натриевая соль поли(пара-дигидрокси-пара-фенилен) тиосульфокислоты, обладающая супероксидазной активностью, и способ ее получения

Формула изобретения

1. Натриевая соль поли(пара-дигидрокси-пара-фенилен)тиосульфокислоты общей формулы



где n = 2 - 6,

обладающая супероксидазной активностью.

2. Способ получения натриевой соли поли(пара-дигидрокси-пара-фенилен)тиосульфокислоты, как она определена в п.1, включающий реакцию взаимодействия парабензохинона с тиосульфатом натрия в водной среде при мольном соотношении между реагентами от 3 : 1 до 10 : 1.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно включает очистку продукта реакции от низкомолекулярных примесей путем экстрагирования указанного продукта диэтиловым эфиром.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что дополнительно включает сушку указанного продукта от экстрагента.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химии полимеров, а предложенный продукт может найти применение в качестве антиоксиданта в биологии, микробиологии и медицине.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В биологии широко известны случаи повреждающего воздействия кислорода на биологические ткани, в частности, при повышении его парциального давления. Более тщательно проведенные исследования показали, что токсические воздействия на биологические объекты оказывает не сам кислород, а промежуточные продукты его метаболизма (Медведев Ю.В., Толстой А.Д. Гипоксия и свободные радикалы в развитии патологических состояний организма. - М.: 000 "Терра-Календер и Промоушн", 2000. - 232 с., [1]). В случае полного восстановления кислорода образуется вода, тогда как в результате частичного его восстановления в тканях появляется ряд активных форм кислорода (АФК), способных оказывать повреждающее воздействие на различные жизненно важные элементы клеток, включая генетический аппарат, ферменты, мембранные и иные структуры. Биологические формы жизни смогли выжить в подобных условиях, выработав эффективную систему защиты от АФК - систему различных антиоксидантов, основными задачами которых являются сведение к минимуму процессов нефизиологического продуцирования АФК и удаление их из биологической среды в случае появления.

В результате присоединения к молекуле кислорода первого электрона образуется супероксидный анион-радикал O₂^- (CAP), последующее восстановление которого сопровождается появлением перекиси водорода и очень активного гидроксильного радикала. В процессе последующих окислительных реакций в биологических тканях появляются гидроперекиси алканов, алкильные, алкоксильные и пероксильные радикалы. Для снижения концентрации O₂^-, образующихся внутри клеток и генерирующих всю гамму других АФК, функционирует особый фермент - супероксиддисмутаза (СОД), который осуществляет диспропорционирование ионов CAP по следующей схеме:

O₂^-+ O₂^-+2H⁺_ H₂O₂+O₂ (I)

Исключительная роль СОД в защите клеток от токсического воздействия АФК подтверждается тем, что константа скорости реакции дисмутации анион-радикалов O₂^- на данном ферменте превышает по меньшей мере на 2 порядка аналогичные константы для всех остальных ферментов (Фридович И. В сб.: Свободные радикалы в биологии /Ред. У. Прайор. т. 1.-М.: Мир, 1979, с. 272-314 [2]).

В зависимости от вида биологических объектов и места локализации фермента в клетке супероксиддисмутазы подразделяют на несколько типов. Общим для всех типов СОД является сложная полипептидная цепь, состоящая из 300-400 аминокислотных остатков, и наличие в полипептидной цепи ионов металлов переменной валентности, в частности ионов меди, цинка, марганца или железа [2].

В процессе функционирования СОД роль ионов металлов переменной валентности сводится, во-первых, к захвату и удержанию вблизи активных центров анпион-радикалов O₂^- и, во-вторых, к участию в процессах донирования и акцептирования электронов. Функция полипептидной связи сводится к организации надлежащей геометрии активного центра фермента и модификации его активности за счет формирования соответствующего лигандного окружения центрального иона фермента.

