способ определения качества клейковины пшеницы

Формула изобретения

Способ определения качества клейковины пшеницы, включающий дезинтеграцию зерна на части, суспендирование, например, встряхиванием, частиц зерна в подкисленной, например, слабой органической кислотой, воде, естественное отстаивание, наблюдение за его динамикой, отличающийся тем, что перед наблюдением суспензию обрабатывают флуоресцентным зондом на гидрофобные зоны биомолекул в концентрации по величине, достаточной для регистрации флуоресценции при связывании его молекул с гидрофобными зонами частиц муки или шрота, которая ниже уровня, вызывающего эффект реабсорбции излучаемого света молекулами самого зонда, облучают ультрафиолетовым светом с последующим наблюдением динамики флуоресценции в процессе оседания частиц муки или шрота и суждением о качестве клейковины по падению интенсивности флуоресценции во времени.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйства и может быть использовано в селекции пшеницы и мукомольно-хлебопекарной промышленности.

Известен способ оценки качества клейковины зерна пшеницы (Н.П. Козьмина, Л.Н. Любарский. Зерно и оценка его качества. М.,Сельхозиздат: 1962, с. 72.), в котором из муки пшеницы изучаемого образца отмывают клейковину и судят о качестве последней по ее способности растягиваться в длину без разрыва.

Однако этот способ характеризуется высокой трудоемкостью и требует для анализа значительного количества зерна пшеницы.

Известен также способ определения качества клейковины зерна пшеницы (Н. С. Беркутова. Методы оценки и формирования качества зерна. М.: Росагропромиздат, 1991, с. 134), в котором из муки пшеницы изучаемого образца отмывают клейковину и оценивают ее упруго-вязкие свойства с помощью измерителя деформации клейковины (ИДК-1), по показаниям шкалы которого и судят о качестве образца.

Однако этот способ не устраняет вышеназванных недостатков.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения качества клейковины зерна пшеницы (В. М. Бебякин, Г.В. Пискунова, О.А. Романова. Микрометодики определения твердости зерна, количества и качества клейковины мягкой пшеницы. Вестник с. -х. науки Казахстана, 1976, N 2, с. 24-28), в котором из микронавески муки (0,5 г) анализируемого материала и 2%-ного раствора хлористого натрия готовят суспензию и центрифугируют ее в течение 3 мин при 4000 об/мин. Из полученного таким образом осадка производят ручную домывку клейковины 2%-ным раствором хлористого натрия. Из отмытой клейковины отвешивают навеску 100 мг и разделяют ее на 8 равных частей, которые помещают в пробирки с 5 мл 0,6 Н уксусной кислоты. Пробирки помещают в термостат в горизонтальном положении при постоянной температуре 42^oC на 105 мин для набухания. По истечении этого времени пробирки встряхивают, а затем ставят в вертикальное положение на 15 мин для отстаивания. Мутность взвеси измеряют на фотоэлектроколориметре. Полученные данные выражают в условных единицах и судят по ним о качестве клейковины.

Прототип, хотя и позволяет снизить количество испытуемого материала по сравнению с двумя другими аналогами, однако, вследствие необходимости отмывания клейковины также обладает высокой трудоемкостью и низкой производительностью. Кроме того, низкая точность результатов, полученных этим способом, не позволяет широко использовать его для массовой оценки селекционного материала.

