специфический для пациента иммуноадсорбент для экстракорпорального афереза и способ его получения

Формула изобретения

1. Иммуноадсорбент для экстракорпорального афереза, полученный специфическим для каждого из пациентов, страдающих аутоиммунными и иммунопатологическими заболеваниями, состоящий из антигенов и антител, ковалентно связанных с активированным биосовместимым твердым материалом-носителем, выделенных путем расщепления иммунокомплексов, изолированных из крови или других жидкостей тела того же самого пациента, для которого данный иммуноадсорбент предназначен.

2. Иммуноадсорбент по п.1, содержащий антитела и антигены, удаленные из пациента с заболеванием, вызванным или поддерживаемым дизрегуляцией иммунной системы.

3. Иммуноадсорбент по пп. 1 и 2, содержащий антигены и/или антитела, удаленные из пациента, страдающего любым заболеванием, выбранным из группы, включающей ревматоидный артрит, быстропрогрессирующий гломерулонефрит, системную красную волчанку, рассеянный склероз, антифосфоидный синдром, васкулиты, полимиозит, неврологические аутоиммунные и иммунопатологические заболевания, возникшие вследствие инфекционных заболеваний или наличия гистологически несовместимых реципиентов трансплантата.

4. Иммуноадсорбент по пп.1 - 3, содержащий антигены и/или антитела, удаленные из пациента, страдающего ревматоидным артритом, системной красной волчанкой или рассеянным склерозом.

5. Иммуноадсорбент по пп.1 - 4, в котором материалом-носителем является сефароза или жемчужная целлюлоза.

6. Способ получения специфического для пациента иммуноадсорбента по пп.1 - 5, включающий выделение иммунокомплексов из крови и/или других жидкостей тела пациента, страдающего аутоиммунным и/или иммунопатологическим заболеванием, с использованием известного способа, например плазмафереза, очистку иммунокомплексов и их расщепление на активные компоненты - антитела и антигены и ковалентное связывание антител и/или антигенов с активированным биосовместимым материалом-носителем.

7. Способ по п.6, в котором расщепление иммунокомплексов осуществляют в кислой или щелочной средах, предпочтительно при pH 5,5 или 10 - 12, предпочтительно в присутствии солей NaCl, MgCl₂, LiCl, или мочевины, или гидрохлорида гуанидина.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается получения иммуноадсорбентов на основе специфических антител и/или антигенов, которые вследствие хода иммунопатологических процессов отвечают за вызывание или поддерживание многих заболеваний. Это позволяет целенаправленно вмешиваться в иммунопатологический цикл регулирования, который отвечает за клинические последствия, не повреждая общей иммунной системы, как это, например, происходит при традиционной терапии медикаментозной иммуносуппрессией.

Кроме того, способ в соответствии с изобретением позволяет обогащение и получение в чистом виде иммунопатологически релевантных гомологичных веществ, открывая таким образом новые возможности для исследования причин и развития терапии.

Функциональная основа иммунной реакции комплексная и основывается на хорошо отрегулированном взаимодействии местных и системно-эффективных целлюлярных и гуморальных элементов неспецифической защиты с системой специфической защиты, состоящей из активированных клеток лимфопоэтической системы и произведенных ими медиаторов и антител.

В зависимости от вида стимулирования доминирующая защита может быть различной.

Повышение этой защиты достигается естественным путем в течение инфекции или искусственно, т.е. лекарством. Это осуществляется как комплексно, так и локально через слизистые оболочки дыхательного, пищеварительного и мочеполового трактов.

Конечно, организм немедленно реагирует на инфекцию. Качество и количество немедленной реакции зависит от вида антигена и места его проникновения. В принципе идентичные реакции происходят, если даются вакцины и другие чужеродные вещества. Специфическая защита, измеряемая, например, обнаружением специфических антител, действенно проявляется только после нескольких дней. После устранения вызывающей причины образование специфических антител снижается и в конце концов прекращается. После биологического разложения антител только присутствие специфических "клеток памяти" указывает на то, с какими антигенами организм в прошлом сталкивался. В определенных обстоятельствах, в большинстве случаев по неизвестным причинам, организм чрезмерно активно реагирует на гомологичные структуры. Развивающаяся аутоиммунная реакция вызывает постоянную деструкцию гомологичной ткани, продукты разложения которой, в свою очередь, стимулируют иммунную систему. Если этот патологический цикл регулирования не прерывается, то последствия будут фатальными, по крайней мере, для соответствующей ткани.

