производные 2,6-дигидрокси-4-аминометилбензоата

Формула изобретения

Производные 2,6-дигидрокси-4-аминометилбензоата формулы CI



где группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна от приблизительно 0 до приблизительно 6 атомов углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6 - 18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3 - 12 атомам углерода;

группа R₁ обозначает электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для вступления производного в реакцию с биологически активными компонентами и выбранным из группы, включающей такие фрагменты, как акриламид, аминогруппа, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфирный остаток, N-гидроксисульфосукцинимидный эфирный остаток, имидатный эфирный остаток, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид и тиол;

группа R₂ обозначает одну из таких групп, как алкильная группа и метиленовая группа, несущая электроотрицательный фрагмент с отрицательным дипольным моментом.

2. Соединение по п.1, где группу R₂ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как CH₃, CH₂CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂ и CH₂OCH₃.

3. Соединение по п.1, где группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)n, где n = 1 - 6.9

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США 08/188531, поданной 28 января 1994 г., по которой выдан патент США 5594151 и которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. Эта заявка также является продолжением заявок на патент США 08/188460, 08/188958 и 08/188176, каждая из которых подана 28 января 1994 г. и каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к получению биоконъюгатов, в частности к классу комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, пригодных для конъюгации биологических макромолекул, и к способу получения и применения таких реагентов.

Предпосылки создания изобретения

Биоконъюгация представляет собой процесс, позволяющий соединять молекулы двух или нескольких различных типов с помощью химического или биологического способов, когда по крайней мере молекула одного типа представляет собой биологическую макромолекулу. Это понятие включает, но не ограничивается ими, конъюгацию протеинов, пептидов, полисахаридов, гормонов, нуклеиновых кислот, липосом и клеток друг с другом или с любыми другими типами молекул, позволяя получать новые лекарства, радиоизотопы, токсины, гаптены, ингибиторы, хромофоры, флуорофоры, лиганды и т.д. с более широким набором полезных свойств. Иммобилизация биологических макромолекул также рассматривается как особый случай биоконъюгации, при котором макромолекулы конъюгируют, либо обратимо, либо необратимо, с нерастворимым носителем. Биоконъюгацию широко используют в биохимических, иммунохимических исследованиях и исследованиях по молекулярной биологии. Основными областями применения биоконъюгации являются обнаружение генных зондов, твердофазный иммуноферментный анализ, получение лекарств на основе моноклональных антител и получение изображений в медицинских целях.

Биоконъюгаты, как правило, классифицируют на прямые или непрямые. Под прямыми конъюгатами понимают таковые, в которых два или более компонентов соединены с помощью прямых ковалентных химических связей. Альтернативно этому под непрямыми конъюгатами понимают таковые, в которых два или более компонентов соединены через промежуточный комплекс, включающий биологические макромолекулы. Представленная в настоящем описании система в первую очередь обладает способностью образовывать непрямые конъюгаты вне зависимости от промежуточных биологических макромолекул.

Система авидин-биотин

Хотя в литературе и описаны многочисленные способы получения непрямых конъюгатов, значительная часть известных конъюгатов получена с помощью системы авидин-биотин, в которой специфическое связывание протеина авидина (очищенного из яичного белка) или стрептавидина (очищенного из бактерии Streptomyces avidini) с кофактором биотином (витамин H) используют для связи макромолекулы, конъюгированной с авидином, с биотинилированной макромолекулой. Авидин и стрептавидин несут по 4 сайта связывания с очень высокой аффиностью (К = 10¹⁵ моля^-1) к биотину.

Система авидин-биотин широко использовалась для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в котором конъюгат фермент-авидин (пригодный для обнаружения путем реакции с субстратом фермента с получением окрашенного или хемолюминисцентного продукта) применяют для обнаружения биотинилированного антитела после первого связывания антитела с иммобилизованным антигеном или гаптеном. Применение системы авидин-биотин широко представлено в большом количестве посвященных этой теме работ, которые в настоящее время обобщены в обзоре Wilchek М. и Bayer Е.А. (1990), Methods in Enzymology, 184.

Несмотря на интенсивное применение, известно несколько связанных с системой авидин-биотин ограничений, которые включают неспецифическое связывание, обычно обусловленное щелочными свойствами молекулы авидина, неспецифическое связывание, обусловленное присутствием углеводных остатков на молекуле авидина, и фоновые помехи, обусловленные присутствием эндогенного биотина, который повсеместно встречается как в эукариотичеаских, так и в прокариотических клетках.

Система дигоксигенин- -дигоксигенин

В настоящее время разработана альтернативная система непрямой биоконъюгации, предназначенная для преодоления некоторых ограничений, связанных с системой авидин-биотин, для обнаружения генных зондов с помощью ELISA (Kessler C. , Holtke H. - J., Seibl R., Burg J. и Muhlegger К. (1990) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, 917 - 965). Эта система предусматривает применение стероидного гаптена дигоксигенина, алкалоида, встречающегося исключительно в растениях сем. Digitalis, и Fab-фрагмента, выделенного из овечьих антител к дигоксигенину ( -дигоксигенин). Высокая специфичность различных антител в виде -дигоксигенина обусловливает низкие фоновые уровни и устраняет неспецифическое связывание, которое характерно для систем авидин-биотин. Меченные дигоксигенином ДНК- и РНК-зонды способствуют обнаружению с помощью Саузерн-блоттинга уникальных копий последовательностей в геноме человека. Данные о разработке системы дигоксигенин- -дигоксигенин в настоящее время обобщены у Kessler C. (1990) в Advances in Mutagenesis Research (под ред. Obe G.), стр. 105-152, Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg. Система дигоксигенин- -дигоксигенин представляет собой наиболее современную систему, характерную для нескольких систем гаптен-антитело, которые применяются в настоящее время для биоконъюгации.

Иммобилизованные фенилборонаты

Известно, что фенилбороновые кислоты взаимодействуют с широким спектром полярных молекул, которые имеют определенные необходимые функциональные группы. Известно, что комплексы различной стабильности, включающие 1,2-диолы, 1,3-диолы, 1,2-гидроксикислоты, 1,3-гидроксикислоты, 1,2-гидроксиламины, 1,3-гидроксиламины, 1,2-дикетоны и 1,3-дикетоны, образуются как с нейтральной фенилбороновой кислотой, так и с анионом фенилбороната. Вследствие этого иммобилизованные фенилбороновые кислоты применялись в качестве хроматографических носителей для селективного удерживания различных биологических образцов, молекулы которых имели необходимые функциональные группы. Многие важные биологические молекулы, включая углеводы, катехоламины, простагландины, рибонуклеозиды и стероиды, содержат необходимые функциональные группы и либо анализировались, либо очищались этим способом. Применение фенилбороновой кислоты в качестве хроматографической среды для выделения и разделения биологических молекул описано в нескольких обзорных работах (Singal R.P. и DeSilva S.S.M. (1992) Adv. Chromatog. 31, 295-335; Mazzeo J. R. и Krull 1.S. (1989) BioChromatog. 31, 293-335; Bergold А. и Scouten W. H. (1983) в Solid Phase Biochemistry (под ред. Scouten W. H.) стр. 149-187, John Wiley & Sons, New York).

Фенилбороновая кислота, подобно борной кислоте, представляет собой кислоту Льюиса и ионизируется не в результате прямого депротонирования, а путем гидрирования с получением тетраэдрного аниона фенилбороната (рК_a = 8,86). Фенилбороновая кислота в три раза сильнее борной кислоты. Ионизация фенилбороновой кислоты представляет собой важный фактор в комплексообразовании, поскольку в результате ионизации бор изменяет треугольную координацию (имеющую средние углы между связями 120^o и средние длины связей 1,37) на тетраэдрную координацию аниона (имеющую средние углы между связями 109^o и средние длины связей 1,48).

Известно, что молекулы, имеющие цис- или коаксиальные 1,2-диольные и 1,3-диольные функциональные группы, в частности углеводы, образуют комплексы с иммобилизованным анионом фенилбороната с образованием циклических сложных эфиров в щелочных водных условиях (Lorand J.P. и Edwards J.O. (1959) J. Org. Chem. 24, 769).

Известно далее, что подкисление комплексов на основе 1,2-диола и 1,3-диола до нейтрального значения pH приводит к высвобождению диолсодержащих молекул, вероятно вследствие гидролиза циклического сложного эфира. Известно также, что копланарные ароматические 1,3-диолы типа 1,8-дигидроксинафталина образуют комплекс даже в кислых условиях вследствие гидролитической стабильности шестичленных циклических эфиров бороновой кислоты (Sienkiewicz Р. А. и Roberts D. C. (1980) J. Inorg. Nucl. Chem. 42, 1559-1571). Также известно, что молекулы, содержащие в качестве функциональных групп подвешенные 1,2- гидроксиламин, 1,3-гидроксиламин, 1,2-гидроксиамид, 1,3- гидроксиамид, 1,2-гидроксиоксим и 1,3-гидроксиоксим, образуют обратимые комплексы с фенилболроновой кислотой в водных щелочных условиях, аналогичных таковым, которые связаны с сохранением диолсодержащих молекул (Tanner D.W. и Bruice T. C. (1967) J. Amer. Chem. Soc. 89, 6954).

Биоконъюгаты на основе фенилбороната

Орто-замещенные ацетамидофенилбороновые кислоты были предложены в качестве потенциальных линкеров для избирательной биоконъюгации через соседние диольные фрагменты углеводных остатков, связанных с гликопротеинами (Cai S. X. и Keana J.F.W. (1991) Bioconjugate Chem., 2, 317-322). Биоконъюгаты фенилбороновой кислоты, полученные из 3-изотиоцианатфенилборной кислоты, успешно применялись для присоединения комплексов диоксима технеция к моноклональным антителам для получения изображений в медицинских целях (Linder К. Е. , Wen M.D., Nowotnik D.P., Malley M.F. Gougoutas J.Z., Nunn A.D. и Eckelman W. C. (1991) Bioconjugate Chein. 2, 160- 170; Linder K.E. Wen M.D., Nowotnik D.P., Ramalingam K., Sharkey P.M. Yost F. Narra R.K. и Eckelman W.C. (1991) Bioconjugate Chem., 2, 407-414).

3-аминофенилбороновая кислота была ковалентно присоединена к протеинам с помощью различных химических методов, и полученные в результате биоконъюгаты фенилбороновой кислоты были изучены в отношении их связывания с D-сорбитом, D-маннозой и глицированным гемаглобином (GHb). Было установлено, что взаимосвязи являются обратимыми, и вследствие очень низкой аффинности биоконъюгаты имеют очень ограниченное практическое применение. Аналогично этому биоконъюгаты щелочной фосфатазы и фенилбороновой кислоты, которые пытались применять в ферментном анализе для обнаружения GHb, оказались неспособны выявить присутствие глицированного протеина (Frantzen F., Grirnsrud К., Heggli D. и Sundrehagen Е. (1995) Journal of Chromatography B, 670, 37-45).

Хотя иммобилизованные фенилборонаты использовали для хроматографического разделения биологических молекул, имеющих необходимые функциональные группы, несмотря на достаточное количество исследований биоконъюгации и достаточное число работ в этой области, избирательность фенилбороновой кислоты тем не менее не применялась достаточно успешно в целях конъюгации биологических макромолекул друг с другом или с другими типами молекул, которые расширяют спектр полезных свойств.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к новому классу комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, пригодных для получения биоконъюгатов, и к способу получения и применения таких реагентов. В одном из вариантов осуществления борсодержащее соединение представляет собой фенилбороновую кислоту или ее производные, которые образуют комплекс с комплексообразующими реагентами по настоящему изобретению. Если не указано иное, понятие "комплесообразующий реагент для фенилбороновой кислоты" в контексте настоящего описания включает более широкий класс комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, а понятие "фенилбороновая кислота" в контексте настоящего описания включает более широкий класс борсодержащих соединений, которые образуют комплекс с комплексообразующими реагентами для борсодержащих соединений. В отличие от известного применения систем авидин-биотин и дигоксигенин- -дигоксигенин согласно настоящему изобретению для облегчения химической конъюгации используются комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений вместе с борсодержащим соединением, такие как реагенты для фенилбороновой кислоты (многие из которых известны из уровня техники), без использования промежуточных биологических макромолекул. Получение биоконъюгатов часто включает конъюгацию протеинов, пептидов, полисахаридов, гормонов, нуклеиновых кислот, липосом и клеток, но не ограничено ими, друг с другом или с любыми другими типами молекул, позволяя получать лекарства, радиоизотопы, токсины, гаптены, ингибиторы, хромофоры, флуорофоры, лиганды, твердофазные носители и комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и т.д. с более широким набором полезных свойств. Эти различные компоненты, применяемые для получения биокоонъюгата, вместе и по отдельности обозначены ниже понятием "биологически активные компоненты" или "биоактивные компоненты".

Реагенты, пригодные для модификации биологически активных компонентов с целью включения комплексообразующего фрагмента для фенилбороновой кислоты и последующей конъюгации с различными (или с этими же) биологически активными компонентами с подвешенными фрагментами фенилбороновой кислоты, представлены общей формулой, которая обозначена как общая формула CI



Общая формула CI

В этой формуле группа R₁ обозначает реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для вступления в реакцию предполагаемого комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой составляет приблизительно 0-6 атомов углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена, несущего электроотрицательный заместитель.

Взаимодействие реагента общей формулы CI с биоактивными компонентами позволяет получить конъюгат с подвешенными комплексообразующими фрагментами для фенилбороновой кислоты (один или несколько) общей формулы CII



Общая формула CII

Символом BAS обозначены биологически активные компоненты (или биоактивные компоненты), которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента (который сам может иметь спейсер), применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту, или могут не содержать этот фрагмент. Следует отметить, что во многих вариантах осуществления несколько идентичных реагентов общей формулы CI могут реагировать с одной молекулой BAS. Например, если BAS представляет собой протеин, многие комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты могут реагировать с протеином, при этом каждый из них может вступать во взаимодействие с одним из нескольких сайтов на протеине, который является реакционноспособным для группы R₁. Группа Z в общей формуле CII обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой составляет приблизительно 0-6 атомов углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена, несущего электроотрицательный заместитель.

Реагент общей формулы CII также может реагировать с получением целого класса конъюгатов комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, например, реагентов с одним или с несколькими подвешенными комплексообразующими фрагментами для фенилбороновой кислоты общей формулы CIV



Общая формула CIV

В конъюгате общей формулы CIV группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3 - 12 атомам углерода. Группу R₃ выбирают из Н, алкила и метилена или этилена с электроотрицательным заместителем. В завершение символ BAS, как указано выше, обозначает биоактивные компоненты, которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов, или могут не содержать его.

Структуры общей формулы CIII и общей формулы CIV и способы их получения представлены в настоящем описании и являются объектом одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/689283, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и высокостабильные комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г. на имя Mark L. Stolowitz, Robert J. Kaiser и Kevin P. Lund и включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

Реагенты для фенилбороновой кислоты, многие из которых известны из уровня техники, а также те, которые описаны более подробно в одновременно рассматриваемой заявке на патент США 08/188958, озаглавленной "Комплекс на основе фенилбороновой кислоты для получения биоконъюгатов", поданной 28 января 1994 г. и включенной в настоящее описание в качестве ссылки, могут быть присоединены к биологически активным компонентам с получением конъюгата с подвешенными фрагментами фенилбороновой кислоты (один или несколько) общей формулы CV



Общая формула CV

где символ BAS^* обозначает вторые биоактивные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных через BAS. BAS^* также могут включать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты.

Конъюгат общей формулы CIV, имеющий по крайней мере один из биологически активных компонентов и содержащий подвешенные комплексообразующие фрагменты для фенилбороновой кислоты (один или несколько), может образовывать комплексы с конъюгатом общей формулы CV, полученным с участием вторых биоактивных компонентов BAS^* и имеющим подвешенные фрагменты фенилбороновой кислоты (один или несколько), с получением биоконъюгата общей формулы CVI



Общая формула CVI

где символы BAS и BAS^* и группы Z и R₃ имеют указанные выше значения. В этом случае биологические макромолекулы могут конъюгироваться друг с другом или с другими функциональными группами, которые придают продукту новые полезные свойства.

Биоконъюгаты общей формулы CVI могут быть получены в забуференном водном растворе или в органических растворителях. Биоконъюгаты образуются в течение нескольких минут в диапазоне температур приблизительно от 4^oC до 70^oC. На стабильность биоконъюгата в водном растворе при данных значении pH и температуре в значительной степени влияет заместитель группы R₃. Биоконъюгаты общей формулы CVI стабильны в водном растворе при приблизительных значениях pH не выше 3,5 и не ниже 10,5.

Реакция биоконъюгации (образование комплекса с фенилбороновой кислотой) нечувствительна к значительным изменениям ионной силы, к присутствию органических растворителей, к присутствию детергентов и к присутствию хаотропических агентов (агентов, денатурирующих протеины), что отличает ее от известных из уровня техники непрямых меченых систем, причем строение биологической макромолекулы должно сохраняться с целью сохранности необходимых характеристик связывания. Во многих случаях ограничения, налагаемые на образование биоконъюгатов с помощью представленной в настоящем описании системы, обусловлены ограничениями, налагаемыми условиями, необходимыми для сохранения жизнеспособности биоактивных компонентов.

В целом настоящее изобретение относится к комплексообразующим реагентам для борсодержащих соединений и способам синтеза этих реагентов. Эти реагенты, включая реагенты, представленные общей формулой CI и общей формулой CII, могут применяться после дополнительных реакций, представленных в настоящем описании, для образования комплексов с борсодержащими соединениями, такими как фенилбороновая кислота или ее производные.

Реагенты, пригодные для модификации биоактивных компонентов с целью включения комплексообразующего фрагмента для фенилбороновой кислоты и последующей конъюгации с различными (или с этими же) биологически активными компонентами с подвешенными фрагментами фенилбороновой кислоты, представлены общей формулой, которая обозначена как общая формула CIII



Общая формула CIII

В этой формуле группа R₁ обозначает реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для вступления в реакцию комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₃ выбирают из H, алкила и метилена или этилена с электроотрицательным заместителем.

Группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как H, CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂, CH₂CH₂OH и CH₂OCH₃. Когда группа R₃ обозначает H, группу R₁ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как акриламид, аминогруппа, дитиопиридил, гидразид, имидат, малеимид и тиол. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Взаимодействие реагента общей формулы CIII с биоактивными компонентами позволяет получить конъюгат с подвешенными комплексообразующими фрагментами для фенилбороновой кислоты (один или несколько) общей формулы CIV



Общая формула CIV

Символ BAS обозначает биологически активные компоненты (или биоактивные компоненты), которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента (который сам может иметь спейсер), применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту, или могут не содержать его. Следует отметить, что во многих вариантах осуществления несколько идентичных реагентов общей формулы CIII могут реагировать с одной молекулой BAS. Например, если BAS представляет собой протеин, многие комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты могут реагировать с протеином, при этом каждый из них может вступать во взаимодействие с одним из нескольких сайтов на протеине, который является реакционноспособным для группы RI.

Группа Z в общей формуле CIV обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₃ выбирают из одного из таких фрагментов, как H, алкил и метилен или этилен с электроотрицательным заместителем.

Структуры общих формул CI и CII и способы их получения представлены в настоящем описании и являются объектом одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/691230, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и высокостабильные комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г. на имя Mark L. Stolowitz, Robert J. Kaiser и Kevin P. Lund и включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

Реагенты для фенилбороновой кислоты, многие из которых известны из уровня техники, а также те, которые описаны более подробно в одновременно рассматриваемой заявке на патент США 08/188958, озаглавленной "Комплекс на основе фенилбороновой кислоты для получения биоконъюгатов", поданной 28 января 1994 г. и включенной в настоящее описание в качестве ссылки, могут быть присоединены к биологически активным компонентам с получением конъюгата, имеющего подвешенные фрагменты фенилбороновй кислоты (один или несколько) общей формулы CV



Общая формула CV

где символ BAS^* обозначает вторые биоактивные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных как BAS. BAS^* также могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты.

Конъюгат общей формулы CIV, имеющий по крайней мере один из биологически активных компонентов и содержащий подвешенные комплексообразующие фрагменты для фенилбороновой кислоты (один или несколько), может образовывать комплексы с конъюгатом общей формулы CV. полученным с участием вторых биоактивных компонентов BAS^* и имеющим подвешенные фрагменты фенилбороновой кислоты (один или несколько), с получением биоконъюгата общей формулы CVI



Общая формула CVI

где символы BAS и BAS^* и группы Z и R₃ имеют указанные выше значения. В этом случае, как это в общем виде показано на фиг. 1", биологические макромолекулы могут конъюгироваться друг с другом или с другими функциональными группами, которые придают продукту новые полезные свойства.

Биоконъюгаты общей формулы CVI могут быть получены в забуференном водном растворе или в органических растворителях. Биоконъюгаты образуются в течение нескольких минут в диапазоне температур приблизительно от 4^oC до 70^oC. На стабильность биоконъюгата в водном растворе при данных значении pH и температуре в значительной степени влияет заместитель группы R₃. Биоконъюгаты общей формулы CVI стабильны в водном растворе при приблизительных значениях pH не выше 2,5 и не ниже 12,5. Реакция биоконъюгации (образование комплекса с фенилбороновой кислотой) нечувствительна к значительным изменениям ионной силы, к присутствию органических растворителей, к присутствию детергентов и к присутствию хаотропических агентов (агентов, денатурирующих протеины), что отличает их от известных непрямых меченых систем, причем строение биологической макромолекулы должно сохраняться с целью сохранности необходимых характеристик связывания. Во многих случаях ограничения, налагаемые на образование биоконъюгатов с помощью представленной в настоящем описании системы, обусловлены ограничениями, налагаемыми условиями, необходимыми для сохранения жизнеспособности биоактивных компонентов.

В целом изобретение относится к комплексообразующим реагентам для борсодержащих соединений, комплексам на основе борсодержащих соединений и способам синтеза этих реагентов и комплексов. Эти реагенты и комплексы представляют собой реагенты и комплексы, представленные общими формулами CIII, CIV и CVI. В одном из вариантов осуществления реагент общей формулы CIII после конденсации с биоактивными компонентами (BAS) может применяться для получения реагента общей формулы CIV. Реагент общей формулы CIV может применяться для образования комплекса с борсодержащим соединением, такого как комплекс, представленный общей формулой CVI.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано применение предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы I и комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы III при получении конъюгатов общей формулы IV, которые в свою очередь могут использоваться для получения биоконъюгатов общей формулы VI.

На фиг. 2 показана общая схема получения алкил-4- и -5-аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы 1, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например, метил, этил, пропил и т.д. Алкил-4- и -5-аминометилсалицилаты также являются пригодными промежуточными продуктами для получения реагентов общей формулы III.

На фиг. 3 показана общая схема получения алкил-4- и -5-аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, например карбоксиметил, цианметил, метоксиметил и т.д.

На фиг. 4 показана общая схема получения алкил-4- и -5-аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы III, в которых R₃ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую или этиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент.

На фиг. 5 показана общая схема получения реагентов общих формул I и III, в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей фрагменты имидазолида, гидразида и N-гидроксисукцинимидного эфира.

