-6936), которые дают два изменения аминокислот: His-202 на Asp; Thr-266 на Ala. Анализ последовательности исходной ДНК-матрицы подтвердил, что эти изменения присутствуют также в геномном клоне pUC18-HPV16 L1/L2, а не вводятся полимеразной цепной реакцией.

ПРИМЕР 32

Конструирование L1 и L2 HPV16 экспрессирующего вектора дрожжей

Плазмиду p14049-37-1 расщепляли Smal, которая разрезает между промотором GAL10 и терминатором транскрипции ADH1. Ген L2 HPV16 1,4 т.п.н. амплифицировали при помощи ПЦР с использованием ДНК pUC18-HPV16 L1/L2 в качестве матрицы, полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 циклов ПЦР-амплификации (94^oC 1 мин; 48^oC 1 мин; 72^oC 1 мин 45 с) и следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров, содержащих фланкирующие сайты SmaI (подчеркнуты):

смысловой праймер: 5"-TCC CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC-3"

антисмысловой праймер: 5"-TCC CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TGA-3"

Смысловой праймер вводит дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность непосредственно против хода транскрипции относительно инициирующего кодона метионина L2 HPV16 (выделенного жирными буквами). ПЦР-продукт L2 1,4 т.п.н. расщепляли SmaI, очищали на геле и лигировали с расщепленным SmaI вектором p14049- 37-1. Выделяли плазмиду pLS 110, содержащую гены L1 и L2 HPV16, которая была названа p14049-42-2. Ген L2 в p14049-42-2 секвенировали при помощи набора PRSM^TM (ABI, Inc.) и секвенатора AB1 Model N 373A в соответствии с инструкциями изготовителя. Было показано, что ген L2 в этом изоляте содержит 5 нуклеотидных изменений по сравнению с корректированной опубликованной последовательностью прототипа (Kirnbauer, R. et al. (1993) supra), которые дают изменение одной аминокислоты: Ser-269 на Pro. Анализ последовательности геномного клона pUC18-HPV16 L1/L2 подтвердил, что это изменение присутствует также в исходной ДНК-матрице, а не вводится полимеразной цепной реакцией.

ПРИМЕР 33

A. Экспрессия L1 HPV16 и ко-экспрессия L1 и HPV16 в дрожжах

Плазмиды p14049-37-1 и p14049-42-2 использовали для трансформации штамма N 1558 S.cerevisiae. Полученные рекомбинантные штаммы представляли собой N 1678 (HPV16-L1) и N1679 (HPV16 L1+L2), показанные в таблице. Клональные изоляты выращивали при 30^oC в среде YEHD, содержащей 2% галактозу, в течение 68-78 часов. После сбора клеток осадки клеток разрушали стеклянными шариками и клеточные лизаты анализировали на экспрессию белка L1 HPV16 или L2 HPV16 при помощи иммуноблоттинга. Пробы, содержащие 40 мкг общего клеточного белка, подвергали электрофорезу на 10% Трис-Глициновых гелях при восстанавливающих и денатурирующих условиях и электроблоттингу на нитроцеллюлозные фильтры. Белок L1 HPV16 иммунодетектировали с применением кроличьих поликлональных антисывороток, индуцированных против слитого белка trpE-L1 HPV11 (D. Brown et al. Virology 201:46-54), в качестве первичного антитела и связанного с пероксидазой хрена ослиного антитела против кроличьего IgG (Amersham, Inc. ) в качестве второго антитела. Фильтры обрабатывали с применением хемилюминесцентного ECL^TM набора для детектирования (Amersham, Inc.). Полосу белка L1 50-55 кДа обнаруживали во всех пробах, за исключением отрицательного контроля (векторный контроль без гена L1 или L2). Белок L2 обнаруживали в виде полосы белка 70 кДа иммуноблоттингом с применением мышиной антисыворотки против L2 HPV16, индуцированной против слитых белков trpE-L2, экспрессируемых в E.coli, в качестве первичного антитела. Козьи антимышиные IgG, связанные с HRP, (Amersham, Inc.) использовали в качестве второго антитела и фильтры обрабатывали, как описано выше.