Заболевания иммунопатологического генеза встречаются часто. Из-за их хронического течения и трудности их лечения они сильно воздействуют на качество жизни соответствующих людей и связаны с невероятными убытками для народного хозяйства. Одно из аутоиммунных заболеваний, встречающихся чаще всего, это ревматоидный артрит, которым болеет около 1% населения. Основной возраст при проявлении заболевания около 40 лет. После 10 лет заболевания 50% пациентов нетрудоспособны и 10-20% физически слабы. До сих пор достигнутые результаты лечения иммуносуппрессией и поддерживающими терапиями недостаточны и часто кончаются прекращением терапии. Лечение базисными лечебными средствами пациентов в течение 3 лет оказывается эффективным максимально для 50% пациентов.

В связи с часто недостаточной эффективностью и большими побочными действиями традиционной иммуносуппрессивной терапии постоянно ищутся новые способы терапии для лечения аутоиммунных заболеваний (J. Sany: Early approaches to immunotherapy of rheumatoid arthritis. EUR-J-RHEUMATOL-INFLAM: 11(1991), 139 - 147).

Такие терапии направлены воздействием на гуморальные и целлюларные иммунные механизмы и системы-медиаторы. Речь идет о экспериментальных попытках терапии, которые достигли первых успехов в экспериментах на животных и в клиническом испытании. Однако до сих пор не было возможно пробить дорогу к новому в прогнозировании пациентов с аутоиммунными заболеваниями.

Обмен плазмой и сорбция плазмы успешно применялись в случаях множества аутоиммунных заболеваний и заболеваний иммунопатологического участия (R.T. Baldwin, R. R. Pierce и О.Н. Frazier: Guillain-Barre syndrome after heart transplantation. J-HEART-LUNGTRANSPLAN: 11(1992), 817-819; J. Braun, J. Sieper, A. Schwarz, F. Кeller, J. Heitz и H.V. Ameln: Severe lupus crisis with agranulocytosis and anuric renal failure due to a mesangial lesion (WHO IIB)- Successful treatment with cyclophosphamide pulse followed by plasmapheresis (2). BR-J-RHEUMATOL: 30 (1991), 312- 313; P.С. Dau: Plasmapheresis in acute_multiple sclerosis: Rationale and results. J-CLIN-APHERESIS: 6 (1991), 200-204; H.H. Euler, J.O. Schroeder, R.A. Zeuner и E. Treske: A randomized trial of plasmapheresis and subsequent pulse cyclophosphamide in severe lupus: Design of the LPSG trial. INT-J-ARTIF-ORGANS: 14 (1991), 639-646; D.C. Hess, К. Sethi и E. Awad: Thrombotic thrombocytopenic purpura in systemic lupus erythematosus and antiphospholipid antibodies: Effective treatment with plasma exchange and immunosuppression. J-RHEUMATOL: 11(1992), 1474-1478; R. Korinthenberg и M. Sauer: The Guillain-Barre syndrome in childhood. Clinical course and therapeutic measures. MONATSSCHR-KINDERHEILKD: 140 (1992), 792-798).

Обмен плазмой - старейший способ терапии, в рамках которого сбрасывается удаленная плазма (мембранный плазмаферез или центрифугация) и одновременно заменяется донорской плазмой или человеческим альбумином. В течение лечения просто заменяется (до двойного количества) плазма пациента. Этот способ неселективный. Для удаления одного или нескольких патогенно важных компонентов заменяется общая плазма и сбрасываются вещества, которые имеют значение для пациента. Для пациента это имеет серьезные последствия, которые пытаются компенсировать различными лекарственными терапиями. Кроме того, существует опасность передачи возбудителей болезни, таких как и HIV или возбудителя гепатита.

При сорбции плазмы через материал-адсорбент прежде всего пропускается предварительно сепарированная плазма. Материал-адсорбент содержит вещества, которые связывают определенные компоненты плазмы, удаляемые таким образом из плазмы пациентов. Если сорбцию плазмы используют для удаления иммунологически важных веществ, то способ называется иммуноадсорбцией. В зависимости от применяемого материала-адсорбента способ имеет различные селективность и специфичность. Они, с другой стороны, обусловливают эффективность терапии, с другой - побочные действия. Для адсорбции иммуноглобулина и иммунокомплексов из сепарированной плазмы в клиниках были использованы различные лиганды и носители (таблица 1).

