способ получения твердофазного носителя для иммуноанализа

Формула изобретения

1. Способ получения твердофазного носителя, включающий обработку лунок микроячеистого планшета физиологически активным веществом, инкубирование и отмывку и последующую обработку блокирующим раствором, отличающийся тем, что часть лунок многоячеистого планшета используют для приготовления контрольных и калибровочных проб, физиологически активным веществом обрабатывают только дно лунок многоячеистого планшета, затем после обработки первым блокирующим раствором дно лунок обрабатывают вторым блокирующим раствором, содержащим коньюгат, сахарозу и сорбит, и высушивают при заданных условиях, причем в лунки, предназначенные для приготовления контрольных и калибровочных проб, дополнительно вносят известные концентрации искомых аналитов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве коньюгата используют специфичные к искомому аналиту антитела, меченые люминесцентным веществом с длительнозатухающей люминесценцией, например хелатами лантанидов или Pt и Pd комплексами металлопорфиринов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в лунки микроячеистого планшета, предназначенные для приготовления контрольных и калибровочных проб, растворы биологических жидкостей с заданной концентрацией искомых аналитов вносят одновременно со вторым блокирующим раствором.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в лунки микроячеистого планшета, предназначенные для приготовления контрольных и калибровочных проб, искомые аналиты в различных концентрациях вносят в виде сухих бумажных дисков после обработки дна лунок вторым блокирующим раствором и высушивания.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для совершенствования диагностики заболеваний человека.

В настоящее время существуют совершенные клинические анализаторы для химического, иммунохимического и биологического тестирования анализируемых образцов. Однако повышающиеся требования к уровням обслуживания в клинических лабораториях требуют усовершенствования технологии проведения анализов, которая должна быть более эффективной по стоимости (экономия реагентов для проведения анализов, снижение стоимости трудозатрат и т.п.) и обеспечивать более быстрое получение результатов анализов. Это позволяет вовремя предпринять необходимые меры для лечения пациентов, уменьшить длительность пребывания их в больнице, улучшить эффективность амбулаторного лечения. Эта задача решается как за счет модернизации аналитической аппаратуры, так и за счет совершенствования методов подготовки и проведения анализов.

Известен способ подготовки набора реагентов и микроячеистого планшета для проведения иммунолюминесцентного анализа (Набор для количественного определения тиротропина человека - ТТГ - в сыворотке и плазме, DELFIA hTSH, Wallac Oy, Финляндия, кат. N 1244-001). Сущность способа заключается в том, что внутреннюю поверхность лунок микроячеистого планшета сенсибилизируют антителами, реагенты и сухие пятна крови с калибровочными и контрольными пробами расфасовывают по флаконам или пластиковым пакетам и хранят до использования. При осуществлении анализа с использованием данного набора по заданной циклограмме растворы реагентов и анализируемых образцов вносят в лунки микроячеистого планшета и детектируют результаты анализа по сигналу люминесцентного метчика. Анализ осуществляют в объеме пробы, равной объему лунки планшета, так как только в этом случае может быть эффективно организован перевод люминесцирующего метчика в люминесцирующий комплекс.

Недостатком способа является необходимость хранения набора жидких реагентов в стеклянных флаконах, большой расход реагентов при проведении анализа, необходимость дозирования реагентов непосредственно при осуществлении анализа, одноразовое использование стеклянных флаконов.

Известен способ приготовления, длительного хранения и использования твердофазных носителей с реагентами для иммунологического анализа (WO 98/50792, класс МКИ G 01 N 33/543). Способ изготовления твердофазного носителя заключается в том, что поверхность иммуносорбента (дисков, колец, пластин) активируют известным способом таким образом, чтобы эта поверхность при проведении анализа могла связываться с антигенами, антителами и другими связывающими компонентами анализируемого образца. Иммуносорбент изготавливают из бумаги, полистирена, полиамида, нейлона и т.д. в большом количестве сразу и хранят в защищенном от воздуха контейнере при температуре 4^oC в течение двух лет. При осуществлении анализа диски помещают в лунки микротитровальных планшетов и проводят иммунологический анализ известным методом. Способ использования иммуносорбента отличается от известных способов тем, что иммунологическая реакция осуществляется на диске или на дне лунки. Остальные операции способа стандартны, требуют наличия жидких реагентов при осуществлении анализа, т.е. способ обладает теми же недостатками, что и описанный выше.

