инозитолгликаны с инсулиноподобным действием, способ их получения, фармацевтическая композиция и способ ее получения

Формула изобретения

1. Инозитолгликан формулы I

A-Z-R, (I)

и/или физиологически приемлемая соль соединения формулы I, при этом А обозначает 1)Н-Р(O)(ОН)-, 2) H-P(S)(OH)-, 3) HO-P(S)(OH)-, 4)S(O)₂(OR¹)-, 5) NH₂-C(O)-,

где R¹ обозначает атом водорода или (С₁-С₄)-алкил,

Z обозначает 1) 2-6 сахарных остатков из группы: 1.1 манноза, 1.2 глюкоза, 1.3 глюконовая кислота, 1.4 галактоновая кислота, 1.5 манноновая кислота, 1.6 глюкозамин, 1.7 фруктоза или 1.8 галактоза или 2)2-6 сахарных остатков из группы, указанной для Z 1.1-1.8, замещенных одно-шестикратно независимо друг от друга 2.1 метилом, 2.2 маннозой, 2.3 глюкозамином, 2.4 диманнозой или 2.5 манноза-глюкозамином, и гликозидная связь обоих сахаров маннозы и глюкозамина находится между С-атомами 1-3, 1-2 или 1-6 обоих сахаров, и R обозначает 1) инозитол, 2) инозитолфосфат, 3) инозитолтиофосфат, 4) инозитолциклотиофосфат или 5) инозитолциклофосфат.

2. Соединение формулы I по п. 1, отличающееся тем, что А обозначает 1)Н-Р(O)(ОН)-, 2) S(O)₂(OR¹)- или 3) NH₂-C(O)-, Z обозначает 1) 2-6 сахарных остатков из группы: 1.1 манноза, 1.2 глюкоза, 1.3 глюконовая кислота, 1.4 галактоновая кислота, 1.5 манноновая кислота, 1.6 глюкозамин, 1.7 фруктоза или 1.8 галактоза или 2)2-6 сахарных остатков из группы, указанной для Z 1.1-1.8, замещенных одно-шестикратно независимо друг от друга 2.1 метилом, 2.2 маннозой, 2.3 глюкозамином, 2.4 диманнозой или 2.5 манноза-глюкозамином, и гликозидная связь обоих сахаров маннозы и глюкозамина находится между С-атомами 1-3, 1-2 или 1-6 обоих сахаров, и R обозначает 1) инозитол, 2) инозитолфосфат, 3) инозитолтиофосфат, 4) инозитолциклотиофосфат или 5) инозитолциклофосфат.

3. Соединение формулы I по п. 1, отличающееся тем, что А обозначает Н-Р(O)(ОН)-; Z обозначает 1) 2-4 сахарных остатка из группы: 1.1 манноза или 1.2 глюкозамин или 2) 2-4 сахарных остатка из группы: 2.1 манноза или 2.2 глюкозамин, однократно замещенный маннозой, и R обозначает 1) инозитол, 2) инозитолфосфат или 3) инозитолциклофосфат.

4. Способ получения соединения формулы I по одному или нескольким пп. 1-3, отличающийся тем, что инозитолгликан синтезируют постадийно из исходных защищенных сахаров и инозитоловых соединений, затем присоединяют остаток А и от образовавшегося соединения отщепляют одну или несколько защитных групп, временно введенных для защиты других функций, и полученное таким образом соединение формулы I в случае необходимости переводят в его физиологически приемлемую соль.

5. Фармацевтичекая композиция, обладающая инсулиноподобным действием, отличающаяся тем, что она содержит эффективное количество, по меньшей мере, одного соединения формулы (I) по пп. 1-3.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере, один модифицированный или немодифицированный инсулин или производное инсулина.

7. Способ получения фармацевтической композиции по п. 5 или 6, отличающийся тем, что готовят, по меньшей мере, из одного соединения формулы I и физиологически приемлемого носителя, а также, в случае необходимости, из подходящих добавок и/или вспомогательных веществ подходящую лекарственную форму.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что добавляют, по меньшей мере, один модифицированный или немодифицированный инсулин или производное инсулина.

9. Соединение формулы I по одному или нескольким пп. 1-3, отличающееся тем, что оно применяется для получения фармацевтической композиции, обладающей инсулиноподобным действием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к инозитолгликанам, обладающим инсулиноподобным действием, которые пригодны для лечения сахарного диабета.