Таблица 2 дает обзор аутоиммунных заболеваний с успешным лечением путем экстракорпоральной иммуноадсорбции.

Недостаток медикаментозного лечения аутоиммунных заболеваний

Медикаментозная иммуносуппрессия неселективна и неспецифическа. А новые иммунологические терапии (моноклоновые или поликлоновые антитела против маркеров активирования или структур реципиентов иммунных клеток и медиаторов) подавляют иммунный ответ не селективно и/или, со своей стороны, индуцируют иммунные феномены в организме.

Недостатки бывшего способа афереза/адсорбции в лечении аутоиммунных заболеваний

Недостаток всех до сих пор известных систем афереза/адсорбции, как и медикаментозной иммуносуппрессии, состоит в их недостаточной селективности. Это относится к уже принятым способам Балинта и Харгривенса (патент США 4.681.870), выделяющие staphylococcus aureus протеина А на подходящем носителе. По этому методу из крови пациента извлекают неспецифические IgG и комплексы IgG. Это относится и к описанному Дависом (заявка PCT - WO 86/07152) способу, в котором в качестве иммуноадсорбента иммунокомплексов использованы связанные с носителем неспецифические протеины, предпочтительно иммуноглобулины разного вида. С помощью этого метода удаляются иммунокомплексы, а не реактивные отдельные компоненты, вновь постоянно образующиеся в случае аутоиммунных заболеваний.

Либерти и Поллора (патент США 4.551.435) описывают способ удаления из крови веществ и иммунокомплексов путем добавки к крови пациента специфических антител определенной концентрации, которые образуют иммунокомплексы с удаляемым веществом. Удаление из крови ведут с помощью таких факторов, как Clq, ревматических факторов, Fc-реципиентов и носящих Fc-реципиенты клеток, которые выделены на твердом носителе. Этот способ предполагает известность причины, что не может быть в большинстве случаев аутоиммунных заболеваний, и наличие в очищенном виде вызывающего антигена для получения антител. Удаление самих иммунокомплексов осуществляется не специфически, не через протеин А, а через биомолекулы, имеющие физиологически высокое сродство к иммуноглобулинам.

Необходимо принять во внимание, что с патофизиологической точки зрения релевантные иммунные структуры различны при отдельных аутоиммунных заболеваниях, различны даже иммунные феномены одного и того же заболевания. Применение до сих пор имеющихся в распоряжении систем афереза ведет не только к удалению значимых иммунопатологически, но и физиологически значимых, важных для гомологичной защиты иммуноглобулинов. Результат - общее ослабление иммунной системы с опасностью септических осложнений.

Изобретение имеет цель обеспечить терапию для пациентов, страдающих заболеваниями, связанными с дизрегуляцией иммунной системы или связанными с иммунопатологическими процессами, развивающимися в хронические, трудно излечимые формы проявления. В основе изобретения лежит задача создания для пациента соответствующего ему специфического иммуноадсорбента, с помощью которого возможно удалить путем адсорбции из крови или плазмы пациента патогенетически важные иммунокомплексы, аутоантитела и антигены.

Эта задача решается изобретением. В соответствии с изобретением иммунокомплексы удаляют из плазмы пациента известными способами, например с помощью протеина А - иммуноадсорбентов, и после соответствующего элюирования они разлагаются на их биологически активные компоненты. Эти компоненты можно отделить известными способами, например с помощью гель-проникающей хроматографии, и связать их с соответствующим материалом-носителем отдельно или в виде смеси из антител и антигенов. С помощью этих иммуноадсорбентов можно удалить из плазмы пациента путем плазмафереза специфические иммунокомплексы, антитела и антигены, имеющие значение для болезни. Можно получить такие специфические для пациентов иммуноадсорбенты для любой болезни, где аутоиммунокомплексы играют патогенетическую роль.

В соответствии с изобретением специфический для пациента иммуноадсорбент состоит из удаленных из иммунокомплексов и связанных с активированными твердыми материалами-носителями антигенов и/или антител, патологически релевантных иммунным факторам пациентов. Иммуноадсорбент содержит антигены и/или антитела, удаленные из пациентов, страдающих заболеваниями, вызванными или поддержанными дизрегуляцией. Аутоиммунными заболеваниями или иммунопатологическими состояниями реакции являются, например, ревматоидный артрит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, системный lupus erythematosus, антифосфоидный синдром, васкулитиды, несовместимые реципиенты трансплантата, полимиозит, неврологические аутоиммунные заболевания или иммунопатологические дизрегуляции вследствие инфекционных заболеваний. Для материалов-носителей пригодны все биологически переносимые вещества, которые могут связать на своих поверхностях достаточно компонентов иммунокомплексов. Предпочтительно применение сефарозы (sepharose) и жемчужной целлюлозы.