В. Очистка рекомбинантных капсидных белков L1+L2 HPV типа 16

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний.

Клетки хранили замороженными при -70^oC. Замороженные клетки (сырой вес = 27,6 г) оттаивали при 20-23^oC и ресуспендировали в 40 мл "L-буфера" (20 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА). Ингибиторы протеаз ПМСФ и Пепстатин A добавляли до конечных концентраций 2 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Клеточную суспензию разрушали при давлении приблизительно 8000 psi (55158056 Па) тремя проходами в Микрофлюидизаторе M110 (Microfluidics Newton, MA). Разрушенную клеточную суспензию центрифугировали при 5000 х g в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса (остатков клеток). Супернатант, содержащий антиген L1+L2, извлекали.

Супернатант разводили 1: 5 добавлением Буфера A (20 мМ MOPS, pH 7,0) и наносили на анионообменную улавливающую колонку (5,0 см (внутр. диаметр) х 4,8 см) из смолы Fractogel^R EMD TMAE-650 (S) (ЕМ Separations, Gibbstown, NJ), уравновешенной в Буфере A. После промывания Буфером A антиген элюировали градиентом 0-1,0 М NaCl в Буфере A. Выполняли иммунодот-блоттинг для определения, какие фракции из колонки содержали белок L1.

Фракции, содержащие белок L1 согласно иммунодот-блоттингу, анализировали на общий белок по методу Бредфорда с последующим электрофорезом на ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром и Вестерн-блоттингом. TMAE-фракции, обнаруживающие сравнимые чистоту и обогащенные белком L1, объединяли. Антиген концентрировали фракционированием при помощи сульфата аммония. Пробы доходили до 48% насыщения сульфата аммония добавлением твердого реагента при осторожном перемешивании в течение более 30 минут. Пробы помещали на лед и давали осаждаться в течение ночи. Пробы центрифугировали при 12000 х g. Осадок ресуспендировали в 20,0 мл PBS (6,25 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl).

Ресуспендированные осадки хроматографировали раздельно на гель-фильтрационной колонке (2,6 см вн. диам. х 89 см) из смолы Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ) при 20-23^oC. Подвижным буфером был PBS. Фракции анализировали при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром и детектированием Вестерн-блоттингом. Самые чистые фракции объединяли. Полученные пулы концентрировали в перемешиваемой ячейке на 50 мл с применением плоскослойных мембран yM-100 (Amicon, Beverly, MA) при давлении N₂ 4-6 psi (27579-41368 Па).

Конечный продукт анализировали электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием Кумасси. Белки L1 и L2 имели 70% гомогенность. Идентичность белков L1 и L2 подтверждали Вестерн-блоттингом с использованием соответствующих сывороток. Конечный продукт делили на аликвоты и хранили при -70^oC. Этот процесс давал в целом 0,53 мг белка.

Анализ при помощи электронной микроскопии выполняли с примерением Structure Probe (West Chester, PA). Аликвоту пробы помещали на медную сетку с угольной пленкой 200 меш. Капля 2% фосфовольфрамовой кислоты, pH 7,0, помещали на эту сетку на 20 секунд. Сетке давали высохнуть на воздухе перед ТЭМ-исследованием. Всю микроскопию выполняли с применением трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000X. Было подтверждено присутствие вирусподобных частиц в диапазоне размеров диаметра 25 нм.