Известно, что матаболическое действие инсулина вызывает также образование низкомолекулярных соединений, обладающих также инсулиноподобным действием (US 4446064). Уже предложен ряд соединений инозитолгликанов, проявляющих инсулиноподобное действие (WO 96/14075, JP 6/293790, JP 4/120089).

Диабет 2-го типа, инсулиннезависимый диабет, сопровождается резистентностью инсулину периферийных тканей, таких как мускульная или жировая ткань. Вызванное этим пониженное использование глюкозы обусловлено отсутствующей инсулиновой стимуляцией транспорта глюкозы и последующих процессов обмена веществ.

При поиске других эффективных соединений, обладающих инсулиноподобным действием, было установлено, что соединения согласно изобретению проявляют in vitro инсулиноподобное действие, имеют хорошую стабильную сыворотку, оказывают на инсулинорезистентные ткани инсулиноподобное действие и, тем самым, пригодны для лечения сахарного диабета.

Изобретение поэтому относится к обладающим инсулиноподобным действием инозитолгликанам формулы I

А-Z-R, (I)

и/или к физиологически приемлемым солям соединения формулы I и/или к стереоизомерным формам соединения формулы I, при этом

А обозначает остаток

1) Н-Р(О) (ОН)-,

2) H-P(S)(ОН)-,

3) HO-P(S)(ОН)-,

4) HS-P(S)(ОН)-,

5) (С₁-С₄)-алкил-Р(О)(ОН)-,

6) (С₁-С₄)-алкил-Р(S)(ОН)-,

7) S(O)₂(OR¹)-,

8) S(O)(OR¹)-,

9) NH₂-C(O)-,

10) R¹R²N-,

11) R¹R²N-C(O) -NH-,

12) R¹O-SO₂-NH-,

13) (С₁-С₄)-алкил-SO₂-,

14) (С₁-С₄)-алкил-S(O)- или

15) R¹-S-

где R¹ и R² независимо друг от друга обозначают атом водорода или (С₁-С₄)-алкил,

Z обозначает

1) 2-6 сахарных остатков,

2) 2-6 сахарных остатков от одно- до шестикратно замещенных независимо друг от друга

2.1 метилом,

2.2 сахарным остатком,

2.3 дисахарным остатком,

2.4 -SO₂-OH,

2.5 -C(O)-NR¹R²,

2.6 -С(О)-(С₁-С₄)-алкилом,

2.7 -Р(O)(Н)ОН,

2.8 -Р(O)(ОН)₂,

2.9 -P(S) (H)OH,

2.10 -P(S)(ОН)₂,

2.11 -P(S)(SH)(ОН),

2.12 -Р(O)(OH)-O-CH₂-CH₂-NR¹R² или

2.13 гликозидной связью между 2-6-тью сахарными остатками, замещенной одно-шестикратно -СН₂- или -S-, и где R¹ и R² независимо друг от друга обозначают атом водорода или (С₁-С₄)-алкил,

R обозначает

1) инозитол,

2) инозитолфосфат,

3) инозитолтиофосфат,

4) инозитолциклофосфат,

5) инозитолциклотиофосфат,

6) остаток из группы, определенной в пп. R 2)-5), замещенный независимо друг от друга одно- или двукратно

6.1 фосфатом или

6.2 тиофосфатом,

7) остаток из группы, определенной в пп. R 2)-5), замещенный однократно

7.1 циклофосфатным остатком или

7.2 циклотиофосфатным остатком, или

8) инозитол, при этом две соседние ОН-группы замещены

8.1 группой -СН₂-SO₂-NН-.

Предпочтительны соединения формулы I, отличающиеся тем, что

А обозначает

1) Н-Р(О) (ОН)-,

2) S(O)₂(ОР¹)-, или

3) NH₂-С(О)-,

Z обозначает

1) 2-6 сахарных остатков из группы

1.1 манноза,

1.2 глюкоза,

1.3 глюконовая кислота,

1.4 галактоновая кислота,

1.5 манноновая кислота,

1.6 глюкозамин,

1.7 фруктоза или

1.8 галактоза или

2) 2-6 сахарных остатков из группы, определенной в пп. Z 1.1-1.8, замещенных одно-шестикратно независимо друг от друга

2.1 метилом,

2.2 маннозой,

2.3 глюкозамином,

2.4 диманнозой или

2.5 манноза-глюкозамином и гликозидная связь обоих сахаров маннозы и глюкозамина лежит между С-атомами в положении 1-3, 1-2 или 1-6 обоих cахаров, и

R обозначает

1) инозитол,

2) инозитолфосфат,

3) инозитолтиофосфат,

4) инозитолциклотиофосфат или

5) инозитолциклофосфат.

