способ хирургического лечения глубоких дефектов роговицы

Формула изобретения

1. Способ лечения глубоких дефектов роговицы, включающий заполнение дефекта трехмерным коллагеновым гелем, отличающийся тем, что используют гель с включенными в него аллогенными фибробластами в концентрации 100-300 тысяч клеток в 1 мл геля.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гель фиксируют с помощью контактной линзы.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют постнатальные фибробласты.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что манипуляцию повторяют до полного закрытия дефекта.

Описание изобретения к патенту

Способ хирургического лечения глубоких дефектов роговицы.

Изобретение относится к области медицины - офтальмологии - предназначено для лечения больных с глубокими дефектами роговицы, в том числе послеожоговыми язвами роговицы с угрозой перфорации.

Хирургическое лечение больных с глубокими дефектами роговицы остается актуальной проблемой в офтальмотравматологии. Нередко даже применение самых современных способов лечения не оказывает эффекта и процесс заканчивается перфорацией роговицы и функциональной гибелью глаза.

Известны способы закрытия дефектов роговицы кадаверной роговицей (Killingsworth D.W. et all. Results of therapeutic penetrating keratoplasty. //Ophthalmology. , 1993 Apr. , 100(4), P.534-41), собственной конъюнктивой (Гундорова Р. А. и др. Аутоконъюнктивальная пластика роговицы - операция выбора для герметизации неинфекционных дефектов роговицы. //Тезисы научно-практической конференции "Теоретические и клинические исследования как основа медикаментозного и хирургического лечения травм органа зрения". Москва, 2000 г. , стр.45-47), аллоплантами (Мулдашев Э.Р. Аллопланты в офтальмохирургии. //Уфа, 1987 г., стр. 80).

Однако получение кадаверной роговицы связано с определенными трудностями: дополнительное обследование трупа донора на наличие у него различных инфекций, получение согласия родственников умершего на взятие материала и др. Также нередки случаи отторжения и некроза трансплантата вследствие глубокого нарушения микроциркуляции собственной поврежденной ткани, развития механизмов иммунологического конфликта в организме реципиента с донорской тканью (Тазетдинова Н. Р. Клинико-иммунологическое обоснование патогенетически ориентированного медикаментозного и хирургического лечения ожоговой болезни глаз. //Дисс. канд. мед. наук. М., -1989. Стр. 26.; Легеза Г.В. и др. Ошибки в тактике лечения тяжелых ожогов глаз на ранних стадиях и их причины. //Ожоги глаз и их последствия, материалы научно-практич. Конф. Москва. -1997. -Стр. 23-24; Kuckelkorn R. et al, Retrospektive Betrachtung von schweren Alkaliveratzungen der Augen.//Klin. Mbl. Augenheilkd. -1993/ -Bd. 203, H.6. -S.397-402). При приживлении трансплантатов формируется грубое помутнение роговицы со значительным снижением остроты зрения травмированного глаза.

Наиболее близким способом того же назначения является способ, при котором осуществляют заполнение глубокого дефекта роговицы коллагеновым гелем (US 5522888А, 18.05.95). Раствор содержит измельченное вещество ткани природного геля, введенное в трехмерную полимерную сетку гидрогеля, и служит для стимулирования роста клеток эпителия и восстановления стромы роговицы глаза. Данный материал способен в процессе заживления покрываться эпителием роговицы. Коллагеновый гель играет роль матрикса для собственных фибробластов, которые, мигрируя в гель, постепенно закрывают дефект. Однако при этом способе коллагеновый гель не оказывает специфического стимулирующего воздействия на репаративные процессы, глубокое угнетение которых происходит при послеожоговых и трофических глубоких дефектах роговицы.