C. Очистка рекомбинантных капсидных белков L1+L2 HPV типа 16

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний. Клетки хранили замороженными при -70^oC. Замороженные клетки (сырой вес = 92,8 г) оттаивали при 20-23^oC и ресуспендировали в 105 мл "L-буфера" (20 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА). Ингибиторы протеаз ПМСФ и Пепстатин A добавляли до конечных концентраций 2 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Клеточную суспензию разрушали при давлении приблизительно 16000 psi (110316012 Па) тремя проходами в Микрофлюидизаторе М110 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Разрушенную клеточную суспензию центрифугировали при 6100 х g в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса (остатков клеток). Супернатант, содержащий антиген L1+L2, извлекали.

Супернатант разводили 1: 5 добавлением Буфера A (20 мМ MOPS, pH 7,0) и наносили на анионообменную улавливающую колонку (5,0 см (внутр. диаметр) х 4,2 см) из смолы Fractogel^R EMD TMAE-650 (S) (ЕМ Separations, Gibbstown, NJ), уравновешенную в Буфере A. После промывания Буфером A антиген элюировали градиентом 0-1,0 М NaCl в Буфере A. Выполняли иммунодот-блоттинг для определения, какие фракции из колонки содержали белок L1.

Фракции, содержащие белок L1 согласно иммунодот-блоттингу, анализировали на общий белок по методику Бредфорда с последующим электрофорезом на ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром и Вестерн-блоттингом.

TMAE-фракции, обнаруживающие сравнимые чистоту и обогащение белком L1, объединяли. Антиген концентрировали фракционированием при помощи сульфата аммония. Пробы доводили до 35% насыщения сульфата аммония добавлением твердого реагента при осторожном перемешивании в течение более 30 минут. Пробы помещали на лед и давали осаждаться в течение ночи. Пробы центрифугировали при 12000 х g. Осадок ресуспендировали в 20,0 мл PBS (6,25 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl), который содержал 1 мМ ЭДТА.

Ресуспендированные осадки хроматографировали раздельно на гель-фильтрационной колонке (2,6 см вн. диам. х 89 см) из смолы Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ) при 20-23^oC. Подвижным буфером был PB + 1 мМ ЭДТА. Фракции анализировали электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром и детектированием Вестерн-блоттингом. Самые чистые фракции объединяли. Полученные пулы концентрировали в перемешиваемой ячейке на 50 мл с применением плоскослойных мембран YM-100 (Amicon, Beverly, MA) при давлении N₂ 4-6 psi (27579-41368 Па).

Конечный продукт анализировали электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием Кумасси. Белки L1 и L2 имели 70% гомогенность. Идентичность белков L1 и L2 подтверждали Вестерн-блоттингом с использованием соответствующих сывороток. Конечный продукт делили на аликвоты и хранили при -70^oC. Этот способ давал в целом 3,8 мг белка.

ПРИМЕР 34

A. Ферментация штамма 1679 (L1+L2 HPV типа 16)

Процедуры, использованные для приготовления замороженных исходных культур, получения инокулята, ферментации и извлечения клеток штамма 1679, в основном соответствовали описанным выше. После 67 часов инкубирования достигалась плотность клеток 4,2 г сухого веса клеток на 1 л, что давало после извлечения в целом 93 г сырого осадка клеток.

В.Ферментация штамма 1678 (L 1 HPV типа 16)

Процедуры, использованные для приготовления замороженных исходных культур, получения инокулята, ферментации и извлечения клеток штамма 1678, в основном соответствовали описанным выше. После 70,5 часов инкубирования содержимое двух 10-литровых ферментаций объединяли (плотность клеток 8,7 г сухого веса клеток на 1 л), что давало в целом 258 г сырого осадка клеток после извлечения.

C. Очистка рекомбинантных капсидных белков L1 HPV типа 16

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний.

Клетки штамма N 1678 хранили замороженными при -70^oC. Замороженные клетки (сырой вес = 128 г) оттаивали при 20-23^oC и ресуспендировали в 140 мл "Модифицированного L1-буфера" (20 мл фосфата натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl). Ингибиторы протеаз ПМСФ и Пепстатин A добавляли до конечных концентраций 2 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Клеточную суспензию разрушали при давлении приблизительно 16000 psi (110316012 Па) тремя проходами в Микрофлюидизаторе М110 (Microfluidics Corp. , Newton, MA). Разрушенную клеточную суспензию центрифугировали при 11000 х g в течение 40 минут для удаления клеточного дебриса (остатков клеток). Супернатант, содержащий антиген L1, извлекали.