Особенно предпочтительны соединения формулы I, отличающиеся тем, что

А обозначает Н-Р(О)(ОН),

Z обозначает

1) 2-4 сахарных остатка из группы

1.1 манноза или

1.2 глюкозамин или

2) 2-4 сахарных остатка из группы

2.1 манноза или

2.2 глюкозамин, однократно замещенный маннозой, и

R обозначает

1) инозитол,

2) инозитолфосфат или

3) инозитолциклофосфат.

Под остатками сахаров понимаются соединения, производные от альдоз и кетоз с 3-7 углеродными атомами, которые могут принадлежать к D- или L-ряду; к ним относятся также аминосахара или уроновые кислоты. В качестве примера следует назвать глюкозу, маннозу, фруктозу, галактозу, рибозу, эритрозу, глицеринальдегид, седогептозу, глюкозамин, галактозамин, глюкуроновую кислоту, галактуроновую кислоту, глюконовую кислоту, галактоновую кислоту или манноновую кислоту.

Под дисахарами подразумевают сахариды, состоящие из двух сахарных звеньев. Три-, тетра-, пента- или гексасахара образуются в результате ацеталеобразной связи 3-6 сахаров. Связи при этом могут устанавливаться в - или -форме. Связи между сахарами предпочтительно образуются через С-атом 1 и С-атом 6, С-атом 1 и С-атом 2, а также С-атом 1 и С-атом 4 соответствующих сахаров. Между сахарами предпочтительна -форма связи.

Связь между А и Z осуществляется, например, через один из кислородных атомов Z или через один из углеродных атомов Z, предпочтительно через углеродный атом СН₂-группы Z. Связь остатков А 10)-12) предпочтительно происходит через углеродный атом Z, другие связи А - предпочтительно через кислородный атом Z.

Связывание между R и Z происходит аналогично связям ди-, три-, тетра-, пента- или гексасахаров. Далее связь между R и Z может быть одно- или многократно замещена на -СН₂-или -S-.

Если сахар замещен, то замещение происходит предпочтительно по атому водорода ОН-группы сахара.

Понятие "инсулинрезистентная ткань" включает, например, жировые клетки крысы, которые не имеют инсулинового рецептора.

Соединения согласно изобретению могут содержать одну или несколько фосфатных групп, которые могут быть дериватизированы также еще фосфатозащитной группой. Фосфатозащитными группами являются, например, фенил, бензил или гидроксипропилнитрил (Houben Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band 12/1 или Band 12/2; Teilheimer, Synthetic Methods of Organic Chemistry, Vol 45).

Под физиологически приемлемыми солями соединений формулы I следует понимать, в частности, фармацевтически пригодные или нетоксичные соли. Такие соли образуют, например, соединения формулы I, содержащие кислотные группы, например, фосфаты или сульфаты, с щелочными или щелочноземельными металлами, такими как Na, К, Мg и Са, а также с физиологически переносимыми органическими аминами, такими как триэтиламин и трис-(2-гидроксиэтил)амин. Соединения формулы I, содержащие основные группы, например аминогруппу, образуют соли с неорганическими кислотами, такими как соляная, серная или фосфорная кислоты, и с органическими карбоновыми или сульфоновыми кислотами, такими как уксусная, лимонная, бензойная, малеиновая, фумаровая, винная кислоты и п-толуолсульфокислота. Соединения, в которых основные и кислотные группы присутствуют в равном числе, образуют внутренние соли и не требуют третьего солевого компонента.

Изобретение далее относится к способу получения соединения формулы I, отличающемуся тем, что инозитолгликан синтезируют постадийно из защищенных сахарных или инозитоловых предшественников, затем присоединяют остаток А и от образовавшегося соединения отщепляют одну или несколько защитных групп, временно введенных для защиты других функций, и полученное таким образом соединение формулы I при необходимости переводят в ее физиологически приемлемые соли.

