способ разделения и идентификации пищевых синтетических красителей

Формула изобретения

Способ разделения и идентификации пищевых синтетических красителей с помощью тонкослойной хроматографии, включающий нанесение пробы и стандартной смеси красителей на пластину с силикагелем, помещение пластины в хроматографическую камеру с водно-органической системой растворителей, в состав которой входят этанол и водный раствор аммиака, проведение хроматографии восходящим способом, детектирование красителей визуально в проходящем свете и идентификацию красителей путем сравнения полученной хроматограммы анализируемой смеси красителей с хроматограммой стандартной смеси красителей, отличающийся тем, что для разделения красителей используют пластины размером (10-20)x(10-20) см и систему растворителей изобутанол - изоамиловый спирт - пиридин - этанол - 25%-ный водный раствор аммиака в объемном соотношении (2,5-3,1): (3,0-3,3):(2,9-3,2):(3,5-4,5):(3,8-4,3) и после идентификации дополнительно проводят определение количественного содержания красителей в анализируемой смеси.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к аналитической химии, точнее к тонкослойной хроматографии пищевых синтетических красителей.

Изобретение может найти применение в пищевой промышленности для контроля производства и качества продуктов, содержащих пищевые синтетические красители, а также в специализированных аналитических лабораториях (медицинских, СЭС, по контролю качества потребительских товаров на предмет содержания запрещенных к применению красителей и т.д.).

В описании использованы следующие понятия и сокращения:

Тонкослойная хроматография (ТСХ) - адсорбционная жидкостная хроматография, проводимая на пластинах, представляющих собой подложки, покрытые слоем сорбента. Разделение компонентов смеси происходит на открытом слое сорбента. Движение элюента (хроматографической смеси растворителей) по пластине происходит под действием капиллярных сил. ТСХ включает следующие стадии: подготовку пластины, нанесение образцов, подготовку хроматографической камеры, развитие хроматограммы, удаление элюента с пластины, детектирование (визуализацию), идентификацию [БЭС. - М.: Большая Рос. Энциклопедия. - 1997. - С.1323].

Коэффициент подвижности (Rf) - отношение скорости миграции данного пищевого синтетического красителя к скорости миграции фронта растворителя [Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. - С.41].

Наиболее часто применяемые пищевые синтетические красители [Сарафанова Л. А. , Кострова И.Е. Применение пищевых добавок. Технические рекомендации. СПб: ГИОРД, 1997, - 48 с.]:

E - индекс международной классификации пищевых красителей;

Тартразин (E 102);

Хинолиновый желтый (E 104);

Желтый "Солнечный закат" FCF (E 110);

Цитрусовый красный N 2 (E 121);

Кармуазин (азорубин) (E 122);

Амарант (E 123);

Понсо 4R (E 124);

Эритрозин (E 127);

Очаровательный красный (E 129);

Патентованный синий (E 131);

Индигокармин (E 132);

Бриллиантовый голубой (E 133);

Зеленый C (E 142);

Бриллиантовый черный (E 151).

E 121 и E 123 запрещены, E 127 не разрешен к использованию в России [Санитарные правила и нормы. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья в пищевых продуктах. М., 1997. - С. 246-269].

Непищевые синтетические красители, которые могут быть использованы при фальсификации пищевых синтетических красителей (красители-фальсификаторы):

Родамин C;

Красный 4;

Кислотный фиолетовый [там же, с. 246-269].

Анализ содержания пищевых синтетических красителей в продуктах питания может преследовать две цели. Во-первых, анализ проводится на пищевых предприятиях с целью контроля за соблюдением конкретных технических условий (рецептур) при производстве данного пищевого продукта. Во-вторых, анализ проводится в контролирующих торговлю и производство организациях на предмет обнаружения в пищевых продуктах и упаковке запрещенных, вредных для здоровья людей красителей. И в том, и в другом случае крайне необходима универсальная методика: достаточна простая, не требующая больших затрат времени и позволяющая идентифицировать в ходе анализа любой из широкого спектра (около 15) синтетических красителей, которые наиболее часто используются для приготовления продуктов.