Супернатант разводили 1: 5 добавлением Буфера A(20 мМ MOPS, pH 760) и наносили на анионообменную улавливающую колонку (5,0 см (внутр. диаметр) х 6,4 см) из смолы Fractogel^R EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ), уравновешенную в Буфере A. После промывания Буфером A антиген элюировали градиентом 0-1,0 М NaCl в Буфере A. Выполняли иммунодот-блоттинг для определения, какие фракции из колонки содержали белок L1.

Фракции, содержащие белок L1 согласно иммунодот-блоттингу, анализировали на общий белок по методу Бредфорда с последующим электрофорезом на ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром и Вестерн-блоттингом.

TMAE-фракции, обнаруживающие сравнимые чистоту и обогащение белком L1, объединяли. Антиген концентрировали фракционированием при помощи сульфата аммония. Пробы доводили до 35% насыщения сульфата аммония добавлением твердого реагента при осторожном перемешивании в течение более 10 минут. Пробы помещали на лед и давали осаждаться в течение 5 часов. Пробы центрифугировали при 12000 х g. Осадок ресуспендировали в 20,0 мл PBS (6,25 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl).

Ресуспендированные осадки хроматографировали раздельно на гель-фильтрационной колонке (2,6 см вн. диам. х 89 см) из смолы Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Подвижным буфером был PBS. Фракции анализировали электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием серебром и детектированием Вестерн-блоттингом. Самые чистые фракции объединяли. Полученные пулы концентрировали в перемешиваемой ячейке на 50 мл с применением плоскослойных мембран YM-100 (Amicon, Beverly, MA) при давлении N₂ 4-6 psi (27579-41368 Па).

Конечный продукт анализировали электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием Кумасси. Белок L1 имел 70% гомогенность. Идентичность белка L1 подтверждали Вестерн-блоттингом с использованием соответствующих сывороток. Конечный продукт делили на аликвоты и хранили при -70^oC. Этот способ давал в целом 7,4 мг белка.

C. Аналитические способы

Способ иммунодот-блоттинга

Пробы разводили (когда это было необходимо) 1:10 в MilliQ-H₂O и 10 мкл пробы наносили на ПВДФ-мембраны Polyscreen^TM (NEN Research Products, Boston, MA). После высыхания пятен мембраны промывали в воде и давали им высохнуть. Раствор первичных антител готовили разведением подходящей антисыворотки в буфере для блоттинга (5% нежирное молоко в 6,25 мМ фосфата натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN). Инкубирование было по меньшей мере в течение 1 часа при 20-23^oC. Блот промывали в течение 1 минуты (каждый) в трех сменах PBS (6,25 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl). Раствор второго антитела готовили разведением подходящего соединенного со щелочной фосфатазой конъюгата антисыворотки в буфере для блоттинга. Инкубирование проводили при тех же самых условиях в течение по меньшей мере 1 часа. Блоты промывали, как описано выше, и детектировали с применением субстрата NBT/BCIP 1 стадии (Pierce, Rockford, IL).

Для обнаружения использовали следующие антитела:

L1 HPV6a детектировали при помощи MAB 837 (Chemicon International. Inc., Temecula, CA). L2 HPV6a детектировали при помощи пула N 641 и N 647 мышиной сыворотки против слитого белка trpE-L2 HPV6a (полученного М. Rosolowski в этой лаборатории). L1 HPV16 детектировали при помощи MAB 885 (Chemicon International, Inc. , Temecula, CA). L2 HPV16 детектировали при помощи пула N 611 мышиной сыворотки против слитого белка trpE-L2 HPV 16 (полученного K. Jansen в данной лаборатории).