Предлагаемый способ основан на применении выращенных в культуре аллогенных фибробластов, включенных в трехмерный коллагеновый гель, представляющий собой эквивалент дермы. Основным преимуществом предлагаемого способа является его многофакторное воздействие на деструктивный процесс: 1 - коллагеновый гель, обладая неспецифическим стимулирующим действием на регенерацию роговичной ткани, играет роль трехмерного каркаса для миграции собственных фибробластов и эпителиальных клеток в дефект стромы и эпителия, выполняет протекторную функцию в защите подлежащих собственных тканей от негативного воздействия факторов внешней среды; 2 - внесенные в коллагеновый гель культивированные аллогенные фибробласты оказывают специфическое стимулирующее воздействие на регенерацию роговичной ткани посредством секреции факторов роста, цитокинов и др. во внешнюю среду, принимают активное участие в синтезе собственной базальной мембраны эпителия.

Метод трансплантации культивированных аллогенных фибробластов в коллагеновом геле успешно применяется в клинической комбустологии, лечении хронических трофических язв и свищей (Сергиенко Н.Ф. и др. Лечение мочевых свищей с применением культуры алогенных фибробластов. //Урология, 1999 г., N1, стр. 44-46).

По данным различных авторов приживление трансплантата аллогенных клеток наступает в 50-90% случаев. Пересаженные клетки оказывают многофункциональное влияние на процессы заживления раны, предотвращая негативное воздействие факторов внешней среды на глубжележащие ткани, выделяя различные клеточные медиаторы стимуляции регенерации, участвуют в синтезе базальных мембран. В результате происходит восстановление типичного для данной ткани эпителия (по пути физиологической эпителизации). Этот процесс носит гистотипический характер. Эпителизация сопровождается постепенным вытеснением или лизисом трансплантата (Smirnov S.V. et all. Seven-years experience in the treatment of burm patients with allogenic cultured keratinicytes. //Annals of bums and fire disasters, Vol. XII, N4, dec. l998, p. 212-216).

Однако восстановление дефектов роговицы принципиально отличается от закрытия дефектов других тканей, при лечении которых использовали трансплантацию аллогенных фибробластов. Если в случае глубоких дефектов кожи, мочевых свищей, эрозий шейки матки восстановление дефекта происходит в основном за счет контракции, то при глубоких дефектах роговицы закрытие дефекта происходит исключительно в результате миграции собственных фибробластов в дефект без элементов контракции, что послужило предпосылкой для использования аллогенных фибробластов при лечении ожогов роговицы.

В офтальмологии предлагаемый способ был впервые применен нами на экспериментальных животных. Эксперимент проведен на стандартной модели тяжелого щелочного ожога роговицы. Экспериментальный ожог глаз 10 кроликов наносили под кеталаровым наркозом путем накладывания на роговицу пропитанного 10% раствором NaOH круга фильтровальной бумаги диаметром 7 мм, время экспозиции 40 секунд. Трехмерный коллагеновый гель с фибробластами получали следующим способом. Стерильный раствор NaOH 0.34 М соединяли с концентрированной питательной средой Игла (x10) или средой 199 в соотношении 1:2, добавляли 100 мг глутамина и 9.0 мл 7.5% раствора бикарбоната натрия на каждые 100 мл среды. Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена 1 типа в уксусной кислоте в соотношении 1:4, одновременно в раствор вносили выращенные культивированные фибробласты в среде 199 или среде Игла (Сергиенко Н. Ф. и др. Лечение мочевых свищей с применением культуры алогенных фибробластов. //Урология, 1999 г., N1, стр. 44-46). В отличии от стандартного способа концентрация фибробластов составляла 100-300 тысяч клеток в 1 мл конечного коллагенового геля. Данная концентрация фибробластов в коллагеновом геле (в 2-3 раза выше, чем в известном способе) была разработана нами специально для лечения глубоких дефектов роговицы. Это связано с тем, что механизм регенерации роговицы отличается от такового в коже и для полноценной регенерации роговицы требуется большая стимуляция со стороны фибробластов.

