способ определения моносахаридов в сыворотке крови

Формула изобретения

Способ определения моносахаридов в сыворотке крови путем осаждения сопутствующих компонентов исследуемой пробы, лиофилизирования надосадочной жидкости и газожидкостной хроматографии на металлической колонке сечением 3 мм, отличающийся тем, что при проведении анализа используют приготовление ацетилированных альдононитрилов моносахаридов сыворотки крови путем прибавления к исследуемой пробе уксусного ангидрида, перемешивания и выпаривания досуха при температуре 60^oC, после чего полученный осадок разводят в хлороформе, пробу вводят в колонку хроматографа длиной 2 м, заполненную 3% Silicone XE-60 на отмытом кислотой хроматоне при температуре 220^oC в изотермическом режиме или режиме программирования температур от 210 до 245^oC со скоростью 12^oC в минуту.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, биологии, в частности к лабораторной диагностике.

Известны методы определения моносахаридов о-тулоидиновым способом, методом тонкослойной хроматографии [1] на слоях кизельгурт-гипс, силикогель-гипс, с использованием ядерно-магнитного резонанса [2], с помощью масс-спектрометрии [3], методом хроматографии на бумаге [4]; однако перечисленные методы не обладают достаточной специфичностью для близких сахаров (например, глюкозы, сахарозы, манозы). Единственным рутинным методом идентификации и количественного анализа родственных моносахаридов в биологических объектах считается газожидкостная хроматография. Наиболее удобным для этого считается способ приготовления производных простого триметилсилилового эфира [5,6], осуществляющийся следующим образом: 0,1 мл сыворотки с помощью пипетки вводят в центрифужную пробирку; для осаждения сопутствующих компонентов добавляют 0,5 мл 2% ZnSO₄7H₂O и 0,5 мл 1,8% Ba(ОН)₂, 0,9 мл дистиллированной H₂O; раствор перемешивают в смесителе Vortex, отстаивают в течение 5 минут; раствор надосадочной жидкости лиофилизируют; сухой материал переносят в пробирку с крышкой, добавляют 1 мл пиридина, 0,2 мл гексаметилдисилазана, 0,1 мл триметилхлорсилана, все это тщательно перемешивают, приблизительно через 20 минут смесь центрифугируют и хранят в пробирке с тефлоновым покрытием. Препарат стабилен в течение недели при температуре 4^oC. Для газохроматографического анализа пробу объемом 1-5 мкл с помощью микрошприца вводят в стеклянную или металлическую колонку длиной 1,7 м и сечением 3 мм, наполненную 15% EGS или 3% SE-52 на промытом кислотой силализированном газ-хроме P. Температура колонки при этом должна составлять около 140^oC при изотермическом режиме или программироваться от 110 до 195^oC со скоростью 5^oC в минуту.

Цель изобретения - увеличение сроков хранения препаратов, упрощение условий их хранения.

Предлагаемый метод отличается тем, что для проведения газохроматографического анализа используется приготовление ацетилированных альдононитрилов моносахаридов сыворотки крови следующим образом: 1 мл сыворотки крови с помощью пипетки вносится в центрифужную пробирку; для осаждения сопутствующих компонентов добавляют 2 мл 1,8% раствора Ba(ОН)₂ и 2 мл Zn SO₄ 7H₂O, перемешивают стеклянной палочкой в течение 1 минуты и 10 минут отстаивают при комнатной температуре; затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут, 2 мл надосадочной жидкости переносят в чистую сухую пробирку, использующуюся в дальнейшем как реакционный сосуд, и выпаривают на водяной бане досуха; к полученному остатку добавляют 2 мл пиридина, 100 мг гидроксиламина, запаивают в ампулу и нагревают на водяной бане в течение 1 часа; ампулу вскрывают, добавляют 2 мл уксусного ангидрида, вновь запаивают и нагревают на водяной бане 1 час; затем содержимое ампулы с помощью разделительной воронки дважды промывают хлороформом по 2 мл, хлороформы объединяют и выпаривают досуха в сухожаровом шкафу при температуре 60^oC.

Подготовленный данным способом препарат стабилен в течение 1 года при комнатной температуре, что позволяет создавать банки проб сыворотки крови, проводить повторные анализы в динамике лечебного процесса.

Для газохроматографического анализа полученный после выпаривания хлороформа осадок разводят 20 микролитрами хлороформа, пробу объемом 0,5-1 микролитр вводят в металлическую колонку хроматографа длиной 2 м, сечением 3 мм, заполненную 3% Silicone XE-60 на отмытом кислотой хроматоне. Температура колонки составляет 220^oC при изотермическом анализе или программируется от 210 до 245^oC со скоростью 12^oC в минуту.