Метод Бредфорда для определения общего белка

Общий белок определяли с применением коммерчески доступного набора Soomassie Plus kit (Pierce, Rockford, IL). Пробы разводили до подходящего уровня в Milli-Q-H₂O. Для стандартного протокола и протокола микротеста требовались объемы 0,1 мл и 1,0 мл соответственно. Для обоих протоколов для получения стандартной кривой использовали БСА (Pierce Rockford, IL). Определение проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя. Стандартные кривые строили с применением программного обеспечения CricketGraph на компьютере Macintosh IIci.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) и Вестерн-блоттинг

Все гели, буферы и прибор для электрофореза были получены из Novex (San Diego, CA) и электрофорез проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя. Вкратце, пробы разводили до равной концентрации белка в Milli-Q-H₂O и смешивали 1: 1 с буфером для инкубирования пробы, содержащим 200 мМ ДТТ. Пробы инкубировали 15 минут при 100^oC и наносили на предварительно залитые 12% Трис-глициновые гели. Пробы подвергали электрофорезу при 125 В в течение 1 часа 45 минут. Гели проявляли с применением либо окрашивания серебром по вариации метода Heukeshoven and Dernick [Electrophoresis, 6 (1985) 1030112), либо окрашивания коллоидным Кумасси с использованием коммерчески полученного набора (Integrated Separation Systems, Natick, MA). Для Вестерн-блотов белки переносили на ПВДФ-мембраны при 25В в течение 40 минут. Мембраны сушили и инкубировали с растворами антител, как и для иммунодот-блотов.

ПРИМЕР 35

Приготовление иммуногенных композиций

Очищенные VLP готовили согласно известным способам, таким как смешивание с фармацевтически приемлемыми носителями, стабилизаторами или вакцинным адъювантом. Иммуногенные VLP данного изобретения могут быть приготовлены для использования в вакцине путем комбинирования с физиологически приемлемой композицией, такой как, например, PBS, солевой раствор или дистиллированная вода. Иммуногенные VLP вводят в диапазоне доз приблизительно 0,1 - 100 мкг, предпочтительно приблизительно 1 - 20 мкг, для получения желаемого иммуногенного действия. Количество VLP на готовую форму варьирует в зависимости от множества факторов, в том числе, но не только, в зависимости от состояния, веса, возраста и пола индивидуума. Введение готовой формы VLP можно осуществлять различные способами, в том числе, но не только, пероральным, подкожным, местным, трансмукозным и внутримышечным способами введения. Такие готовые формы VLP могут состоять из одного типа VLP (т.е. VLP из HPV6a) или смеси VLP (т.е. VLP из HPV6a, HPV11, HPV16 и HPV18).

Необязательно может присутствовать антимикробный консервант, например тимеросал. Иммуногенные антигены по данному изобретению можно применять, если желательно, в сочетании со стабилизаторами вакцин и адъювантами вакцин. Типичные стабилизаторы представляют собой специфические соединения, например полианионы, такие как гепарин, инозит-гексасульфат, сульфатированный бета-циклодекстрин, менее специфические наполнители, например аминокислоты, сорбит, маннит, ксилит, глицерин, сахароза, декстроза, трегалоза, и вариации в условиях, относящихся к раствору, например нейтральный pH, высокая ионная сила (приблизительно 0,5-2,0 М соли), двухвалентные катионы (Ca²⁺, Mg²⁺). Примерами адъювантов являются Al(OH)₃ и Al(PO₄). Вакцину по данному изобретению можно хранить в холодильнике или в лиофилизированном виде.