На следующие сутки культивированные фибробласты в коллагеновом геле после предварительной некрэктомии были уложены на дефект. Фиксация трансплантата проводилась с помощью терапевтической мягкой контактной линзы.

Морфогистологические исследования, проведенные на 2, 7, 14, 30 сутки, свидетельствуют о временном приживлении трансплантата и постепенном замещении коллагенового геля и аллогенных фибробластов собственными кератоцитами. Восстановление эпителия происходит за счет эпителизации по поверхности трансплантата с сохранением эпителиального покрова в процессе замещения трансплантата. В итоге происходит закрытие роговичного дефекта и предупреждение грозного осложнения ожога роговицы - перфорации. Обнадеживающие результаты позволили нам применить способ в клинической практике.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является восстановление структуры роговицы с небольшим количеством рубцовой ткани.

Технический результат достигается за счет стимуляции неосинтеза коллагена в строме роговицы с помощью коллагенового геля с включенными в него любыми аллогенными фибробластами, как постнатальными, так и эмбриональными.

Способ осуществляется следующим образом. После местной анестезии лезвием и скарификатором производят удаление некротически измененной роговичной ткани. В дефект роговицы укладывают соответствующий по объему дефекта трансплантат культивированных фибробластов в трехмерном коллагеновом геле, трансплантат фиксируют в ложе роговицы, например, мягкой контактной линзой, через 3-7 дней регистрируют результаты лечения и в случае неполного закрытия дефекта манипуляцию повторяют.

Конкретные примеры выполнения способа.

Пример N1. Кролик N1. Модель тяжелого химического ожога роговицы обоих глаз щелочью по стандартной методике. На 2 сутки после ожога под кеталаровым наркозом произведена некрэктомия на обоих глазах. На опытном глазу в дефект роговицы произведена трансплантация коллагеннового геля с включенными в него культивированными человеческими фибробластами в концентрации 100 тыс. клеток в 1 мл геля. На обоих глазах роговица закрыта мягкой контактной линзой диаметром 18 мм и произведена некровавая блефарорафия. На 7 сутки при осмотре на обоих глазах отмечено формирование десцеметоцеле, однако на опытном глазу диаметр десцеметоцеле в 2 раза меньше, чем на контрольном. Произведена повторная трансплантация фибробластов на опытном глазу с концентрацией 100 тыс. клеток в 1 мл геля. В дальнейшем на опытном глазу отмечено полное закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы на 20 сутки после операции. На контрольном глазу до последнего дня наблюдения (30 сутки) имела место персистирующая эрозия и сохранялся дефект стромы.

Пример N2. Кролик N2. Модель тяжелого химического ожога роговицы обоих глаз щелочью по стандартной методике. Полученный дефект роговицы оказался большим по объему, чем в примере N1. На 2 сутки после ожога под кеталаровым наркозом произведена некрэктомия на обоих глазах. На опытном глазу в дефект роговицы произведена трансплантация коллагеннового геля с включенными в него культивированными человеческими фибробластами в концентрации 200 тыс. клеток в 1 мл геля. На обоих глазах роговица закрыта мягкой контактной линзой диаметром 18 мм и произведена некровавая блефарорафия. На 7 сутки при осмотре на обоих глазах отмечено формирование десцеметоцеле, однако на опытном глазу диаметр десцеметоцеле в 2 раза меньше, чем на контрольном. Произведена повторная трансплантация фибробластов на опытном глазу при концентрации 200 тыс. клеток в 1 мл геля. В дальнейшем на опытном глазу на 22 сутки после операции отмечено полное закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы. На контрольном глазу к 28 суткам также наступила полная эпителизация раны роговицы с формированием грубого бельма 4-5 категории.