Способ получения специфических для пациентов иммуноадсорбентов характеризуется следующими этапами.

Прежде всего иммунокомплексы известными не селективными способами, например с помощью протеина А - иммуноадсорбентов, удаляют из плазмы пациентов и после соответствующего элюирования разлагают на их биологически активные компоненты. Известным методом, например, гель-проникающей хроматографией, можно связать компоненты отдельно или в виде смеси антител и антигенов с соответствующим материалом-носителем. Предпочтительно разложение иммунокомплексов на отдельные компоненты в кислой или щелочной средах, преимущественно при pH 2-5 или 10-12. В случае необходимости фракционируют и добавляют в определенных концентрациях соли, такие как NaCl, MgCl₂, LiCl, мочевину или гидрохлорид гуанидина, удерживающих компоненты в диссоциированном состоянии. Затем компоненты связывают при pH 2-12 известными методами с твердыми материалами.

С помощью этих иммуноадсорбентов путем экстракорпоральной иммуноадсорбции можно удалить из плазмы пациента "его" специфические иммунокомплексы, антитела и антигены, имеющие значение для болезни. Используемые при этом колонки реактивируемы и предназначены для повторного пользования. В общем, получение таких специфических для пациентов иммуноадсорбентов возможно для каждой болезни, где аутоиммунокомплексы играют патогенетическую роль.

Кроме применения в терапии этот способ позволяет выделить вещества из крови пациентов, которые, по меньшей мере, отвечают за вызывание (инициирование) иммунологической дизрегуляции. Это облегчает исследование по патогенезу аутоиммунных заболеваний или заболеваний, которые ухудшаются из-за иммунологической дисфункции. Преимущества по сравнению с традиционными решениями следующие:

1. Удаляются не только иммунокомплексы, но и отдельные вещества, участвующие в реакции.

2. Замещения чужеродных иммуноглобулинов больше не требуется (перенос болезни как HIV исключается, дополнительные затраты не допускаются).

3. Не зная причин болезни, можно получить специфические иммуноадсорбенты, что требует меньших затрат. Таким образом, можно предоставить специфические инструменты терапии и для таких аутоиммунных болезней, по которым из-за незначительного уровня заболеваний промышленность отказывалась от целенаправленных разработок по экономическим причинам.

4. Можно удалить антигены и/или антитела, которые отвечают за вызывание (инициирование) или поддержание аутоиммунной болезни отдельного пациента, и, таким образом, предоставить их для дальнейших исследований.

Далее изобретение раскрывается более подробно.

Пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, как, например, ревматоидным артритом, lupus erythematodes или рассеянным склерозом, подвергают экстракорпоральному аферезу, применяя иммуноадсорбенты стафилококкового протеина А. По окончании цикла афереза колонку тщательно промывают буферным раствором, к которому добавляют детергенты, или удаляют связанные адсорбцией компоненты плазмы из колонки путем повышения концентрации ионов (например, 1-3 моль/л NaCl). Степень освобождения адсорбированных компонентов плазмы проверяют электрофорезом или определением иммуногенности промывочного буферного раствора. Затем осуществляют элюирование иммуноглобулинов, иммунокомплексов и диссоциированных иммунологических веществ, участвующих в реакции, например, цитратным или ацетатным буфером, pH 7-2, или концентрированными солевыми растворами различной величины pH (4-7). Путем электрофореза, хроматографии или других подходящих способов разделения элюированные фракции исследуют на спектр протеина и степень диссоциации иммунокомплексов.

Для связывания на твердых носителях используют фракции, в которых иммунокомплексы расщеплены на их активные компоненты. В случае необходимости перед связыванием их можно отделить подходящими способами. Компоненты иммунокомплексов связывают с материалами-носителями, активированными этиловым эфиром, ONB-карбонатом или N-оксисукцинимидом. После удаления всех не связанных компонентов, специфических для пациента, с помощью регенерированного иммуноадсорбента из крови пациента селективно удаляют только те вещества, которые отвечают за иммунопатологическую гуморальную дизрегуляцию.