Цель изобретения - снижение трудоемкости при увеличении производительности и точности оценки качества клейковины пшеницы.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе определения качества клейковины пшеницы навеску, например 2-3 грамма, зерна дезинтегрируют, например получая муку или шрот, затем суспендируют, например, встряхиванием в 0,1 н. растворе молочной кислоты, добавляя при этом флуоресцентный зонд на гидрофобные зоны биомолекул в концентрации по величине, достаточной для регистрации флуоресценции при связывании его молекул с гидрофобными зонами частиц муки или шрота, которая ниже уровня, вызывающего эффект реабсорбции излучаемого света молекулами самого зонда, например 1-анилинонафталин-8-сульфонат (АНС) в концентрации 110^-5 -110^-4 М/л, после чего наблюдают за его свечением, например, с помощью флуориметра при длине волны 480 нм, используя для облучения суспензии ультрафиолетовый свет, например, с длиной волны 360 нм, регистрируя интенсивность флуоресценции в начальный момент времени и периодически, например, через каждую минуту, в процессе естественного отстаивания суспензии муки и судят о качестве клейковины по падению интенсивности флуоресценции во времени.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: берут зерно пшеницы (мягкой, твердой и др.), например, в количестве 2-3 г, размалывают его, например, на мельнице Квадрумат Юниор фирмы "Брабендер" (ФРГ) для получения муки или на мельнице Пируэт для получения шрота. Затем навеску муки или шрота не менее 0,05 г суспендируют, например, встряхиванием в 10 мл раствора слабой органической кислоты, например 0,1 н. молочной кислоты, и добавляют к суспензии водный раствор флуоресцентного зонда на гидрофобные зоны биомолекул, типа 1-анилинонафталин-8-сульфонат (АНС), представляющего собой органический краситель, имеющий в своем составе гидрофобную ароматическую часть и какую-либо ионизированную группировку, способный изменять свои спектральные характеристики флуоресценции (интенсивность и положение максимума излучения) в зависимости от степени гидрофобности окружающей среды. В частности, в воде молекулы АНС имеют низкую интенсивность флуоресценции с максимумом при длине волны 520 нм, тогда как встраивание гидрофобной части молекулы в белки, липидные мицеллы или биологические мембраны приводит к резкому увеличению интенсивности флуоресценции и смещению максимума до длины волны 480 нм. Концентрация флуоресцентного зонда в суспензии должна быть достаточной для регистрации флуоресценции при связывании его молекул с гидрофобными зонами частиц муки или шрота, однако она не должна превышать уровня, при котором наступает эффект реабсорбции излучаемого света молекулами самого зонда. Практически, например, для АНС данное условие выполняется при концентрации зонда 110^-5 -110^-4 М/л. После добавления зонда и вторичного встряхивания суспензии наблюдают за его свечением, например, с помощью флуориметра, который, например, в случае использования АНС оснащают возбуждающим фильтром с максимумом пропускания при длине волны 360 нм и отсекающим фильтром с длиной волны пропускания 480 нм, что позволяет регистрировать интенсивность флуоресценции в положении максимума излучения. В период наблюдения регистрируют интенсивность флуоресценции в начальный момент времени и периодически, например, через каждую минуту. О качестве клейковины судят по падению интенсивности флуоресценции во времени, связанной с процессом оседания частиц муки или шрота в процессе отстаивания суспензии. Для этого используют, например, следующие показатели: интенсивность флуоресценции в условных единицах в начальный момент времени (Ф₀) и после пяти минут отстаивания суспензии (Ф₅); падение интенсивности флуоресценции за 5 мин (Р₅), определяемую по формуле Р₅ = Ф₀-Ф₅; точку замедления осаждения (ТЗО), получаемую делением интенсивности флуоресценции в точке, когда ее падение практически остановилось, на время, прошедшее до этого момента; скорость осаждения суспензии (С_ос), интенсивность флуоресценции при бесконечном отстаивании суспензии (Ф), константу осаждения суспензии (К_ос). Последние три параметра определяют, используя кинетические кривые, перестроенные в обратных координатах (Ю. А. Владимиров, Р.Е. Добрецов. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980, с. 83).