На фиг. 6 показана общая схема получения реагентов общих формул I и III. в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей бром, хлор, йод, малеимид, динитропиридил и имидат.

На фиг. 7 показана общая схема получения реагентов общих формул I и III, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, a Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

На фиг. 1" показано применение предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CI и комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CIII при получении конъюгатов общей формулы IV, которые в свою очередь могут использоваться для получения биоконъюгатов общей формулы CVI.

На фиг. 2" показана общая схема получения алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил, пропил и т.д. Алкил-4- и -5-аминометилсалицилаты также являются пригодными промежуточными продуктами для получения реагентов общей формулы CIII.

На фиг. 3" показана общая схема получения алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, например карбоксиметил, цианметил, метоксиметил и т.д.

На фиг. 4" показана общая схема получения 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовых кислот, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CIII, в которых R₃ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую или этиленовую группу, несущую злектроотрицательный фрагмент.

На фиг. 5" показана общая схема получения реагентов общих формул CI и CIII, в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей фрагменты имидазолида, гидразида и N- гидроксисукцинимидного эфира.

На фиг. 6" показана общая схема получения реагентов общих формул CI и CIII, в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей бром, хлор, йод, малеимид, динитропиридил и имидат.

На фиг. 7" показана общая схема получения реагентов общих формул CI и CIII, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, a Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Подробное описание изобретения

Комплексообразующие реагенты и конъюгаты фенилбороновой кислоты, полученные из 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты

Этот раздел относится к классу комплексообразующих реагентов и конъюгатов фенилбороновой кислоты, полученных из 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты, и относится к фиг. 1-7. Реагенты и конъюгаты фенилбороновой кислоты, полученных из 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты, являются объектом одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/689341, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г., и одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/691929, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г. , номера дел патентного поверенного 81741.P005 и 81741.P006 соответственно. Приведенное в настоящем описании получение этих соединений позволяет более наглядно пояснить отличия этих соединений от новых соединений, представленных в настоящем описании. Предоставление данных о получении различных соединений из близкого семейства комплексообразующих реагентов и конъюгатов позволяет более полно охарактеризовать объем настоящего изобретения.

Общая схема трехстадийного процесса, в котором для получения биоконъюгатов используются реагенты общей формулы I, показана на фиг. 1. Сначала выбирают реагент общей формулы I, который включает пригодную реакционноспособную электрофильную или нуклеофильную группу R₁, способную реагировать с требуемыми биологически активными компонентами.

Общая формула I

Группа R₁ представляет собой реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для взаимодействия предлагаемого комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группу ₁ предпочтительно выбирают из таких фрагментов (не ограничиваясь только ими), как акриламид, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, имидат, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид, аминогруппа и тиол.

Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной, предпочтительно неразветвленной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена, несущего электроотрицательный заместитель. Электроотрицательный заместитель представляет собой заместитель с отрицательным дипольным моментом, например CN, COOH и т.д. Группу R₂ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как CH₃, CH₂CH₃, CH₂CN, CH₂COOH. CH₂CONH₂ и CH₂OCH₃.

Следующая стадия трехстадийного получения биоконъюгатов представляет собой конденсацию пригодного реагента с биоактивными компонентами с получением конъюгата общей формулы II



Общая формула II

В общей формуле II Z и R₂ имеют указанные выше значения, a BAS обозначает биологически активные компоненты, которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента (и любого спейсера), применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту, или могут не содержать его.

Затем конъюгат подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина общей формулы NH₂OR₃, где для R₃ выбирают любое из значений из группы, включающей H, алкил (например, метил, этил и т.д.), метилен и этилен с электроотрицательным фрагментом. Пригодными производными гидроксиламина являются (но не ограничиваясь ими) NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂ и NH₂OCH₂CH₂OH. Полученный в результате конъюгат имеет общую формулу, представленную общей формулой IV



Общая формула IV

В общей формуле IV группы Z и BAS имеют указанные выше значения, а для R₃ выбирают любое из значений из группы, включающей H, алкил и метилен с электроотрицательным заместителем.

Конъюгат общей формулы IV затем подвергают комплексообразованию с конъюгатом фенилбороновой кислоты общей формулы V



Общая формула V

где символ BAS^* обозначает вторые биологически активные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных через BAS в комлексообразующем реагенте, BAS^* также могут включать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту фенилбороновой кислоты. Комлексообразование приводит к получению стереоизомерного комплекса (примерно тетраэдрный бор) общей формулы VI



Общая формула VI

Синтез предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы I



Общая формула I

Реагенты общей формулы I являются производными либо 4-, либо 5-метилсалициловой кислоты. В каждом случае реагент в конечном итоге получают из синтетического промежуточного продукта, который представляет собой либо алкил-4-, либо -5-аминометилсалицилат.

На фиг. 2 показана общая схема получения алкил-4- и -5-амипометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил и т. д. На фиг. 2 показан пример, в котором R₂ обозначает метильную группу. Сначала на стадии 1 либо 4-, либо 5-метилсалициловую кислоту этерифицируют с получением соответствующего алкил-4- и-5-аминометилсалицилата. На стадии 2 эфир бромируют с помощью N-бромсукцинимида и перекиси бензоила в качестве катализатора, получая соответствующий бензилбромид. На стадии 3 бензилбромид алкилируют с помощью азида натрия, получая соответствующий бензилазид. В завершение на стадии 4 бензилазид подвергают гидрированию с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина.

На фиг. 3 показана общая схема получения промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает метилен, несущий электроотрицательный фрагмент, например карбоксиметил-, ацетамидометил- и цианметил- 4- или -5-аминометилсалицилат. Очевидно, что другие возможные заместители группы R₂ могут быть получены с помощью аналогичного синтеза.

Сначала на стадии 1 по фиг. 3 алкил-4- или -5-аминометилсалицилат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2, подвергают взаимодействию с ди-трет-бутилдикарбонатом и триэтиламином (ТЭА) в метаноле, получая соответствующий замещенный метил-М-(трет-бутоксикарбонил)аминометилсалицилат. На стадии 2 метиловый эфир расщепляют путем взаимодействия с триметилсиланолатом калия и, работая в водной кислоте, получают соответствующую салициловую кислоту. На стадии 3 салициловую кислоту алкилируют путем взаимодействия либо с -галоидкислотой, -галоидацетамидом, либо с -галоидацетонитрилом и триэтиламином (ТЭА), получая соответствующий карбоксиметиловый, ацетамидометиловый или цианметиловый эфир соответственно. В завершение на стадии 4 N-(трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводным HCl в тетрагидрофуране, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина.

Другой реагент по настоящему изобретению, который представляет собой амид акриловой кислоты и аминометилсалицилата, может быть получен в одну стадию с использованием конечного продукта реакции, схема которой представлена на фиг. 3, путем конденсации ангидрида акриловой кислоты или акрилоилхлорида с аминометилсалицилатом.

На фиг. 5 показана общая схема получения реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил, либо метилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а значение группы R₁ выбирают из любого фрагмента, такого как имидазолид, гидразид и N-гидроксисукцинимидный эфир. Каждый из этих реагентов получают с помощью двухстадийного процесса, в котором на первой стадии используют ангидрид алифатической кислоты. Сначала алкил-4- или - 5-аминометилсалицилат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, конденсируют с ангидридом алифатической кислоты, предпочтительно выбранным из любого из таких ангидридов (но не ограничиваясь ими), как сукциновый ангидрид, глутаровый ангидрид, малеиновый ангидрид и ангидрид гликолевой кислоты, в апротонном органическом растворителе, что приводит к введению спейсера (группа Z), имеющего свободный концевой фрагмент карбоновой кислоты. В случае когда ангидрид алифатической кислоты в этой реакции конденсации представлен малеиновым ангидридом, образовавшаяся группа Z является ненасыщенной, т.к. она содержит алкеновую группу. Затем фрагмент карбоновой кислоты дополнительно функционализуют путем взаимодействия либо с N,N-карбонилдиимидазолом, изобутилхлорформиатом и трет-бутилкарбазидом, либо с N,N- дициклогексилкарбодиимидом (ДЦК) и N-гидроксисукцинимидом (N-ГС), получая соответствующий имидазолил, защищенный гидразид и N- гидроксисукцинимидный эфир соответственно. В случае защищенного гидразида N-(трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводной соляной кислотой.

На фиг. 6 показана общая схема синтеза реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил. либо метилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а значение группы R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как акриламид, бромацетамид, хлорацетамид, малеимид, дитиопиридил и имидат. Реагенты общей формулы I, в которых группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром и хлор, получают конденсацией алкил-4- или -5- аминометилсалицилата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, либо с ангидридом бромуксусной кислоты, либо хлоруксусной кислоты соответственно. Гомологичный йодсодержащий реагент получают путем галоидного замещения хлорсодержащего реагента с помощью йодида натрия. Реагенты общей формулы I, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, йод, бромацетамид, хлорацетамид и йодацетамид, как правило, не могут быть получены, когда R₃ обозначает H, вследствие возможного внутримолекулярного алкилирования незащищенного гидроксамата. Реагенты общей формулы I, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как малеимид и дитиопиридил, получают конденсацией алкил-4- или -5- аминометилсалицилата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатического карбонового эфира, который несет концевой фрагмент либо малеимида, либо дитиопиридила. Реагент общей формулы I, в котором R₁ обозначает имидат, получают с помощью двухстадийного процесса, в котором алкил-4- или -5-аминометилсалицилат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, сначала конденсируют с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатического карбонового эфира, который несет концевой фрагмент нитрила. Затем нитрильный фрагмент превращают в метилимидат взаимодействием с безводным хлористым водородом в метаноле при 0^oC.

Реагенты общей формулы I, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как N-гидроксисукцинимидный эфир и дитиопиридил, могут использоваться в качестве промежуточных продуктов синтеза для получения реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы I, в которых R₁ обозначает фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы R₁-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z. обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидом или дисульфидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы I, содержащие фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира и предпочтительно полученные из дикарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, ацетилендикарбоновая кислота и глутаровая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы HO₂C-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений (но не ограничиваясь ими), как глицин, -аланин, аминопропиоловая кислота, 4-аминомасляная кислота и 6-аминокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагентов общей формулы I, в которых R₁, обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, а Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом, показана на фиг. 7.

Реагенты общей формулы I, в которых R₁ обозначает фрагмент дитиопиридила, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевые тиольные фрагменты общей формулы R₁-Z₂-SH, где Z_z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы I, содержащие фрагмент дитиопиридила и предпочтительно полученные из меркаптокарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6-меркаптокапроновая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевой тиольный фрагмент общей формулы HO₂C-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6-меркаптокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагентов общей формулы I, в которых R₁ обозначает N- гидроксисукцинимидный эфир, а Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом, показана на фиг. 7.

Реагенты общей формулы I, в которых Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода, получают путем конденсации алкил-4- или -5- аминометилсалицилата, полученного согласно общей схеме по фиг. 2 или 3, с полиэтиленгликолевым реагентом, содержащим как фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, так и любой из реакционноспособных электрофильных или нуклеофильных фрагментов (или его защищенный предшественник), многие из которых имеются в продаже, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода.

Синтез комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы III



Общая формула III

На фиг. 4 показана общая схема получения 4- и 5-аминометилсалицилгидроксамовых кислот, которые являются промежуточными продуктами синтеза, проводящего к получению реагентов общей формулы III, в которых R³ обозначает один из таких радикалов, как алкил или метилен, несущий электроотрицательный фрагмент. Сначала на стадии 1 алкил-4- или - 5-аминометилсалицилат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2, конденсируют с N-(бензилоксикарбонил)оксисукцинимидом, получая защищенный алкил-N-бензилоксикарбонилом 4- или 5-аминометилсалицилат. На стадии 2 фенольный гидроксильный фрагмент конденсируют с бензилбромидом, получая промежуточный продукт, представляющий собой дополнительно защищенный бензиловый эфир. На стадии 3 алкиловый эфир избирательно расщепляют путем реакции с LiOH, получая соответствующую карбоновую кислоту. На стадии 4 карбоновую кислоту активируют взаимодействием с изобутилхлорформиатом, получая смешанный ангидрид, который затем подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина, предпочтительно выбранного из группы, включающей любой из таких радикалов (но не ограничиваясь ими), как NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH и NH₂OCH₂OCH₃, получая соответствующую защищенную гидроксамовую кислоту. В завершение на стадии 5 и у амина и у фенольного гидроксильного фрагмента одновременно удаляют защитные группы с помощью гидрирования с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая гидрохлорид соответствующей 4- или 5-аминометилсалицилгидроксамовой кислоты. Эти промежуточные продукты синтеза, которые структурно близки к соответствующим алкил-4- или -5-аминометилсалицилатам, могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5 или 6, с получением реагентов общей формулы III.

Получение комплексообразующих конъюгатов для фенилбороновой кислоты общей формулы IV

На этой стадии предлагаемые комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы I могут быть подвергнуты взаимодействию с пригодными биологически активными компонентами с поручением конъюгата общей формулы II



Общая формула II

Затем конъюгат общей формулы II конденсируют с производным гидроксиламина, получая соответствующий комплексообразующий конъюгат для фенилбороновой кислоты общей формулы IV



Общая формула IV

Пригодные производные гидроксиламина предпочтительно выбирают из таких радикалов (но не ограничиваясь ими), как NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH, NH₂OCH₂OCH₃. Когда группа R₂ в общей формуле II обозначает алкильную группу, для осуществления взаимопревращения соединения общей формулы II в соединение общей формулы IV предпочтительно используют NH₂OH.

В альтернативном варианте конъюгаты общей формулы IV также могут быть получены способом, приведенном на фиг. 1, в котором используется реагент общей формулы III



Общая формула III

Комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы III могут быть подвергнуты взаимодействию с биологически активными компонентами с получением конъюгата общей формулы IV



Общая формула IV

Общая схема двухстадийного процесса, в котором используются реагенты общей формулы III для получения биоконъюгатов, показана на фиг. 1. Сначала выбирают реагент общей формулы III, который включает пригодную реакционноспособную электрофильную или нуклеофильную группу ₁, способную реагировать с требуемыми биологически активными компонентами.

Общая формула III

Группа R₁ представляет собой реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для взаимодействия комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группу R₁ предпочтительно выбирают из таких фрагментов (но не ограничиваясь ими), как акриламид, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, имидат, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид, аминогруппа и тиол.

Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной, предпочтительно неразветвленной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенными или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Для группы R₃ выбирают любое значение из группы, включающей H, алкил и метилен или этилен с электроотрицательным заместителем.

Группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как H, CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂, CH₂CH₂COH и CH₂OCH₃. Когда R₃ обозначает H, группу R₁ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как акриламид, аминогруппа, дитиопиридил, гидразид, имидат, малеимид и тиол.

Реагент общей формулы III затем конденсируют с биоактивными компонентами, получая конъюгат общей формулы IV



Общая формула IV

где группы Z и BAS имеют указанные выше значения, a R₃ выбирают из одного из таких фрагментов, как H, алкил и метилен или этилен с электроотрицательным заместителем.

Затем конъюгат общей формулы IV подвергают комплексообразованию с конъюгатом фенилбороновой кислоты общей формулы V



Общая формула V

где символ BAS^* обозначает вторые биологически активные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных как BAS в комплексообразующем реагенте. BAS^* также могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты. Комплексообразование приводит к получению стереоизомерного комплекса (тетраэдрный бор) общей формулы VI



Общая формула VI

Общая схема альтернативного трехстадийного процесса, в котором используются реагенты общей формулы I для получения биоконъюгатов, показана на фиг. 1. Сначала выбирают реагент общей формулы I, который включает пригодную реакционноспособную электрофильную или нуклеофильную группу ₁, способную реагировать с требуемыми биологически активными компонентами.

Общая формула I

Группа R₁ представляет собой реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для взаимодействия предлагаемого комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группу ₁ предпочтительно выбирают из таких фрагментов (но не ограничиваясь ими), как акриламид, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, имидат, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид, аминогруппа и тиол.

Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной, предпочтительно неразветвленной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена или этилена, несущего электроотрицательный заместитель. Электроотрицательный заместитель представляет собой заместитель с отрицательным дипольным моментом, например, CN, COOH и т.д. Группу R₂ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как CH₃, CH₂CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂ и CH₂OCH₃.

Следующая стадия трехстадийного получения биоконъюгатов представляет собой конденсацию пригодного реагента с биоактивными компонентами с получением конъюгата общей формулы II



Общая формула II

В общей формуле II Z, BAS и R₂ имеют указанные выше значения.

Затем конъюгат подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина общей формулы NH₂OR₃, где R₃ выбирают либо из H, алкила (например, метила, этила и т. д.), либо из метилена или этилена с электроотрицательным заместителем. Пригодные производные гидроксиламина включают (но не ограничиваясь ими) NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂ и NH₂OCH₂CH₂OH.

Полученный в результате конъюгат имеет общую формулу IV



Общая формула IV

В общей формуле IV группы Z и BAS имеют указанные выше значения, а R₃ выбирают из одного из таких фрагментов, как H, алкил и метилен или этилен, несущий электроотрицательный заместитель.

Конъюгат общей формулы IV затем подвергают комплексообразованию с конъюгатом фенилбороновой кислоты общей формулы V



Общая формула V

где символ BAS^* обозначает вторые биологически активные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных как BAS в комлексообразующем реагенте. BAS^* также могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты. Комлексообразование приводит к получению стереоизомерного комплекса (тетраэдрный бор) общей формулы VI



Общая формула VI

Синтез комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы III



Общая формула III

Реагенты общей формулы III являются производными либо 4-, либо 5-метилсалициловой кислоты. В каждом случае реагент в конечном итоге получают из синтетического производного, который представляет собой либо алкил-4-, либо -5-аминометилсалицилат.

На фиг. 2 показана общая схема получения алкил-4- и -5- аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы III, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил и т. д. На фиг. 2 показан пример, в котором R₂ обозначает метильную группу. Сначала на стадии 1 либо 4-, либо 5-метилсалициловую кислоту этерифицируют с получением соответствующего алкил-4- и -5- аминометилсалицилата. На стадии 2 эфир бромируют с помощью N- бромсукцинимида (N-БС) и перекиси бензоила в качестве катализатора, получая соответствующий бензилбромид. На стадии 3 бензилбромид алкилируют с помощью азида натрия, получая соответствующий бензилазид. В завершение на стадии 4 бензилазид подвергают гидрированию с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина.

На фиг. 4 показана общая схема получения 4- и 5- аминометилсалицилгидроксамовых кислот, которые являются промежуточными продуктами синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы III, в которых R₃ обозначает один из таких радикалов, как алкил или метилен либо этилен, несущий электроотрицательный фрагмент. Сначала на стадии 1 алкил-4- или - 5-аминометилсалицилат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2, конденсируют с N-(бензилоксикарбонил) оксисукцинимидом, получая защищенный алкил-N-бензилоксикарбонилом 4- или 5-аминометилсалицилат. На стадии 2 фенольный гидроксильный фрагмент конденсируют с бензилбромидом, получая промежуточный продукт, представляющий собой дополнительно защищенный салициловый эфир. На стадии 3 алкиловый эфир избирательно расщепляют путем реакции с LiOH, получая соответствующую салициловую кислоту. На стадии 4 салициловую кислоту активируют взаимодействием с изобутилхлорформиатом, получая смешанный ангидрид, который затем подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина, предпочтительно выбранного из группы, включающей любой из радикалов (но не ограничиваясь ими) NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH и NH₂OCH₂OCH₃, получая соответствующую защищенную гидроксамовую кислоту. В завершение на стадии 5 и у амина, и у фенольного гидроксильного фрагмента одновременно удаляют защитные группы с помощью гидрирования с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая гидрохлорид соответствующей 4- или 5- аминометилсалицилгидроксамовой кислоты.

Другой реагент по настоящему изобретению, который представляет собой амид акриловой кислоты и аминометилсалицилгидроксамовой кислоты, может быть получен с помощью одностадийного процесса с использованием конечного продукта, приведенного на фиг. 4, путем конденсации ангидрида акриловой кислоты или акрилоилхлорида с аминометилсалицилгидроксамовой кислотой при условии, что ₃ не обозначает H.

На фиг. 5 показана общая схема синтеза реагентов общей формулы III, в которых группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как H, CH₃ и метилен или этилен с электроотрицательным фрагментом, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как имидазолид, гидразид и N-гидроксисукцинимидный эфир. Каждый из этих реагентов получают с помощью двухстадийного процесса, в котором на первой стадии используют ангидрид алифатической кислоты. Сначала 4- или -5-аминометилсалицилгидроксамовую кислоту, полученную согласно общей схеме по фиг. 4, конденсируют с ангидридом алифатической кислоты, предпочтительнее выбранным из любого из таких ангидридов (но не ограничиваясь ими), как сукциновый ангидрид, глутаровый ангидрид, малеиновый ангидрид и ангидрид гликолевой кислоты, в апротонном органическом растворителе, что приводит к введению спейсера (группа Z), имеющего свободный концевой фрагмент карбоновой кислоты. В случае когда ангидрид алифатической кислоты в этой реакции конденсации представлен малеиновым ангидридом, образовавшаяся группа Z является ненасыщенной, т.к. она содержит алкеновую группу. Затем фрагмент карбоновой кислоты дополнительно функционализуют путем взаимодействия либо с N,N-карбонилдиимидазолом, изобутилхлорформиатом и трет-бутилкарбазидом, либо с N,N- дициклогексилкарбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом, получая соответствующий имидазолид, защищенный гидразид и N- гидроксисукцинимидный эфир соответственно. В случае защищенного гидразида N-(трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводной соляной кислотой.

На фиг. 6 показана общая схема синтеза реагентов общей формулы III, в которых группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как H, CH₃ и метилен или этилен с электроотрицательным фрагментом, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, малеимид, дитиопиридил и имидат. Реагенты общей формулы III, в которых группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром и хлор, получают конденсацией алкил-4- или -5-аминометилсалицилгидроксамовой кислоты, полученной согласно общей схеме по фиг. 4, либо с ангидридом бромуксусной кислоты, либо хлоруксусной кислоты соответственно. Гомологичный йодсодержащий реагент получают путем галоидного замещения хлорсодержащего реагента с помощью йодида натрия. Реагенты общей формулы III, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, йод, бромацетамид, хлорацетамид и йодацетамид, как правило, не могут быть получены, когда R₃ обозначает H, вследствие возможного внутримолекулярного алкилирования незащищенного гидроксамата. Реагенты общей формулы III, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как малеимид и дитиопиридил, получают конденсацией 4- или 5-аминометилсалицилгидроксамовой кислоты, полученной согласно общей схеме по фиг. 4, с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатиченского карбонового эфира, который несет концевой фрагмент либо малеимида, либо дитиопиридила. Реагенты общей формулы III, в которых R₁ обозначает имидат, получают с помощью двухстадийного процесса, в котором 4-или 5-аминометилсалицилгидроксамовую кислоту, полученную согласно общей схеме по фиг. 4, сначала конденсируют с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатического карбонового эфира, который несет концевой фрагмент нитрила. Затем нитрильный фрагмент превращают в метилимидат взаимодействием с безводной соляной кислотой в метаноле при 0^oC.