Синтез сахаров от ди- до полисахаридов осуществляется известными способами (Н. Paulsen, Angew. Chem. Int. Ed. 21 (1982) S. 155). Для синтеза олигосахаридов предпочтительно применяют трихлорацетамидатный метод (R. R. Schmidt, Angew. Chem. Int. Ed. 25 (1986) 212-235; T. Ogawa, Tetrahedron Lett. 31 (1990) 2439-2442).

Синтез фосфатов осуществляют с помощью Н-фосфатного и фосфорамидатного метода (W. Bannwath et al. , Helvetica Chemica Ada, 70 (1987), Seiten 175 - 186; L. A. Slotin, Synthesis (1977), Seiten 737-752).

В качестве защитных групп для гидроксильных групп в сахарах рассматривают в основном следующие защитные группы: бензильная, ацетильная, бензоильная, пивалоильная, тритильная, трет-бутилдиметилсилильная, бензилиденовая, циклогексилиденовая или изопропилиденовая.

Соединения формулы I и их физиологически приемлемые соли служат, в первую очередь, в качестве биологически активных веществ для формацевтических препаратов для лечения сахарного диабета или инсулиннезависимого диабета.

Поэтому предметом изобретения является также фармацевтическая композиция, отличающаяся содержанием по меньшей мере одного соединения формулы I и/или по меньшей мере одной его фармацевтически приемлемой соли в растворенной, аморфной и/или кристаллической, предпочтительно в аморфной и/или кристаллической, форме.

Фармацевтическая композиция предпочтительно является раствором или суспензией для инъекции с рН приблизительно от 3,0 до 9,0, предпочтительно приблизительно от 5,0 до 8,5, содержащим подходящее изотонирующее средство, подходящее стабилизирующее средство и, в случае необходимости, подходящий буфер, а также, в случае необходимости, с продленным действием, все в стерильном водном растворе или суспензии. Совокупность составных частей композиции, за исключением биологически активного вещества, образует носитель композиции. Пригодными изотонирующими средствами являются, например, глицерин, глюкоза, маннит, NaCl, соединения кальция или магния, такие как СаС1₂ или МgС1₂. Пригодными стабилизирующими средствами являются, например, фенол, м-крезол, бензиловый спирт и/или эфир п-гидроксибензойной кислоты.

В качестве буфера, в особенности для доведения рН до значения приблизительно от 5,0 до 8,5, можно применять ацетат натрия, цитрат натрия или фосфат натрия. Кроме того, для регулирования рН пригодны также физиологически приемлемые разбавленные кислоты (обычно НС1) или соответственно щелочи (обычно NaOH).

С целью вариации направленности действия композиции согласно изобретению могут быть подмешаны модифицированные (ср. ЕР-В 132769 и ЕР-В 132770) и/или немодифицированные инсулины, как правило, бычий, свиной или человеческий инсулин, в особенности человеческий инсулин.

Фармацевтическую композицию получают, помещая по меньшей мере одно соединение формулы I и/или по меньшей мере одну из его физиологически приемлемых солей, в случае необходимости, вместе с модифицированными и/или немодифицированными инсулинами (производными инсулина), с физиологически приемлемым носителем, а также, в случае необходимости, с подходящими добавками и вспомогательными веществами, в подходящую лекарственную форму.

Ниже изобретение поясняется более подробно следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Получение соединения В

(Способ синтеза описан схемой в конце описания).

Синтез соединения 3

60 г (94 ммоль) 1 (T. G. Mayer, В. Kratzer, R. R. Schmidt, Angew. Chem. 106 (1994) 2289-93) и 21,2 г (42,4 ммоль) 2 (A. Termin, R. R. Schmidt, Liebigs Ann. Chem. (1989) 789-795) растворяют в 200 мл сухого метиленхлорида и 400 мл сухого н-гептана. После добавления 70 г сухого молекулярного сита (0,4 нм) перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,05 М триметилсилилтрифторметансульфокислоты в метиленхлориде (далее обозначен как раствор катализатора). Спустя 15 мин добавляют 300 мл смеси н-гептана с этилацетатом (1: 1) и фильтруют через силикагель. Промывают смесью н-гептана с этилацетатом (1: 1) и затем концентрируют. После очистки с помощью флэш-хроматографии получают 41,0 г (99%) 3 в виде бесцветного масла. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (1: 1), R_f= 0,6, MS: (M+Li)⁺= 981,1, рассчитано C₅₅H₆₇N₃O₁₁Si, М= 974,21.