Пример 1. Модельные исследования для определения биологической активности выделенного на твердом носителе человеческого IgG через связывание IgG козы - таблица 3.

Соединение человеческого IgG с соответствующим носителем (сефароза 6FF и жемчужная целлюлоза) осуществляли в условиях элюирования. Для соединения с человеческим IgG был использован активированный Cl-CO-ONB гель, содержащий около 30 мкмоль/мл групп ONB карбоната.

1 мл сыворотки животного (5,3 мг IgG козы) был разбавлен 1 мл физиологического раствора поваренной соли с фосфатным буфером (PBS) и нанесен на соответствующий носитель (расход: 0,1 мл/мин). Колонки были промыты PBS и 3 мол. раствором NaCl, pH 5,0 в количестве, многократно превышающем объем колонки. Элюирование осуществляли в 0,1 м растворе глицин-HCl с 0,05% твина 20, pH 2,0 (расход: 1,0 мл/мин, 2-6^oC). Концентрацию протеина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм после нейтрализации элюатов 0,5 моль раствором K₂HPO₄. Количественная оценка связывания IgG-антител животного на мл геля по отношению к связыванию человеческого IgG в стандартных условиях (0,5 мол. раствор фосфатного буфера с 0.05% твина 20, pH 7.2) представлена в таблице 3.

Пояснения к таблице 3:

а) активирование Cl-CO-ONB в присутствии третичных аминов (катализированные основанием); степень активирования: 20 мкмоль групп ONB-карбоната/мл геля, эффективность связывания 57%;

б) 5,3 мг антител, очищенных хроматографией по сродству, в 9,2 мл нейтрализующего буфера элюирования; расход - 0,1 мл/мин, промывной буферный раствор - PBS, 3 мол раствор NaCl (pH 5,0); элюирование при расходе жидкости 1 мл/мин; было элюировано 63% предложенных антител;

в) 5,3 мг антител, очищенных хроматографией по сродству, в 9,2 мл нейтрализующего буфера элюирования; расход - 0,1 мл/мин, промывной буферный раствор - PBS, 3 мол раствор NaCl (pH 5,0); элюирование при расходе жидкости 0,5 мл/мин; было элюировано 70% предложенных антител.

Пример 2. Модельные исследования для определения емкости связывания человеческого IgG (антигена), выделенного на твердом носителе - активированной ONB-карбонатом сефарозе 6FF при pH 3,0, путем хроматографии по сродству при использовании избытка IgG (антитела) животного. Таблица 4.

Для связывания человеческий IgG (сигма) был растворен в связывающем буферном растворе и раствор отфильтрован (0,2 мкм). Этот раствор был добавлен к увлажненной растворителем, активированной сефарозе. Выделение осуществляли при температуре помещения (1 ч). После блокировки на 1 ч (1 моль этаноламина в 0,1 мол растворе бората, pH 8,0) гель был интенсивно промыт, например, на фритте 10-кратным количеством емкости колонки в следующей последовательности: связывающий буферный раствор - вода - 0,01 н. раствор HCl - вода - 24 часа в 0,1 боратном буфере, pH 8,3 - вода.

Хроматографию по сродству осуществляли при 2-6^oC системой ECONO (BIO-RAD), используя колонку Omnifit с внутренним диаметром 5,0 0,3 см (350 мкл геля). Были выбраны расходы с 0,25 по 1,0 мл/мин. Элюирование было измерено с помощью УФ-расходофотометра (280 нм). После связывания антител и промывки PBS антитела элюировали по следующей программе:

1. 30 мин PBS

2. 60 мин 3 мол раствор NaCl, pH 5

3. 30 мин PBS

4. 60 мин 0.1 мол раствор глицин - HCl, pH 2.0

5. 30 мин PBS.

Расход жидкости - 0.25 мл/мин

Пояснения к таблице 4:

ТП - температура помещения; НМ - прерывистый метод; НМЭ - элюирование связанных прерывистым методом антител (1 опыт) после промывки PBS в колонке; НМД - дополнительные антитела к антителам, связанным прерывистым методом; промывка и элюирование в колонке; MX -"микро"- хроматография по сродству с традиционной загрузкой антителами; МЦ - "микро"-хроматография по сродству с традиционной загрузкой колонки циркуляцией очищенных антител; МЦА - "микро"-хроматография по сродству с сывороткой козы, разбавленной в PBS циркуляцией.