Известны способ получения твердофазного носителя с зафиксированным на нем физиологически активным веществом (ФАВ), способ его хранения и способ проведения иммунологического анализа с его использованием (ЕР N 0653635, класс МКИ G 01 N 33/52). Способ получения твердофазного носителя заключается в следующем. На водонерастворимое основание (носитель) наносят слой ФАВ, смешанного с водорастворимой смолой, либо на всю поверхность, либо в виде отдельных пятен, разделенных перфорацией. На носитель может быть нанесено несколько ФАВ: разные антигены, или антитела, меченые антитела, в том числе в различных разведениях для построения калибровочной кривой. Пластина носителя, целиком или разделенная на элементы, может сохранять свою активность длительное время при хранении в атмосфере инертного газа, в вакууме, в вакуумно-сушильном шкафу, в полиэтиленовом пакете и т.п. Иммуноанализ с твердофазным носителем подобного типа осуществляют, например, в микроячеистых планшетах традиционным способом, получая необходимые реагенты растворением пластин с ФАВ в буферном растворе. При этом определенную часть лунок планшета используют для приготовления реагента для построения калибровочной кривой. Использование готовых пластин с ФАВ позволяет существенно ускорить проведение анализов, так как исключает необходимость дозирования реагентов в процессе проведения исследований и позволяет получить различные концентрации антител без операции разведения. Отказ от стеклянных флаконов разового пользования для хранения реагентов позволяет удешевить способ получения твердофазного носителя.

Однако твердофазные носители, получаемые данным способом, не позволяют проводить экспрессный иммуноанализ, так как сохраняются все операции способа: сенсибилизация лунок планшета антителами или антигенами, отмывка, обработка блокирующим раствором и т.д.

Известен способ получения многослойного твердофазного носителя (тест-карты) для проведения иммуноанализа (патент США N 5120662, класс НКИ 436-530). Приготовление тест-карты осуществляется следующим образом. Для получения тест-карты используют материал с достаточно пористой поверхностью, которая после активации может ковалентно или гидрофобными силами связываться с антигенами или антителами. В материале носителя (тест-карты) выполняют углубления в виде круглых лунок, расположенных рядами. В лунки наносят различные антигены или антитела так, что исследуемый образец может быть одновременно протестирован на присутствие связывающих компонентов, специфичных к различным реагентам. Часть лунок содержит аналит для проведения положительного контроля, а часть лунок не содержит реагента, их используют для отрицательного контроля. В качестве индикаторных меток используют ферментные, люминесцентные (флуоресцентные), хемилюминесцентные и другие метки и в соответствии с использованными метками применяют ту или иную детектирующую систему. При изготовлении твердофазного носителя в лунки наносят микроколичества раствора антигенов или антител и высушивают при комнатной температуре. Затем в лунки наносят блокирующий раствор, инкубируют при постоянном встряхивании, отмывают, высушивают и хранят до использования при температуре 2 - 4^oC. С помощью твердофазного носителя, полученного таким способом, можно детектировать антигены или антитела вируса гепатита В, вируса гепатита С, цитомегаловируса, вируса герпеса простого и др.

Недостатком способа является то, что реагенты, необходимые для проведения иммунологического анализа (конъюгаты, буферы для их разведения, а также контрольные материалы и калибраторы), хранятся отдельно, что усложняет процедуру анализа и удорожает его.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита С (патент РФ N 2095815, класс МКИ G 01 N 33/543). Сущность способа заключается в том, что лунки полистиролового планшета, используемого в качестве твердофазного носителя, обрабатывают вирусспецифическим белком (ФАВ), инкубируют при заданной температуре, избыток ФАВ удаляют, промывают планшет фосфатным буфером и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Для снижения неспецифической сорбции на носителе после удаления раствора и высушивания лунки планшета обрабатывают 10% раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота. Затем планшет герметично запаивают в полиэтиленовые пакеты. Иммуносорбент (твердофазный носитель) с иммобилизованным антигеном сохраняет высокую специфическую активность более года.