Синтез имидата 4

41 г (42,0 ммоль) 3 растворяют в 400 мл тетрагидрофурана (THF) и 9 мл уксусной кислоты. После добавления 70 мл 1 М раствора TBAF/THF выдерживают в течение 8 часов при комнатной температуре. Уксусную кислоту удаляют вымораживанием (16 час при -30^oС) и фильтрат после концентрирования очищают посредством флэш-хроматографии. Выход: 34,1 г (94%) соединения со снятой защитой. Полученное соединение растворяют в 300 мл сухого метиленхлорида. После добавления 50 мл трихлорацетонитрила и 20 г карбоната калия перемешивают в течение 4 час при комнатной температуре. Фильтруют через силикагель, промывают смесью н-гептана с этилацетатом (1: 1) и концентрируют. Выход сырого продукта: 42,1 г. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (2: 1): R_f= 0,5. ¹H-NMR (CDCl₃): характеристические сигналы для имидата; == 8,78 для NH и 5,63 для аномеров (-имидат).

Синтез трисахарида 6

33,2 г (33,0 ммоль) 4 и 13,3 г (25,0 ммоль) 5 (R. Aneja, S. G. Aneja, A. Parra, Tetrahedron, Asymmetry 6 (1995) 17-18; C. J. J. Elie, R. Verduyn, C. E. Dreef, D. M. Braunts, G. A. Van der Marel, J. H. Van Boom, Tetrahedron, 46 (1990) 8243-54) растворяют в 120 мл сухого метиленхлорида и 360 мл сухого н-гептана. После добавления 100 г молекулярного сита перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Охлаждают в атмосфере аргона до -20^oС и затем смешивают с 20 мл раствора катализатора. Спустя 30 мин оставляют оттаивать до комнатной температуры. Для очистки фильтруют через силикагель и промывают смесью н-гептана с этилацетатом (1: 1). Концентрируют и сырой продукт (46,2 г) растворяют в 150 мл метиленхлорида. После добавления 400 мл метанола и 15 мл 1 М раствора NaOMe/MeOH отстаивают 16 час при комнатной температуре. Раствор смешивают с 1 мл воды и концентрируют. Полученное масло растворяют в 50 мл этилацетата, разбавляют с помощью 200 мл смеси н-гептан/этилацетат (1: 1) и фильтруют через силикагель. После концентрирования очищают посредством флэш-хроматографии. Выход: 32,5 г (97%) белой пены в виде смеси аномеров. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (2: 1), R_f= 0,5. MS: (M+Li)⁺= 1336,7; рассчитано C₈₀H₈₇N₃O₁₅, M= 1330,59.

Синтез трисахарида 7

Смесь аномеров 6 может быть легко хроматографически разделена только в виде производного 7. 32,4 г (24,4 ммоль) 6 растворяют в 200 мл метиленхлорида. После добавления 500 мл 0,5 М HCl/MeOH (из 17,5 мл АсС1 в 500 мл МеОН) и 20 мл этиленгликоля оставляют на 17 час стоять при комнатной температуре. После концентрирования очищают посредством флэш-хроматографии. Полученный продукт (26,9 г, 88%) растворяют в 300 мл метиленхлорида. Добавляют 3,0 г имидазола и 4,6 г TBDMSCI. Через 16 час при комнатной температуре разбавляют с помощью 500 мл смеси н-гептана с этилацетатом (2: 1) и фильтруют через силикагель. Промывают смесью н-гептана с этилацетатом (2: 1) и концентрируют. Полученный сырой продукт очищают посредством флэш-хроматографии. Выход: 21,1 г (72%) 7 и 6,3 г (22%) альфа-продукта. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (2: 1), R_f= 0,5 для 7 и R_f= 0,3 для альфа-продукта. MS: (M+Li)⁺= 1370,6; рассчитано: C₈₀H₉₃N₃O₁₅Si, M= 1364,71.