Для разделения и идентификации пищевых синтетических красителей в продуктах питания в настоящее время используются электрохимические методы анализа (электрофорез, полярография), хроматография (высокоэффективная жидкостная - ВЭЖХ, тонкослойная - ТСХ, бумажная восходящая и радиальная), а также методы, основанные на фиксации электромагнитного и корпускулярного излучения. Все они не являются универсальными для всего спектра пищевых синтетических красителей и, как правило, различают от 4 до 10 красителей. Наиболее широко применяются ВЭЖХ и ТСХ. ВЭЖХ превосходит ТСХ по разрешающей способности, однако ее существенными недостатками являются сложное и крайне дорогое аппаратурное оформление и повышенные требования к степени очистки растворителей. Достоинствами метода ТСХ являются простота методик и отсутствие дорогостоящего оборудования, а значит, доступность для массового потребителя. Разработанные в последнее десятилетие новые неподвижные фазы, оборудование для нанесения проб, новые методы элюирования пластин и количественного определения с использованием сканирующих денситометров способны обеспечить более высокое разрешение, лучшее детектирование и воспроизводимость результатов качественного и количественного ТСХ-анализа пищевых синтетических красителей [Аналитическая хроматография / К.И.Сакодынский и др. - М.: Химия, 1993, - с. 6] . Кроме того, как будет показано ниже, только ТСХ позволяет проводить экспресс-визуальную оценку результатов анализа пищевых синтетических красителей, образующих на хроматографической пластине хорошо различимые невооруженным глазом цветные пятна.

Принципиальным моментом для проведения ТСХ любых объектов, в том числе и пищевых синтетических красителей, является выбор сорбирующего слоя, наносимого на подложку пластины, и хроматографической системы растворителей. Для всего спектра пищевых синтетических красителей, которые могут присутствовать в продуктах питания, до сих пор не подобраны универсальные условия разделения (сорбент - система растворителей). Это связано с тем, что сам объект - многочисленные пищевые синтетические красители - обладает близкими значениями Rf, плотно заполняющими почти весь возможный интервал Rf (0,10-0,95), что является трудно преодолимым препятствием для проведения ТСХ с хорошей разрешающей способностью.

Известен способ разделения и идентификации 3 пищевых синтетических красителей E 102, E 123, E 132 и родамина C с помощью ТСХ на пластинах "Силуфол" (Чехия) размером 20 х 20 см со слоем современного эффективного сорбента - силикагеля. Для разделения используется система растворителей: этанол-толуол - 25%-ный водный раствор аммиака - вода в соотношении 3,00 : 3,00 : 0,40 : 0,25 (по объему). Красители идентифицированы визуально в проходящем свете по образуемым ими окрашенным пятнам на пластине [Морозова Г.Н. Идентификация синтетических пищевых красителей методом ТСХ // Вопросы питания. - 1977. - N 1. - С. 85-87]. Недостатком известного способа является небольшое количество разделенных и идентифицированных красителей.

Известен способ разделения и идентификации 7 пищевых синтетических красителей: нафтальный желтый S, E 102, E 123, E 124, E 127, E 131, E 132 и родамина C с помощью ТСХ на пластинах фирмы Merck (Германия) размером 20 х 20 см со слоем силикагеля. Для разделения используется система растворителей: этанол - бутанол - вода в соотношении 9 : 2 : 1 (по объему). Разделенные красители идентифицированы визуально в проходящем свете [Byle S.J., Tehrani M.S. Thin-layer chromatographic separation and subsegnent determination of some water-soluble dyestuffs // J. of Chromatography. - 1979. - V. 175. - P. 163-168] . Недостатком известного способа является небольшое количество идентифицированных красителей.