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа в сравнении с прототипом и другими известными аналогами

Пример 1

Зерно яровой мягкой пшеницы 35 разнокачественных сортов урожая 1995, 1996 и 1997 годов размалывали на муку на мельнице Квадрумат Юниор фирмы "Брабендер" (ФРГ), для просеивания использовали сито с 70%-ным выходом муки. Навеску муки 0,05 г суспендировали в слабом растворе органической кислоты, а именно в 0,1 н. молочной кислоте, добавляя при этом флуоресцентный зонд на гидрофобные зоны биомолекул АНС при конечной концентрации 410^-5 М/л, после чего с помощью флуориметра, собранного на базе фотоколориметра КФК-2, содержащего в качестве источника ультрафиолетового излучения ртутно-кварцевую лампу ДРШ-250, в качестве возбуждающего светофильтра - УФС-6, а в качестве отсекающего - интерференционный светофильтр с максимумом пропускания 480 нм, наблюдали за свечением и регистрировали интенсивность флуоресценции в произвольных единицах в начальный момент времени (Ф₀) и с интервалом в 1 мин в течение 5 мин (Ф₁, Ф₂, Ф₃, Ф₄, Ф₅). Для оценки качества клейковины использовали следующие прямые показатели: Ф₀ и Ф₅, а также расчетные показатели: падение интенсивности флуоресценции за 5 мин (Р₅= Ф₀- Ф₅) и 1 мин (Р₁= Ф₀- Ф₅); точку замедления осаждения (ТЗО), получаемую делением интенсивности флуоресценции в точке, когда ее падение практически остановилось, на время, прошедшее до этого момента; скорость осаждения суспензии муки (С_ос), интенсивность флуоресценции при бесконечном отстаивании взвеси муки (Ф), константу осаждения взвеси муки (К_ос), а также соотношения Ф₀/Р₁ и Ф₀/Р₅.

Параллельно проводили измерение растворимости клейковины этих же сортов яровой мягкой пшеницы в слабых органических кислотах по прототипу. Кроме того, экспериментальный материал оценивали по известным аналогам определения качества зерна, клейковины и теста яровой мягкой пшеницы: фаринографическая оценка (сопротивление теста замесу, разжижение теста, стабильность теста, валориметрическое число), измерение деформации клейковины (ИДК-1), расплываемость клейковины, растяжимость клейковины, SDS-седиментация.

Выявили устойчивую и статистически значимую корреляцию между предлагаемыми показателями параметров флуоресценции АНС в суспензиях муки, например Ф₀/Р₁, и общепринятыми показателями качества, которая превосходила (или была на одном уровне) аналогичную корреляцию между растворимостью клейковины в слабых кислотах (согласно прототипу) и другими общепринятыми показателями качества, статистически незначимую в отдельные годы (табл. 1).

Предлагаемый способ определения качества клейковины пшеницы выгодно отличается от прототипа и других общепринятых аналогов малым количеством необходимого материала, что является крайне важным для оценки селекционного материала на ранних этапах селекционного процесса, высокой производительностью, сравнительно низкой трудоемкостью и большим количеством регистрируемых показателей (табл. 2).

Данные показатели также тесно связаны с общепринятыми показателями, характеризующими различные аспекты качества: физические свойства клейковины (растяжимость, расплываемость, индекс деформации клейковины), физико-химические свойства клейковины (набухание, растворимость в слабых органических кислотах) и муки (SDS-седиментация), реологические свойства теста (фаринографическая оценка), что позволяет получать более полную информацию об исследуемом объекте (табл. 3).

Пример 2

По схеме, описанной в примере 1, оценивали клейковину из шести сортов яровой мягкой пшеницы, три из которых традиционно относятся к группе сильных пшениц: Саратовская 29, Саратовская 42 и Саратовская 55, и три к группе слабых: Альбидум 43, Саратовская 52 и Диамант. Зерно этих сортов было получено в контрастные по погодным условиям годы: 1995 - острозасушливый, 1997 - с избыточным увлажнением.

Результаты проведенных оценок (табл. 4) показали, что предложенные показатели хорошо дифференцировали зерновой материал по качеству клейковины, не уступая в этом отношении общепринятым показателям аналогов, а по некоторым позициям превосходили их в независимости от погодных условий года не только между "группами качества", но и внутри группы. Так, разрешающая способность предложенных показателей, оцениваемая по уровню межсортовой вариации (CV), была значительно выше, чем у таких общепринятых показателей, как: валориметрическое число (13,32 - 15,03%), ИДК-1 (4,32 - 7,78%) (1995 -1997 гг.), растяжимость клейковины (17,87 - 17,95%) (1996 -1997 гг.)