Несмотря на рекордно высокую активность СОД, при различных патологических состояниях организма в отдельных тканях отмечается существенное снижение активности СОД, что неизбежно приводит к активации патологических процессов свободнорадикального окисления в тканях и их повреждению (Камышенцев М. В. , Волчек И. В. , Платонов В.Г. и др. Докл. АН, 1992, т. 326, N 4, с. 722-724 [3]). Поэтому в настоящее время в качестве веществ, обладающих супероксиддисмутазной активностью, предлагаются различные соединения синтетического происхождения, в частности комплексы металлов переменной валентности, таких как марганец (заявка на патент РФ N 98104277, [4]).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является расширение спектра продуктов, способных подобно СОД осуществлять реакцию дисмутации O₂^-. Особый интерес представляет возможность реализации подобной реакции на продукте небелковой природы, поскольку белки гидролитически нестабильны, а их синтез трудоемок и в случае СОД еще не был реализован. Крайне желательно также в подобном продукте исключить присутствие ионов металлов переменной валентности, которые часто проявляют высокую прооксидантную активность, присутствуя в биологических средах даже в малых концентрациях.

На основании изложенного выше авторы настоящего изобретения предположили, что молекула иной природы по сравнению с СОД будет способна осуществить реакцию дисмутации O₂^-, если она будет располагать возможностью акцептирования анион-радикалов и участвовать в обратимых процессах переноса электронов и протонов.

Поэтому для реализации поставленной задачи авторами настоящего изобретения был осуществлен синтез натриевой соли поли(пара-дигидрокси-пара-фенилен)тиосульфокислоты (далее для краткости называемой также пара-НПФ), имеющей общую структурную формулу:

,

где n = 2-6.

Брутто-формула С_6nH_4n+1O_2n+3S₂Na продукта.

Продукт был получен в результате реакции пара-бензохинона с тиосульфатом натрия в водной среде при нагревании от 50^oC до 100^oC. Образующийся в процессе реакции продукт отделяют от растворителя и очищают от низкомолекулярных примесей путем экстракции диэтиловым эфиром. Более подробно условия синтеза и свойства получаемого продукта описаны в нижеследующих примерах.

Наиболее близким структурным аналогом предложенного соединения является натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4- тиосульфокислоты (мета НПФ), получаемая в результате взаимодействия пара-бензохинона с тиосульфатом натрия в водно-спиртовой среде при температуре выше 65^oC (Патент РФ N 2105000, МПК⁶ С 07 С 381/02, C 08 G 61/10, А 61 К 31/05 [5]). В известном продукте полимерная цепь состоит из набора гидрохиноидных звеньев, соединенных между собой в мета-положении (мета-НПФ).)

Принципиальное отличие соединения, предложенного в соответствии с настоящим изобретением, от его аналога заключается в том, что в предложенном соединении гидрохиноидные звенья образуют полимерную цепь за счет присоединения в пара-положении, а не в мета-положении, как у аналога. Как известно, изменение химической структуры вещества неизбежно связано с изменением его свойств. Из химии ароматических соединений известно, что заместители, расположенные в мета-положении ароматического ядра, оказывают слабое влияние друг на друга, тогда как заместители, расположенные в пара-положении, сильно влияют друг на друга и на молекулу в целом. Наиболее ярким проявлением особых свойств продукта в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с аналогом является проявление характерного сигнала, регистрируемого с помощью метода спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопии), свидетельствующего о наличии в пара-НПФ неспаренных электронов (Фиг. 1), которые не были зафиксированы в образцах аналога. Спектр не меняет интенсивности в течение месячного хранения образца на воздухе. Наличие сигнала ЭПР в образцах пара-НПФ и его стабильность в процессе месячного хранения свидетельствуют о появлении сильного взаимодействия между всеми фенильными ядрами полимерной цепи, соединенными между собой в пара-положении. В результате образуется достаточно протяженная система сопряжения, способная эффективно удерживать неспаренный электрон, регистрируемый методом ЭПР-спектроскопии. Спектр ЭПР наблюдается как для твердого образца (кривая 1, изображенная сплошной линией на Фиг. 1), так и для водного раствора вещества (кривая 2, изображенная пунктирной линией на Фиг. 1).

Исследование супероксиддисмутазной активности натриевой соли поли(пара-дигидрокси-пара-фенилен)тиосульфокислоты (пара-НПФ)

Для подтверждения супероксиддисмутазной активности (СОД- активности) предложенного продукта был использован метод, основанный на конкурентном взаимодействии O₂^- с известным красителем тетранитротетразолиевым синим (ТНТ) и исследуемым веществом (Beauchamp С., Fridovich 1., Anal.Biochem., 44, 276(1971) [6]).

Схема опыта и полученные при этом результаты представлены на Фиг. 2, на которой условно обозначены:

ВКЛ - включение света;

ВЫКЛ - выключение света;

ТНТ - введение красителя;

пара-НПФ - введение натриевой соли поли(пара-дигидрокси- пара-фенилен)тиосульфокислоты.