Реагенты общей формулы III, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как N-гидроксисукцинимидный эфир и дитиопиридил, могут использоваться в качестве промежуточных продуктов синтеза реагентов общей формулы III, в которых Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы III, в которых R₁ обозначает фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы R₁-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, с получением реагентов общей формулы III, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы III, содержащие фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира и предпочтительно полученные из дикарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, ацетилендикарбоновая кислота и глутаровая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы HO₂C-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений, как глицин, -аланин, аминопропиоловая кислота, 4-аминомасляная кислота и 6-аминокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5, с получением реагентов общей формулы III, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагента общей формулы III, в котором R₁ обозначает N- гидроксисукцинимидный эфир, а Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом, показана на фиг. 7.

Реагенты общей формулы III, в которых R₁ обозначает фрагмент дитиопиридила, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевые тиольные фрагменты общей формулы R₁-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы III, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним из промежуточных дисульфидных фрагментов.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы III, содержащие фрагмент дитиопиридила и предпочтительно полученные из меркаптокарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6- меркаптокапроновая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевой тиольный фрагмент общей формулы HO₂C-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6-меркаптокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5, с получением реагентов общей формулы III, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагента общей формулы III, в котором ₁ обозначает N- гидроксисукцинимидный эфир, a Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом, показана на фиг. 7.

Реагенты общей формулы III, в которых Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3- 12 атомам углерода, получают путем конденсации 4- аминометилсалицилгидроксамовой кислоты, полученной согласно общей схеме, приведенной на фиг. 4, с полиэтиленгликолевым реагентом, содержащим как фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, так и любой из реакционноспособных электрофильных или нуклеофильных фрагментов (или его предшественника), многие из которых имеются в продаже, с получением реагентов общей формулы III, в которых группа Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода.

Синтез предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы I



Общая формула I

Реагенты общей формулы I являются производными либо 4-, либо 5-метилсалициловой кислоты. В каждом случае реагент в конечном итоге получают из синтетического промежуточного продукта, представляющего собой либо алкил-4-, либо 5-аминометилсалицилат.

На фиг. 2 показана общая схема получения алкил-4- и -5-аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил и т. д. На фиг. 2 показан пример, в котором R₂ обозначает метильную группу. Сначала на стадии I либо 4-, либо 5-метилсалициловую кислоту этерифицируют с получением соответствующего алкил-4- и -5- аминометилсалицилата. На стадии 2 эфир бромируют с помощью N- бромсукцинимида и перекиси бензоила в качестве катализатора, получая соответствующий бензилбромид. На стадии 3 бензилбромид алкилируют с помощью азида натрия, получая соответствующий бензилазид. В завершение на стадии 4 бензилазид подвергают гидрированию с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина.

На фиг. 3 показана общая схема получения промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает метилен или этилен, несущий электроотрицательный фрагмент, например, карбоксиметил-, ацетамидометил- и цианметил-4- или -5-аминометилсалицилат. Очевидно, что с помощью аналогичного синтеза могут быть получены и другие возможные заместители группы R₂. Сначала на стадии 1 по фиг. 3 алкил-4- или -5- аминометилсалицилат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2, подвергают взаимодействию с ди-трет-бутилдикарбонатом и триэтиламином в метаноле, получая соответствующий замещенный метил-N-(трет-бутоксикарбонил)аминометилбензоат. На стадии 2 метиловый эфир расщепляют путем взаимодействия с триметилсиланолатом калия и, работая в водной кислоте, получают соответствующую бензойную кислоту. На стадии 3 бензойную кислоту алкилируют путем взаимодействия либо с c -галоидкислотой, - галоидацетамидом, либо с -галоидацетонитрилом и триэтиламином, получая соответствующий карбоксиметиловый, ацетамидометиловый или цианметиловый эфир соответственно. В завершение на стадии 4 N- (трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводным HCl в тетрагидрофуране, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина. В случае защищенного гидразида 4 N-(трет- бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием реагента с безводной соляной кислотой.

На фиг. 5 показана общая схема синтеза реагентов общей формулы I, и которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил, либо метилен или этилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а группу R₁, выбирают из любого такого фрагмента, как имидазолид, гидразид и N-гидроксисукцинимидный эфир. Каждый из этих реагентов получают с помощью двухстадийного процесса, в котором на первой стадии используют ангидрид алифатической кислоты. Сначала алкил-4- или -5-аминометилсалицилат. полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, конденсируют с ангидридом алифатической кислоты, предпочтительно выбранным из любого из таких ангидридов (но не ограничиваясь ими), как сукциновый ангидрид, глутаровый ангидрид, малеиновый ангидрид и ангидрид гликолевой кислоты, в апротонном органическом растворителе, что приводит к введению спейсера (группа Z), имеющего свободный концевой фрагмент карбоновой кислоты. Затем фрагмент карбоновой кислоты дополнительно функционализуют путем взаимодействия либо с N,N-карбонилдиимидазолом, изобутилхлорформиатом и трет- бутилкарбазидом, либо с N,N-дициклогексилкарбодиимидом и N- гидроксисукцимидом, получая соответствующий имидазолид, защищенный гидразид и N-гидроксисукцинимидный эфир соответственно.

На фиг. 6 показана общая схема синтеза реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил, либо метилен или этилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, малеимид, дитиопиридил и имидат. Реагенты общей формулы I в которых группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром и хлор, получают конденсацией алкил-4- или -5-аминометилсалицилата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, либо с ангидридом бромуксусной кислоты, либо хлоруксусной кислоты соответственно. Гомологичный йодсодержащий реагент получают путем галоидного замещения хлорсодержащего реагента с помощью йодида натрия. Реагенты общей формулы I, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, йод, бромацетамид, хлорацетамид и йодацетамид, как правило, не могут быть получены, когда R₃ обозначает H, вследствие возможного внутримолекулярного алкилирования незащищенного гидроксамата. Реагенты общей формулы I, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как малеимид и дитиопиридил, получают конденсацией алкил-4- или -5-аминометилсалицилата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатического карбонового эфира, который несет концевой фрагмент либо малеимида, либо дитиопиридила. Реагент общей формулы I, в котором R₁ обозначает имидат, получают с помощью двухстадийного процесса, в котором алкил-4- или -5-аминометилсалицилат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, сначала конденсируют с N- гидроксисукцинимидным эфиром алифатиченского карбонового эфира, который несет концевой фрагмент нитрила. Затем нитрильный фрагмент превращают в метилимидат взаимодействием с безводной соляной кислотой в метаноле при 0^oC.

Реагенты общей формулы I, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как дитиопиридил, имидазолид и N-гидроксисукцинимидный эфир, могут использоваться в качестве промежуточных продуктов синтеза для поручения реагентов общей формулы I, имеющих удлиненные спейсеры, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы I, в которых группу R выбирают из любого такого фрагмента, как имидазолид и N-гидроксисукцинимидный эфир, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы R₁-Z"-NH₂, где Z" обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом. Следует отметить, что Z" на фиг. 7 обозначена как Z₂.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы I, в которых группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как имидазолид и N-гидроксисукцинимидный эфир, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы H₂N-Z"-COOH, где Z" обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений (но не ограничиваясь ими), как глицин, -аланин, аминопропиоловая кислота, 4- аминомасляная кислота и 6-аминокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5, с получением реагентов общей формулы 1, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом.

Реагенты общей формулы I, в которых R₁ обозначает фрагмент дитиопиридила, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевые тиольные фрагменты общей формулы R₁-Z"-SH, где Z" обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы I, в которых R₁ обозначает фрагмент дитиопиридила, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевой тиольный фрагмент общей формулы HS-Z"-COOH, где Z" обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением соединений, имеющих свободный концевой фрагмент карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы I, в которых Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода, получают путем конденсации алкил-4- или -5-аминометилсалицилата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2 или 3, с полиэтиленгликолевым реагентом, содержащим как фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, так и любой из реакционноспособных электрофильных или нуклеофильных фрагментов (или его предшественник), многие из которых имеются в продаже, с получением реагентов общей формулы I, в которых группа Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода.

Получение комплексообразующих конъюгатов для фенилбороновой кислоты общей формулы IV

На этой стадии комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы III могут быть подвергнуты взаимодействию с пригодными биологически активными компонентами с получением конъюгата общей формулы IV



Общая формула IV

В альтернативном варианте предлагаемые комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы I могут быть подвергнуты взаимодействию с пригодными биологически активными компонентами с получением конъюгата общей формулы II



Общая формула II

Затем конъюгат общей формулы II конденсируют с производным гидроксиламина, получая соответствующий комплексообразующий конъюгат для фенилбороновой кислоты общей формулы IV



Общая формула IV

Пригодные производные гидроксиламина предпочтительно выбирают из таких радикалов (но не ограничиваясь ими), как NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH, NH₂OCH₂OCH₃. Когда группа R₂ в общей формуле II обозначает алкильную группу, для осуществления взаимопревращения соединения общей формулы II в соединение общей формулы IV предпочтительно используют NH₂OH.

Получение биоконъюгатов общей формулы VI

Биоконъюгаты общей формулы VI могут быть получены в забуференном водном растворе или в органических растворителях. Предпочтительными буферами являются ацетат, цитрат, фосфат, карбонат и диглицин. Боратные буферы должны быть исключены вследствие их способности образовывать комплекс с комплексообразующим фрагментом для фенилбороновой кислоты. Трис-, -гидроксиаминные и -гидроксикислотные буферы должны быть исключены вследствие их способности образовывать комплекс с фенилбороновой кислотой. Биоконъюгат образуется в течение нескольких минут в диапазоне температур приблизительно от 4 до 70^oC. На стабильность биоконъюгата в водном растворе при данных значении pH и температуре в определенной степени влияет заместитель группы R₃. Биоконъюгаты общей формулы VI стабильны в водном растворе при приблизительных значениях pH не выше 3,5 и не ниже 10,5. Реакция биоконъюгации (образование комплекса с фенилбороновой кислотой) нечувствительна к значительным изменениям ионной силы в диапазоне от 0,01М до 1М, к присутствию органических растворителей, включая ацетонитрил, метанол, этанол, изопропанол, бутанол, N,N-диметилформамид и диметилсульфоксид, к присутствию детергентов и к присутствию хаотропических агентов (агентов, денатурирующих протеины), включая мочевину, гидрохлорид гуанидина, тиоцианат гуанидина и формамид, что отличает их от известных из уровня техники непрямых меченых систем, причем строение биологической макромолекулы должно сохраняться с целью сохранности необходимых характеристик связывания. Будучи сформированы, биоконъюгаты стабильны при удалении воды и могут быть лиофилизованы для хранения.

Было установлено, что на стабильность биоконъюгата при данном значении pH в определенной степени влияет заместитель группы R₃. Комплексы па основе фенилбороновой кислоты общей формулы VI, в которых группа R₃ обозначает H, стабильны в забуференных водных растворах при приблизительных значениях pH в диапазоне от 3,5 до 10,5. Комплексы на основе фенилбороновой кислоты общей формулы VI, в которых группа R₃ обозначает CH₃, стабильны в забуференных водных растворах при приблизительных значениях pH в диапазоне от 4,5 до 10,5. Комплексы на основе фенилбороновой кислоты общей формулы VI, в которых группа R₃ включает электроотрицательный фрагмент, стабильны в забуференных водных растворах при приблизительных значениях pH в диапазоне от ниже 3,5 до 10,5.

Стабильность комплекса на основе фенилбороновой кислоты по отношению к катализируемому кислотой гидролизу определяется значением рК_a гидроксамовой кислоты, входящей в комплекс. Чем ниже значение рК_a фрагмента гидроксамовой кислоты, тем более стабилен комплекс. Следовательно, комплексы на основе фенилбороновой кислоты общей формулы VI, в которых группа R₃ включает электроотрицательный фрагмент, проявляют более высокую стабильность по отношению к катализируемому кислотой гидролизу, чем комплексы, в которых группа R₃ обозначает либо H, либо CH₃.

В приведенных ниже примерах подробно описан синтез реагентов общей формулы I и общей формулы III.

Пример I

Получение гидрохлорида этил-4-аминометилсалицилата



Этил-4-метилсалицилат

4-метилсалициловую кислоту (20,0 г, 131 ммоль) растворяли в этаноле (3,0 мл) и добавляли концентрированную серную кислоту (2,0 мл). Смесь выдерживали при температуре дефлегмации в течение 40 ч. Объем реакционной смеси уменьшали до 100 мл, переносили в делительную воронку и разбавляли хлороформом (250 мл) и водой (200 мл). Небольшими порциями добавляли твердый бикарбонат натрия до тех пор, пока значение pH водного слоя не достигало приблизительно 8 (индикаторная бумага для определения pH). Смесь в делительной воронке интенсивно встряхивали, и слои разделялись. Органический слой сначала промывали водой (150 мл), а затем насыщенным водным раствором хлорида натрия (150 мл). В завершение органический слой сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали, получая 14,0 г (выход 59%) жидкого этил-4-метилсалицилата.

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 1,40 (триплет, J=7 Гц, 3H, CH₂CH₃), 2,33 (синглет, 3H, ArCH₃), 4,38 (квартет, J=7 Гц, 3H, CH₂CH₃), 6,67 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,78 (синглет, 1H, ArH), 7,72 (дублет, J=8 Гц, 1Н, ArH). 10,181 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 14,0, 21,7, 61,1, 110,1, 117,7, 120,4, 129,7, 146,9, 161,7, 170,3.

Этил-4-бромметилсалициловая кислота

Этил-4-метилсалицилат (13,1 г, 72,5 ммоль) растворяли в четыреххлористом углероде (150 мл) и добавляли N-бромсукцинимид (13,1 г, 73,2 ммоль) и перекись бензоила (0,2 г, 0,8 ммоль). Смесь выдерживали при температуре дефлегмации в течение 3,5 ч и затем давали охладиться до комнатной температуры. Твердые частицы удаляли фильтрацией и фильтрат упаривали досуха. Неочищенный твердый продукт кристаллизовали из гексана (100 мл), получая 5,0 г (выход 27%) этил-4-бромметилсалициловой кислоты (t_пл 64-66^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 1,41 (триплет. J=7 Гц, 3H, CH₂CH₃, 4,40 (квартет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₃), 4,40 (синглет, 2H, CH₂Br), 6,90 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,99 (синглет, 1H, ArH), 7,82 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 10,88 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 14,0, 31,9, 61,5, 112,4, 117,9, 119,8, 130,5, 145,5, 161,8, 169,9.

Гидрохлорид этил-4-аминометилсалицилата

Этил-4-бромметилсалицилилат (4,8 г, 18,6 ммоль) растворяли в безводном N, N-диметилформамиде (50 мл) и добавляли азид натрия (1,2 г, 18,9 ммоль). Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (150 мл) и экстрагировали 1н. водным раствором соляной кислоты (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). В завершение раствор сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха, получая этил-4-азидометилсалицилат в виде масла.

В сосуд для гидрирования объемом 1 л в атмосфере азота добавляли палладий на угле (0,5 г, 10 мас.%). Неочищенный этил-4-азидометилсалицилат растворяли в этаноле (200 мл) и переносили в сосуд для гидрирования. Затем добавляли концентрированную водную соляную кислоту (2 мл) и сосуд присоединяли к гидрогенизатору Парра. Реакционную смесь встряхивали при давлении водорода 35 фунтов/кв.дюйм в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем смесь фильтровали через целит для удаления катализатора и фильтрат упаривали досуха, получая беловатое твердое вещество. В завершение твердое вещество кристаллизовали из EtOH, получая 3,1 г (выход 71%) гидрохлорида этил-4-аминометилсалицилата (t_пл 240-241^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,30 (триплет, J=7 Гц, 3H, CH₂CH₃), 3,99 (синглет, 2H, CH₂NH₃), 4,33 (квартет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₃), 7,06 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,15 (синглет, 1H, ArH), 7,77 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,71 (синглет с расширением, 3H, NH₃), 10,62 (синглет с расширением, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 14,0, 38,7, 41,6, 61,5, 112,9, 117,7, 119,8, 130,3, 142,2, 160,2, 168,9.

Пример II

Получение реагента общей формулы I: этил-N-йодацетил-4- аминометилсалицилата



Этил-N-хлорацетил-4-аминометилсалицилат

Гидрохлорид этил-4-аминометилсалицилата (0,50 г, 2,17 ммоль) суспендировали в безводном N,N-диметилформамиде (25 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,38 мл, 2,18 ммоль). После растворения аминной соли добавляли хлоруксусный ангидрид (0,39 г, 2,25 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4,5 ч. Затем реакционную смесь разбавляли этилацетатом (100 мл) и этот раствор экстрагировали 1н. водным раствором соляной кислоты (100 мл), водой (50 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха, получая твердое вещество белого цвета. В завершение это твердое вещество кристаллизовали из смеси этилацетат: гексан (в соотношении 8:2, 10 мл), получая 0,13 г (выход 22%) этил-N-хлорацетил-4- аминометилсалицилата (t_пл 120-121^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,31 (триплет, J=7 Гц, 3H, CH₂CH₃), 4,14 (синглет, 2H, ClCH₂), 4,29 (дублет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂), 4,34 (квартет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₃), 6,82 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,84 (синглет, 1H, ArH), 7,73 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 8,78 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,58 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 13,9, 42,1, 42,6, 61,3, 111,6, 115,6, 118,4, 130,1, 147,6, 160,6, 166,5, 169,1.

Этил-N-йодацетил-4-аминометилсалицилат

Этил-N-хлорацетил-4-аминометилсалицилат (0,11 г, 0,40 ммоль) растворяли в ацетоне (5 мл) и добавляли йодид натрия (0,06 г, 0,40 ммоль). Раствор выдерживали при температуре дефлегмации в течение 2,5 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха, получая в виде твердого вещества белого цвета этил-N-йодацетил-4-аминометилсалицилат (0,19 г, выход 100%) 105-108^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,31 (триплет, J-7 Гц, 3H, CH₂CH₃), 3,6(8 (синглет, 2H, ICH₂), 4,26 (дублет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂), 4,33 (квартет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₃), 6,82 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,84 (синглет, 1H, ArH), 7,72 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 8,79 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,58 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 0,41, 13,9, 42,0, 61,3, 111,4, 115,5, 118,3, 130,1, 147,9, 160,6, 168,3, 169,1.

Пример III

Получение реагента общей формулы I: трифторацетата этил (6-аминогексаноил)аминометилсалицилата



Этил (N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексаноил)аминометилсалицилат

Гидрохлорид этил-4-аминометилсалицилата (0,52 г, 1,28 ммоль) суспендировали в безводном N,N-диметилформамиде (25 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,79 мл, 4,53 ммоль), а затем сукцинимидиловый эфир N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексановой кислоты (0,74 г, 2,26 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере сухого азота в течение 18 ч, причем за это время растворялись все твердые частицы. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (100 мл) и экстрагировали 1н. водным раствором соляной кислоты (100 мл). Слои разделяли и этилацетатный раствор промывали водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (500 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая аморфное твердое вещество беловатого цвета. В завершение это твердое вещество кристаллизовали из этилацетата, фильтровали и сушили в вакууме, получая 0,67 г (выход 73%) этил(N- трет-бутоксикарбонил-6-аминогексано-ил)аминометилсалицилата (t_пл 120-121^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,19 (мультиплет, 2H, NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 1,34 (мультиплет, 5H, CH₂CH₂CO и CH₂CH₃, 1,34 (синглет, 9H, C(CH₃)₃), 1,49 (мультиплет, 2H, NHCH₂CH₂, 2,12 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂СO), 2,87 (квартет, J= 6 Гц, 2H, NHCH₂CH₂), 4,23 (дублет, J=6 Гц, 2H, CH₂Ar), 4,32 (квартет, J= 7 Гц, CH₂CH₃), 6,74 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂CH₂), 6,80 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 6,81 (синглет, 1H, ArH), 7,71 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,34 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂Ar), 10,58 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 14,0, 25,1, 26,3, 28,3, 29,7, 36,3, 40,2, 42,9, 61,4, 79,0, 111,6, 116,0, 118,3, 130,4, 146,9, 156,2, 161,9, 173.0.

Трифторацетат этил(6-аминогексаноил)аминометилсалицилата

Этил(N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексаноил)аминометилсалицилат (0,58 г, 1,41 ммоль) растворяли в дихлорметане (5 мл) и раствор охлаждали в бане сухой лед/вода. Добавляли трифторуксусную кислоту (5 мл) и реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. Через 2 ч реакционную смесь упаривали досуха и получали продукт в виде масла, который сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 0,59 г (выход 99%) трифторацетата этил(6-аминогексаноил) аминометилсалицилата.

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,28 (мультиплет. 5H, H₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO и CH₂CH₃), 1,53 (мультиплет, 4H, NH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 2,15 (триплет, J=8 Гц, 2H, CH₂CH₂CO), 2,71 (мультиплет, 2H, NH₃CH₂CH₂), 4,21 (дублет, J=6 Гц, 2H, CH₂Ar), 4,30 (квартет, J=8 Гц, 2H, CH₂CH₃), 6,79 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,81 (синглет, 1H, ArH), 7,68 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,18 (синглет с расширением, 3H, NH₃), 8,60 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂Ar), 10,58 (синглет с расширением, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 14,0, 24,8, 25,6, 26,7, 35,1, 38,6, 41,7, 61,3, 111,5, 115,5, 118,3, 130,1, 148,6, 160,6, 169,2, 172,6.

Пример IV

Получение реагента общей формулы I: сукцинимидилового эфира метил-4-сукциниламинометилсалицилата



Метил-4-метилсалицилат

4-метилсалициловую кислоту (100 г, 658 ммоль) растворяли в безводном метаноле (500 мл) и осторожно добавляли концентрированную серную кислоту (25 мл). Раствор выдерживали при температуре дефлегмации в течение 18 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Реакционную смесь концентрировали до объема приблизительно 150 мл и добавляли этилацетат (250 мл). Этилацетатный раствор дважды промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (порции объемом по 250 мл), а затем насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали, получая прозрачную красновато-коричневую жидкость. Этот неочищенный продукт отгоняли под вакуумом (масляный насос), получая прозрачную вязкую жидкость, которая затвердевала при стоянии, с получением 98,1 г (выход 90%) метил-4-метилсалицилата.

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 2,32 (синглет, 3H, ArCH₃), 3,91 (синглет, 3H, OCH₃), 6,67 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,78 (синглет, 1H, ArH), 7,69 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 10,71 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d₆) 21,8. 52,1, 110,0, 117,9, 120,6, 129,9, 147,3, 161,9, 170,9.