Способ неэкономичен, так как для проведения анализа с активированным планшетом необходимо в составе диагностического набора иметь флаконы с контрольными и калибровочными материалами, что приводит к большому расходу реагентов, флаконов и упаковки.

Задачей является создание твердофазного носителя, пригодного для различных иммунолюминесцентных исследований.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является улучшение условий сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя, уменьшение расхода реагентов, тары и упаковочного материала, отсутствие процедуры дозирования реагентов при проведении анализов, что сокращает время проведения исследований и удешевляет как способ получения твердофазного носителя, так и способ проведения анализов с этим носителем.

Задача решается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения твердофазного носителя, включающего обработку лунок многоячеистого планшета физиологически активным веществом, инкубирование и отмывку и последующую обработку блокирующим раствором, часть лунок многоячеистого планшета используют для приготовления контрольных и калибровочных проб, физиологически активным веществом обрабатывают только дно лунок многоячеистого планшета, затем после обработки первым блокирующим раствором дно лунок обрабатывают вторым блокирующим раствором, содержащим конъюгат, сахарозу и сорбит, и высушивают при заданных условиях, причем в лунки, предназначенные для приготовления контрольных и калибровочных проб, дополнительно вносят известные концентрации искомых аналитов.

Сущность изобретения заключается также в том, что в качестве конъюгата используют специфичные к искомому аналиту антитела, меченные люминесцентным веществом с длительнозатухающей люминесценцией, например хелатами лантанидов или Pt и Pd комплексами металлопорфиринов.

Сущность способа заключается также в том, что в лунки микроячеистого планшета, предназначенные для приготовления контрольных и калибровочных проб, растворы биологических жидкостей с заданной концентрацией искомых аналитов вносят одновременно с внесением второго блокирующего раствора.

Сущность способа заключается также и в том, что в лунки микроячеистого планшета, предназначенные для приготовления контрольных и калибровочных проб, искомые аналиты в различных концентрациях вносят в виде сухих бумажных дисков после обработки лунок вторым блокирующим раствором и высушивания.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемой. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию новизны.

Использование части лунок планшета для проведения калибровочных и контрольных проб, нанесение реагентов только на дно лунок планшета и использование второго блокирующего раствора позволяют значительно уменьшить количество реагентов, используемых для проведения анализа, улучшить условия сохранения активности реагентов в течение длительного времени и достичь при использовании изобретения указанного выше технического результата. При этом использование вещества с длительно затухающей люминесценцией в качестве люминесцентной метки (хелаты лантанидов, Pt и Pd комплексы металлопорфиринов) в совокупности со всеми признаками позволяют сохранить высокую чувствительность иммунолюминесцентного анализа при значительно меньшем количестве используемых реагентов и исследуемого аналита по сравнению с известными способами получения твердофазных носителей и способами анализа. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники.

Твердофазный носитель, получаемый по предлагаемому способу, найдет широкое применение в здравоохранении, в частности, в клинических лабораториях, для проведения химического, иммунохимического и иммунологического анализа и может быть использован для детектирования широкого спектра маркеров соматических и инфекционных заболеваний - гормонов таких, как хорионический гонадотропин человека, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, стероидные и тиреоидные гормоны, антигены возбудителей бактериальных и вирусных инфекций и др. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию примышленной применимости.

Способ получения твердофазного носителя для иммуноанализа осуществляется следующим образом.