Генерацию O₂^- в ячейке осуществляли фотохимическим методом в присутствии рибофлавина и тетраметилэтилдендиамина:



Образовавшиеся анион-радикалы самопроизвольно диссоциируют на кислород и перекись водорода, которая в присутствии каталазы расщепляется на кислород и воду:



Убыль кислорода в ячейке регистрировали с помощью кислородного датчика (участок А кривой). При выключении света генерация O₂^- прекращается и кислород не расходуется (начало участка В кривой). При выключении света в ячейку вводили краситель ТНТ, который при повторном генерировании анион-радикалов вызывает их интенсивное окисление, превращаясь в формазан в соответствии со следующей реакцией:



При этом количество окисленных анион-радикалов строго соответствует количеству регенерированного кислорода и концентрация регенерированного кислорода в ячейке не меняется.

Внесение в ячейку пара-НПФ и включение света сопровождается повторным поглощением кислорода, однако с меньшей скоростью (участок С кривой), что свидетельствует о протекании конкурентного взаимодействия O₂^- с красителем (без расходования кислорода по реакции (IV)) и с пара-НПФ по реакции (III) с расходованием кислорода. Полученные результаты подтверждают, что пара-НПФ проявляет супероксидазную активность, реализуя процесс дисмутации по реакции



Внесение пара-НПФ в среду, где генерируются анион-радикалы ₂^-, ускоряет процесс их дисмутации, при этом эффективность данного процесса зависит от концентрации пара-НПФ. Результаты исследования СОД-активности предложенного соединения представлены в Таблице 1.

Вещества, способные снижать концентрацию анион-радикалов O₂^-, ответственных за появление остальной гаммы АФК, представляют значительный практический интерес в качестве антиоксидантов. Введение пара-НПФ в состав глюкозо-минеральной питательной среды, содержащей (г/л): глюкозы - 4, Na₂HPO₄ - 7, KH₂PO₄ - 3, NH₄Cl - 1, NaCl - 0,5, MgSO₄ - 0,2, CaCl₂ - 0,02, никотиновой кислоты - 0,005, пара-НПФ - 0,03, позволило при выращивании клеток Escherichia coli штамм М-17 повысить количество жизнеспособных клеток после завершения процесса культивирования до (88,2 4,3)% вместо (75,8 3,3)% в контроле, где пара-НПФ не вводился. Антиоксидантные свойства предложенного в соответствии с настоящим изобретением вещества проявляются не только в водных средах, но и в сухих продуктах (см. Таблицу 2).

Если содержание жизнеспособных клеток после культивирования микроорганизмов принять за 100%, то в процессе лиофильной сушки около 15% клеток утрачивают жизнеспособность. Процесс помола сопровождается значительной инактивацией микроорганизмов и количество жизнеспособных клеток составляет около половины. В случае использования пара-НПФ после помола сохраняется жизнеспособными около 75% клеток от исходной культуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Изобретение проиллюстрировано графическими материалами, на которых:

Фиг. 1 представляет собой ЭПР-спектр порошка пара-НПФ (кривая 1) и 5%-ного раствора пара-НПФ в воде (кривая 2);

Фиг. 2 представляет собой схему процесса определения СОД-активности пара-НПФ;

Фиг. 3 представляет собой ИК-спектр пара-НПФ в таблетке KBr;

Фиг. 4 представляет собой УФ-спектр поглощения раствора пара-НПФ в воде;

Фиг. 5 представляет собой ¹³C-ЯМР спектр пара-НПФ в твердой фазе.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для лучшего понимания сути изобретения приведены следующие примеры.

Пример 1.

В аппарат емкостью 2 л, снабженный мешалкой и рубашкой, помещают 76,6 г (0,31 М) тиосульфата натрия и при перемешивании вливают 1 л дистиллированной воды. Раствор нагревают до температуры 60^oC и при интенсивно работающей мешалке вводят 100 г (0,93 М) пара-бензохинона. Через 1,5 часа процесс прекращают и образовавшийся продукт сушат на распылительной сушилке. Сухой порошкообразный продукт помещают в аппарат Сокслетта и удаляют примеси при использовании диэтилового эфира в качестве экстрагента. Время экстракции - 24 часа. Продукт сушат под вакуумом при температуре 50^oC. Выход целевого продукта - 109,2 г. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равна 400.