ПРИМЕР 36

Получение антител к VLP

Для образования антител использовали очищенные вирусподобные частицы (VLP). Термин антитела в применении здесь относится как к поликлональным, так и к моноклональным антителам, а также их фрагментам, таким как фрагменты Fv, Fab и F(ab)2, которые способны связывать антиген или гаптен. Эти антитела используют различным образом, в том числе (но не только) для очистки рекомбинантных VLP, очистки нативных белков L1 и L2 и для наборов. Наборы могут содержать компартментализованный носитель, пригодный для удерживания в тесных границах по меньшей мере одного контейнера. Носитель может, кроме того, содержать реагенты, такие как антитела против VLP или VLP, пригодные для обнаружения HP V или фрагментов HPV или антител к HPV. Носитель может также содержать детектирующие средства, такие как меченый антиген или субстраты для ферментов или т.п. Эти антитела или VLP или наборы применимы для различных целей, в том числе (но не только), для анализов в судебной медицине и для эпидемиологических исследований.

ПРИМЕР 37

Очистка рекомбинантных капсидных белков L1 HPV типа 11

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний. Клетки хранили замороженными при -70^oC. Замороженные клетки (сырой вес = 180 г) оттаивали при 20-23^oC и ресуспендировали в 900 мл "разрушающего буфера" (50 мМ MOPS, pH 7,2, 500 мМ NaCl, 1 мМ CaCl₂). Ингибиторы протеаз AEBSF и Пепстатин A добавляли до конечных концентраций 1 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Клеточную суспензию разрушали при давлении приблизительно 16000 psi (110316012 Па) четырьмя прохождениями в Микрофлюидизаторе М110 (Microfluidics Corp., Newton, MA). К разрушенной клеточной суспензии добавляли достаточный объем 10% детергента Тритон X-100 (Pierce, Pockford, IL) для получения концентрации Тритона Х-100 0,5%. Суспензию перемешивали в течение 20 часов. Обработанный Тритоном X-100 лизат центрифугировали при 12000 х g в течение 40 минут для удаления остатков клеток. Извлекали супернатант, содержащий белок L1.

Супернатант диафильтровали против пяти объемов 20 мМ фосфата натрия, pH 7,2, 0,5 М NaCl с применением мембранной кассеты тангенциального тока 300 К (Filtron, Northborough, MA). При помощи радиоиммуноанализа и вестерн-блоттинга было показано, что материал, удерживаемый мембраной, содержит белок L1.

Ретентат наносили на аффинную колонку высокого разрешения (11,0 см (внут. диам. ) х 5,3 см) со смолой SP Spherodex (М)^r (IBP, Villeneuve-La-Garenne, France), уравновешенную в 20 мМ фосфате натрия, pH 7,2, 0,5 М NaCl. После промывания буфером для уравновешивания и стадии промывания 20 мМ фосфатом натрия, pH 7,2, 1,0 М NaCl, белок 1 элюировали в стадии промывания 20 мМ фосфатом натрия, pH 7,2, 2,5 М NaCl. Фракции собирали во время промываний и элюции. Фракции колонки анализировали на общий белок по методу Бредфорда. Затем фракции анализировали вестерн-блоттингом и электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием коллоидным Кумасси. Фракции также анализировали при помощи радиоиммуно-анализа.

Фракции SP Spherodex, обнаружившие сравнимые чистоту и обогащение L1 белка, объединяли.

Конечный продукт анализировали при помощи вестерн-блоттинга и электрофореза в ПААГ-ДСН с окрашиванием коллоидным Кумасси. Было показано, что гомогенность белка L1 была > или = 90%. Идентичность белка L1 была подтверждена вестерн-блоттингом. Конечный продукт асептически фильтровали через мембрану 0,22 мкм и хранили при 4^oC. Этот способ давал в целом 100 мг белка.

ЭМ-анализ выполняли при помощи Structure Probe (West Chester, PA). Аликвоту пробы помещали на медную сетку с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты, pH 7,0, помещали на эту сетку на 20 секунд. Сетке давали высохнуть на воздухе перед ТЭМ-исследованием. Всю микроскопию выполняли с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000X.