а) Для удаления избытка предложенных антител и/или связанных адсорбцией протеинов осуществляли промывку PBS. Промывку повторяли через часовые интервалы (или 16 ч) до начала программы элюирования.

б) Количество IgG животного (антител) определяли на спектрофотометре при ₂₈₀ (E^0,1% = 1,38) после нейтрализации 0,5 мол растворе K₂HPO₄. Считалось, что связывание равно 100%, если каждая выделенная на твердом носителе молекула IgG человека связывает 2 молекулы IgG животного.

в) сыворотка козы, разбавлялась в PBS в соотношении 1:8.

Пример 3.

а) Элюирование антител к альбумину (HSA) кроликов, иммунизированных человеческой сывороткой, из комплексов антиген-антитело c HSA осуществляли с помощью микротитровальных плит, покрытых HSA. Определяли оптимальные условия элюирования для хроматографии по сродству (Таблица 5).

Микротитровальные плиты (96 ячеек) были заполнены HSA. В каждой ячейке было инкубировано 0,1 мкг HSA животного. Системой обнаружения (ELISA) служил IgG животного, сопряженный с щелочной фосфатазой (субстрат: 4 - нитрогенфенилфосфат, _405нм).

200 мкл соответствующего элюирующего буфера были внесены пипеткой в ячейки. Элюирование осуществляли при температуре помещения в течение часа при постоянном движении микротитровальной плиты. После тщательной промывки ячейки исследовали на наличие HSA животного. Для оценки средней величины измерений использовали 8 ячеек (%CV = 4.4). Количество элюированных PBS HSA-антител животного было зафиксировано равным 0%.

б) Выделение на твердом носителе HSA животного - HSA человека на активированной и катализированной ONB-карбонатом сефарозе 6FF в средах связывания, используемых как среды элюирования для хроматографии по сродству (Таблица 6).

К отфильтрованным средам связывания, к которым был добавлен связываемый протеин (0.45 мкм), была добавлена влажная, активированная ONB-карбонатом сефароза. Связывание осуществляли в течение часа при температуре помещения и легком встряхивании. Затем осуществляли блокирование в боратном буфере с этаноламином (pH 8,1) в течении часа при температуре помещения. ONB-карбонатные группы были определены спектрофотометрическим образом (_макс около 267 нм).

0,5 мол. фосфатный буфер (pH 7,3) служил для определения базовой величины максимального выделения на твердом носителе (иммобилизации). Промывку осуществляли, как в примере 2.

HSA-антитела животного были получены в предварительном эксперименте хроматографией по сродству (0,05 - 0,1 мол цитрата, pH 2,0), нейтрализованы 0,5 мол К₂HPO₄, хранились при -20^oC, а после оттаивания для связывания устанавливали pH 3,0 или 4,0 разбавленной HCl.

Для связывания смеси из антигенов и антител человеческую сыворотку с альбумином (HSA) растворяли в PBS, разбавленном HCl, устанавливали в ней соответствующий pH, после чего сыворотку добавляли к раствору антител.

Определение протеина в связывающем буфере осуществляли спектрофотометрически OD₂₈₀ нм (антитела E^0,1% = 1.38 и альбумин человеческой сыворотки (HSA) E^0,1% = 0.67). После обработки гелей 1 н. NaOH выделенные на твердом носителе протеины были определены по Ловри.

Результат связывания (%) - сравнительное количество выделенного на твердом носителе (иммобилизированного) протеина по отношению к известному количеству протеина.

Пример 4. Определение биологической активности (способности к связыванию) антигенов и антител на модели HSA животного/HSA человека после выделения на твердом носителе в условиях расщепления иммунокомплексов (Таблица 7)

Активированную ONB-карбонатом сефароза 6FF, катализированную основанием, связывали с HSA животного - HSA человека в условиях элюирования (pH 3,0; pH 4,0, 4 мол. гуанидин-HCl), как описано в примерах 1 и 3 осуществления связывания HSA животного - HSA человека. После промывки колонки HSA человека или HSA животного находились в связывающем буфере. После повторной промывки колонки PBS осуществляли элюирование (pH 2,0) и фотометрическое определение концентрации протеина.