Синтез трисахарида 8

21,2 г (15,5 ммоль) 7 растворяют в 60 мл метиленхлорида и 180 мл диметоксипропана. Добавляют 250 мг TsOH и выдерживают 1 час при комнатной температуре. После добавления 2 мл триэтиламина концентрируют и получают 23,1 г сырого продукта. Последний растворяют в 150 мл ТHF и смешивают с 30 мл 1 М раствором TBAF/THF. Спустя 16 час концентрируют и очищают посредством флэш-хроматографии. Выход: 20,0 г (99%) 8 в виде белой пены. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (2: 1), R_f= 0,4. MS: (M+Li)⁺= 1296,7; рассчитано C₇₇H₈₃N₃O₁₅, M= 1290,51.

Синтез тетрасахарида 10

20 г (15,4 ммоль) 8 и 15,0 г (23,5 ммоль) 9 (T. G. Mayer, В. Kratzer, R. R. Schmidt, Angew. Chem. 106 (1994) 2289-93) подвергают взаимодействию аналогично описанному для соединения 6 и получают 20,3 г (76%) тетрасахарида 10 в виде белой пены. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (2: 1), R_f= 0,6, MS: (M+Li)⁺= 1770, рассчитано C₁₀₇H₁₁₅N₃O₂₀, M= 1763,09.

Синтез пентасахарида 12

20,3 г (11,8 ммоль) 10 и 12,0 г (20,3 ммоль) 11 (T. G. Mayer, В. Kratzer, R. R. Schmidt, Angew. Chem. 106 (1994) 2289-93) подвергают взаимодействию аналогично описанному для соединения 6 и получают 19,4 г (80%) деацилированного продукта. Этот продукт растворяют в 200 мл метиленхлорида и смешивают с 3,4 г (50,0 ммоль) имидазола. Добавляют 6,0 г (40,0 ммоль) TBDMSCI и перемешивают в течение 15 час при комнатной температуре. После добавления 5 мл метанола выдерживают 10 минут, затем разбавляют с помощью 200 мл смеси н-гептана с этилацетатом (1: 1) и фильтруют через силикагель. Затем промывают смесью н-гептана с этилацетатом (1: 1), концентрируют и очищают посредством флэш-хроматографии. Выход: 19,4 г (95%) 12 в виде белой пены. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (2: 1), R_f= 0,7, MS: (M+Li)⁺= 2226, рассчитано С₁₃₃H₁₅₁N₃O₂₅Si, M= 2219,75.

Синтез гексасахарида 14

19,4 г (8,9 ммоль) 12 и 14,0 г (20,0 ммоль) 13 (T. G. Мауеr, В. Kratzer, R. R. Schmidt, Angew. Chem. 106 (1994) 2289-93) растворяют в 100 мл сухого метиленхлорида и 300 мл сухого н-гептана. После добавления 40 г молекулярного сита (0,4 нм) перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавляют 10 мл раствора катализатора и перемешивают 15 мин. Для очистки фильтруют через силикагель и промывают смесью н-гептана с этилацетатом (1: 1). Концентрируют и получают 33 г сырого продукта. Последний растворяют в 200 мл метиленхлорида и смешивают с 500 мл 0,5 М раствора НС1 в метаноле. Через 2 часа при комнатной температуре концентрируют и многократно концентрируют метиленхлоридом. Полученный промежуточный продукт растворяют в 200 мл метиленхлорида и смешивают с 3,4 г (50 ммоль) имидазола и 6,0 г (40 ммоль) TBDMSCI. Через 16 час очищают аналогично соединению 12. Выход: 20,2 г (85%) 14 в виде белой пены. Тонкослойная хроматография: н-гептан/этилацетат (2: 1), R_f= 0,3, MS: (M+Li)⁺= 2669; рассчитано С₁₆₁Н₁₇₇N₃O₃₀Si, М= 2662,26.