Метод Бредфорда для определения общего белка

Общий белок определяли при помощи коммерчески доступного набора Coumassie Plus (Pierce, Rockford, IL). Пробы разводили до подходящих уровней в Milli-Q-H₂O. Для стандартных протоколов и для микротестов требовались объемы 0,1 мл и 1,0 мл соответственно. Для обоих протоколов, для построения стандартной кривой использовали БСА (Pierce, Rockford, IL). Анализ выполняли в соответствии с рекомендациями изготовителя. Стандартные кривые строили с применением программного обеспечения CricketGraph на компьютере Macintosh IIci.

Электрофорез в ПААГ-ДСН и Вестерн-блоттинг

Все гели, буферы и прибор для электрофореза были получены из Novex (San Diego, CA) и электрофорез проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя. Вкратце, пробы разводили до равной концентрации белка в Milli-Q-H₂O и смешивали 1:1 с буфером для инкубирования пробы, содержащим 200 мМ ДТТ. Пробы инкубировали 15 минут при 100^oC и наносили на предварительно залитые 12% Трис-глициновые гели. Пробы подвергали электрофорезу при 125 В течение 1 часа 45 минут. Гели проявляли окрашиванием коллоидным Кумасси с применением коммерчески полученного набора (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Для вестерн-блотов белки переносили на мембраны ПВДФ 25 В в течение 40 минут. Мембраны промывали Milli-Q-H₂ и сушили на воздухе. Первичным антителом была поликлональная кроличья антисыворотка, индуцированная слитым белком trpE-HPV11L1 (подарок др. D.Brown). Раствор антител готовили разведением антисыворотки в буфере для блоттинга (5% нежирное молоко в 6,25 мМ фосфате натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN₃. Инкубирование проводили по меньшей мере 1 час при 20-23^oC. Блот промывали в течение 1 минуты в каждой из трех смен PBS (6,25 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl). Раствор второго антитела готовили разведением козьей антисыворотки против кроличьих IgG, конъюгированной со щелочной фосфатазой (Peirce, Rockford, IL) в буфере для блоттинга. Инкубирование проводили при тех же самых условиях по меньшей мере в течение 1 часа. Блоты промывали, как описано выше, и детектирование выполняли при помощи NBT/BCIP субстрата стадии 1 (Pierce, Rockford, IL).

ПРИМЕР 38

Очистка рекомбинантных капсидных белков L1 HPV типа 6a

Все стадии проводили при 4^oC, если нет других указаний. Клетки хранили замороженными при -70^oC. Замороженные клетки (сырой вес = 60 г) оттаивали в водяной бане при 45^oC и ресуспендировали в 300 мл "Разрушающего буфера" (50 мМ MOPS, pH 7,2, 500 мМ NaCl, 1 мМ CaCl₂). Ингибиторы протеаз AEB SF и Пепстатин A добавляли до конечных концентраций 1 мМ и 1,7 мкМ соответственно. Клеточную суспензию разрушали при давлении приблизительно 16000 psi (110316012 Па) пятью прохождениями в Микрофлюидизаторе MllO (Vicrofluidics Corp. , Newton, MA). К разрушенной клеточной суспензии добавляли достаточный объем 10% детергента Тритон X-100 (Pierce, Rockford, IL) для получения концентрации Тритона X-100 0,5%. Суспензию перемешивали в течение 18 часов. Обработанный Тритоном X-100 лизат центрифугировали при 12000 х g в течение 40 минут для удаления остатков клеток. Извлекали супернатант, содержащий белок L1.

Супернатант диафильтровали против пяти объемов 20 мМ фосфата натрия, pH 7,2, 0,5 М NaCl с применением мембранной кассеты тангенциального тока 300 К (Filtron, Northborough, MA). При помощи радиоиммуноанализа и вестерн-блоттинга было показано, что материал, удерживаемый мембраной, содержит белок L1.