Этими модельными экспериментами было обнаружено, что антиген (HSA человека) и антитела (HSA животного) иммунокомплексов (HSA человека/HSA животного), выделенные (иммобилизированные) на твердом носителе в условиях расщепления, сохраняют свою способность к связыванию. Иммобилизированная из иммунокомплексов HSA человека постоянно связывала HSA животного, которая и после повторного элюирования в рамках ELISA отличалась высокой реактивностью с HSA человека (результаты не были представлены). При условии, что 1 моль HSA человека связывает 1 моль HSA животного из иммунокомплексов (3-й эксперимент) были иммобилизированы 0.9 мг HSA человека на 1 мл геля, которые связывали 2.1 мг HSA животного. Подобные результаты получены в экспериментах 5,7, 13 и 16. Несмотря на то, что в этой модели HSA животного (IgG кролика), выделенный из иммунокомплексов, эффективно иммобилизируется и в условиях стандартного связывания (успех можно показать на IgG кролика), связывание происходит здесь, очевидно, в молекулярном диапазоне, который создает стереохимические препятствия для связывания HSA человека. Сами антитела сохраняют свою биологическую активность.

Пример 5. Хроматография по сродству плазмы пациента, страдающего lupus erythematodes (одновременно стандартный метод).

Была использована плазма пациента, страдающего lupus erythematodes. Для получения общих -глобулинов была использована колонка протеина А (PHARMACIA). Выделение на твердом теле антител осуществили активированной ONB-карбонатом сефарозой FF6 (20 мкмолей/мл).

Буферные растворы для иммуноадсорбции

Буфер РА: pH 7,0, 1000 мл; pH устанавливали HCl или NaOH.

Тринатрийцитрат: 3,30 г.

Ацетат натрия 3H₂O: 5,45 г.

Хлорид натрия: 4,90 г.

Динатрийгидрофосфат: 2,91 г.

Дигидрофосфат калия: 0,26 г.

Элюант РА: pH 2,2; 1000 мл; pH устанавливали HCl или NaOH.

Лимонная кислота H₂O: 6,12 г.

Хлорид натрия: 9,00 г.

Буфер промывки: 1000 мл; pH устанавливали HCl или NaOH.

3 мол.NaCl pH 7,0.

Тринатрийцитрат: 3,30 г.

Ацетат натрия 3H₂O: 5,45 г.

Хлорид натрия: 175,0 г.

Динатрийгидрофосфат: 2,91 г.

Дигидрофосфат калия: 0,26 г.

Твин 20: 0,50 г.

Цитратный буфер.

0,1 мол, pH 2.2, 250 мл; pH устанавливали NaOH.

Лимонная кислота: 5,25 г

Методы.

Колонка, связанная с протеином А (5 мл геля, Pharmacia), была уравновешена буфером РА центрифугированием. Свежую плазму (20 мл), центрифугированную с высокой скоростью, перемешивали с буфером РА 1:2 и вносили в колонку. Для хроматографии использовали систему ЭКОНО (BIORAD). Плазму после удаления снова вносили в колонку для достижения полной адсорбции. Требовалась интенсивная промывка колонки 5-кратным количеством РА для удаления не адсорбированного материала. Промывной буфер, содержащий 3 мол NaCl, удалил не специфически связанные протеины. Иммуноглобулины и протеины, элюированные из иммунокомплексов с помощью 0,1 мол цитратного буфера, 0,05% твина 20, pH 2,2 выражены острым пиком. Объем элюата составил 6,5 мл. УФ-адсорбцией при _280нмк концентрация протеина была определена в 17.6 мг/мл. Немедленно после элюирования раздельно присутствующие IgG и протеины должны быть связанны с активированной ONB-карбонатом сефарозой. Для этого к элюату добавляли 6 мл отсосанного геля, приготовленного в соответствии с инструкцией поставщика, потом его встряхивали в течение 1 ч. Благодаря буферному действию растворенных в элюате протеинов он имел pH от 3 до 4. Необходимо было насыщать свободные связи 1 мол раствором этаноламина в 0,1 мол. боратном буфере, pH 8,0. Сравнивая концентрации протеина в объединенных промывных растворах с элюатом протеина А, была установлена эффективность связывания 57%. После тщательной промывки гель мог быть использован в качестве носителя для экспериментов с хроматографией по сродству.

В связи с этим 40 мл плазмы пациентов центрифугировали, разбавляли РА 1: 2 и пропускали 2 раза через колонку. Несвязанный или не специфически связанный материал был удален последующей промывкой промывным буфером и РА 10-кратным количеством емкости колонки РА. Специфически связанный протеин был элюирован 0,1 мол цитратным буфером, pH 2.2 (фиг. 1).