Пример 1. В каждую лунку 96-ячеистого полистиролового планшета (Фирма FluoroNunc^ТМ Modules, кат. N 444337915) вносят по 10 мкл физиологически активного вещества - моноклональных, специфических к -субъединице тиротропина, антител (Моноклональные антитела против тиротропина человека производства ЗАО "Иммуноскрин": клон N 1 (8Т6) и клон N 2 (9В4) в концентрации 10 мкГ/мл в растворе 0,1М фосфатного буфера и сенсибилизируют поверхность дна лунок планшета в течение 24 часов при температуре 20^oC. Удаляют с помощью автоматического или ручного промывателя (Промыватель Wellwash Ascent, фирма Labsystems, Финляндия, кат. N 5161000) избыток специфических антител. Вносят в ячейки планшета по 250 мкл блокирующего буфера, содержащего 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (Бычий сывороточный альбумин фирмы SIGMA, США, кат. N А2153) в 0,1М Трис- буфере. Планшет инкубируют в течение 1 часа при температуре 37^oC. Объем блокирующего буфера должен соответствовать объему лунки микропланшета. Удаляют несвязавшиеся компоненты буфера с помощью промывателя. Вносят в лунки по 10 мкл второго блокирующего раствора, который содержит конъюгат, меченные люминесцирующим комплексом европия антитела в концентрации 1 мкГ/мл, и защитные компоненты: сахарозу (Сахароза фирмы SIGMA, США, кат. N S7903) в концентрации 5% и сорбит (Сорбитол фирмы SIGMA, США, N 7547) в концентрации 0,6%. Конъюгат получают по методике Paik С.Н., Ebbert М. А. et.al. Factors influencing DTPA conjugation with antibodies by cyclic DTPA anhydride. //J. Nucl.Med. -1983. -Vol.24.-p. 1158-1163. Второй блокирующий раствор, предназначенный для внесения в лунки для приготовления калибровочных и контрольных проб, дополнительно содержит тиротропин (Тиротропин человека фирмы SIGMA, США, кат. N Т9265) в концентрации от 0,25 мкМЕ/мл (первая калибровочная проба) до 324 мкМЕ/мл (шестая калибровочная проба). Микропланшет высушивают при комнатной температуре в открытом виде на воздухе или в вакуум-сушильном шкафу в течение 24 часов, запаивают под вакуумом в пластиковые пакеты и хранят до использования.

Пример 2. Способ осуществляется так же, как описано в примере 1, только отличается тем, что в лунки для приготовления калибровочных и контрольных проб после внесения второго блокирующего раствора и его высушивания вносят бумажные диски диаметром 3 мм с сухими пятнами крови, содержащими известные концентрации тиротропина: от 1 мкМЕ/мл (первая калибровочная проба) до 250 мкМЕ/мл (шестая калибровочная проба). Калибровочные пробы пятен крови готовят на бумаге фирмы Schleicher & Schuell, кат. N 2992 путем нанесения 50 мкл крови с заданной концентрацией гормона и их подсушивания. В последующем из пятен крови выбиваются диски диаметром 3 мм, что эквивалентно 3 мкл крови.

Пример 3. Проведение анализа с использованием твердофазного носителя, полученного по предлагаемому способу.

В лунки планшета, не содержащие калибровочных и контрольных материалов к тиротропину, вносят исследуемые образцы сыворотки крови в объеме 10 мкл, а в лунки с калибраторами и контрольными материалами с заданной концентрацией тиротропина вносят водный раствор в том же объеме. Затем после инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре лунки планшета шесть раз промывают физиологическим раствором и регистрируют сигнал люминесценции от каждой ячейки на флуориметре с временным разрешением люминесценции Arcus 1232. По состоянию уровней сигналов в ячейках с контрольными и калибровочными материалами с помощью калибровочного графика рассчитывают концентрацию аналита в исследуемом образце.

Нанесение реагентов только на дно лунок микроячеистого планшета, использование второго блокирующего раствора, нанесение всех реагентов, необходимых для проведения анализа, в лунки планшета, с одной стороны, обеспечивают возможность длительного сохранения активности реагентов, экономный расход реагентов, тары и упаковки при проведении иммунологических исследований, а с другой стороны, отсутствие операций дозирования реагентов и их внесения в лунки во время проведения исследований позволяют проводить экспрессный анализ образцов при сохранении высокой чувствительности, которая достигается как за счет высокой концентрации реагентов и исследуемого аналита в тонком слое на дне лунок микроячеистого планшета, так и за счет использования веществ с длительнозатухающей люминесценцией в качестве люминесцентных меток.