Пример 3

Для определения воспроизводимости предлагаемого способа определения качества клейковины пшеницы использовали 25 микронавесок зерна сорта Саратовская 29 урожая 1995 года. Материал исследовали предлагаемым способом по схеме, указанной в примере 1, а также измеряли растворимость клейковины в слабой органической кислоте (согласно прототипу). Результаты статистической обработки (табл. 5) показали малый (Ф₀, Ф₅, Р₅, Ф₀/Р₅, Ф, К_ос) и средний (Р1, Ф0/Р1, ТЗО, С_ос) коэффициент вариации предлагаемых показатели качества, высокую точность опыта и высокий коэффициент вариации у прототипа.

Пример 4

Зерно яровой твердой пшеницы 24 разнокачественных сортов урожаев 1991, 1996 и 1997 гг. оценивали предлагаемым способом по схеме, описанной в примере 1. Параллельно проводили измерение растворимости клейковины в слабых органических растворителях (по прототипу) этих же сортов твердой пшеницы. Экспериментальный материал также оценивали с помощью общепринятых способов (аналогов) определения качества зерна, клейковины и теста твердой пшеницы: миксографическая оценка (устойчивость теста к замесу, эластичность теста), измерение деформации клейковины (ИДК- 1), растяжимость клейковины (табл. 6). Выявили устойчивую и статистически значимую корреляцию между предлагаемыми показателями флуоресценции взвеси муки, например Ф₀/Р₁, и общепринятыми показателями качества, которая значительно превосходила аналогичную корреляцию между растворимостью клейковины в слабых органических кислотах (по прототипу) и другими общепринятыми показателями качества (аналогами), часто статистически незначимую.

Здесь и ранее в других примерах конкретного осуществления, по прототипу, из 0,5 г муки анализируемого материала и 2 мл 2%-ного раствора хлористого натрия готовили суспензию и центрифугировали ее в течение 3 мин при 4000 об/мин. Из полученного таким образом осадка производили ручную домывку клейковины 2%-ным раствором хлористого натрия. Из отмытой клейковины отвешивали навеску 100 мг и разделяли ее на 8 равных частей, которые помещали в пробирки с 5 мл 0,6 н. уксусной кислоты. Пробирки помещали в термостат в горизонтальном положении при постоянной температуре 42^oC на 105 мин для набухания. По истечении этого времени пробирки встряхивали, а затем ставили в вертикальное положение на 15 мин для отстаивания. Мутность раствора измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2 при фильтре N 3 в кювете N 5. Полученные данные умножали на 1000, выражали в условных единицах и судили по ним о качестве клейковины.

Сравнительный анализ способов определения качества клейковины пшеницы показал, что корреляция между растворимостью клейковины в слабых органических кислотах (по прототипу) и другими общепринятыми показателями качества в отдельные годы оказывается незначимой, чего не наблюдается при использовании предлагаемого способа (табл. 1, 6). Способ определения качества клейковины по прототипу также уступает предлагаемому способу по таким показателям, как затраты материала (шрота или муки) на 1 навеску для анализа, затраты времени на анализ одной навески, максимальному числу анализируемых навесок в день и числу информационных показателей (табл. 2,3). Кроме того, анализ качества клейковины пшеницы, выполненный по прототипу, дает более высокие показатели коэффициента вариации и точности опыта по сравнению с предлагаемым способом.

Таким образом, результаты сравнительных оценок предлагаемого способа с прототипом и другими известными аналогами демонстрируют достижение цели изобретения - снижение трудоемкости при увеличении производительности и точности оценки качества клейковины. Кроме того, важным преимуществом предлагаемого способа перед прототипом является использование минимальных количеств (минимум 0,05 г) анализируемого материала (муки или шрота), что представляет особую ценность для анализа качества клейковины в ранних селекционных питомниках, где количество зерна, как правило, ограничено.