Протеины плазмы и фракции, полученные хроматографией, анализировали SDS-электрофорезом в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) по стандартному методу (минипротеан II, BIORAD). Гель имел концентрацию 10-25%. Окрашивание осуществлялось Coomassie brilliant blue R-250 (фиг. 2 и 3).

Из фиг. 2 видно, что в элюате протеина А помимо антител содержатся еще другие протеины. После их иммобилизации (выделения на твердом носителе) они в состоянии связать из плазмы пациентов специфически соответствующие вещества, участвующие в реакции. В пике элюирования 2 (0,1 мол цитратный буфер, pH 2,2) после хроматографии по сродству (фиг. 1) можно идентифицировать несколько протеинов по методу PAGE. Кроме иммуноглобулинов и нескольких высокомолекулярных протеинов в элюате протеина А еще 3 протеина дают едва видимые линии, которые обнаруживаются по методу PAGE (фиг. 3). Они имеют молекулярную массу около 40 кД.

Пример 6. Хроматография по сродству плазмы пациента, страдающего рассеянным склерозом.

Обработка плазмы, элюирование протеина А и связывание протеина элюата осуществляли аналогично примеру 5. После вымывания связанных адсорбцией протеинов из иммуноадсорбента (1-й пик, фиг. 4) элюирующим буфером удаляли из матрицы специфически связанный протеин, который идентифицируется по методу PAGE как смесь протеинов, содержащая в основном иммуноглобулины.

Пример 7. Хроматография по сродству плазмы пациента, страдающего ревматоидным артритом.

Обработка плазмы, элюирование протеина А и связывание протеина элюата осуществляли аналогично примеру 5. После вымывания связанных адсорбцией протеинов из иммуноадсорбента (1-й пик, фиг. 6) элюирующим буфером удаляли из матрицы специфически связанный протеин, который по методу PAGE (фиг. 7) идентифицируется как смесь протеинов, содержащая в основном иммуноглобулины.

Пояснения к фиг. 1 - 7

Фиг. 1. Профилограмма элюирования плазмы пациента после адсорбции сефарозы 6FF, связанной в соответствии со стандартным методом с гомологичными антителами и антигенами.

Маркировки указывают обмен буфером при промывке и элюировании (загрузка колонки не указывается).

N 1 - промывной буфер, N 2-0.1 мол цитратный буфер pH 2,2.

Фиг. 2. PAGE элюата колонки протеина А до и после связывания с активированной ONB-карбонатом сефарозой.

N 1 и 2-5 или 10 мкл материала до связывания, N 3 - проводник 10 кД, N 4 - стандарт -глобулина, N 5-8 как 1-4, но после связывания (т.е. не связанный материал).

Фиг. 3. PAGE элюата, полученного из иммуносорбентной колонки после прохождения гомологичной плазмы при pH 2,2.

N 1-7 и 9-15 - фракции пика, N 8 и 17 - маркер протеина 10 кД, N 16 - дополнительная промывка.

Фиг. 4. Профограмма элюирования плазмы пациента после адсорбции на сефарозе 6FF, связанной стандартным методом с гомологичными антителами и антигенами.

Маркировки характеризуют обмен буфером при промывке и элюировании (загрузка колонки не указывается).

N 1 - промывной буфер, N 2-0,1 мол цитратный буфер, pH 2,2.

Фиг. 5. PAGE элюата, полученного из иммуносорбентной колонки после прохождения гомологичной плазмы при pH 2,2.

N 1 - стандарт 10 кД; N 2 - стандарт -глобулина, N 3 - фракция пика (2-й пик, илл. 4), N 4 - фракция пика после суживания с помощью amicon centrifree.

Фиг. 6. Профилограмма элюирования плазмы пациента после адсорбции на сефарозе 6FF, связанной стандартным методом с гомологичными антителами и антигенами.

Маркировки характеризуют замену буфера при промывке и элюировании (загрузка колонки не указывается).

N 1 - промывной буфер, N 2-0,1 мол цитратный буфер, pH 6,0/Твин, N 3 - 0,1 мол цитратный буфер, pH 2,2.

Фиг. 7. PAGE элюата, полученного из иммуносорбентной колонки после прохождения гомологичной плазмы при pH 2,2.

N 1-4 - протеины из промывного буфера, N 5, 6 - фракции пика (3-й пик, илл. 6), N 7 - стандарт 10 кД, N 8 - стандарт -глобулина.