Известен способ разделения и идентификации 10 пищевых синтетических красителей: E 102, E 104, E 110, E 122, E 123, E 124, E 127, E 131, E 132, E 151 с помощью ТСХ на пластинах Merck со слоем силикагеля. Способ включает нанесение пробы и стандартной смеси красителей на пластину, помещение пластины в хроматографическую камеру с водно-органической системой растворителей: этанол - хлороформ - 12,5%-ный водный раствор аммиака - диэтиламин в соотношении 6 : 5 : 3 : 6 (по объему). Хроматография проводится восходящим способом. Хроматография протекает более 5 часов. Разделенные красители детектированы визуально в проходящем свете. Идентификация красителей происходит путем сравнения хроматограммы анализируемой смеси с хроматограммой стандартной смеси красителей [Milovanovic G., Velikovic G. Analysis of synthetic organic food dyes by thin-layer chromatography on silicagel // J. Serb. Chem. Soc. - 1989. - V. 54(3). - P. 155-162]. Известный способ позволяет идентифицировать наибольшее количество красителей по сравнению с другими аналогами, однако этого явно недостаточно для проведения анализа всего спектра пищевых синтетических красителей, используемых при производстве продуктов питания. Известный способ не позволяет идентифицировать запрещенный к применению в России цитрусовый красный N 2 (E 121). Недостатком известного способа является также плохая разрешающая способность в отношении красителей, имеющих наиболее близкие значения Rf. В описании способа не обнаружено сведений об определении количественного содержания идентифицированных красителей.

Общим недостатком всех известных способов разделения и идентификации пищевых синтетических красителей является то, что с их помощью можно обнаружить в продуктах не более 10 красителей и то, что воспроизводимые результаты получены только при использовании высококачественных, но дорогих пластин максимального размера 20 х 20 см (при попытках анализа более 10 красителей или при использовании пластин меньшего размера наблюдается наложение друг на друга пятен красителей, имеющих близкие значения Rf, то есть разрешающая способность ТСХ резко ухудшается). Кроме того, в известных способах не проводится количественная оценка содержания идентифицированных красителей, что важно при контроле за соблюдением технических условий производства продуктов питания.

Таким образом, проблема проведения полноценного анализа спектра пищевых синтетических красителей в продуктах питания остается актуальной.

Задачей заявляемого изобретения является создание способа разделения и идентификации пищевых синтетических красителей, позволяющего проводить анализ содержания в продуктах питания всего спектра наиболее часто используемых красителей.

Поставленная задача решается заявляемым способом разделения и идентификации пищевых синтетических красителей с помощью ТСХ на отечественных и импортных пластинах размером (10-20) х (10-20) см со слоем силикагеля с использованием водно-органической системы растворителей, включающей этанол и водный раствор аммиака, следующего состава: изобутанол - изоамиловый спирт - пиридин - этанол - 25%-ный водный раствор аммиака в соотношении (2,5-3,1) : (3,0-3,3) : (2,9-3,2) : (3,5-4,5) : (3,8-4,3) (по объему). Хроматографию осуществляют восходящим способом. Хроматография протекает в течение 45 мин. Идентификацию красителей проводят после окончания процесса хроматографии и высушивания пластины визуально в проходящем свете путем сравнения со стандартом. Затем определяют количественное содержание красителей (с помощью сканирующего денситометра).

Указанная совокупность существенных признаков заявляемого способа обеспечивает получение технического результата - улучшения разрешающей способности процесса ТСХ и возможности разделения и идентификации значительно большего, чем у аналогов количества пищевых синтетических красителей. С помощью заявляемого способа можно обнаружить 16 красителей, наиболее часто используемых для производства продуктов питания. Заявляемый способ в отличие от аналогов позволяет определить в продуктах запрещенные к применению в России цитрусовый красный N 2 (E 121), амарант (E 123) и эритрозин (E 127), а также красители-фальсификаторы (родамин C, красный 4 и др.). Кроме того, заявляемый способ в отличие от аналогов позволяет определить не только качественный, но и количественный состав красителей, использованных при приготовлении пищевого продукта. Дополнительный технический результат: заявляемый способ является более универсальным с точки зрения предъявляемых требований к качеству пластин, так как реализуется на отечественных и импортных стандартных пластинах любого размера. Это связано с тем, что в заявляемом способе полное развитие хроматограммы завершается на расстоянии 5-6 см от линии старта (в способе-прототипе для этого нужно не менее 15 см). Следует отметить, что в заявляемом способе хроматография протекает значительно быстрее (за 45 мин), чем в способе-прототипе (более 5 часов).