ИК-спектр образца (Фиг. 3) имеет широкую полосу валентных колебаний гидроксильных групп в области 3600 - 2000 см^-1, полосы при 1200 и 1040 см^-1 подтверждают наличие сульфогрупп, полоса в области 1600-1550 см^-1 относится к так называемым "дышащим" колебаниям C=C связей бензольного кольца. Другая характерная полоса колебаний C=C кольца наблюдается при 1500 см^-1. Полосы поглощения 1370, 1448 и 1520 см^-1 относятся к колебаниям C-C связей кольца, смешанным с деформацией углов СОН и CCH. Полоса в области 830 см^-1 относится к неплоским деформационным колебаниям связи CH в тетразамещенном бензольном кольце.

В электронном спектре поглощения пара-НПФ (Фиг. 4) наблюдается сплошное поглощение от ультрафиолетовой до видимой области с двумя слабо выраженными максимумами y 40000 и 33000 см^-1. Эти полосы относятся к -^*-переходам в ароматических ядрах с двумя хромофорными группами, расположенными в пара-положении друг относительно друга.

Пара-НПФ, внесенный в состав бактериальной суспензии Escherichia coli - штамм М-17, увеличивает жизнеспособность микробных клеток, высушенных методом контактной сушки, в процессе их хранения при комнатной температуре. Результаты представлены в Таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что при хранении сухой бактериальной культуры в течение месяца при комнатной температуре наблюдается потеря жизнеспособности 80% исходных клеток, что связывают с медленно протекающими реакциями окисления. Введение перед стадией сушки в состав клеточной суспензии пара-НПФ позволяет снизить потери в процессе месячного хранения до 5-20%, что может быть связано с обрывом цепного процесса свободнорадикального окисления на первой стадии - стадии образования анион-радикалов O₂^-.

Пример 2.

В аппарат, описанный в примере 1, помещают 38,3 г (0,15 М) тиосульфата натрия и 1 л дистиллированной воды, раствор нагревают до 70^oC и при эффективном перемешивании вводят 100 г (0,93 М) пара-бензохинона. Через 2 часа реакцию прекращают и содержимое сушат на распылительной сушилке. После экстрагирования примесей диэтиловым эфиром в течение суток продукт сушат под вакуумом при 50^oC. Выход целевого продукта - 98,7 г. По данным элементного анализа содержание серы -11,7%, молекулярная масса - 650.

Способность полученного образца способствовать диспропорционированию подтверждена на модели активированных полиморфно ядерных лейкоцитов (нейтрофилов). Известно, что нейтрофилы являются одним из звеньев клеточного иммунитета, обеспечивающим защиту организма от чужеродных объектов. Одним из эффективных механизмов бактерицидного воздействия на чужеродные клетки является способность нейтрофилов быстро перестроить свой метаболизм на массовую продукцию анион-радикалов O₂^- оказывающих токсический эффект на патогены (Кузнецов В. Ф., Черешков В. А. Патофизиологическая дисфункция нейтрофилов. - Киров, 1998, - 119 с. [7]). Результаты сравнительных испытаний СОД-активности синтезированного образца и СОД представлены в Таблице 4.

Избыточная продукция O₂^- нейтрофилами при ряде патологий ответственна за поражение сосудистого русла. Введение препаратов, обеспечивающих возможность эффективного диспропорционирования O₂^-, позволит снизить патологическое воздействие активированных нейтрофилов на сосуды.

Пример 3.

В аппарат, описанный в примере 1, помещают 23 г (0,093 М) тиосульфата натрия в 1 л дистиллированной воды, раствор нагревают до 90^oC и вводят при интенсивном перемешивании 100 г (0,93 М) пара-бензохинона. Через 1,5 часа реакцию прекращают и содержимое сушат на распылительной сушилке. Выделенный сухой продукт экстрагируют диэтиловым эфиром в течение 24 часов, затем сушат под вакуумом при температуре 50^oC. Выход целевого продукта 80,2 г. По данным элементного анализа содержание серы 10,8%, молекулярная масса 750.

Присоединение гидрохиноидных звеньев в синтезированном образце в пара-положении друг относительно друга подтверждается данными ¹³C-ЯМР по наличию полосы поглощения при 147,87 м.д., характерной для C_аром-C_аром связи между бензольными кольцами (Фиг. 5).