Метил-4-бромметилсалицилат

Метил-4-метилсалицилат (98,1 г, 590 ммоль) растворяли в четыреххлористом углероде (600 мл) и добавляли N-бромсукцинимид (105,0 г, 590 ммоль) и перекись бензоила (0,7 г, 3 ммоль). Смесь выдерживали при температуре дефлегмации в атмосфере азота. Через 2 ч добавляли дополнительную порцию (0,7 г) N-бромсукцинимида. Кипячение с обратным холодильником продолжали в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и твердый продукт удаляли фильтрацией. Фильтрат желтого цвета упаривали досуха, получая густой сироп желтого цвета, который затвердевал при стоянии. К твердому продукту добавляли гексан (500 мл) и смесь кипятили до практически полного растворения твердого продукта. Горячий гексановой раствор фильтровали и концентрировали до тех пор, пока твердое вещество не начинало осаждаться. Смесь нагревали с целью растворения твердого вещества и раствору давали медленно охладиться до комнатной температуры, при этом медленно образовывались кристаллы светло-желтого цвета. Затем смесь выдерживали на льду в течение 2 ч до полной кристаллизации. В завершение твердое вещество фильтровали, промывали холодным гексаном (100 мл) и сушили в вакууме, получая 83,5 г (выход 58%) метил-4-бромметилсалицилата (t_пл 73-75^oC, открытый капилляр, неточные данные)

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 3,95 (синглет, 3H, OCH₃), 4,40 (синглет, 2H, CH₂), 6,90 (дублет, J=8 Гц. 1H, ArH), 7,00 (синглет, 1H, ArH), 7,80 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 10,78 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 32,1, 52,5, 112,4, 118,2, 120,1, 130,7, 145,8, 162,0, 170,5.

Метил-4-азидометилсалицилат

Метил-4-бромметилсалицилат (83,5 г, 341 ммоль) растворяли в безводном N, N-диметилформамиде (150 мл) и добавляли азид натрия (925,0 г. 380 ммоль). Суспензию желтого цвета перемешивали при комнатной температуре, и твердые частицы быстро растворялись. Раствор приобретал коричневый цвет, и образовывался осадок бромида натрия. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч, а затем фильтровали. Фильтрат упаривали до получения масла коричневого цвета, которое растворяли в смеси гексана и этилацетата (в объемном соотношении 1:1, 100 мл). К раствору коричневого цвета добавляли силикагель (25 г, пригодной для экспресс-хроматографии чистоты) и смесь тщательно перемешивали. Двуокись кремния удаляли фильтрацией через стеклянную фритту и трижды промывали гексаном: этилацетатом (в объемном соотношении 1:1, порции по 50 мл). Силикагель сушили на фритте и объединенные фильтраты упаривали досуха, получая жидкость темно-желтого цвета. Установлено, что неочищенный продукт (который использовали для следующей реакции) содержал остаточные количества N,N-диметилформамида.

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 3,94 (синглет, 3H, OCH₃), 4,32 (синглет, 2H, CH₂), 6,82 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,93 (синглет, 1H, ArH), 7,83 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 10,80 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 52,5, 54,3, 112,3, 117,0, 118,7, 130,8, 143,9, 162,1, 170,5.

Гидрохлорид метил-4-аминометилсалицилата

Неочищенный метил-4-азидометилсалицилат растворяли в метаноле (750 мл) в сосуде для гидрирования Парра объемом 2 л. В качестве катализатора добавляли палладий на угле (10 мас.%, 3,8 г) в воде (25 мл), а затем концентрированную соляную кислоту (35 мл). Сосуд присоединяли к гидрогенизатору Парра и смесь встряхивали при комнатной температуре и при давлении водорода 40 фунтов/кв. дюйм в течение 16 ч. Затем реакционную смесь фильтровали через найлоновый фильтр с размером пор 0,45 мм. Оставшийся твердый продукт затем промывали метанолом (150 мл), водой (100 мл) и еще раз метанолом (150 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха, получая твердое вещество желтовато-коричневого цвета. Это твердое вещество растворяли в горячем денатурированном этаноле (150 мл) и раствору давали охладиться до комнатной температуры. Быстро образовывались белые кристаллы. В завершение смесь вновь выдерживали в течение 16-18 ч при 4^oC доходной кристаллизации. Твердый продукт фильтровали, промывали небольшим количеством холодного этанола (50 мл), а затем диэтиловым эфиром (150 мл) и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 51,5 г (выход 65% относительно метил-4- аминометилсалицилата) гидрохлорида метил-4-аминометилсалицилата (t_пл 225-227^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 3,87 (синглет, 3H, OCH₃), 4,00 (синглет, 2H, CH₂), 7,06 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,13 (синглет, 1H, ArH). 7,77 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 8,59 (синглет с расширением, 3H, NH₃Cl), 10,55 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 41,6, 52,6, 113,0, 117,7, 119,8, 130,4, 142,1, 160,0, 169,1.

Метил-4-сукциниламинометилсалицилат

Гидрохлорид метил-4-аминометилсалицилата (3,00 г, 13,8 ммоль) суспендировали в безводном пиридине (25 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (2,7 мл, 15,5 ммоль). Суспензию перемешивали в бане лед/вода в течение 15 мин и затем добавляли сукциновый ангидрид (1,36 г, 13,6 ммоль). Смеси давали нагреться до комнатной температуры, при этом твердые частицы исходного продукта растворялись. После перемешивания в течение 2 ч смесь упаривали досуха и образовавшееся твердое вещество распределяли между этилацетатом (300 мл) и 1М водным раствором соляной кислоты (100 мл). Слои разделяли и этилацетатный раствор промывали 1М соляной кислотой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Раствор сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха, получая твердое вещество белого цвета. В завершение твердое вещество кристаллизовали из этилацетата/гексана, фильтровали и сушили в вакууме, получая 3.02 г (выход 87%) метил-4-сукциниламинометилсалицилата (t_пл 161-163^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 2,43 (триплет, J=6 Гц, 2H, CH₂CONH), 2,49 (триплет, J=6 Гц, 2H, HO₂CCH₂), 3,87 (синглет, 3H, OCH₃), 4,27 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,83 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,86 (синглет, 1H, ArH), 7,71 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 8,43 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,54 (синглет, 1H, OH), 12,12 (синглет, 1H, CO₂H).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 29,1, 30,1, 41,9, 52,5, 111,3, 115,6, 118,4, 130,1, 148,7, 160,7, 169,7, 171,7, 174,2.

Сукцинимидиловый эфир метил-4-сукиниламинометилсалицилата

Метил-4-сукциниламинометилсалицилат (2,60 г, 10,2 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (100 мл) и добавляли N-гидроксисукцинимид (1,29 г, 11,2 ммоль) и 1,3-дициклогексилкарбодиимид (2,10 г, 10,2 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в сухом азоте, и твердые частицы быстро растворялись. Приблизительно через 20 мин образовывался осадок белого цвета. Реакционную смесь перемешивали в течение 16-18 ч, затем выдерживали несколько часов при -20^oC. Смесь фильтровали в холодном виде и твердый продукт промывали небольшим количество тетрагидрофурана (25 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха и остаток кристаллизовали из этилацетата/гексана, фильтровали и сушили в вакууме, получая 2,39 г (выход 62%) сукцинимидилового эфира метил-4-сукиниламинометилсалицилата (t_пл 133-135^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 2,56 (триплет, J=7 Гц, 2H, CH₂CONH), 2,80 (синглет, 4H, COCH₂CH₂CO), 2,91 (триплет, J= 7 Гц, 2H, NO₂CCH₂), 3,87 (синглет, 3H, OCH₃), 4,27 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH). 6,83 (дублет, J=9 Гц, 1H, ArH), 6,84 (синглет, 1H, ArH), 7,71 (дублет, J=9 Гц, 1H, ArH), 8,51 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,50 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 25,4, 25,9, 29,2, 41,8, 52,4, 111,4, 115,6, 118,4, 130,2, 148,2, 160,4, 168,9, 169,4, 170,2, 170,4.

Пример V

Получение реагента общей формулы I: гидрохлорида метил(6-аминогексаноил)аминометилсалицилата



Метил (N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексаноил)аминометилсалицилат

Гидрохлорид метил-4-аминометилсалицилата (2,25 г, 10,3 ммоль) суспендировали в безводном N,N-диметилформамиде (30 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (3,6 мл, 20,7 ммоль), а затем сукцинимидиловый эфир N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексановой кислоты (3,38 г, 10,3 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере сухого азота в течение 18 ч, при этом растворялись все твердые частицы. Затем растворитель выпаривали, получая сироп светло-коричневого цвета, который распределяли между этилацетатом (100 мл) и 1М водным раствором соляной кислоты (100 мл). Слои разделяли и этилацетатный раствор промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали, получая аморфное твердое вещество беловатого цвета. Твердое вещество кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан, фильтровали и сушили в вакууме, получая 3,25 г (выход 80%) метил(N-трет-бутоксикарбонил-6-амцногексаноил)аминометилсалицилата (t_пл 120-121^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,22 (мультиплет, 2H, NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 1,36 (мультиплет, 2H, CH₂CH₂CO), 1,36 (синглет, 9H, C(CH₃)₃), 1,51 (мультиплет, 2H, NHCH₂CH₂), 2,13 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CO), 2,87 (квартет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂CH₂), 3,87 (синглет, 3H, OCH₃), 4,24 (дублет, J=6 Гц, 2H, CH₂Ar), 6,75 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂CH₂), 6,80 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,82 (синглет, 1H, ArH), 7,72 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,35 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂Ar), 10,53 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 25,0, 26,0, 28,2, 29,3, 35,3. 41,7, 52,4, 77,4, 111,2, 115,5, 118,3, 130,1, 148,7, 155,8, 160,5, 169,5, 172,6.

Гидрохлорид метил (6-аминогексаноил)аминометилсалицилата

Метил (N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексаноил)аминометилсалицилат (3,00 г, 7,60 ммоль) растворяли в этилацетате (100 мл) и раствор медленно барботировали безводным хлористым водородом. Реакционная смесь нагревалась по мере растворения газа. Через 5 мин подачу газа отключали и раствор перемешивали при комнатной температуре. В растворе образовывался осадок белого цвета. Через 30 мин реакционную смесь охлаждали на льду в течение 2 ч, затем отфильтровывали твердое вещество, промывали диэтиловым эфиром (50 мл) и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 2,50 г (выход 99%) гидрохлорида метил (аминогексаноил)аминометилсалицилата (разлагается с выделением газа при 158-160^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,28 (мультиплет, 2H, H₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 1,54 (мультиплет, 4H, NH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 2,16 (триплет, J=8 Гц, 2H, CH₂CH₂CO), 2,71 (мультиплет, 2H, NH₃CH₂CH₂), 3,85 (синглет, 3H, OCH₃), 4,22 (дублет, J=6 Гц, 2H, CH₂Ar), 6,80 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,83 (синглет, 1H, ArH), 7,70 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,10 (синглет с расширением, 3H, NH₃), 8,54 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂Ar), 10,35 (синглет с расширением, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 24,8, 25,6, 26,7, 35,1, 41,7, 111,5, 115,6, 118,4, 130,2, 148,6, 160,4, 169,4.

Пример VI

Получение реагента общей формулы I: сукцинимидилового эфира цианметил-4-глутарамино метил салицилата



Метил-N-трет-бутоксикарбониламинометилсалицилат

Гидрохлорид метил-4-аминометилсалицилата (10,9 г, 50 ммоль) суспендировали в безводном метаноле (200 мл) и добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (10,9 г, 50 ммоль) и триэтиламин (7,0 мл, 50 ммоль). Твердое вещество быстро растворялось со слабым выделением газа. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температур в течение 18 ч в атмосфере сухого азота, затем упаривали досуха, получая аморфную массу белого цвета. Эту массу распределяли между этилацетатом (200 мл) и водой (100 мл). Слои разделяли и этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом натрия. Раствор фильтровали и выпаривали, получая твердое вещество белого цвета. Твердое вещество кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан, фильтровали и сушили в вакууме, получая 13,7 г (выход 97%) метил-N-трет-бутоксикарбониламинометилсалицилата (t_пл 95-96^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 1,42 (синглет, 9H, C(CH₃)₃), 3,90 (синглет, 3H, OCH₃), 4,26 (дублет, J=6 Гц, 2H, CH₂Ar), 4,99 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 6,75 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,84 (синглет, 1H, ArH), 7,73 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 10,72 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 28,5, 44,4, 52,4, 80,0, 111,5, 115,9, 118,2, 130,5, 150,0, 156,3, 162,1, 170,8.

N-трет-бутоксикарбониламинометилсалициловая кислота

Метил-N-трет-бутоксикарбониламинометилсалицилат (8,7 г, 30,9 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (100 мл) и добавляли триметилсиланолат калия (4,4 г, 30,9 ммоль, 90%-ная чистота). Раствор желтого цвета выдерживали при температуре дефлегмации в течение 24 ч, причем за это время образовывался осадок желтовато-коричневого цвета, а раствор становился светло-коричневым. Смесь упаривали досуха и твердое вещество растворяли в холодной воде (100 мл). Раствор коричневого цвета охлаждали в ледяной бане и значение pH раствора доводили титрованием до 2-3, добавляя при перемешивании насыщенный водный раствор бисульфата калия. Во время титрования осаждался беловатый твердый продукт. Твердый продукт фильтровали, промывали холодной водой и сушили в вакууме над гидроксидом калия, получая 6,7 г (выход 81%) неочищенной N-трет-бутоксикарбониламинометилсалициловой кислоты (t_пл 141-144^oC, при плавлении разлагается с выделением газа, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 1,47 (синглет, 9H, C(CH₃)₃), 4,33 (дублет, J= 6 Гц, 2H, CH₂Ar), 5,07 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 6,80 (дублет, J=8 Гц. 1H, ArH), 6,88 (синглет, 1H, ArH), 7,81 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 10,72 (синглет с расширением, 2H, OH и CO₂H).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 28,5, 44,4, 80,5, 111,1, 115,9, 118,3, 131,5, 148,5, 156,6, 162,6, 174,1.

Цианметил-N-трет-бутоксикарбониламинометилсалицилат

N-трет-бутоксикарбониламинометилсалициловую кислоту (8,2 г, 30,6 ммоль) суспендировали в хлорацетонитриле (25 мл) и добавляли триэтиламин (4,3 мл, 30,6 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере сухого азота при 50^oC и твердые частицы растворялись. Раствор перемешивали в течение 18 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Растворитель выпаривали и остаток распределяли между этилацетатом (250 мл) и водой (250 мл). Слои разделяли и этилацетатный слой промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Раствор сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха. Остаток в виде твердого вещества светлого желтовато-коричневого цвета растворяли в этилацетате (100 мл) и добавляли силикагель (10 г, пригодной для экспресс-хроматографии чистоты). Смесь тщательно перемешивали и давали выстояться в течение пяти минут при комнатной температуре. Двуокись кремния удаляли фильтрацией через стеклянную фритту и промывали этилацетатом (100 мл). Фильтрат упаривали досуха. Твердый остаток кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан, получая 7,9 г (выход 88%) цианметил-N-трет-бутоксикарбониламинометилсалицилата (t_пл 144-146^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 1,45 (синглет, 9H, C(CH₃)₃), 4,30 (дублет, J= 6 Гц, 2H, CH₂Ar), 5,00 (синглет, 2H, OCH₂CN), 5,05 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 6,83 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,91 (синглет, 1H, ArH). 7,77 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 10,12 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 28,4, 44,3, 49,0, 80,1, 109,6, 114,2, 116,1, 118,7, 130,5, 149,7, 156,2, 162,5, 168,5.

Гидрохлорид цианметиламинометилсалицилата

Цианметил-N-трет-бутоксикарбониламинометилсалицилат (7,7 г, 26,2 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (150 мл) и раствор медленно барботировали безводным хлористым водородом. Реакционная смесь нагревалась по мере растворения газа. Через 5 мин подачу газа отключали и раствор перемешивали при комнатной температуре. В растворе образовывался густой осадок кремово-белого цвета. Через 30 мин реакционную смесь охлаждали на льду в течение 2 ч, затем отфильтровывали твердое вещество, промывали диэтиловым эфиром (100 мл) и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 5,8 г (выход 91%) гидрохлорида цианметиламинометилсалицилата

(t_пл 210^oC, темнеет, разлагается при 228^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 4,00 (синглет, 2H, CH₂Ar), 5,20 (синглет, 2H, OCH₂CN), 7,05 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,15 (синглет, 1H, ArH), 7,75 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 8,62 (синглет с расширением. 3H, NH₃), 10,38 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 41,6, 49,7, 113,0, 116,1, 118,0, 119,7, 131,1, 142,3, 159,5, 166,1.

Цианметил-4-глутараминометилсалицилат

Гидрохлорид цианметиламинометилсалицилата (1,22 г, 5,0 ммоль) суспендировали в безводном дихлорметане (100 мл) и суспензию перемешивали в бане лед/вода. Затем по каплям в течение 15 мин добавляли раствор глутарового ангидрида (0,57 г, 5,0 ммоль) и триэтиламина (0,7 мл, 5,0 ммоль) в безводном дихлорметане (25 мл). Смеси давали нагреться до комнатной температуры и реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч. Смесь упаривали досуха и остаток растирали в 0,1М безводной соляной кислоте (50 мл). Твердое вещество собирали фильтрацией, промывали холодной водой и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 1,43 г (выход 89%) цианметил-4-глутараминометилсалицилата (t_пл 125-126^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,75 (квинтет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,19 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONH), 2,22 (триплет, J=7 Гц, 2H, HO₂CCH₂, 4,24 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 5,17 (синглет, 2H, OCH₂CN), 6,81 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,85 (синглет, 1H, ArH), 7,70 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,39 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,5 (синглет с 1 очень большим расширением, 1H, OH), 11,7 (синглет с очень большим расширением, 1H, CO₂H).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 20,7, 33,1, 34,5, 41,8, 49,7, 111,2. 115,9, 116,2, 118,5, 130,9, 149,1, 160,2, 166,6, 172,3, 174,5.

Сукцинимидиловый эфир цианметил-4-глутараминометилсалицилата

Цианметил-4-глутараминометилсалицилат (1,00 г, 3,1 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (50 мл) и добавляли N-гидроксисукцинимид (0,36 г, 3,1 ммоль) и 1,3-дихлорциклогексилкарбодиимид (0,64 г, 3,1 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота и твердые частицы быстро растворялись. Приблизительно через 60 мин образовывался осадок белого цвета. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч, затем выдерживали при -20^oC в течение нескольких часов. Смесь фильтровали в холодном виде, твердое вещество промывали небольшим количеством тетрагидрофурана (10 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха и остаток кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан, фильтровали и сушили в вакууме, получая 1,04 г (выход 80%) сукцинимидилового эфира цианметил-4- глутараминометилсалицилата (t_пл 116-119^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,88 (квинтет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,30 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONH), 2,71 (триплет, J=7 Гц, 2H, NO₂CCH₂), 2,80 (синглет, 4H, COCH₂CH₂CO), 4,26 (дублет. J= 6 Гц. 2H, ArCH₂NH), 5,18 (синглет, 2H, OCH₂CN), 6,82 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,86 (синглет, 1H, ArH), 7,71 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,44 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,18 (синглет с расширением, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 20,4, 25,5, 29,7, 33,6, 41,8, 49,6, 111,2, 115,9, 116,2, 118,4, 130,9, 148,9, 160,1, 166,5, 169,0, 170,5, 171.7.

Пример VII

Получение реагента обшей формулы I: цианметил-4-(6-малеимидогексаноил)аминометилсалицилата



Цианметил-4-(6-малеимидогексаноил)аминометилсалицилат

Гидрохлорид цианметил-4-аминометилсалицилата (79 г, 0,32 ммоль) и N-гидроксисукцинимидный эфир 6-малеимидокапроновой кислоты (100 мг, 0,32 ммоль) суспендировали в безводном N,N-диметилформамиде (5,0 мл) и суспензию перемешивали при комнатной температуре. Добавляли N,N-диизопропилэтиламин (87 мкл, 0,50 ммоль). Твердое вещество быстро растворялось, при этом образовывался прозрачный раствор светло-желтого цвета. Через 30 мин смесь упаривали досуха и остаток распределяли между этилацетатом (25 мл) и холодным 0,1М водным раствором соляной кислоты (25 мл). Слои разделяли и этилацетатный раствор промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (25 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (25 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали, получая твердое вещество белого цвета. Твердое вещество кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан, получая 108 мг (выход 84%) цианметил-4-(6- малеимидогексаноил)аминометилсалицилата (t_пл 141-144^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,20 (мультиплет, 2H, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂, 1,53 (мультиплет, 4H, CH₂CH/CH₂CH₂CH₂, 2,13 (триплет, J=7 Гц, 2H, NCH₂CH₂), 3,38 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CO), 4,26 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 5,02 (синглет, 2H, OCH₂CN), 6,68 (синглет, 2H, CH=CH), 6,76 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,80 (синглет, 1H, ArH), 7,69 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 7,99 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,04 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 24,5, 25,7, 27,6, 35,2, 36,9, 41,9, 48,8, 109,1, 114,3, 115,6, 118,2, 129,8, 133,8, 149,2, 161,2, 167,6, 170,4, 172,7.

Пример VIII

Получение реагента общей формулы I: цианметил-4-(3-(2-пиридилдитио)пропионил)аминометилсалицилат



Цианметил-4-(3-(2-пиридилдитио)пропионил)аминометилсалицилат

Гидрохлорид цианметил-4-аминометилсалицилата (79 мг, 0,32 ммоль) и N-гидроксисукцинимидный эфир 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты (100 мг, 0,32 ммоль) суспендировали в безводном N, N-диметилформамиде (5,0 мл) и суспензию перемешивали при комнатной температуре. Добавляли N,N-диизопропилэтиламин (87 мкл, 0,50 ммоль). Твердое вещество быстро растворялось, при этом образовывался прозрачный раствор светлого желто-коричневого цвета. Через 30 мин смесь упаривали досуха и остаток распределяли между этилацетатом (25 мл) и холодной 0,1М соляной кислотой (25 мл). Слои разделяли и этилацетатный раствор промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (25 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (25 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали, получая прозрачное масло. После растирания с холодным гексаном получали 64 мг (выход 48%) цианметил-4-(3-(2-пиридилдитио)пропионил)аминометилсалицилата в виде смолы.

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 2,60 (триплет, J=7 Гц, 2H, SCH₂CH₂), 3,05 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CO), 4,27 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 5,19 (синглет, 2H, OCH₂CN), 6,84 (дублет, J=8 Гц, 1H. ArH), 6,88 (синглет, 1H, ArH), 7,23 (триплет, J=6 Гц, 1H, ArH), 7,71 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,74- 7,82 (мультиплет, 2H, ArH), 8,44 (дублет, J=6 Гц, 1H, ArH), 8,56 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,13 (синглет с расширением, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 34,0, 34,5, 41,8, 49,6, 54,9, 111,2, 115,9, 116,0, 118,4, 119,3, 121,3, 130,8, 137,9, 148,6, 149,7, 159,4, 160,0, 166,4, 170,3.