Пример N3. Кролик N3. Модель тяжелого химического ожога роговицы обоих глаз щелочью по стандартной методике. К 12 суткам после нанесения ожога на обоих глазах сформировалось десцеметоцеле диаметром до 5 мм. На 13 сутки после ожога под кеталаровым наркозом произведена некрэктомия на обоих глазах. На опытном глазу в дефект роговицы произведена трансплантация коллагеннового геля с включенными в него культивированными человеческими фибробластами в концентрации 100 тыс. клеток в 1 мл геля. На обоих глазах роговица закрыта мягкой контактной линзой диаметром 18 мм и произведена некровавая блефарорафия. При осмотре на 7 сутки на опытном глазу отмечено уменьшение диаметра десцеметоцеле на 3 мм, на контрольном глазу диаметр десцеметоцеле уменьшился на 1 мм. Произведена повторная трансплантация фибробластов на опытном глазу с концентрацией 100 тыс. клеток в 1 мл геля. В дальнейшем на опытном глазу на 14 сутки после операции наступило полное закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы. На контрольном глазу к 20 суткам также наступила полная эпителизация раны роговицы с формированием грубого бельма 4-5 категории.

Пример N4. Больной К. 5 дней назад перенес химический щелочной ожог роговицы 3-4 степени. Консервативное лечение по месту жительства неэффективно. При поступлении роговица матового цвета, глубокий дефект роговицы диаметром до 8 мм. Конъюнктива в верхнем своде гиперемирована, васкуляризирована. Произведена операция на травмированном глазу по предложенному способу: некрэктомия, трансплантация аллогенных культивированных фибробластов в трехмерном коллагеновом геле с концентрацией 300 тыс. клеток в 1 мл геля с фиксацией трансплантата мягкой контактной линзой диаметром 14 мм. На 5 сутки после трансплантации отмечено уменьшение диаметра дефекта роговицы до 4 мм. Произведена повторная трансплантация фибробластов с концентрацией 300 тыс. клеток в 1 мл коллагенового геля. На 4 сутки после второй трансплантации отмечено уменьшение диаметра дефекта роговицы до 2 мм. Произведена третья трансплантация с концентрацией 100 тыс. клеток в 1 мл геля. В послеоперационном периоде к 14 суткам после начала лечения наступило полное закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы. Выписан с остротой зрения 0.1 на травмированном глазу.

Пример N5. Больной М. 30 дней назад перенес термохимический ожог конъюнктивы 1-2 степени, роговицы 3 степени. Консервативное лечение по месту жительства без положительного эффекта. При поступлении определяется глубокий дефект роговицы диаметром до 6 мм, роговица отечная, по периферии отек эпителия, местами эпителий отсутствует. Глубжележащие структуры не видны. На 30 сутки после травмы произведена операция по предложенному способу с введением в дефект коллагенового геля с концентрацией фибробластов 200 тыс. клеток в 1 мл геля. На 5 сутки после операции отмечено уменьшение дефекта роговицы до 3 мм. Произведена вторая трансплантация фибробластов с концентрацией 200 тыс. клеток в 1 мл геля. На 4 сутки после второй трансплантации отмечено уменьшение диаметра дефекта роговицы до 2 мм. Произведена третья трансплантация с концентрацией 200 тыс. клеток в 1 мл геля. К 16 суткам после начала лечения отмечено полное закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы.

Всего предлагаемым способом оперировано 10 кроликов и 4 больных с тяжелыми ожогами роговицы. Во всех случаях получена активизация репаративных процессов, быстрое закрытие дефектов стромы и эпителия роговицы.

Основным преимуществом предлагаемого способа является его многофункциональное действие на деструктивный процесс: стимуляция аллогенными фибробластами регенерации посредством секреции факторов роста, цитокинов и др. во внешнюю среду, активное участие их в синтезе собственной базальной мембраны, формирование коллагеновым гелем каркаса для миграции собственных фибробластов в дефект стромы, защита коллагеновым гелем подлежащих собственных тканей от негативного воздействия факторов внешней среды. Преимуществом способа является формирование помутнения роговицы меньшей интенсивности, чем при использовании других способов лечения.