Синтез соединения 15

30,0 г триазола растворяют в 800 мл сухого THF. При 10^oС по каплям добавляют 13,5 мл оксихлорида фосфора. После этого прикапывают 60 мл триэтиламина и перемешивают 15 мин при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и промывают небольшим количеством сухого THF. Фильтрат добавляют к 19,1 г (7,2 ммоль) 14. Раствор концентрируют до 100 мл. Через 15 мин разбавляют этилацетатом (500 мл) и дважды промывают водой (по 100 мл воды). Органическую фазу сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют. После флэш-хроматографии получают 19,0 г (97%) циклического фосфатного производного в виде белой пены. Тонкослойная хроматография: метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (100/7/1), R_f= 0,3, MS: (M+2Li-H)⁺= 2737, рассчитано C₁₆₁H₁₇₄N₃O₃₂PSi, M= 2724,22. Циклический фосфат растворяют в 350 мл THF и добавляют 100 мл TBAF (1 М в THF). Через 20 час концентрируют и остаток очищают посредством флэш-хроматографии. Выход: 18,1 г (99%) 15 в виде белой пены. Тонкослойная хроматография: метилен-хлорид/метанол/33% NH₃ (100/7/1), R_f= 0,3 (параллельно с эдуктом), MS: (M+2Li-H)⁺= 2622, рассчитано C_l55H_l62N₃O₃₂P, М= 2609,96.

Синтез соединения 16

14 г фосфористой кислоты четырежды концентрируют пиридином и затем поглощают в 200 мл сухого пиридина. При 10^oС прикапывают 16 мл пивалоилхлорида. Этот реакционный раствор выдерживают 15 минут при комнатной температуре. В вышеописанной реакционный раствор вводят 18,1 г (6,9 ммоль) 15. Спустя 1 час разбавляют с помощью 200 мл толуола и 150 мл смеси метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (30/10/3). После концентрирования трижды отгоняют с толуолом остаточный пиридин. Остаток суспендируют в 200 мл смеси метиленхлорид/метанол (20: 1). Не растворившиеся компоненты отфильтровывают и дважды промывают с помощью 50 мл смеси метиленхлорида и метанола (20: 1). Фильтрат концентрируют и очищают посредством флэш-хроматографии. Выход: 16,9 г (91%) защищенного целевого продукта. Тонкослойная хроматография: метиленхлорид/мета-нол/33% NH₃ (100/7/1), R_f= 0,25. MS: (М+3Li-2H)⁺= 2691, рассчитано С₁₅₅Н₁₆₃N₃O₃₄P₂, М= 2673,94. Для снятия защиты конденсируют 600 мл аммиака при -78^oС. Растворяют в них 4,7 г (204 ммоль) натрия. Этот раствор разбавляют сухим THF (300 мл) и затем при температуре реакции -78^oС к нему медленно прикапывают 16,9 г (6,3 ммоль) защищенного целевого продукта, растворенного в 100 мл сухого THF. После 15 мин проведения реакции (синяя окраска не должна исчезать) осторожно смешивают с 10 г хлорида аммония. Если синяя окраска исчезнет, то осторожно разбавляют с помощью 100 мл воды и 300 мл метанола. Оттаивают и затем концентрируют приблизительно до 150 мл. Этот раствор разбавляют двумя литрами (2 л) смеси метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (3/3/1) и подают на флэш-хроматографическую колонку (700 мл силикагеля). Затем элюируют тремя литрами (3 л) смеси метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (3/3/2) с 3 л (3/3,5/3). Продукт элюируют, когда затем хроматографируют в системе н-бутанол/этанол/вода/33% NH₃ (2/2/2/1). Выход: 5,5 г (78%) 16 в виде белого твердого вещества. Тонкослойная хроматография: (2/2/2/1), R_f= 0,4. MS: (М+Н)⁺= 1116,5; рассчитано C₃₆H₆₃NO₃₄P₂, M= 1115,83. ³¹P-NMR (D₂О) == 16,3 РРМ для циклического фосфата и 7,9 для Н-фосфата.

ПРИМЕР 2

Соединения А, С, D, Е, F, G, Н и I получают аналогично способам, описанным в примере 1. В табл. 1 указаны структурные формулы, суммарные формулы и масс-спектры.

ПРИМЕР 3

Фармацевтическая активность

Биологическая активность предлагаемых согласно изобретению соединений формулы I определяют на изолированных жировых клетках крысы.

Приготовление жировых клеток крысы производят следующим образом.

Белую жировую ткань придатка яичка (крыса Wistar, 160-180 г, никакого ограничения корма) переваривают коллагеназой и полученные отдельные жировые клетки отделяют путем фильтрации от непереваренной ткани и несколько раз промывают буфером Кребса-Рингера-Гензелейта (KRH-буфер).