Пример IX

Получение реагента общей формулы III: гидразида 4-глутариламинометилсалицилгидроксамовой кислоты



N-трет-бутилоксикарбонилгидразид метил-4- глутариламинометилсалицилата

Сукцинимидиловый эфир метил-4-глутариламинометилсалицилата (2,57 г, 6,8 ммоль) (полученный так же, как и его сукцинильное производное, путем замещения глутарового ангидрида на сукциновый ангидрид) растворяли в безводном тетрагидрофуране (100 мл) и добавляли трет-бутилкарбазат (0,90 г, 6,81 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 60 ч. Затем раствор упаривали досуха и остаток растворяли в этилацетате (100 мл). Этилацетатный раствор промывали насыщенным водным раствором бикарбоната калия (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Затем его сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха. Остаток кристаллизовали, растворяя его при осторожном нагревании в этилацетате (50 мл), добавляя гексан (50 мл) для нагревания раствора и выдерживая при -20^oC. Когда кристаллизация начиналась, добавляли вторую порцию гексана (50 мл) и смесь выдерживали в течение 18 ч при -20^oC. В завершение твердый продукт фильтровывали, промывали смесью гексан:этилацетат (в объемном соотношении 2: 1, 90 мл) и сушили в вакууме, получая 2,51 г (выход 90%) N-трет-бутилоксикарбонилгидразида метил-4- глутариламинометилсалицилата (t_пл 68-72^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,37 (синглет, 9H, (CH₃)₃C), 1,74 (квинтет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,70 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂), 2,07 (триплет, J=7 Гц, 2H, HNHNOCCH₂), 3,86 (синглет, 3H, OCH₃), 4,23 (дублет, J= 6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,80 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,82 (синглет, 1H, ArH), 7,71 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 8,37 (триплет. J=6 Гц, 1H, NH), 8,65 (синглет, 1H, NHNHCOCH₂, 9,48 (синглет, 1H, OCONHNH), 10,50 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 21,2, 28,0, 32,6, 34,6, 41,7, 52,4, 79,1, 111,4, 115,5, 118,3, 130,2, 148,5, 155,5, 160,4, 169,4, 171,7, 172,1.

N-трет-бутилоксикарбонилгидразид 4-глутариламинометилсалицилгидроксамовой кислоты

N-трет-бутилоксикарбонилгидразид метил-4-глутариламинометилсалицилата (2,00 г, 4,9 ммоль) добавляли к охлажденному (баня лед/вода) раствору, содержащему сульфат гидроксиламина (0,82 г, 5,0 ммоль), гидроксид натрия (1,00 г, 25,0 ммоль) и сульфит натрия (0,20 г) в воде (25 мл). Суспензию перемешивали в течение 18 ч в темноте, давая нагреться до комнатной температуры. Затем раствор фильтровали, удаляя некоторое количество нерастворенного продукта, и раствор светло-желтого цвета охлаждали в бане лед/вода. Значение pH холодной реакционной смеси медленно доводили титрованием до 3-4 с помощью холодной серной кислоты (25 об.%, водный раствор), при этом осаждался смолообразный продукт. Затем смесь выдерживали в течение нескольких часов на льду и жидкость сливали. Оставшийся аморфный твердый продукт растворяли в метаноле (25 мл), фильтровали и упаривали, получая пену белого цвета. Пену сушили в вакууме, получая 1,86 г (выход 94%) неочищенного N-трет-бутилоксикарбонилгидразида 4-глутариламинометилсалицилгидроксамовой кислоты.

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,37 (синглет, 9H, (CH₃)₃C), 1,74 (квинтет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,10 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂), 2,16 (триплет, J= 7 Гц, 2H, HNHNOCCH₂, 4,20 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,71 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 6,74 (синглет, 1H, ArH), 7,60 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,32 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 8,65 (синглет, 1H, NHNHCOCH₂), 9,29 (синглет с расширением, 1H, NHOH), 9,48 (синглет, 1H, OCONHNH), 11,37 (синглет с расширением, 1H, ArOH), 12,32 (синглет с расширением, 1H, NHOH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 21,2, 28,0, 32,6, 34,6, 41,7, 79,1, 112,4, 115,6, 117,6, 127,1, 145,9, 155,6, 159,8, 166,5, 171,7, 172,1.

Гидрохлорид гидразида 4-глутариламинометилсалицилгидроксамовой кислоты

N-трет-бутилоксикарбонилгидразид 4-глутариламинометилсалицилгидроксамовой кислоты (1,86 г, 4,6 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (100 мл) и раствор медленно барботировали безводным хлористым водородом. Реакционная смесь нагревалась по мере растворения газа. Через 5 мин подачу газа отключали и раствор перемешивали при комнатной температуре. В растворе образовывался осадок белого цвета. Через 30 мин реакционную смесь помещали на лед на 2 ч, затем твердый продукт фильтровали, промывали диэтиловым эфиром (50 мл) и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 1,51 г (выход 95%) гидрохлорида гидразида 4-глутариламинометилсалицилгидроксамовой кислоты (t_пл снижается до 65^oC, разложение с выделением газа при 100^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,72 (квинтет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,17 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂), 2,23 (триплет, J=7 Гц, 2H, H₃NHNOCCH₂), 4,17 (дублет, J= 6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,69 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,74 (синглет, 1H, ArH), 7,66 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 8,49 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,49 (синглет с расширением, 4H, NH₃NHCOCH₂), 11,08 (синглет с расширением, 1H, ArOH), 11,43 (синглет с расширением, 2H, NHOH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 21,0, 25,2, 32,3, 34,4, 41,8, 67,2, 112,6, 115,7, 117,7, 127,4, 145,9, 159,8, 166,5, 171,7, 172,1.

Пример X

Получение реагента общей формулы III: сукцинимидилового эфира 4-глутариламинометилсалицил (O-метил) гидроксамовой кислоты



Метил-N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометилсалицилат

Гидрохлорид метил-4-аминометилсалицилата (5,04 г, 23,2 ммоль) суспендировали в хлороформе (80 мл) и добавляли N,N- диизопропилэтиламин (4,10 мл, 23,5 ммоль) и N- (бензилоксикарбонилокси)сукцинимид (6,48 г, 26,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, при этом все твердые частицы растворялись. Затем реакционную смесь экстрагировали 1н. водным раствором соляной кислоты (100 мл), водой (75 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Хлороформный слой сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха, получая твердое вещество белого цвета. Продукт кристаллизовали из смеси этилацетат:гексан, получая 6,17 г (выход 84%) метил-N-(бензилоксикарбонил)-4- аминометилсалицилата (t_пл 91-92^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 3,86 (синглет, 3H, OCH₃), 4,21 (дублет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂), 5,05 (синглет, 2H, CH₂O), 6,82 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,86 (синглет, 1H, ArH), 7,27-7,36 (мультиплет, 5H, ArH), 7,72 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,90 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,53 (синглет, 1H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 43,5, 52,4, 65,6, 111,5, 115,4, 118,2, 127,9, 128,0, 128,5, 130,2, 137,3, 148,6, 156,7, 160,5, 169,5.

Метил-N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалицила

Метил-N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометилсалицилат (6,06 г, 19,2 ммоль) растворяли в ацетоне (150 мл) и добавляли бензилбромид (2,60 мл, 21,9 ммоль) и безводный карбонат калия (13,28 г, 96,1 ммоль). Смесь перемешивали и выдерживали при температуре дефлегмации в течение 22 ч. Смесь концентрировали для удаления большей части ацетона и добавляли этилацетат (100 мл). Медленно добавляли водный раствор соляной кислоты (1н., 200 мл). часто перемешивая для растворения твердого карбоната. Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (50 мл). Этилацетатные растворы объединяли и промывали водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали до объема примерно 50 мл. Этот раствор доводили до кипения и добавляли гексан (150 мл). Раствор охлаждали на льду, при этом медленно образовывались кристаллы. Кристаллы собирали фильтрацией, промывали гексаном и сушили в вакууме, получая 6,97 г (выход 89%) метил-N- (бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалицилата (t_пл 106-107^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 3,76 (синглет, 3H, OCH₃), 4,27 (дублет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂), 5,07 (синглет, 2H, CH₂OCO), 5,15 (синглет, 2H, CH₂O), 6,94 (дублет, J= 8 Гц, 1H, ArH), 7,16 (синглет, 1H, ArH), 7,26-7,42 (мультиплет, 8H, ArH), 7,49-7,51 (мультиплет, 2H, ArH), 7,68 (дублет. J=8 Гц, 1H, ArH), 7,90 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 43,8, 51,8, 65.6, 69,7, 112,5, 112,6, 118,9, 119,0, 127,2, 127,9, 128,0, 128,5 (2 углерода), 131,3, 137,0, 137,3, 146,2, 156,7, 157,8, 166,1.

N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалициловая кислота

Метил-М-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалицилат (6,81 г, 16,8 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (50 мл). Добавляли раствор моногидрата гидроксида лития (0,78 г, 18,5 ммоль) в воде (25 мл) и реакционную смесь перемешивали и выдерживали при 75^oC в течение 24 ч. Раствор охлаждали и добавляли 1н. водный раствор соляной кислоты (50 мл). Реакционную смесь экстрагировали дважды этилацетатом (150 мл, затем 50 мл). Объединенные этилацетатные экстракты промывали водой (75 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали до объема 150 мл. Этилацетатный раствор доводили до кипения и добавляли гексан (150 мл). Раствор охлаждали на льду, при этом образовывались кристаллы. Кристаллы собирали фильтрацией, промывали гексаном и сушили в вакууме, получая 5,92 г (выход 90%) N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалициловой кислоты (t_пл 139-140^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 4,23 (дублет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂), 5,06 (синглет, 2H, CH₂OCO), 5,13 (синглет, 2H, CH₂O), 6,90 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,11 (синглет, 1H, ArH), 7,28-7,40 (мультиплет, 8H, ArH), 7,48-7,51 (мультиплет, 2H, ArH), 7,64 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,88 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 12,57 (синглет, 1H, COOH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 43,8, 65,6, 69,8, 112,5 (2 углерода), 118,9, 120,4, 127,4, 127,9, 128,0, 128,5 (2 углерода), 131,2, 137,1, 137,4, 145,6, 156,7, 157,5, 167,4.

N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалицил(O- метил)гидроксамовая кислота

N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалициловую кислоту (3,07 г, 7,84 ммоль) растворяли в безводном N,N-диметилформамиде (75 мл) в атмосфере сухого азота. После охлаждения раствора в бане лед/вода добавляли триэтиламин (2,20 мл, 15,8 ммоль), а затем изобутилхлорформиат (1,10 мл, 8,48 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при охлаждении на льду в течение 1,51 ч. Добавляли гидрохлорид метоксиламина (0,67 г, 8,02 ммоль) и реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. Через 3 ч реакционную смесь разбавляли этилацетатом (150 мл) и экстрагировали 1н. водным раствором соляной кислоты (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали до объема приблизительно 50 мл. Этот раствор кипятили и добавляли гексан (100 мл). При охлаждении на льду быстро образовывались кристаллы. Их собирали фильтрацией и промывали гексаном, получая 2,87 г (выход 87%) N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O- бензилсалицил (O-метил)гидроксамовой кислоты (t_пл 116-117^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 3,63 (синглет, 3H, NHOCH₃), 4,20 (дублет, J= 6 Гц, 2H, NHCH₂), 5,04 (синглет, 2H, CH₂OCO), 5,13 (синглет, 2H, CH₂O), 6,90 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,08 (синглет, 1H, ArH), 7,29-7,49 (мультиплет, 11H, ArH), 7,88 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 11,13 (синглет, 1H, NHOCH₃).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 43,7, 63,2, 65,5, 69,8, 111.8, 119,2, 121,7, 127,6, 127,9, 128,0, 128,1, 128,5 (2 углерода), 129,8, 136,8, 137,3, 144,3, 155,9, 156,6, 163,3.

Гидрохлорид 4-аминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты

N-(бензилоксикарбонил)-4-аминометил-2-O-бензилсалицил (O- метил)гидроксамовую кислоту (1,42 г, 3,38 ммоль) и палладий на угле (0,10 г, 10 (мас.%) помещали в сосуд для гидрирования объемом 1 л в атмосфере сухого азота. Добавляли этанол (150 мл), а затем концентрированный водный раствор соляной кислоты (0,30 мл). Сосуд подсоединяли к гидрогенизатору Парра и встряхивали в течение 7 ч при комнатной температуре при давлении водорода 35 фунтов/кв.дюйм. Затем реакционную смесь фильтровали через целит для удаления катализатора и фильтрат концентрировали до тех пор, пока не начинал образовываться осадок. Смесь охлаждали на льду, твердое вещество собирали фильтрацией, промывали гексаном и сушили в вакууме, получая 0,65 г (выход 83%) гидрохлорида 4-аминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты (t_пл > 250^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 3,71 (синглет, 3H, NHOCH₃, 3,95 (синглет, 2H, NH₃CH₂), 7,00 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,05 (синглет, III. ArH), 7,72 (дублет, J= 8 Гц, H, ArH), 8,53 (синглет с расширением, 3H. NH₃), 12,01 (синглет с расширением, 2H, NHOCH₃ и OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 41,7, 63,6, 114,2, 117,6, 119,3, 128,2, 140,0, 159,4, 166,1.

Сукцинимидиловый эфир 4-глутараминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты

Гидрохлорид 4-аминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты (0,57 г, 1,82 ммоль) растворяли в безводном N,N-диметилформамиде (10 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,35 мл, 2,01 ммоль) и глутаровый ангидрид (0,23 г, 2,02 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 26 ч и затем добавляли N-гидроксисукцинимид (0,23 г, 2,00 ммоль) и 1,31-дициклогексилкарбодиимид (0,42 г, 2,01 ммоль). Реакционную смесь перемешивали еще в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем смесь фильтровали и разбавляли этилацетатом (100 мл). Этилацетатный раствор промывали 1н. водным раствором соляной кислоты (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Затем раствор сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха. Неочищенный смолоподобный продукт растирали со смесью этилацетата и диэтилового эфира, получая твердое вещество, которое фильтровали и сушили в вакууме, получая 0,15 г (выход 20%) сукцинимидилового эфира 4-глутараминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты (t_пл 121-124^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,85 (квинтет, J=7 Гц, 2H, CH₂H₂CH₂), 2,27 (триплет, J=7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂), 2,69 (триплет, J=7 Гц, 2H, NOCCH₂), 2,80 (синглет, 4H, COCH₂CH₂CO), 3,70 (синглет, 3H, NHOCH₃), 4,21 (дублет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂), 6,75 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,77 (синглет, 1H, ArH), 7,57 (дублет, J=8 Гц, H, ArH), 8,39 (триплет, J=6 Гц, 1H, NHCH₂), 11,75 (синглет, 1H, OH), 11,78 (синглет, 1H, NHOCH₃).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 20,4, 25,4, 29,7, 33,4, 33,6, 41,7, 112,8, 115,6, 117,8, 127,8, 146,2, 159,3, 166,3, 169,0, 170,5, 171,5.

Пример XI

Получение реагента общей формулы III: 4-(3-(2- пиридилдитио)пропионил)аминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты



4-(3-(2-пиридилдитио)пропионил)аминометилсалицил (O-метил) гидроксамовая кислота

N-гидроксисукцинимидный эфир 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты (100 мг, 0,32 ммоль) растворяли в безводном N,N-диметилформамиде (5,0 мл) и добавляли N, N-диизопропилэтиламин (65 мкл, 0,36 ммоль), а затем гидрохлорид 4-аминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты (82 мг, 0,35 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре. Растворитель выпаривали в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан/метанол/уксусную кислоту (в объемном соотношении 95:5:1). Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяли и упаривали, получая 44 мг (выход 35%) 4-(3-(2- пиридилдитио)пропионил)аминометилсалицил(O-метил)гидроксамовой кислоты в виде масла.

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 2,58 (триплет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₂S), 3,04 (триплет, J=7 Гц, 2H, COCH₂CH₂), 3,70 (синглет, 3H, OCH₃), 4,23 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,76 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 6,79 (синглет, 1H, ArH), 7,23 (триплет, J=6 Гц, 1H, ArH), 7,57 (дублет, J=8 Гц, 1H, ArH), 7,73-7,82 (мультиплет, 2H, ArH), 8,44 (дублет, J-6 Гц, 1H, ArH), 8,48 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 11,80 (синглет с расширением, 2H, OH и NHO).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 34,1, 34,5, 41,8, 63,5, 112,7, 115,7, 117,8, 119,3, 121,3, 127,7, 138,0, 145,9, 149,8. 159,4, 166,3, 170,2, 172,8.

Комплексообразующие реагенты и конъюгаты фенилбороновой кислоты, полученные из 4-аминометил-2,6-дигидроксибензойной кислоты

Общая схема трехстадийного процесса, в котором для получения биоконъюгатов используют реагенты общей формулы CI, показан на фиг. 1". Сначала выбирают реагент общей формулы CI, который включает пригодную реакционноспособную электрофильную или нуклеофильную группу R₁, способную реагировать с требуемыми биологически активными компонентами.

Общая формула CI

Группа R₁ представляет собой реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для взаимодействия предлагаемого комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группу ₁ предпочтительно выбирают из таких фрагментов (но не ограничиваясь ими), как акриламид, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, имидат, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид, аминогруппа и тиол.

Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной, предпочтительно неразветвленной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена, несущего электроотрицательный заместитель. Электроотрицательный заместитель представляет собой заместитель с отрицательным дипольным моментом, например, CN, COOH и т.д. Группу R₂ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как CH₃, CH₂CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂ и CH₂OCH₃.

Следующая стадия трехстадийного получения биоконъюгатов представляет собой конденсацию пригодного реагента с биоактивными компонентами с получением конъюгата общей формулы CII



Общая формула CII

В общей формуле II Z и R₂ имеют указанные выше значения, a BAS обозначает биологически активные компоненты, которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента (и любого спейсера), применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту, или могут не содержать его.

Затем конъюгат подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина общей формулы NH₂OR₃, где для R₃ выбирают любое значение из группы, включающей H, алкил (например, метил, этил и т.д.) или метилен или этилен с электроотрицательным фрагментом. Пригодные производные гидроксиламина включают (но не ограничиваясь ими) NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂ и NH₂OCH₂CH₂OH. Полученный в результате конъюгат имеет общую формулу CIV



Общая формула CIV

В общей формуле CIV группы Z и BAS имеют указанные выше значения, а для R₃ выбирают любое значение из группы, включающей H, алкил и метилен с электроотрицательным заместителем.

Конъюгат общей формулы CIV затем подвергают комплексообразованию с фенилбороновой кислотой общей формулы CV



Общая формула CV

где символ BAS^* обозначает вторые биологически активные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных как BAS в комплексообразующем реагенте. BAS^* также могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту фенилбороновой кислоты. Комплексообразование приводит к получению стереоизомерного комплекса (примерно тетраэдрный бор) общей формулы CVI



Общая формула CVI

Для специалиста в данной области техники с учетом ссылок, приведенных в настоящем описании, очевидно, что различные методы синтеза, описанные в предыдущих разделах (касающиеся реагентов и конъюгатов, являющихся производными 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты, которые показаны на фиг. 1-7), при необходимости могут использоваться для соответствующего синтеза реагентов, представленного на фиг. 1" - 7" и/или описанного в данном разделе. Например, методы добавления Z-групп и R₁-групп, описанные в предыдущем разделе, могут также применяться при получении реагентов, показанных на фиг. 1"-7" и/или описанных в данном разделе.

Синтез предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CI



Общая формула CI

Реагенты общей формулы CI являются производными алкил-2,6-дигидрокси-4-метилбензоатов. На фиг. 2" показана общая схема получения алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы I" в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил и т.д. На фиг. 2" показан пример, в котором R₂ обозначает метильную группу. Сначала на стадии 1 алкил-2,6-дигидрокси-4-метилбензоат ацетилируют для уменьшения реакционной способности кольцевой системы в отношении бромирования. получая соответствующий алкил-2,6-диацетокси-4-метилбензоат. На стадии 2 эфир бромируют с помощью N-бромсукцинимида (N-БС) и перекиси бензоила в качестве катализатора, получая соответствующий бензилбромид. На стадии 3 бензилбромид алкилируют с помощью азида натрия, получая соответствующий бензилазид. На стадии 4 бензилазид подвергают гидрированию с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина. В завершение на стадии 5 ацетоксизащитные группы удаляют с помощью катализируемого кислотой метанолиза.

На фиг. 3" показана общая схема получения промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает метилен, несущий электроотрицательный фрагмент, например карбоксиметил-, ацетамидометил- и цианметил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат. Очевидно, что с помощью аналогичного синтеза могут быть поручены и другие возможные заместители группы R₂. Сначала на стадии 1 по фиг. 3" алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2", подвергают взаимодействию с ди-трет-бутилдикарбонатом и триэтиламином (ТЭА) в метаноле, получая соответствующий замещенный метил-N-(трет-бутоксикарбонил)аминометилбензоат. На стадии 2 алкиловый эфир расщепляют путем взаимодействия с триметилсиланолатом калия и, работая в водной кислоте, получают соответствующую бензойную кислоту. На стадии 3 бензойную кислоту алкилируют путем взаимодействия либо -галоидкислотой, -галоидацетамидом, либо с -галоидацетонитрилом и триэтиламином, получая соответствующий карбоксиметиловый, ацетамидометиловый или цианметиловый эфир соответственно. В завершение на стадии 4 N-(трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводным HCl в тетрагидрофуране, получая гидрохлорид алкил-4-аминометил-2,6- дигидроксибензоата.

Другой реагент по настоящему изобретению, который представляет собой амид акриловой кислоты и алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата, может быть получен в одну стадию с использованием конечного продукта из схемы, представленной на фиг. 3", путем конденсации ангидрида акриловой кислоты или акрилоилхлорида с алкил-4-аминометил-2,6- дигидроксибензоатом.

На фиг. 5" показана общая схема синтеза реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил, либо метилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как имидазолид, гидразид и N-гидроксисукцинимидный эфир. Каждый из этих реагентов получают с помощью двухстадийного процесса, в котором на первой стадии используют ангидрид алифатической кислоты. Сначала алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", конденсируют с ангидридом алифатической кислоты, предпочтительно выбранным из любого из таких ангидридов (но не ограничиваясь ими), как сукциновый ангидрид, глутаровый ангидрид, малеиновый ангидрид и ангидрид гликолевой кислоты, в апротонном органическом растворителе, что приводит к введению спейсера (группа Z), имеющего свободный концевой фрагмент карбоновой кислоты. В случае когда ангидрид алифатической кислоты в этой реакции конденсации представлен малеиновым ангидридом, образовавшаяся группа Z является ненасыщенной, т.к. она содержит алкеновую группу. Затем фрагмент карбоновой кислоты дополнительно функционализуют путем взаимодействия либо с N,N-карбонилдиимидазолом, изобутилхлорформиатом и трет-бутилкарбазидом, либо с N,N-дициклогексилкарбодиимидом и N- гидроксисукциимидом, получая соответствующий имидазолид, защищенный гидразид и N-гидроксисукципимидный эфир соответственно. В случае защищенного гидразида N-(трет- бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводной соляной кислотой.