Отличительными существенными признаками заявляемого способа от способа-прототипа являются использование новой системы растворителей, содержащей изобутанол, изоамиловый спирт, пиридин, этанол и 25%-ный водный раствор аммиака в соотношении (2,5-3,1) : (3,0-3,3) : (2,9-3,2) : (3,5-4,5) : (3,8-4,3) (по объему), и отечественных и импортных пластин размером (10-20) х (10-20) см, а также определение количественного содержания красителей.

Анализ уровня науки и техники показал, что используемая в заявляемом изобретении система растворителей неизвестна, и поэтому не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым. Это подтверждает новизну предложения.

Только совокупность существенных признаков заявляемого способа позволяет достичь указанного выше результата. Из известности отдельных признаков способа не вытекает с очевидностью возможность разделения и идентификации 13 пищевых синтетических красителей и 3 красителей-фальсификаторов, то есть по количеству почти в 2 раза больше, чем в способах-аналогах. Известно, что подбор системы растворителей приводит к улучшению результатов анализа. Однако поиск такой системы является самой сложной задачей любого типа хроматографии, тем более, он не может гарантировать заранее качественного скачка в анализе. Таким образом, в заявляемом изобретении реализована новая функциональная зависимость "состав - свойство". Это позволяет утверждать о соответствии предлагаемого изобретения условию охраноспособности "изобретательский уровень" ("неочевидность").

На фигуре 1 приведена хроматограмма, полученная в результате ТСХ-анализа смеси 13 пищевых синтетических красителей и 3 красителей-фальсификаторов в условиях заявляемого способа (на отечественной пластине "Сорбфил" 10х10 см) с использованием системы растворителей: изобутанол - изоамиловый спирт - пиридин - этанол - 25%-ный водный раствор аммиака в объемном соотношении 2,9 : 3,1 : 3,1 : 4,1 : 3,8. 1 - E 142; 2 - E 131; 3 - E 124; 4 - E 102; 5 - E 123; 6 - E 122; 7 - E 132; 8 - E 110; 10 - красный 4; 9 - E 133; 11 - кислотный фиолетовый; 12 - E 129, 13 - E 127; 14 - E 104; 15 - родамин C; 16 - E 121.

На фигуре 2 изображена хроматограмма, полученная в результате ТСХ-анализа китайского ликера "Hiang Tiao" в условиях заявляемого способа на пластине "Сорбфил" 10 х 10 см. На хроматограмме слева - стандартная предполагаемая в анализируемом ликере смесь красителей, в центре - анализируемая смесь красителей китайского ликера (экстракт), справа - стандартные красители по отдельности: 1 - E 124, 2 - E 123, 3 - E 122. Для анализа использована следующая система растворителей; изобутанол - изоамиловый спирт - пиридин - этанол - 25%-ный водный раствор аммиака в соотношении 2,8 : 3,1 : 2,9 : 3,9 : 4,1.

Для подтверждения соответствия решения условию охраноспособности "промышленная применимость" и для лучшего понимания изобретения приводим примеры конкретного выполнения.

Для анализа пищевых синтетических красителей могут быть использованы пластины со слоем силикагеля фирмы Merck (Германия), "Силуфол" (Чехия) и "Сорбфил" (Россия, НПЦ "Ленхром") размером 10 х 10, 10 х 15, 20 х 20 см.

Для проведения анализа выбраны 16 красителей фирм "Warner Jenkinson Europe Ltd. " (Великобритания) и "Flevo chemie" (Нидерланды): E 102, E 104, E 110, E 121, E 122, E 123, E 124, E 127, E 129, E 131, E 132, E 133, E 142, родамин C, красный 4, кислотный фиолетовый.

Для идентификации красителей приготавливают стандартные смеси пищевых синтетических красителей с концентрацией 875, 1200, 1660, 2500 г/т.

Анализируемые продукты питания подвергаются предварительной подготовке, заключающейся в выделении смеси красителей путем экстракции и концентрирования пробы до 100-2500 г/т.