Ретентат наносили на колонку высокого разрешения (5,0 см (внут. диам.) х 10,0 см) со смолой POROS^R 50HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), уравновешенную в 20 мМ фосфате натрия, pH 7,2, 0,5 М NaCl. После промывания буфером для уравновешивания белок L1 элюировали линейным градиентом 0,5 - 1,5 М NaCl в 20 мМ фосфате натрия, pH 7,2. Фракции собирали во время промываний и элюции. Фракции колонки анализировали на общий белок по Бредфорду. Затем фракции анализировали при помощи вестерн-блоттинга и электрофореза в ПААГ-ДСН с окрашиванием коллоидным Кумасси. Фракции анализировали также при помощи радиоиммуноанализа.

Фракции колонки, обнаружившие сравнимые чистоту и обогащение белка L1, объединяли. Объединенные фракции асептически фильтровали через мембрану 0,22 мкм. Продукт концентрировали в перемешиваемой ячейке на 50 мл с применением плоскослойных мембран 43 мм YM-100 (Amicon, Beverly, MA) при давлении N₂ 4-6 psi (27579-41368 Па). Продукт хранили при 4^oC. Этот способ давал в целом 2,7 мг белка.

Пробу конечного продукта концентрировали далее осаждением при помощи TXY и анализировали при помощи вестерн-блоттинга и электрофореза в ПААГ-ДСН в окрашиванием коллоидным Кумасси. Как показала денситометрия окрашенных коллоидным Кумасси гелей, белок L1 имел гомогенность > или = 90%. Идентичность белка L1 была подтверждена вестерн-блоттингом.

ЭМ-анализ выполняли при помощи Structure Probe (West Chester, PA). Аликвоту пробы помещали на медную сетку с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты, pH 7,0, помещали на эту сетку на 20 секунд. Сетке давали высохнуть на воздухе перед ТЭМ-исследованием. Всю микроскопию выполняли с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000X.

Метод Бредфорда для определения общего белка

Общий белок определяли при помощи коммерчески доступного набора Coumassie Plus (Pierce, Rockford, IL). Пробы разводили до подходящих уровней в Milli-Q-H₂. Для стандартных протоколов и для микротестов требовались объемы 0,1 мл и 1,0 мл соответственно. Для обоих протоколов, для построения стандартной кривой использовали БСА (Pierce, Rockford, IL). Анализ выполняли в соответствии с рекомендациями изготовителя. Стандартные кривые строчили с использованием программного обеспечения CricketGraph на компьютере Macintosh IIci.

Электрофорез в ПААГ-ДСН и Вестерн-блоттинг

Все гели, буферы и прибор для электрофореза были получены из Novex (San Diego, CA) и электрофорез проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя. Вкратце, пробы разводили до равной концентрации белка в Milli-Q-H₂ и смешивали 1: 1 с буфером для инкубирования пробы, содержащим 200 мМ ДТТ. Пробы инкубировали 15 минут при 100^oC и наносили на предварительно залитые 12% Трис-глициновые гели. Пробы подвергали электрофорезу при 125 В в течение 1 часа 45 минут. Гели проявляли окрашиванием коллоидным Кумасси с применением коммерчески полученного набора (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Для вестерн-блотов белки переносили на мембраны ПВДФ при 25 В в течение 40 минут. Мембраны промывали Milli-Q-H₂O и сушили на воздухе. Первичными антителами были MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA), которые были ковалентно связаны с ферментом щелочной фосфатазой (J. Cook, MRL). Раствор антител готовили разведением антисыворотки в буфере для блоттинга (5% нежирное молоко в 6,25 мМ фосфате натрия, pH 7,2, 150 мM NaCl, 0,02% NaN₃). Инкубирование продолжалось по меньшей мере 1 час при 20-23^oC. Блот промывали в течение 1 минуты в трех сменах PBS (6,25 мМ фосфат натрия, pH 7,2, 150 мМ NaCl). Блоты детектировали при помощи NBT/BCIP субстрата стадии I (Pierce, Rockford, IL).