На фиг. 6" показана общая схема синтеза реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил либо метилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как акриламид, бромацетамид, хлорацетамид, малеимид, дитиопиридил и имидат. Реагенты общей формулы CI, в которых группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром и хлор, получают конденсацией алкил-4- или -5-аминометил-2,6-дигидроксибензоата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", либо с ангидридом бромуксусной кислоты, либо хлоруксусной кислоты соответственно. Гомологичный йодсодержащий реагент получают путем галоидного замещения хлорсодержащего реагента с помощью йодида натрия. Реагенты общей формулы CI, в которых ₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, йод, бромацетамид, хлорацетамид и йодацетамид, как правило, не могут быть получены, когда R₃ обозначает Н, вследствие возможного внутримолекулярного алкилирования незащищенного гидроксамата. Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как малеимид и дитиопиридил, получают конденсацией алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", с N- гидроксисукцинимидным эфиром алифатического карбонового эфира, который несет концевой фрагмент либо малеимида, либо дитиопиридила. Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ обозначает имидат, получают с помощью двухстадийного процесса, в котором алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3" сначала конденсируют с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатиченского карбонового эфира, который несет концевой фрагмент нитрила. Затем нитрильный фрагмент превращают в метилимидат взаимодействием с безводной соляной кислотой в метаноле при 0^oC.

Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как N-гидроксисукцинимидный эфир и дитиопиридил, могут использоваться в качестве промежуточных продуктов синтеза для получения реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ обозначает фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы R₁-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы CI, содержащие фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира и предпочтительно полученные из дикарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, ацетилендикарбоновая кислота и глутаровая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы HO₂C-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений (но не ограничиваясь ими), как глицин, -аланин, аминопропиоловая кислота, 4-аминомасляная кислота и 6-аминокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5", с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагентов общей формулы CI, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, a Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом, показана на фиг. 7".

Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ обозначает фрагмент дитиопиридила, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевые тиольные фрагменты общей формулы R₁-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы CI, содержащие фрагмент дитиопиридила и предпочтительно полученные из меркаптокарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6- меркаптокапроновая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевой тиольный фрагмент общей формулы HO₂C-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6-меркаптокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5", с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным, дисульфидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагентов общей формулы I, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир и Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом, показана на фиг. 7".

Реагенты общей формулы CI, в которых Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода, получают путем конденсации алкил-4- аминометил-2,6-дигидроксибензоата. полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", с полиэтиленгликолевым реагентом, содержащим как фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, так и любой из реакционноспособных электрофильных или нуклеофильных фрагментов (или его защищенный предшественник), многие из которых имеются в продаже, с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода.

Синтез комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CIII



Общая формула CIII

На фиг. 4" показана общая схема получения 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовых кислот, которые являются промежуточными продуктами синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CIII, в которых R₃ обозначает один из таких радикалов, как алкил или метилен, несущий электроотрицательный фрагмент. Сначала на стадии 1 алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2", конденсируют с N-(бензилоксикарбонил)оксисукцинимидом, получая защищенный алкил-N-бензилоксикарбонилом алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат. На стадии 2 фенольные гидроксильные фрагменты конденсируют с бензилбромидом, получая промежуточный продукт, представляющий собой дополнительно защищенный бензиловый эфир. На стадии 3 алкиловый эфир избирательно расщепляют путем реакции с LiOH, получая соответствующую карбоновую кислоту. На стадии 4 карбоновую кислоту активируют взаимодействием с изобутилхлорформиатом, получая смешанный ангидрид, который затем подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина, предпочтительно выбранного из группы, включающей любой из таких радикалов (но не ограничиваясь ими), как NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH и NH₂OCH₂OCH₃, получая соответствующую защищенную гидроксамовую кислоту. В завершение на стадии 5 и у амина, и у фенольного гидроксильного фрагмента одновременно удаляют защитные группы с помощью гидрирования с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая гидрохлорид соответствующей 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовой кислоты. Эти промежуточные продукты синтеза, которые структурно близки к соответствующим алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоатам, могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5" или 6", с получением реагентов общей формулы CIII.

Получение комплексообразующих конъюгатов для фенилбороновой кислоты общей формулы CIV

На этой стадии предлагаемые комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы CI могут быть подвергнуты взаимодействию с пригодными биологически активными компонентами с получением конъюгата общей формулы CII



Общая формула CII

Затем конъюгат общей формулы CII конденсируют с производным гидроксиламина, получая соответствующий комплексообразующий конъюгат для фенилбороновой кислоты общей формулы CIV



Общая формула CIV

Пригодные производные гидроксиламина предпочтительно выбирают из таких радикалов (но не ограничиваясь ими), как NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH, NH₂OCH₂OCH₃. Когда группа R₂ в общей формуле CII обозначает алкильную группу, для осуществления взаимопревращения соединения общей формулы CII в соединение общей формулы CIV предпочтительно используют NH₂OH.

В альтернативном варианте конъюгаты общей формулы CIV также могут быть получены способом, схема которого приведена на фиг. 1" и в котором используется реагент общей формулы CIII



Общая формула CIII

Комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы CIII могут быть подвергнуты взаимодействию с биологически активными компонентами с получением конъюгата общей формулы CIV



Общая формула CIV

Общая схема двухстадийного процесса, в котором используются реагенты общей формулы CIII для получения биоконъюгатов, показана на фиг. 1". Сначала выбирают реагент общей формулы CIII, который включает пригодную реакционноспособную электрофильную или нуклеофильную группу ₁, способную реагировать с требуемыми биологически активными компонентами.

Общая формула CIII

Группа R₁ представляет собой реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для взаимодействия комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группу R₁ предпочтительно выбирают из таких фрагментов (но не ограничиваясь ими), как акриламид, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, имидат, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид, аминогруппа и тиол.

Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной, предпочтительно неразветвленной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Для группы R₃ выбирают любое значение из группы, включающей H, алкил и метилен или этилен с электроотрицательным заместителем.

Группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как H, CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂, CH₂CH₂COH и CH₂OCH₃. Когда R₃ обозначает H, группу R₁ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как акриламид, аминогруппа, дитиопиридил, гидразид, имидат, малеимид и тиол.

Реагент общей формулы CIII затем конденсируют с биоактивными компонентами, получая конъюгат общей формулы CIV



Общая формула CIV

где группы Z и BAS имеют указанные выше значения, a R₃ выбирают из группы, включающей такие фрагменты, как H, алкил и метилен или этилен с электроотрицательным заместителем.

Затем конъюгат общей формулы CIV подвергают комплексообразованию с конъюгатом фенилбороновой кислоты, соответствующим общей формуле CV



Общая формула CV

где символ BAS^* обозначает вторые биологически активные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных как BAS в комплексообразующем реагенте. BAS^* также могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты. Комплексообразование приводит к получению стереоизомерного комплекса (тетраэдрный бор) общей формулы CVI



Общая формула CVI

Общая схема альтернативного трехстадийного процесса, в котором используются реагенты общей формулы CI для получения биоконъюгатов, показана на фиг. 1". Сначала выбирают реагент общей формулы CI. который включает пригодную реакционноспособную электрофильную или нуклеофильную группу R₁, способную реагировать с требуемыми биологически активными компонентами.

Общая формула CI

Группа R₁ представляет собой реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для взаимодействия предлагаемого комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группу ₁ предпочтительно выбирают из таких фрагментов (но не ограничиваясь ими), как акриламид, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, имидат, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид, аминогруппа и тиол.

Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной, предпочтительно неразветвленной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена или этилена, несущего электроотрицательный заместитель. Электроотрицательный заместитель представляет собой заместитель с отрицательным дипольным моментом, например, CN, COOH и т.д. Группу R₂ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как CH₃, CH₂CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂ и CH₂OCH₃.

Следующая стадия трехстадийного получения биоконъюгатов представляет собой конденсацию пригодного реагента с биоактивными компонентами с получением конъюгата общей формулы CII



Общая формула CII

В общей формуле CII Z, BAS и R₂ имеют указанные выше значения.

Затем конъюгат подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина общей формулы NH₂OR₃, где R₃ выбирают либо из H, алкила (например, метила, этила и т. д.), либо из метилена или этилена с электроотрицательным заместителем. Пригодные производные гидроксиламина включают (но не ограничиваясь ими) NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂ и NH₂OCH₂CH₂OH.

Полученный в результате конъюгат соответствует следующей общей формуле CIV



Общая формула CIV

В общей формуле CIV группы Z и BAS имеют указанные выше значения, а R₃ выбирают из одного из таких фрагментов, как H, алкил и метилен или этилен, несущий электроотрицательный заместитель.

Конъюгат общей формулы CIV затем подвергают комплексообразованию с конъюгатом фенилбороновой кислотой общей формулы CV



Общая формула CV

где символ BAS^*, обозначает вторые биологически активные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных как BAS в комплексообразующем реагенте. BAS^* также могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты. Комплексообразование приводит к получению стереоизомерного комплекса (примерно тетраэдрный бор) общей формулы CVI



Общая формула CVI

Для специалиста в данной области техники с учетом ссылок, приведенных в настоящем описании, очевидно, что различные методы синтеза, описанные в предыдущих разделах (касающиеся реагентов и конъюгатов, являющихся производными 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты, которые показаны на фиг. 1-7), при необходимости могут использоваться для соответствующего синтеза реагентов, представленного на фиг. 1" - 7" и/или описанного в данном разделе. Например, методы добавления Z-групп и R₁-групп, описанные в предыдущем разделе, могут также применяться при получении реагентов, показанных на фиг. 1"-7" и/или описанных в данном разделе.

Синтез комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CIII



Общая формула CIII

Реагенты общей формулы CIII являются производными 2,6-дигидрокси-4-метилбензойной кислоты. В каждом случае реагент в конечном итоге получают из синтетического промежуточного продукта, представляющего собой алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат.

На фиг. 2" показана общая схема получения алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CIII, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил и т.д. Сначала на стадии 1 алкил-2,6-дигидрокси-4-метилбензоат ацетилируют для снижения реакционной способности кольцевой системы по отношению к бромированию, получая соответствующий алкил-2,6-диацетокси-4-метилбензоат. На стадии 2 эфир бромируют с помощью N-бромсукцинимида и перекиси бензоила в качестве катализатора, получая соответствующий бензилбромид. На стадии 3 бензилбромид алкилируют с помощью азида натрия, получая соответствующий бензилазид. На стадии 4 бензилазид подвергают гидрированию с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина. В завершение на стадии 5 ацетоксизащитные группы удаляют с помощью катализируемого кислотой метанолиза.

На фиг. 4" показана общая схема получения 4-аминометил-2,6- дигидроксибензогидроксамовых кислот, которые являются промежуточными продуктами синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CIII, в которых R₃ обозначает один из таких радикалов, как алкил или метилен или этилен, несущий электроотрицательный фрагмент. Сначала на стадии 1 алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат, полученный согласно общей схеме. приведенной на фиг. 2", конденсируют с N-(бензилоксикарбонил) оксисукцинимидом, получая защищенный алкил-N-бензилоксикарбонилом 4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат. На стадии 2 фенольные гидроксильные фрагменты конденсируют с бензилбромидом, получая промежуточный продукт, представляющий собой дополнительно защищенный бензиловый диэтиловый эфир. На стадии 3 алкиловый эфир избирательно расщепляют путем реакции с LiOH, получая соответствующую бензойную кислоту. На стадии 4 бензойную кислоту активируют взаимодействием с изобутилхлорформиатом, получая смешанный ангидрид, который затем подвергают взаимодействию с производным гидроксиламина, предпочтительно выбранного из группы, включающей любой из таких радикалов (но не ограничиваясь ими), как NH₂OH, NH₂OCH₃, NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH и NH₂OCH₂OCH₃, получая соответствующую защищенную гидроксамовую кислоту. В завершение на стадии 5 и у амина, и у фенольного гидроксильного фрагмента одновременно удаляют защитные группы с помощью гидрирования с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая соответствующий гидрохлорид 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовой кислоты.

Другой реагент по настоящему изобретению, который представляет собой амид акриловой кислоты 4-аминометил-2,6-дигидробензогидроксамовой кислоты, может быть получен с помощью одностадийного процесса с использованием конечного продукта, приведенного на фиг. 4", путем конденсации ангидрида акриловой кислоты или акрилоилхлорида с 4-аминометил-2,6- дигидроксибензогидроксамовой кислотой при условии, что R₃ не обозначает H.

На фиг. 5" показана общая схема синтеза реагентов общей формулы CIII, в которых группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как H, CH₃ и метилен или этилен с электроотрицательным фрагментом, а группу R₁, выбирают из любого такого фрагмента, как имидазолид, гидразид и N-гидроксисукцинимидный эфир. Каждый из этих реагентов получают с помощью двухстадийного процесса, в котором на первой стадии используют ангидрид алифатической кислоты. Сначала 4-аминометил- 2,6-дигидроксибензогидроксамовую кислоту, полученную согласно общей схеме, приведенной на

фиг. 4", конденсируют с ангидридом алифатической кислоты, предпочтительно выбранным из любого из таких ангидридов (но не ограничиваясь ими), как сукциновый ангидрид, глутаровый ангидрид, малеиновый ангидрид и ангидрид гликолевой кислоты, в апротонном органическом растворителе, что приводит к введению спейсера (группа Z), имеющего свободный концевой фрагмент карбоновой кислоты. В случае когда ангидрид алифатической кислоты в этой реакции конденсации представлен малеиновым ангидридом, образовавшаяся группа Z является ненасыщенной, так как она содержит алкеновую группу. Затем фрагмент карбоновой кислоты дополнительно функционализуют путем взаимодействия либо с N, N- карбонилдиимидазолом, изобутилхлорформиатом и трет- бутилкарбазидом, либо с N, N-дициклогексилкарбодиимидом и N- гидроксисукцинимидом, получая соответствующий имидазолид, защищенный гидразин и N-гидроксисукцинимидный эфир соответственно. В случае защищенного гидразида N-(трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводной соляной кислотой.

На фиг. 6" показана общая схема синтеза реагентов общей формулы CIII, и которых группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как H, CH₃ и метилен или этилен с электроотрицательным фрагментом, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, малеимид, дитиопиридил и имидат. Реагенты общей формулы CIII, в которых группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром и хлор, получают конденсацией 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовой кислоты, порученной согласно общей схеме, приведенной на фиг. 4" либо с ангидридом бромуксусной кислоты, либо хлоруксусной кислоты соответственно. Гомологичный йодсодержащий реагент получают путем галоидного замещения хлорсодержащего реагента с помощью йодида натрия. Реагенты общей формулы CIII, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, йод, бромацетамид, хлорацетамид и йодацетамид, как правило, не могут быть получены, когда R₃ обозначает H, вследствие возможного внутримолекулярного алкилирования незащищенного гидроксамата. Реагенты общей формулы CIII, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как малеимид и дитиопиридил, получают конденсацией 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовой кислоты, полученной согласно общей схеме, приведенной на фиг. 4" с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатического карбонового эфира, который несет концевой фрагмент либо малеимида, либо дитиопиридила. Реагенты общей формулы CIII, в которых R₁ обозначает имидат, получают с помощью двухстадийного процесса, в котором 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовую кислоту, полученную согласно общей схеме, приведенной на фиг. 4", сначала конденсируют с N-гидроксисукцинимидным эфиром алифатического карбонового эфира, который несет концевой фрагмент нитрила. Затем нитрильный фрагмент превращают в метилимидат взаимодействием с безводным хлористым водородом в метаноле при 0^oC.

Реагенты общей формулы CIII, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как N-гидроксисукцинимидный эфир и дитиопиридил, могут использоваться в качестве промежуточных продуктов синтеза реагентов общей формулы CIII, в которых Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы CIII, в которых R₁ обозначает фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы R₁-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цель, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы CIII, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы CIII, содержащие фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, предпочтительного полученные из дикарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, ацетилендикарбоновая кислота и глутаровая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы HO₂C-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений, как глицин, -аланин, аминопропиоловая кислота, 4-аминомасляная кислота и 6-аминокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5", с получением реагентов общей формулы CIII, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагента общей формулы CIII, в котором R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, а Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом, показана на фиг. 7".

Реагенты общей формулы CIII, в которых R₁ обозначает фрагмент дитиопиридила, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевые тиольные фрагменты общей формулы R₁-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы CIII, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы CIII, содержащие фрагмент дитиопиридила, предпочтительного полученные из меркаптокарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как меркаптоуксусная кислота, меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6- меркаптокапроновая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевой тиольный фрагмент общей формулы HO₂C-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6-меркаптокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5", с получением реагентов общей формулы CIII, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагента общей формулы III, в котором ₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, а Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом, показана на фиг. 7".

Реагенты общей формулы CIII, в которых Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода, получают путем конденсации 4-аминометил-2,6- дигидроксибензогидроксамовой кислоты, полученной согласно общей схеме, приведенной на фиг. 4" с полиэтиленгликолевым реагентом, содержащим как фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, так и любой из реакционноспособных электрофильных или нуклеофильных фрагментов (или его предшественника), многие из которых имеются в продаже, с получением реагентов общей формулы CIII. в которых группа Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода.

Синтез предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CI



Общая формула CI

Реагенты общей формулы CI являются производными 2,6-дигидрокси-4-метилбензоатов.

На фиг. 2" показана общая схема получения алкил-4-аминометил-2.6-дигидроксибензоатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил и т.д. На фиг. 2 показан пример, в котором R₂ обозначает метальную группу. Сначала на стадии 1 алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат ацетилируют для уменьшения реакционной способности кольцевой системы по отношению к бромированию, получая соответствующий алкил-2,6-диацетокси-4- метилбензоат. На стадии 2 эфир бромируют с помощью N-бромсукцинимида и перекиси бензоила в качестве катализатора, получая соответствующий бензилбромид. На стадии 3 бензилбромид алкилируют с помощью азида натрия, получая соответствующий бензилазид. На стадии 4 бензилазид подвергают гидрированию с участием палладиевого катализатора в присутствии HCl, получая соответствующий гидрохлорид бензиламина. В завершение на стадии 5 ацетоксизащитные группы удаляют с помощью катализируемого кислотой метанолиза.

На фиг. 3" показана общая схема получения промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает метилен, несущий электроотрицательный фрагмент, например карбоксиметил-, ацетамидометил- и цианметил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат. Должно быть ясно, что другие возможные заместители группы R₂ могут быть получены с помощью аналогичного синтеза. Сначала на стадии 1, фиг. 3", алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат. полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2", подвергают взаимодействию с ди-трет-бутилдикарбонатом и триэтиламином в метаноле, получая соответствующий замещенный метил-N-(трет-бутоксикарбонил)аминометилбензоат. На стадии 2 алкиловый эфир расщепляют путем взаимодействия с триметилсиланолатом калия и, работая в водной кислоте, получают соответствующую бензойную кислоту. На стадии 3 бензойную кислоту алкилируют путем взаимодействия либо с -галоидкислотой, -галоидацетамидом, либо с -галоидацетонитрилом и триэтиламином, получая соответствующий карбоксиметиловый, ацетамидометиловый или цианметиловый эфир соответственно. В завершение на стадии 4 N-(трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют взаимодействием с безводным HCl в тетрагидрофуране, получая гидрохлорид алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата.

На фиг. 5" показана общая схема синтеза реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил, либо метилен или этилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как имидазолид, гидразид и N-гидроксисукцинимидный эфир. Каждый из этих реагентов получают с помощью двухстадийного процесса, в котором на первой стадии используют ангидрид алифатической кислоты. Сначала алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", конденсируют с ангидридом алифатической кислоты, предпочтительно выбранным из любого из таких ангидридов (но не ограничиваясь ими), как сукциновый ангидрид, глутаровый ангидрид, малеиновый ангидрид и ангидрид гликолевой кислоты, в апротонном органическом растворителе, что приводит к введению спейсера (группа Z), имеющего свободный концевой фрагмент карбоновой кислоты. Затем фрагмент карбоновой кислоты дополнительно функционализуют путем взаимодействия либо с N,N-карбонилдиимидазолом, изобутилхлорформиатом и трет-бутилкарбазидом, либо с N,N- дициклогексилкарбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом, получая соответствующий имидазолид, защищенный гидразид и N- гидроксисукцинимидный эфир соответственно. В случае защищенного гидразида N-(трет-бутоксикарбонильную) защитную группу удаляют путем взаимодействия реагента с безводной соляной кислотой.

На фиг. 6" показана общая схема синтеза реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает один из таких радикалов, как алкил, либо метилен или этилен, несущий электроотрицательный фрагмент, а группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, малеимид, дитиопиридил и имидат. Реагенты общей формулы CI, в которых группу R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром и хлор, получают конденсацией алкил-4-аминометил-2,6- дигидроксибензоата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", либо с ангидридом бромуксусной кислоты, либо хлоруксусной кислоты соответственно. Гомологичный йодсодержащий реагент получают путем галоидного замещения хлорсодержащего реагента с помощью йодида натрия. Реагенты общей формулы CI, в которых ₁ выбирают из любого такого фрагмента, как бром, хлор, йод, бромацетамид, хлорацетамид и йодацетамид. как правило, не могут быть получены, когда R₃ обозначает H, вследствие возможного внутримолекулярного алкилирования незащищенного гидроксамата. Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как малеимид и дитиопиридил, получают конденсацией алкил-4-аминометил-2,6- дигидроксибензоата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", с N-гидроксисукцинимидным эфиром эфира алифатической карбоновой кислоты, который несет концевой фрагмент либо малеимида, либо дитиопиридила. Реагенты общей формулы CI, в котором R₁ обозначает имидат, получают с помощью двухстадийного процесса, в котором алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат, полученный согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", сначала конденсируют с N-гидроксисукцинимидным эфиром эфира алифатической карбоновой кислоты, который несет концевой фрагмент нитрила. Затем нитрильный фрагмент превращают в метилимидат взаимодействием с безводной соляной кислотой в метаноле при 0^oC.

Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как дитиопиридил, имидазолид и N-гидроксисукцинимидный эфир, могут использоваться в качестве промежуточных продуктов синтеза для поручения реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы CI, в которых R₁ выбирают из любого такого фрагмента, как N-гидроксисукцинимидный эфир и дитиопиридил, могут использоваться в качестве промежуточных продуктов синтеза для получения реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Реагенты общей формулы CI, в которых группа R₁ обозначает фрагменты N-гидроксисукцинимидного эфира, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы R₁-Z₂-NH₂, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы CI, содержащие N-гидроксисукцинимидный эфир и предпочтительно полученные из дикарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, ацетилендикарбоновая кислота и глутаровая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими фрагменты первичного алифатического амина общей формулы H₂N-Z₂-COOH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений (но не ограничиваясь ими), как глицин, -аланин, аминопропиоловая кислота, 4-аминомасляная кислота и 6- аминокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которые могут быть дополнительно функционализованы согласно способу, приведенному на фиг. 5", с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагентов общей формулы CI, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным амидным 1 фрагментом, показана на фиг. 7".

Реагенты общей формулы CI, в которых R₁, обозначает фрагмент дитиопиридила, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевые тиольные фрагменты общей формулы R₁-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой предпочтительно равна приблизительно 1-5 атомам углерода, с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом.