А) Липогенез

Этот тест определяет стимулируемое инсулином превращение глюкозы в растворимые в толуоле продукты (триглицериды, фосфолипиды, жирные кислоты), которое требует транспорта глюкозы и синтеза триглицерид/фосфолипид/жирной кислоты (синтез глицерин-3-Р, этерификация), включая инсулиновые каскад передачи сигнала. При концентрации глюкозы 2,5 мМ во время теста этерификация (а не синтез глицерина-3-Р, включая транспорт глюкозы) является стадией, определяющей скорость стимуляции липогенеза.

200 мкл (3х10⁵ клеток/мл) жировых клеток крысы в KRH-буфере инкубируют со 100 мкл D-[3-³Н] глюкозы (25 мМ, 0,4 мкCi) в присутствии или в отсутствие инсулина (10 нг/мл) или предлагаемого изобретением соединения формулы I в течение 90 мин при 37^oС (конечный объем 1 мл). Добавляя растворимую в толуоле сцинтилляционную смесь (10 мл), растворяют клетки и отделяют липиды от растворимых в воде продуктов и инкубационной среды. После разделения фаз наведенную в липиды радиоактивность определяют непосредственно сцинтилляционным измерением без удаления водной фазы ([^зH] липид[dpm*10^-3] ). Из этой радиоактивности вычитают контрольное значение (инкубация при идентичных условиях, однако без клеток). Скорость липогенеза является линейной вплоть до 120 мин. Максимальный коэффициент стимуляции - т. е. отношение результата инкубации с инсулином к результату инкубации без инсулина - принимают за 100%. Процентные данные "%Ins_max" являются частями определенного таким образом максимального коэффициента стимуляции. Величина ЕС₅₀ определяет концентрацию соединения формулы I, при которой наблюдается 50% от максимальной стимуляции, достигаемой соответствующим соединением формулы I.

Б) Транспорт глюкозы

Жировые клетки крысы в 100 мкл KRH-буфера (титр 5х10⁵ клеток/мл) инкубируют с инсулином или с предлагаемым согласно изобретению соединением формулы I в течение 15 мин при 37^oС. После добавления 50 мкл 2-[³H] деоксиглюкозы (0,3 мМ, 0,2 мкCi) инкубацию продолжают при комнатной температуре. Через определенные промежутки времени (0-20 мин) отбирают 100 мкл тестируемого образца и переводят в реакционный сосуд (вместимость 400 мкл), в котором находятся 250 мкл динонил-фталата. После центрифугирования (15000g, 1 мин) клетки на масляном слое отделяют от инкубационной среды под масляным слоем путем разрезания пробирки на высоте масляного слоя и переводят в сцинтилляционный сосуд. После добавления 5 мл водорастворимой сцинтилляционной жидкости определяют радиоактивность. Суммарную наведенную в клетках радиоактивность корректируют поправкой на пассивно дифундирующую в клетки и включенную в межклеточное пространство [³H] деоксиглюкозу путем вычитания контрольного значения (инкубация в присутствии ингибитора транспорта глюкозы цитохалазина В). Начальная (стимулированная) скорость транспорта глюкозы является вплоть до 15 мин линейной. Максимальный коэффициент стимуляции - т. е. отношение результата инкубации с инсулином к результату инкубации без инсулина - принимают за 100%.

Понятия "%Ins_max" и "ЕС₅₀" определены в разделе А) "Липогинез". Фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит эффективное количество, по меньшей мере одного, соединения формулы (1) и в случае необходимости физиологически приемлемый носитель, обычные добавки и вспомогательные вещества (см. табл. 2). Так, например, для получения раствора для инъекций биологически активное вещество формулы (1) растворяют в дважды перегнанной воде, добавляют при необходимости изотоническое средство и устанавливают рН в интервале от 3,0 до 9,0, предпочтительно от 5,0 до 8,5, раствор фильтруют в стерильных условиях, разливают в стеклянные емкости для препаратов для инъекции, лиофилизируют в стерильных условиях и стерильно закрывают. В качестве изотонического средства могут быть использованы глицерин, глюкоза, маннит, соединения кальция или магния, с также хлорид натрия. Раствор для инъекций может содержать также стабилизирующие средства, указанные заявителем выше.