способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмоза

Формула изобретения

Способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмоза, включающий выделение из сыворотки иммуноглобулинов, отличающийся тем, что сыворотку получают на 10-14 сутки обострения болезни от больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих на протяжении 2-10 лет в количестве 5-10 мл, с титрами антитела в НМФА > 1 : 640 или в ИФА > 1 : 3200, инактивируют при 56°С в течение 30 мин, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов двухкратным осаждением 20%-ным раствором полиэтиленгликоля, тип 6000, и метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом в соотношении Igтокс-ФИТЦ-20 : l.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения антитоксоплазменных иммуноглобулинов для прямого обнаружения токсоплазм в патологическом материале.

В связи с разнообразием характера течения болезни при токсоплазмозе практически исключается возможность постановки диагноза только на основании клинической картины. В большинстве случаев при диагностике токсоплазмоза ориентируются на выявление в сыворотках крови токсоплазменных антител. В то же время способность токсоплазм поражать клетки всех типов тканей, определяющая многообразие клинических проявлений заболевания, не всегда сопровождается выработкой специфических антител. Поэтому вопрос о выделении токсоплазм и обнаружение их в клиническом материале у больных с подозрением на токсоплазмоз, а также в патологоанатомических образцах остается актуальным.

Существующие методы исследования возбудителя токсоплазмоза включают поиск его путем непосредственной микроскопии материала в гистологических срезах внутренних органов либо с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также выделение микроорганизма на восприимчивых лабораторных животных.

Перечисленные методы диагностики токсоплазмоза не пользуются широкой популярностью в практической медицине. Несмотря на то, что метод прямой микроскопии несложен и доступен, он не всегда информативен и его отрицательный результат не исключает наличия токсоплазменной инфекции. Выделение токсоплазм методом биопробы предполагает работу с живым возбудителем и восприимчивыми лабораторными животными (белые мыши, морские свинки, кролики или хомяки), трудоемок, дорогостоящ и продолжителен по времени получения результата. (Эпидемиология, клиника, диагностика и лечение токсоплазмоза. Методические рекомендации. Авторы: Л.И.Грачева, Д.Б.Гончаров -М., 1998, с. 24). ПЦР - дорогостоящий диагностический тест и доступен не всем лабораториям.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является сэндвичная иммунологическая проба. При выполнении данного теста для обнаружения в образце биологической жидкости животных антигена Toxsoplasma gondii, который вызывает острую форму токсоплазмоза, на поверхности твердого субстрата сорбируют F (ав¹)₂ - фрагмент Ig-антител к упомянутому антигену либо моноклональные антитела к нему, добавляют к сорбируемому материалу исследуемый образец и инкубируют полученную смесь. Разделяют адсорбируемые и неадсорбируемые фракции инкубируемой смеси и к первой из них добавляют меченые антитела к Т. gondii. Вторую смесь также инкубируют и затем разделяют адсорбированную и неадсорбированную ее фракции. В первой определяют присутствие меченого антитела (США, патент N 4361647).

Недостатками выполнения данного иммунологического теста является его многоэтапность, дороговизна, необходимость иммунизации животных для получения иммунных специфических к T.gondii сывороток и F (ав¹)₂ фрагмента либо моноклональных антител, которые используются в качестве "подложки".

Целью настоящего изобретения является упрощение способа получения высокоактивных и специфических антител к токсоплазмам для выявления антигенов Т. gondii непосредственно в клиническом материале от больных токсоплазмозом, а также в патологоанатомических образцах в прямом варианте МФА.

Поставленная цель достигается тем, что иммунную сыворотку к токсоплазмам получают от больных людей хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения (повышение температуры, увеличение периферических лимфатических узлов, головная боль, сильная слабость) отбирают сыворотку в количестве 5-10 мл от одного больного и определяют титры специфических антител НМФА и в ИФА. Сыворотку с высоким титром специфических токсоплазменных антител ( 1:640 в НМФА или 1:3200 в ИФА) инактивируют при 56^oC в течение 30 мин и центрифугируют при 13000 об/мин для удаления аггрегированных белков в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и помещают на мешалку. Добавляют равный объем 20% раствора полиэтиленгликоля, тип 6000. После экспозиции 20 мин при комнатной температуре осадок отделяют центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема. Снова добавляют равный объем раствора ПЭГ и после экспозиции центрифугируют повторно. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема (5 мл). Добавляют 1% хлороформа, перемешивают, помещают в холодильник и через 2 часа центрифугируют при 13000 об/мин - 30 мин. Надосадочная жидкость представляет собой раствор иммуноглобулина (Ig). Осуществляют метку флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в соотношении Ig:ФИТЦ 20:1.

Полученные таким образом иммуноглобулины в разведении 1:256 - 1:2000 способны обнаруживать антигены токсоплазм как в клиническом материале от больных, так и в патологоанатомических образцах от плода при поздних выкидышах и от мертворожденных детей.

Примеры конкретного выполнения.

I. Отбор сывороток

1. У больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения проводят забор крови в количестве 5-10 мл.

2. Определяют титры антител к токсоплазмам в сыворотке крови в НМФЛ или ИФА.

3. При наличии специфических антител в титре 1:640 в НМФА или 1: 3200 в ИФА выделяют иммуноглобулин двухкратным осаждением 20% раствором ПЭГ.

4. Метят в соотношении Ig: ФИТЦ - 20:1.

5. Определяют рабочее разведение полученного конъюгата Igтокс -ФИТЦ.

II. Обнаружение T.gondii в образце мочи новорожденного с подозрением на токсоплазмоз.

1. Пробу мочи от новорожденного центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин в течение 10 мин и осадок (10 мкл) наносят на предметное стекло.

2. Фиксируют спиртом или ацетоном 15 мин.

3. Наносят Igтокс - ФИТЦ, в рабочем разведении 1:256 в количестве 10 мкл.

4. Экспозиция 30 мин при 37^oC во влажной камере.

5. Отмывают физиологическим раствором 3 раза по 5 мин.

6. Промывают дистиллированной водой.

7. Высушивают.

8. Просматривают в ЛЮМ микроскопе после нанесения на препарат монтирующей жидкости.

III. Проверка специфичности - см. таблицу.

Результаты проверки специфичности флуоресцирующих токсоплазменных иммуноглобулинов даны в табллице.

В результате предлагаемого способа были получены иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам (Igтокс-ФИТЦ) с высокой активностью (1:256 - 1:2000) и специфичностью, позволяющие экспрессно обнаружить в прямом варианте МФА токсоплазмы в клиническом и патологоанатомическом материале, имеющим посторонние примеси, упростив тем самым метод диагностики токсоплазмоза. 5 мл специфической токсоплазменной сыворотки достаточно на 1000 исследуемых образцов. Полученный препарат сохраняет свои свойства на протяжении 12 месяцев.