В альтернативном варианте реагенты общей формулы CI, содержащие фрагмент дитиопиридила, которые предпочтительно являются производными меркаптокарбоновой кислоты, выбранной из любой такой кислоты, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6-меркаптокапроновая кислота, могут быть сконденсированы с соединениями, имеющими концевой тиольный фрагмент общей формулы HO₂C-Z₂-SH, где Z₂ обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь с длиной предпочтительно приблизительно 1-5 атомов углерода, предпочтительно выбранную из группы, включающей любое из таких соединений, как меркаптоуксусная кислота, -меркапопропионовая кислота, меркаптопропионовая кислота, 4-меркаптомасляная кислота и 6-меркаптокапроновая кислота, с получением соединений, имеющих свободные концевые фрагменты карбоновых кислот, которым может быть придана дополнительная функциональная активность, согласно способу, приведенному на фир. 5", с получением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом. Общая схема этого процесса для синтеза реагентов общей формулы I, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, a Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь по крайней мере с одним промежуточным дисульфидным фрагментом, показана на фиг. 7".

Реагенты общей формулы CI, в которых Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3- 12 атомам углерода, получают путем конденсации алкил-4- аминометил-2,6-дигидроксибензоата, полученного согласно общей схеме, приведенной на фиг. 2" или 3", с полиэтиленгликолевым реагентом, содержащим как фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира, так и любой из реакционноспособных электрофильных или нуклеофильных фрагментов (или его предшественник), многие из которых имеются в продаже, с поручением реагентов общей формулы CI, в которых группа Z обозначает полиэтиленгликолевую цепь, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода.

Получение комплексообразующих конъюгатов для фенилбороновой кислоты общей формулы CIV

На этой стадии комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы CIII могут быть подвергнуты взаимодействию с пригодными биологически активными компонентами с получением конъюгата общей формулы CIV



Общая формула CIV

В альтернативном варианте предлагаемые комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты общей формулы CI могут быть подвергнуты взаимодействию с пригодными биологически активными компонентами с получением конъюгата общей формулы CII



Общая формула CII

Затем конъюгат общей формулы CII конденсируют с производным гидроксиламина, получая соответствующий комплексообразующий конъюгат для фенилбороновой кислоты общей формулы CIV



Общая формула CIV

Пригодные производные гидроксиламина предпочтительно выбирают из таких радикалов (но не ограничиваясь ими), как NH₂OH, NH₂OCH₃. NH₂OCH₂CN, NH₂OCH₂COOH, NH₂OCH₂CONH₂, NH₂OCH₂CH₂OH, NH₂OCH₂OCH₃. Когда группа R₂ в общей формуле CII обозначает алкильную группу, для осуществления взаимопревращения соединения общей формулы CII в соединение общей формулы CIV предпочтительно используют NH₂OH.

Получение биоконъюгатов общей формулы CVI

Биоконъюгаты общей формулы CVI могут быть получены в забуференном водном растворе или в органических растворителях. Предпочтительными буферами являются ацетат, цитрат, фосфат, карбонат и диглицин. Боратные буферы должны быть исключены вследствие их способности образовывать комплекс с комплексообразующим фрагментом для фенилбороновой кислоты. Трис-, -гидроксиаминные и -гидроксикислотные буферы должны быть исключены вследствие их способности образовывать комплекс с фенилбороновой кислотой. Биоконъюгат образуется в течение нескольких минут в диапазоне температур приблизительно от 4 до 70^oC. На стабильность биоконъюгата в водном растворе при данном значении pH и температуре в определенной степени влияет заместитель группы R₃. Биоконъюгаты общей формулы CVI стабильны в водном растворе при приблизительных значениях pH не выше 2,5 и не ниже 12,5. Реакция биоконъюгации (образование комплекса с фенилбороновой кислотой) нечувствительна к значительным изменениям ионной силы в диапазоне от 0,01М до 1М, к присутствию органических растворителей, включая ацетонитрил, метанол, этанол, изопропанол, бутанол, N,N-диметилформамид и диметилсульфоксид, к присутствию детергентов и к присутствию хаотропических агентов (агентов, денатурирующих протеины), включая мочевину, гидрохлорид гуанидина, тиоцианат гуанидина и формамид, что отличает их от известных из уровня техники непрямых меченых систем, причем строение биологической макромолекулы должно сохраняться с целью сохранности необходимых характеристик связывания. Будучи сформированы, биоконъюгаты стабильны при удалении воды и могут быть лиофилизованы для хранения.

Было становлено, что на стабильность биоконъюгата при данном значении pH в определенной степени влияет заместитель группы R₃. Комплексы на основе фенилбороновой кислоты общей формулы CVI, в которых группа R₃ обозначает H, стабильны в забуференных водных растворах при приблизительных значениях pH в диапазоне от 2,5 до 12,5. Комплексы на основе фенилбороновой кислоты общей формулы CVI, в которых группа R₃ обозначает CH₃, стабильны в забуференных водных растворах при приблизительных значениях pH в диапазоне от 3,5 до 12,5. Комплексы на основе фенилбороновой кислоты общей формулы CVI, в которых группа R₃ включает электроотрицательный фрагмент, стабильны в забуференных водных растворах при приблизительных значениях pH в диапазоне от ниже 2,5 до 12,5.

Стабильность комплекса на основе фенилбороновой кислоты по отношению к катализируемому кислотой гидролизу определяется значением рК_а гидроксамовой кислоты, входящей в комплекс. Чем ниже значение рК_а фрагмента гидроксамовой кислоты, тем более стабилен комплекс. Следовательно комплексы на основе фенилбороновой кислоты общей формулы CVI, в которых группа R₃ включает электроотрицательный фрагмент, проявляют более высокую стабильность по отношению к катализируемому кислотой гидролизу, чем комплексы, в которых группа R₃ обозначает либо H, либо CH₃.

Следует отметить, что стабильность при разных значения pH, характерная для биоконъюгатов общей формулы CVI, которые являются производными 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовой кислоты, существенно превышает стабильность биоконъюгатов общей формулы CVI, которые являются производными либо 4-, либо 5- аминометилсалицилгидроксамовой кислоты, в отношении как кислотного, так и щелочного гидролиза.

В приведенных ниже примерах более подробно описан синтез реагентов общей формулы CI и общей формулы CIII.

Пример Cl

Получение гидрохлорида метил-4-аминометил-2,6- дигидроксибензоата



Метил-4-метил-2,6-диацетоксибензоат

Метил-4-метил-2,6-дигидроксибензоат (14,0 r, 76,8 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (250 мл) и осторожно добавляли уксусный ангидрид (21 мл, 223 ммоль) и безводный пиридин (18 мл, 223 ммоль). Раствор выдерживали при температуре дефлегмации в атмосфере сухого азота в течение 30 ч, затем охлаждали до комнатной температуры. Раствор промывали дважды 1М водным раствором соляной кислоты (порции объемом по 200 мл) и затем насыщенным водным раствором хлорида натрия (200 мл). Дихлорметановый раствор сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая беловатое твердое вещество. Этот неочищенный продукт затем подвергали экспресс-хроматографии на силикагеле (250 г), используя и качестве элюирующего раствора смесь гексан:зтилацетат (в объемном соотношении 70:30). Фракции, содержащие основной продукт (R_f= 0,3), объединяли и упаривали досуха, получая 19,0 г (выход 98%) метил-4-метил-2,6-диацетоксибензоата в виде твердого вещества белого цвета (t_пл 70 - 71^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 2,27 (синглет, 2H, COOH₃), 2,37 (синглет, 3H, ArCH₃), 3,83 (синглет, 3H, OCH₃), 6,84 (синглет, 2H, ArH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 20,9, 21,5, 52,4, 116,5, 122,1, 143,8, 150,2, 163,9, 169,4.

Метил-4-бромметил-2,6-диацетоксибензоат

Метил-2,6-диацетоксибензоат (14,9 г, 56,0 ммоль) растворяли в четыреххлористом углероде (200 мл) и добавляли N-бромсукцинимид (11,1 г, 62,2 ммоль) и перекись бензоила (0,2 г, 0,8 ммоль). Смесь выдерживали при температуре дефлегмации в атмосфере азота. Через 3,5 ч добавляли дополнительную порцию (0,2 г) N-бромсукцинимида. Кипячение с обратным холодильником продолжали еще в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем в течение 1 ч на льду и твердое вещество удаляли фильтрацией. Фильтрат упаривали досуха. К остатку добавляли гексан (25 мл) и смесь кипятили до полного растворения. Гексановый раствор концентрировали до объема примерно 75 мл, в это время начинал осаждаться твердый продукт. Смесь нагревали для растворения твердого продукта и раствору давали медленно охладиться до комнатной температуры. Медленно образовывались кристаллы белого цвета, и смесь выдерживали на льду в течение 2 ч до полной кристаллизации. Твердое вещество фильтровали, промывали холодным гексаном (100 мл) и сушили в вакууме, получая 11,9 г (выход 62%) метил-4-бромметил-2,6- диацетоксибензоата (t_пл 93-95^oC, открытый капилляр, неточные данные). Продукт был загрязнен небольшим количеством метил-2,6-диацетокси-4-дибромметилбензоата, который не оказывал влияния на доследующие взаимодействия.

¹H-ЯМР (300 МГц, CHCl₃-d) 2,29 (синглет, 6H, COCH₃), 3,85 (синглет, 3H, OCH₃), 4,41 (синглет, 2H, CH₂), 7,08 (синглет, 2H, ArH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 20,9, 30,9, 52,7, 119,6, 121,8, 142,4, 150,2, 163,5, 169,1.

Гидрохлорид метил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата

Метил-4-бромметил-2,6-диацетоксибензоат (45,8 г, 133 ммоль) растворяли в N, N-диметилформамиде (150 мл) и добавляли азид натрия (8,8 г, 135 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли дихлорметан (350 мл) и этот раствор промывали водой (250 мл), 1М водным раствором соляной кислоты (250 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (150 мл). Органический слой сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая прозрачное масло светло-желтого цвета. Масло растворяли в метаноле (750 мл) и переносили в сосуд для гидрогенизатора Парра объемом 2 л. Добавляли в качестве катализатора палладий на угле (10 мас.%, 1,5 г) в воде (10 мл), затем концентрированную соляную кислоту (15 мл). Сосуд присоединяли к гидрогенизатору Парра и смесь встряхивали при комнатной температуре и давлении водорода 30 фунтов/кв. дюйм в течение 24 ч. Реакционную смесь фильтровали через найлоновый фильтр с размером пор 0,45 мм. Затем оставшееся твердое вещество промывали метанолом (150 мл) и к фильтрату добавляли концентрированную соляную кислоту (7 мл). Фильтрат нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч, охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха, получая беловатое твердое вещество. Это твердое вещество растворяли в горячем денатурированном этаноле (250 мл) и раствору давали охладиться до комнатной температуры. Быстро образовывались кристаллы белого цвета. Затем смесь выдерживали в течение 16-18 ч при 4^oC до полной кристаллизации. Твердый продукт отфильтровывали, промывали небольшим количеством холодного этанола (50 мл), а затем диэтиловым эфиром (150 мл) и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 16,0 г (выход 52% относительно исходного продукта с 1 атомом брома) гидрохлорида метил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата (t_пл > 260^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 3,77 (синглет, 3H, OCH₃), 3,83 (синглет, 2H, CH₂), 6,44 (синглет, 2H, ArH), 8,35 (синглет с расширением. 3H, NH₃), 10,20 (синглет, 2H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 41,9, 52,1, 107,2, 107,3, 138,5, 157,6, 168,3.

Пример CII

Получение реагента общей формулы CI: гидрохлорида метил (6-аминогексаноил)аминометил-2,6-дигидроксибензоата



Метил (N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексаноил)аминометил- 2,6-дигидроксибензоат

Гидрохлорид метил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата (1,50 г, 6,4 ммоль) суспендировали в безводном N,N-диметилформамиде (25 мл) и добавляли N, N-диизопропилэтиламин (2,2 мл, 12,8 ммоль), а затем сукцинимидиловый эфир N-трет-бутоксикарбонил-6- аминогексановой кислоты (2,10 г, 6,4 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере сухого азота в течение 4 ч, причем за этот промежуток времени все твердые частицы растворялись. Затем растворитель выпаривали, получая сироп светло-коричневого цвета, который распределяли между этилацетатом (70 мл) и 1М водным раствором соляной кислоты (50 мл). Слои разделяли и этилацетатный раствор промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (50 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, упаривали, получая аморфное беловатое твердое вещество. Твердое вещество кристаллизовали из этилацетата/гексана, фильтровали и сушили в вакууме, получая 2,10 r (выход 80%) метил (N-трет- бутоксикарбонил-6-аминогексаноил)аминометил-2,6- дигидроксибензоата (t_пл 73-76^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,26 (мультиплет, 2H, NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 1,36 (мультиплет, 2H, CH₂CH₂CO), 1,36 (синглет, 9H, C(CH₃)₃), 1,50 (мультиплет, 2H, NHCH₂CH₂), 2,10 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CO), 2,87 (квартет, J=6 Гц, 2H, NHCH₂CH₂, 3,78 (синглет, 3H, OCH₃), 4,08 (дублет, J=6 Гц, 2H, CH₂Ar), 6,23 (синглет, 2H, ArH), 6,75 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂CH₂), 8,26 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂Ar), 10,04 (синглет, 2H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 25,0, 26,0, 28,3, 29,3, 35,3, 41,7, 52,0, 77,4, 104,3, 145,8, 155,8, 158,2, 169,0, 172,4.

Гидрохлорид метил(6-аминогексаноил)аминометил-2.6- дигидроксибензоата

Метил(N-трет-бутоксикарбонил-6-аминогексаноил)аминометил- 2,6-дигидроксибензоат (2,00 г, 4,87 ммоль) растворяли в этилацетате (50 мл) и раствор медленно барботировали безводным хлористым водородом. Реакционная смесь нагревалась по мере растворения газа. Через 5 мин подачу газа отключали и раствор перемешивали при комнатной температуре. В растворе образовывался осадок белого цвета. Через 30 мин реакционную смесь переносили на лед и выдерживали в течение 2 ч, после чего твердое вещество отфильтровывали, промывали этилацетатом (50 мл), а затем диэтиловым эфиром (50 мл) и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 1,68 г (выход 99%) гидрохлорида метил(6-аминогексаноил)аминометил- 2,6-дигидроксибензоата (t_пл снижается до 145^oC, разложение с выделением газа при 152-154^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,29 (мультиплет, 2H, H₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 1,55 (мультиплет, 4H, NH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO), 2,13 (триплет, J=8 Гц, 2H, CH₂CH₂CO), 2,70 (мультиплет, 2H, NH₃CH₂CH₂), 3,75 (синглет, 3H, OCH₃), 4,07 (дублет, J= 6 Гц, 2H, CH₂Ar), 6,26 (синглет, 2H, ArH), 8,05 (синглет с расширением, 3H, NH₃), 8,39 (триплет, J=6 Гц, 1H, CONHCH₂Ar), 9,84 (синглет с расширением, 2H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 24,8, 25,6, 26,7, 35,1, 41,8, 52,0, 104,7, 105,5, 145,5, 158,1, 169,0, 172,3.

Пример CIII

Получение реагента общей формулы CI: метил-N-бромацетил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата



Метил-N-бромацетил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоат

Бромуксусную кислоту (0,30 г, 2,16 ммоль) растворяли в безводном N,N-диметилформамиде (15 мл) и добавляли N-гидроксисукцинимид (0,25 г, 2,21 ммоль) и 1,3-дициклогексилкарбодиимид (0,44 г, 2,14 ммоль). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,25 ч. Добавляли гидрохлорид 4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата (0,50 г, 2,14 ммоль), а затем N,N-диизопропилэтиламин (0,38 мл, 2,15 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 ч и затем разбавляли этилацетатом (100 мл). Смесь фильтровали и фильтрат промывали дважды 1 н. водным раствором соляной кислоты (100 мл, затем 50 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Органический раствор сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха. Неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле, элюируя гексаном:этилацетатом (в объемном соотношении 1:1). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли и упаривали досуха, получая 0,43 г метил-N-бромацетил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоата в виде твердого вещества белого цвета (выход 63%) (t_пл 157-158^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 3,77 (синглет, 3H, OCH₃), 4,11 (синглет, 2H, BrCH₂), 4,13 (дублет, J= 6 Гц, 2H, CH₂NH), 6,25 (синглет, 2H, ArH), 8,70 (триплет, J=6 Гц, 1H, CH₂NH), 10,05 (синглет, 2H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 42,3, 42,6, 52,1, 104,7, 105,7, 144,7, 158,2, 166,3, 168,9.

Пример CIV

Получение реагента общей формулы CI: сукцинимидилового эфира метил-4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензоата



Метил-4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензоат

Глутаровый ангидрид (2,3 г, 20 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (100 мл) и суспензию перемешивали в атмосфере азота. Добавляли N, N-диизопропилэтиламин (7,0 мл, 40 ммоль), а затем гидрохлорид метил-4-аминометил-2,6-дигидробензоата (4,7 г, 20 ммоль). После перемешивания в течение 18 ч смесь упаривали досуха и образовавшееся твердое вещество растворяли в дихлорметане (100 мл) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. Дихлорметановый раствор упаривали досуха, получая густой сироп, который обрабатывали холодным 1М водным раствором соляной кислоты (100 мл) в течение 30 мин на льду. Осаждался беловатый твердый продукт, который фильтровали, промывали холодной водой и сушили в вакууме, получая 5,5 г (выход 88%) метил-4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензоата (t_пл 163-164^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,74 (квинтет, J=8 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,16 (триплет, J= 8 Гц, 2H, CH₂CONH), 2,20 (триплет, J=8 Гц, 2H, HO₂CCH₂, 3,78 (синглет, 3H, OCH₃), 4,10 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,23 (синглет, 2H, ArH), 8,31 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,05 (синглет с расширением, 3H, OH и CO₂H).

C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 20,7, 33,1, 34,4, 41,8, 52,1, 104,4, 105,6, 145,7, 158,2, 169,0, 172,0, 174,5.

Сукцинимидиловый эфир метил-4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензоата

Метил-4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензоат (2,0 г, 6,4 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (80 мл) и добавляли N-гидроксисукцинимид (0,8 г, 7,0 ммоль) и 1,3-дициклогексилкарбодиимид (1,3 г, 6,4 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере сухого азота, при этом твердые частицы быстро растворялись. Приблизительно через 20 мин образовывался осадок белого цвета. Реакционную смесь перемешивали в течение 16-18 ч, а затем выдерживали при температуре -20^oC. Смесь фильтровали в холодном состоянии и твердое вещество промывали небольшим количеством тетрагидрофурана (25 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха и остаток измельчали в ледяной воде (25 мл). Твердое вещество отфильтровывали, быстро промывали холодной водой (25 мл), а затем диэтиловым эфиром (100 мл) и сушили в вакууме. Твердое вещество перекристаллизовывали из этилацетата/гексана, получая 2,5 г (выход 95%) сукцинимидилового эфира метил-4- глутариламинометил-2,6-дигидроксибензоата (t_пл 161-163^oC).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,83 (квинтет, J=8 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,26 (триплет, J= 8 Гц, 2H, CH₂CONH), 2,73 (триплет, J=8 Гц, 2H, NO₂CCH₂), 2,80 (синглет, 4H, COCH₂CH₂CO), 3,77 (синглет, 3H, OCH₃), 4,10 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,24 (синглет, 2H, ArH), 8,35 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 10,04 (синглет с расширением, 2H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 20,4, 25,4, 29,7, 33,6, 41,8, 52,0, 104,5, 105,6, 145,5, 158,1, 168,9, 170,5, 171,4.

Пример CV i

Получение реагента общей формулы CI: гидразида метил-4- глутариламинометил-2,6-дигидроксибензойной кислоты



N-трет-бутилоксикарбонилгидразид метил-4-глутариламинометил- 2,6-дигидроксибензота

Сукцинимидиловый эфир метил-4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензоата (1,6 г, 3,9 ммоль) суспендировали в безводном дихлорметане (50 мл) и добавляли трет-бутилкарбазат (0,50 г, 3,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Светлый раствор затем дважды промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (порции объемом по 50 мл), 0,1М водным раствором соляной кислоты (50 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Затем его сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха. Остаток подвергали экспресс-хроматографии на силикагелевой колонке размером 2,5 х 150 см, элюируя этилацетатом. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли и упаривали, получая прозрачный сироп. Этот сироп кристаллизовали из этилацетата:гексана при -20^oC. Твердое вещество фильтровали, промывали холодным гексаном и сушили в вакууме, получая 1,0 г (выход 62%) N-трет-бутилоксикарбонилгидразид метил-4- глутариламинометил-2,6-дигидроксибензота (t_пл 95-100^oC, размягчение при 88^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,37 (синглет, 9H, (CH₃C)₃C), 1,74 (квинтет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,07 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂), 2,15 (триплет, J=7 Гц, 2H, HNHNOCCH₂), 3,77 (синглет. 3H, OCH₃), 4,09 (дублет, J= 6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,23 (синглет, 2H, ArH), 8,28 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 8,65 (синглет, 1H, NHNHCOCH₂), 9,47 (синглет. 1H, OCONHNH), 9,96 (синглет, 2H, OH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 21,2, 28,0, 32,7, 34,7, 41,7, 52,1, 79,1, 104,4, 105,6, 145,7, 155,5, 158,2, 169,0, 171,7, 172,0.

Гидразид метил-4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензойной кислоты.

N-трет-бутилоксикарбонилгидразид метил-4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензот (0,50 г, 1,2 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (25 мл) и раствор медленно барботировали безводным хлористым водородом. Реакционная смесь нагревалась по мере растворения газа. Через 5 мин подачу газа отключали и раствор перемешивали при комнатной температуре. В растворе образовывался осадок белого цвета. Через 30 мин реакционную смесь переносили на лед и выдерживали в течение 2 ч, затем твердое вещество фильтровали, промывали диэтиловым эфиром (50 мл) и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 0,42 г (выход 98%) гидразида метил-4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензойной кислоты (t_пл 158-159^oC, разложение с выделением газа, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,76 (квинтет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,16 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂), 2,21 (триплет, J=7 Гц, 2H, H₃NHNOCCH₂), 3,75 (синглет, 3H, OCH₃), 4,07 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 5,00-7,00 (синглет с очень большим расширением, 2H, OH), 6,25 (синглет, 2H, ArH), 8,39 (триплет, J= 6 Гц, 1H, NH), 10,49 (синглет с расширением, 3H, NHNH₃), 11,09 (синглет, 1H, NHNH₃).

¹³C-ЯМР (75 МГц, CHCl₃-d) 20,9, 32,2, 34,4, 41,8, 52,0, 104,8, 105,6, 145,5, 158,1, 169,0, 171,6, 171,9.