Образцы стандартных и исследуемой смесей наносят на стартовую линию, проведенную карандашом на расстоянии 10-15 мм от нижнего края пластины, пятнами диаметром не более 3-4 мм, отстоящими друг от друга на 10 мм. Нанесение образцов в количестве 0,3-0,5 мкл осуществляют с помощью микрошприца. Перед внесением в хроматографическую камеру пластину сушат на специальном столике.

Хроматографию осуществляют восходящим способом в хроматографической камере 130 х 130 х 50 или 230 х 230 х 50 мм. Камеру для ТСХ предварительно заряжают системой растворителей и насыщают в течение 1 часа под плотно притертой крышкой. Для разделения красителей используют систему растворителей: изоамиловый спирт - изобутанол - пиридин - этанол - 25%-ный раствор аммиака в объемном соотношении (2,5-3,1) : (3,0-3,3) : (2,9-3,2) : (3,5-4,5) : (3,8-4,3). В примере 1 (фиг. 1) объемное соотношение составляет 2,9 : 3,1 : 3,1 : 4,1 : 3,8, в примере 2 (фиг. 2) - 2,8 : 3,1 : 2,9 : 3,9 : 4,1. Хроматографию прекращают при достижении фронта высотой 5-6 см. Время ТСХ - 45 мин. После проведения хроматографии пластины высушивают на воздухе на специальном столике или в термостате при 45^oC (5 мин).

Красители образуют на хроматограмме компактные окрашенные пятна, хорошо различимые визуально в проходящем свете. Идентификацию проводят сравнением с хроматограммой стандартной смеси красителей. Значение величин Rf всех анализируемых красителей находится в пределах, рекомендуемых для методов ТСХ. Значения Rf красителей в стандартной смеси приводятся в соответствии с местом проявления пятен красителей на хроматограмме (фиг. 1) снизу-вверх: E 142 - 0,15; E 131 - 0,19; E 124 - 0,24; E 102 - 0,26; E 123 - 0,28; E 122 - 0,33; E 132 - 0,35; E 110 - 0,38; красный 4 - 0,42; E 133 - 0,40; кислотный фиолетовый - 0,46; E 129 - 0,49; E 127 - 0,56; E 104 - 0,71 родамин C - 0,86; E 121-0,95. Большинство анализируемых красителей, за исключением индигокармина, сохраняются на пластине в течение полугода без видимого изменения цвета.

Анализ количественного содержания красителей в исследуемой смеси проводят с помощью сканирующего оптического видеоденситометра "ДенСкан-02" (Россия. НПЦ "Ленхром") с помощью программы "Densi 3,0".

Реализация заявленного интервала соотношений ингредиентов системы растворителей (включая граничные) приводит к эффективному разделению одновременно всех основных 13 пищевых синтетических красителей и 3 красителей-фальсификаторов (в стандартной смеси). На хроматограммах образцов, состоящих, как правило, из 2-3 красителей, присутствующих в конкретных продуктах питания, порядок расположения красителей сохраняется, как в стандартной смеси.

Заявляемое изобретение не исчерпывается вышеприведенными примерами и не исключает разделение и идентификацию пищевых синтетических красителей и красителей-фальсификаторов, не входящих в число наиболее часто применяемых, но тем не менее используемых при приготовлении продуктов питания.

Выход за рамки заявленных интервальных параметров приводит к резкому ухудшению эффективности разделения.

Вид получающихся хроматограмм наглядно иллюстрирует преимущество заявляемого способа - способность эффективно разделить и идентифицировать 16 наиболее часто используемых при производстве пищевых продуктов синтетических красителей. Таким образом, его можно считать современной универсальной методикой для идентификации и определения количественного содержания всего спектра пищевых синтетических красителей, применяемых при производстве продуктов питания. С помощью способа-прототипа можно идентифицировать только 10 красителей.

Следует подчеркнуть, что разделение красителей с помощью заявляемого способа протекает значительно быстрее, чем в способе-прототипе. Кроме того, предлагаемая система растворителей может быть использована при ТСХ на пластинках с силикагелем разных фирм - зарубежных и отечественных, так как универсальна для разделения пищевых синтетических красителей на силикагеле.