Пример CVI

Получение реагента общей формулы CIII: синтез гидразида 4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовой кислоты



N-трет-бутилоксикарбонилгидразид 4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензогидроксамовой кислоты

N-трет-бутилоксикарбонилгидразид метил-4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензота (0,30 г, 0,7 ммоль) добавляли к охлажденному (баня лед/вода) раствору, содержащему сульфат гидроксиламина (0,12 г, 0,7 ммоль), гидроксид натрия (0,15 г, 3,6 ммоль) и сульфит натрия (0,05 г, 0,4 ммоль) в воде (6 мл). Суспензию перемешивали в течение 24 ч в темноте, давая нагреться до комнатной температуры. Раствор разбавляли 1М соляной кислотой (4 мл) и экстрагировали дважды этилацетатом (порции объемом по 15 мл). Объединенные этилацетатные экстракты промывали водой (10 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха. Остаток растворяли в минимальном объеме этилацетата и добавляли диэтиловый эфир для осажденния смолообразного продукта оранжевого цвета. Смолу растирали с диэтиловым эфиром, получая твердое вещество, которое отфильтровывали, промывали простым эфиром и сушили в вакууме с получением 0,21 г (выход 62%) N-трет- бутилоксикарбонилгидразид 4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензогидроксамовой кислоты (t_пл разложение с выделением газа при 60-65^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, AMCO-d₆) 1,37 (синглет. 9H, (CH₃)₃C), 1,73 (квинтет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,07 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂, 2,15 (триплет, J= 7 Гц, 2H, HNHNOCCH₂), 4,08 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,22 (синглет, 2H, ArH), 8,28 (триплет, J=6 Гц, 1H, NH), 8,65 (синглет, 1H, NHNHCOCH₂), 9,47 (синглет, OCONHNH), 10,77 (синглет с расширением, 1H, NHOH), 12,30 (синглет с расширением, 3H, ArOH и NHOH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 21,3, 28,1, 32,7, 34,7, 41,7, 79,1, 100,1, 105,6, 145,8, 155,6, 159,8, 167,5, 171,7, 172,0.

Трифторацетат гидразида 4-глутapилaминoмeтил-2,6- дигидpoкcибeнзoгидроксамовой кислоты

трет-Бутилкарбазат 4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензогидроксамовой кислоты (0,09 г, 0,2 ммоль) суспендировали в безводном дихлорметане (5 мл) и добавляли трифторуксусную кислоту (0,5 мл). Твердый продукт растворялся при добавлении кислоты, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Через 1 ч образовывался осадок оранжевого цвета. Осадок собирали фильтрацией и сушили в вакууме над гранулами гидроксида калия, получая 0,1 г (выход 100%) трифторацетата гидразида 4-глутариламинометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовой кислоты (t_пл 104-108^oC, открытый капилляр, неточные данные).

¹H-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) 1,80 (квинтет, J=7 Гц, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2,17 (триплет, J= 7 Гц, 2H, CH₂CONHCH₂), 2,23 (триплет, J=7 Гц, 2H, HNHNOCCH₂), 4,09 (дублет, J=6 Гц, 2H, ArCH₂NH), 6,22 (синглет, 2H, ArH), 8,32 (триплет, J= 6 Гц, 1H, NH), 8,95-10,60 (синглет с очень большим расширением, 5H, NHNH₃ и NHOH), 11,80-12,95 (синглет с очень большим расширением, 3H, ArOH и NHOH).

¹³C-ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) 20,9, 32,2, 34,4, 41,8, 100,1, 105,7, 145,8, 158,5, 159,0, 159,9, 167,5, 171,8, 171,9.

Пример CVII

Получение конъюгатов общей формулы CIV

Синтез 5"-ФБК-меченных олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов

Олигодезоксирибонуклеотид 7172 (последовательность 5"- GATTACGCCAGTTGTACGGAC-3") синтезировали в масштабе 1 мкмоль, используя стандартный автоматический фосфорамидитный метод (устройство Beckman Instruments Oligo 1000 и входящие в него реагенты). С этим же устройством применяли защищенный аминосодержащий фосфорамидит (Aminolink 2, фирма Applied Biosystems или Unilink Amino Modifier, фирма Clontech) для введения 1-4 реакционноспособных первичных аминов на 5"-конец олигодезоксирибонуклеотида, используя стандартные химические методы. Полноразмерный олигодезоксирибонуклеотид затем отщепляли от носителя и удаляли защитные группы нуклеотидных оснований, используя набор Ultra Fast Deprotection kit (Beckman Instruments) согласно протоколу производителя.

Аминоолигонуклеотиды очищали путем осаждения этанолом, растворяли в 0,8 мл 0,1М NaHCO₃ и конденсировали с реагентом, содержащим фенилбороновую кислоту (ФБК-Z-NHS) и имеющим реакционноспособный фрагмент N-гидроксисукцинимидного эфира (5 мг на ммоль первичных аминогрупп аминоолигонуклеотида в 0,2 мл безводного N,N-диметилформамида), в течение 2-18 ч при комнатной температуре.

Неочищенный ФБК-модифицированный олигонуклеотид выделяли из реакционной смеси путем гель-фильтрации на колонке из декстрана типа KwikSep (фирма Pierce Chemical) в 0,1М водном растворе ацетата триэтиламмония, pH 6,5. Затем ФБК-модифицированный олигонуклеотид концентрировали в вакуумной центрифуге до объема 1 мл и очищали с помощью ЖХВД с обращенной фазой на C18-колонке размером 4,6х250 мм в градиенте ацетат триэтиламмония-ацетонитрил. Целевой продукт собирали и упаривали в вакуумной центрифуге до получения небольшой гранулы, растворяли в 0.5 мл воды и хранили в замороженном виде.

Получение магнитных гранул салицилгидроксамовой кислоты

Десять мл немодифицированных магнитных гранул М280 или М450 (фирма Dynal) постепенно дегидратировали в ацетонитриле и превращали в модифицированные альдегидом гранулы с помощью оксалилхлорида, активированного N,N-диметилсульфоксидом и триэтиламином в дихлорметане при -78^oC. Образовавшиеся несущие альдегид гранулы постепенно регидратировали и суспендировали в 5 мл 0,1М натрий- ацетатного буфера, pH 5,5. Альдегидные группы сочетали с гидразидом 4-глутариламинометилсалицилигидроксамовой кислоты (СГК-Z-NHNH₂), добавляя 15-25 мг продукта, растворенного в 200 мкл N,N-диметилсульфоксида, и проводя циклическую реакцию сочетания в течение ночи при комнатной температуре. Гранулы затем интенсивно промывали водой и хранили в 5 мл 10%-ного этанола.

Получение комплекса салицилгидроксамовая кислота (СГК)- сефароза 4В

СГК-сефарозу 4В получали перемешиванием в течение ночи при комнатной температуре 130 мг (6-аминогексаноил)-4- аминометилсалицилгидроксамовой кислоты (СГК-Z-NH₂), растворенной в 30 мл 0,2М NaHCO₃, с 6,5 г HCl, промытой CNBr- активированной сефарозой 4В (фирма Pharmacia). После реакции сочетания добавляли 2 мл 0,5М трис, pH 8,5 и гелеобразную суспензию смешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем промывали водой, 0,5М NaCl и еще раз водой. Образовавшийся конъюгат СГК-сефароза 4В суспендировали в 30 мл 20%-ного этанола и хранили при 4^oC.

Получение комплекса 2,6-дигидроксибензогидроксамовая кислота (ДГБГК-сефароза 4В

(ДГБГК-сефарозу 4В получали, перемешивая в течение ночи при комнатной температуре 114 мг метил(6-аминогексаноил)-4-аминометил-2,6- дигидроксибензоата [ДГБК(OMe)-X-NH₂] , растворенного в 30 мл 0,2М NaHCO₃, с 5 г HCl, промытой CNBr-активированной сефарозой 4В (фирма Pharmacia). После реакции сочетания гель промывали водой и суспендировали в 50 мл 0,1 M NH₂OH, pH 9, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. В завершение гель промывали водой и суспендировали в 30 мл 20%-ного этанола и хранили при 4^oC.

Получение конъюгата фенилбороновая кислота-антитело к -биотину

1 мл моноклонального антитела IgG1 к -биотину (6,5 мг/мл в 0,1 М NaHCO₃) конъюгировали с 440 нмоль ФБК-Z-NHS (7,5 мкл 60 мМ ФБК-Z-NHS, растворенного в N,N-диметилсульфоксиде), в течение 1 ч при комнатной 1 температуре. Неконъюгированный ФБК-Z-NHS и продукты его гидролиза удаляли диализом. Ультрафиолетовый спектр абсорбции образовавшегося конъюгата (ФБК- -биотин) показал увеличение абсорбции при 260 нм (А₂₆₀) относительно А₂₈₀, что свидетельствует о модификации фенилбороновой кислоты.

Получение конъюгата фенилбороновая кислота-щелочная фосфатаза

Один мл щелочной фосфатазы (фирма Sigma, 6 мг/мл) подвергали диализу с использованием 1 л 0,1M NaHCO₃ и конъюгировали с 700 нмоль ФБК-Z-NHS (10 мкл 70 мМ маточного раствора в N,N-диметилформамиде) и течение 2 ч на льду. Неконъюгированный ФБК-Z-NHS и продукты его гидролиза удаляли диализом с использованием 0,1М NaHCO₃. Ультрафиолетовый спектр абсорбции образовавшегося конъюгата (ФБК-ЩФ) показал увеличение А₂₆₀ относительно A₂₈₀, что свидетельствует о модификации фенилбороновй кислоты. Конъюгат хранили при 4^oC.

Получение конъюгата 2,6-дигидроксибензогидроксамовая кислота-щелочная фосфатаза

Один мл щелочной фосфатазы (фирма Sigma, 6 мг/мл) подвергали диализу с использованием 1 л 0,1М NaHCO₃ и конъюгировали с 714 нмоль сукцинимидилового эфира метил-4-глутариламинометил-2,6- дигидроксибензоата [ДГБК(OMe)-Z-NHS] (10,5 мкл 68 мМ в N,N- диметилформамиде) и течение 2 ч на льду. Метиловый эфир конъюгата превращали в гидроксамовую кислоту, добавляя 1 мл 2М NH₂OH, pH 10, и инкубируя реакционную смесь при 4^oC в течение 6 дней. NH₂OH-реакционную смесь затем подвергали диализу с использованием 0,1М NaHCO₃ и хранили при 4^oC.

Получение конъюгата салицилгидроксамовая кислота-козлиное -мышиное антитело

Два мл козлиного -мышиного антитела (фирма Rockland, 8,8 мг/мл в 0,1М NaHCO₃) конъюгировали с 2,35 мкмоль сукцинимидилового эфира 4-глутариламинометилсалицилата [CK(OMe)- Z-NHS] в течение 1 ч при комнатной температуре. Метиловый эфир конъюгата превращали в гидроксамовую кислоту добавлением 2 мл 2М NH₂OH, pH 10, доведением значения pH до 10 с помощью 1н. NaOH и инкубированием реакционной смеси при комнатной температуре в течение 3 дней. NH₂OH и неконъюгированный CK(OMe)-X-NHS и продукты его гидролиза удаляли гель-фильтрацией на G-25-колонке с сефадексом (фирма Pharmacia) в 0,1М NaHCO₃ и конъюгат (СГК- козлиное -мышиное антитело) хранили при 4^oC.

Получение конъюгата 2,6-дигидроксибензогидроксамовая кислота-козлиное -мышиное антитело

Два мл козлиного -мышиного антитела (фирма Rockland, 8,8 мг/мл в 0,1М NaHCO₃) конъюгировали с 2,35 мкмоль [ДГБК(OMe)-Z-NHS] в течение 1 ч при комнатной температуре. Метиловый эфир конъюгата превращали в гидроксамовую кислоту добавлением 2 мл 2М NH₂OH, pH 10, доведением значения pH до 10 с помощью 1н. NaOH и инкубированием реакционной смеси при комнатной температуре в течение 3 дней. NH₂OH и неконюгированный ДГБК(OMe)-X-NHS и продукты его гидролиза удаляли гель-фильтрацией на G-25-колонке с сефадексом (фирма Pharmacia) в 0,1М NaHCO₃ и конъюгат (ДГБК-козлиное -мышиное антитело) хранили при 4^oC.

Протокол полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Область ДНК фага лямбда (801 пара оснований) амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции. Реакционная смесь для ПЦР включала в 1 мкМ однократного (1х) ПЦР-буфера II (фирма Perkin Elmer) 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ, а также биотин- и ФБК-модифицированные олигонуклеотидные праймеры, ДНК фага лямбда (1 нг/мкл) и 1 ед. ДНК-полимеразы Thermus aquaticus. Реакционную смесь денатурировали при 92^oC в течение 1 мин и аплифицировали с помощью 35 циклов ПЦР при 95^oC и течение 10 с, при 62^oC в течение 20 с и при 72^oC в течение 30 с, конечное удлинение проводили 72^oC в течение 5 мин. В результате реакции получали 50-100 нг амплифицированного продукта (801 пара оснований), который отличался замедленной подвижностью относительного немодифицированного ПЦР-продукта в процессе электрофореза на 1%-ных агарозных гелях в буфере, содержавшем 50 мМ трис, 100 мМ борат, 2 мМ ЭДТК, pH 8,3.

Пример CVIII

Получение биоконъюгатов общей формулы CVI

Обнаружение с помощью сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот-зондов

42-мерный олигонуклеотид гибридизовали с двумя 21-мерными олигонуклеотидами, несущими 5"-ФБК и биотиновые метки, в 1,5М NaCl, 150 мМ натрий-цитратном буфере, pH 7, при 45^oC в течение 10 мин. 25 мкл смеси для гибридизации смешивали с 25 мкл стрептавидин-магнитными частицами М280 (фирма Dynal) в лунке полипропиленового титрационного микропланшета. Через 30 мин магнитные частицы собирали на дне лунки с помощью магнитной пластины и пятикратно промывали буфером, содержащим 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, 0,02% твина 20, pH 8.

100 мкл ДГБГК-ЩФ (1 мкг/мл в 1 мг/мл БСА, 140 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, pH 8) добавляли к магнитным частицам и тщательно смешивали. Через 30 мин магнитные частицы собирали на дне лунки с помощью магнитной пластины и фестикратно промывали буфером, содержащим 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, 0,02% твина 20, pH 8. Добавляли субстрат для щелочной фосфатазы (1 мг/мл пара-нитрофенилфосфата в 1М диэтаноламинном буфере, 1 мМ MgCl₂, 0,1 мМ 1 ZnCl₂, pH 10,4) и инкубировали при 37^oC в течение 90 мин. Абсорбцию при 405 нм (A₄₀₅) измеряли с помощью планшет-ридера для ELISA-анализа (фирма Molecular Devices).

Выраженную абсорбцию при 405 нм (А₄₀₅) получали, когда присутствовали все компоненты сэндвича для гибридизации, а сигнал был пропорционален количеству 42-мерного олигонуклеотида. В контрольных экспериментах, в которых отсутствовали либо 42-мерный олигонуклеотид, либо меченные биотином олигонуклеотиды или ФБК- олигонуклеотиды, не обнаружено выраженной абсорбции при 405 нм (А₄₀₅).

Пример CIX

Получение биоконъюгатов общей формулы CVI

Обнаружение ФБК-меченного ПЦР-продукта на титрационных микропланшетах, сенсибилизированных ДГБГК

Лунки полистиролового титрационного микропланшета (фирма Becton Dickinson) сенсибилизировали ДГБГК, наполняя лунки 200 мкл конъюгата ДГБГК-козлиное -мышиное антитело (30 мкл/мл в 0.1М NaHCO₃, pH 9,0) и инкубировали в течение ночи при 4^oC. Сенсибилизирующий раствор удаляли и планшет повторно сенсибилизировали с помощью 5 мг/мл БСА (300 мкл на лунку в 0,2М NaHCO₃, pH 9,0) в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор БСА удаляли путем пятикратной промывки промывочным буфером для ELISA (150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, 0,02% твин 20, pH 8).

100 мкл неочищенного ПЦР-продукта, меченного ФБК и биотином, добавляли к 900 мкл буфера, содержащего 1,5 н. NaCl, 150 мМ цитрат натрия, pH 7,0 (10xSSC (десятикратный раствор хлорида и цитрата натрия)), и проводили серийное разведение с помощью десятикратного SSC. В лунки добавляли 100 мкл разведенных ПНР-продуктов и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет затем пятикратно промывали в промывочном буфере для ELISA и в каждую лунку добавляли 100 мкл комплекса стрептавидин-щелочная фосфатаза (фирма Boehrtingher Manhheim, 0,2 ед./мл в 1 мг/мл БСА, 140 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, pH 8) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.

Планшет пятикратно промывали промывочным буфером для ELISA и в планшет добавляли 200 мкл пара-нитрофенилфосфата (1 мг/мл в 1М диэтаноламине, 1 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, pH 10,4) и инкубировали при 37^oC в течение 30-60 мин. Обнаружено менее 1 мкл ПЦР-продукта, ПЦР-продукт, в котором отсутствовали как ФБК-метка, так и биотин, не выявлялись.

Пример CIX

Получение биоконъюгатов общей формулы CVI

Обнаружение ФБК-меченного ПЦР-продукта

Обнаружение ФБК-меченного ПЦР-продукта на СГК-магнитных гранулах

ФБК-меченный ПЦР-продукт (0,02 мкл-5 мкл) разбавляли в 25-100 мкл буфера, содержащего 1,5 М NaCl, 150 мМ цитрат натрия, pH 7 (10-кратный SSC) и вносили в лунку полипропиленового титрационного микроплантшета, содержащую СГК-магнитные частицы (10-50 мкл). Частицы и ПЦР-продукт периодически перемешивали в течение 30-60 мин при комнатной температуре. Магнитные частицы собирали на дне лунки с помощью магнитной пластины и пятикратно промывали в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, 0,02% твина 20, pH 8 (промывочный буфер для ELISA). Добавляли 100 мкл комплекса стрептавидин-щелочная фосфатаза (фирма Boehrtingher Manhheim, 0,2 ед./мл в 1 мг/мл БСА, NaCl, трис-HCl, pH 8) и смешивали с магнитными частицами в течение 30 мин при комнатной температуре. Магнитные частицы собирали на дне лунки с помощью магнитной пластины и пятикратно промывали промывочным буфером для ELISA. Добавляли субстрат для щелочной фосфатазы (1 мг/мл пара-нитрофенилфосфат в 1М диэтаноламинном буфере, 1 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, pH 10,4) и проводили окрашивание при 37^oC в течение 10-60 мин. Нижний предел чувствительности метода составлял 50 пг ПЦР-продукта.

Пример CXI

Получение биоконъюгатов общей формулы CVI

Обнаружение ФБК-меченного олигонуклеотидного гибрида

Обнаружение ФБК-меченного олигонуклеотида, гибридизованного с меченным биотином олигонуклеотидом

42-мерный олигонуклеотид гибридизовали с двумя 21-мерными олигонуклеотидами, несущими 5"-ФБК и биотиновые метки в 1,5М NaCl, 150 мМ натрий-цитратном буфере, pH 7, при 45^oC в течение 10 мин. 25 мкл смеси для гибридизации смешивали с 1-50 мкл СГК-магнитными частицами (фирма Dynal, М450) в лунке полипропиленового титрационного микропланшета. Через 30 мин магнитные частицы собирали на дне лунки с помощью магнитной пластины и пятикратно промывали буфером, содержащим 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, 0,02% твин 20, pH 8.

100 мкл СГК-ЩФ (1 мкг/мл в 1 мг/мл БСА, 140 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, pH 8) добавляли к магнитным частицам и хорошо смешивали. Через 30 мин магнитные частицы собирали на дне лунки с помощью магнитной пластины и шестикратно промывали буфером, содержащем 150 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, 0,02% твина 20, pH 8. Частицы смешивали с субстратом для щелочной фосфатазы (1 мг/мл пара-нитрофенилфосфата в 1М диэтаноламинном буфере, 1мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, pH 10,4) и инкубировали при 37^oC в течение 90 мин. Абсорбцию при 405 нм (А₄₀₅) измеряли с помощью планшет-ридера для ELISA (фирма Molecular Devices). Было обнаружено не более 45 пг 42-мерного олигонуклеотида. В контрольных экспериментах, в которых отсутствовали либо 42-мерный олигонуклеотид, либо меченные ФБК или биотином олигонуклеотиды, не выявлено выраженной абсорбции при 405 нм (А₄₀₅).

Пример CXII

Получение биоконъюгатов общей формулы CVI

Иммобилизация конъюгата ФБК- -биотин на СГК-сефарозе 4В

1 мг конъюгата ФБК- -биотин, разбавленного до 1 мл забуференным трис физиологическим раствором, вносили в небольшую колонку из СГК-сефарозы 4В (1,0х2,0 см) и интенсивно промывали забуференным трис физиологическим раствором. Размер пика при А₂₈₀ для продукта, не связавшегося с колонкой, свидетельствовал о том, что практически весь ФБК-конъюгат был иммобилизован на колонке.

Способность колонки связывать биотин определяли путем внесения в колонку 5 мл 1 мкг/мл биотинилированной щелочной фосфатазы в забуференном трис физиологическом растворе, который содержал 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА). Образец продукта, прошедшего через колонку, собирали с целью сравнения ферментативной активности образца с активностью соответствующего разбавления щелочной фосфатазы, внесенного в колонку. После получения образца колонку промывали 20 мл буфера. После промывки очень небольшой образец материала колонки (25 мкл жидкости, содержащей примерно 1 мкл геля) собирали для измерения связанной с гелем ферментативной активности, которая получена в результате захвата иммобилизованным -биотиновым антителом.

Активность щелочной фосфатазы измеряли путем инкубации 25 мкл образов фермента в 250 мкл 1 мг/мл пара-нитрофенилфосфата в 1М диэтаноламинном буфере, 1 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, pH 10,4 в течение 20 мин и последующего внесения 650 мкл 0,1М NaHCO₃, 10 мМ ЭДТК. По сравнению с чистым буфером значение А₄₀₅ образца, нанесенного на колонку, составляло 1,57, в то время как значение А₄₀₅ продукта, несохранившегося на колонке, составляло только 0,042, свидетельствуя о том, что практически весь включающий фермент конъюгат был иммобилизован на колонке. Для небольшого количества изученного геля значение A₄₀₅ составило 1,30, свидетельствуя о том, что фермент действительно был захвачен колонкой.

Пример CXIII

Получение биоконъюгатов общей формулы CVI

Иммобилизация конъюгата ФБК-щелочная фосфатаза на СГК-магнитных гранулах

Конъюгат ФБК-щелочная фосфатаза разбавляли до 5 мкг/мл забуференным трис физиологическим раствором, который содержал 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. 200 мкл разбавленного, конъюгированного с ФБК фермента смешивали с 5, 10 или 20 мкл конъюгата СГК-магнитные частицы (фирма Dynal, М450). Фермент также смешивали с 40 мкл немодифицированных гранул в качестве контроля. Гранулы осторожно перемешивали в течение 10 мин на льду, после чего гранулы собирали магнитом из редкоземельного металла и 4 раза промывали забуференным трис физиологическим раствором. Затем гранулы суспендировали с 250 мкл 1 мг/мл пара-нитрофенилфосфата в 1М диэтаноламинном буфере, 1 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, pH 10,4, и периодически перемешивали при 37^oC в течение 10 мин. Реакцию прекращали с помощью 750 мкл забуференного трис физиологического раствора, 5 мМ ЭДТК. Оценивали значение А₄₀₅ по сравнению с чистым буфером с целью определения активности щелочной фосфатазы, связанной с магнитными гранулами. Для контрольных гранул значение А₄₀₅ составляло только 0,15, в то время как значение А₄₀₅ для СГК-магнитных гранул составляло 0,62, 0,97 и 1,33 для 5, 10 и 20 мкл гранул соответственно, что свидетельствует об иммобилизации значительного количества конъюгата ФБК-ЩФ на поверхности гранул.