способ извлечения эстрогенов из мочи кобылы
Классы МПК: | A61K35/22 моча; мочевая система A61K31/56 соединения, содержащие циклопента(а)гидрофенантреновые кольцевые системы; их производные, например стероиды |
Автор(ы): | БАН Иван (DE), ХАЙНЕМАНН Хеннинг (DE), МЕХТОЛЬД Герхард (DE), РАШЕ Хайнц-Хельмер (DE) |
Патентообладатель(и): | СОЛВЕЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛС ГМБХ (DE) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1996-08-30 публикация патента:
10.02.2002 |
Способ может быть использован в медицине для получения природной смеси сопряженных эстрогенов, обедненной фенольными веществами, из мочи жеребых кобыл. Мочу, или ее концентрат, или ретентат мочи приводят в контакт с неионогенной полуполярной полимерной адсорбционной смолой, отделяют загруженную смесью сопряженных эстрогенов смолу от остальной мочи, промывают смолу водой, приводят в контакт с элюирующей жидкостью и элюат, содержащий эстрогены, отделяют от смолы. Способ позволяет получить продукт с пониженным содержанием находящихся в моче фенольных веществ и в значительной степени свободный от крезола и НРМY. 7 з. п. ф-лы, 1 табл.
Рисунок 1
Формула изобретения
1. Способ получения природной смеси сопряженных эстрогенов, обедненной фенольными веществами, из мочи жеребых кобыл, отличающийся тем, что а) жидкость мочи, которая представляет собой очищенную от слизи и твердых веществ мочу, сконцентрированный концентрат этой мочи или полученный путем мембранной фильтрации этой мочи сконцентрированный ретентат мочи приводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов количеством неионогенной полуполярной полимерной адсорбционной смолы, и отделяют загруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу от остальной жидкости мочи, b) загруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу промывают промывочной водой с величиной рН по крайней мере 12,0, и с) промытую адсорбционную смолу приводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной на ней смеси сопряженных эстрогенов количеством элюирующей жидкости, которая представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель из группы смешиваемых с водой эфиров, низших алканолов и низших алифатических кетонов или смесь из смешиваемого с водой органического растворителя и при необходимости щелочной воды, и содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов, обедненную фенольными веществами, элюат отделяют от адсорбционной смолы и в случае необходимости концентрируют. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в стадии а) способа в качестве неионогенной полуполярной адсорбционной смолы используют макропористую смолу сложного эфира поликарбоновой кислоты. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве смолы сложного эфира поликарбоновой кислоты используют сшитую в сетчатый полимер, алифатическую смолу сложного эфира поликарбоновой кислоты, предпочтительно сшитую в сетчатый полимер смолу сложного полиакрилового эфира с предпочтительно макроретикулярной структурой. 4. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что в стадии а) способа 1 объемную часть неионогенной полуполярной адсорбционной смолы загружают количеством жидкости мочи, соответствующим 20-80, предпочтительно 30-50 об. ч. мочи. 5. Способ по одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что в стадии а) способа жидкость мочи пропускают через реактор, содержащий неионогенную полуполярную полимерную адсорбционную смолу, со скоростью протекания, которая соответствует протеканию от 3 до 10, предпочтительно 5-7 об. ч. мочи на 1 об. ч. адсорбционной смолы в час. 6. Способ по одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что используемая в стадии b) способа промывочная вода является водным раствором гидроокиси натрия с величиной рН, устанавливаемой примерно на 12,5-13,5. 7. Способ по одному из пп. 1-6, отличающийся тем, что в стадии с) способа в качестве элюирующей жидкости используют смесь из воды и смешиваемого с водой органического растворителя с соотношением объемов органического растворителя и воды в диапазоне от 20: 80 до 40: 60, в частности 30: 70. 8. Способ по одному из пп. 1-7, отличающийся тем, что в стадии с) способа используют содержащую этанол элюирующую жидкость.Описание изобретения к патенту
Настоящее изобретение относится к извлечению природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл. Эстрогены применяют в медицине для гормонозаместительной терапии. В частности, смеси эстрогенов используют для лечения и профилактики возникающих у женщин жалоб климактерического периода после естественной или искусственной менопаузы. При этом оказались особенно эффективными и хорошо переносимыми природные смеси сопряженных эстрогенов, которые обнаружены в моче жеребых кобыл. Содержание растворенного твердого вещества в моче жеребых кобыл (= pregnant mares urine, в последующем называемой также сокращенно "PMU") может естественным образом колебаться в широких пределах и обычно находится в диапазоне 40 - 90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и другими обычно содержащимися в моче веществами в твердом веществе мочи жеребых кобыл содержатся фенольные составные части в количестве около 2-5 мас. % в пересчете на сухое вещество. Среди этих фенольных составных частей находятся крезолы и известный как HPMF дигидро-3,4-бис[(3- гидроксифенил)метил] -2(3H)-фуранон. Он может находиться в свободной или сопряженной форме. В моче жеребых кобыл (PMU) содержится природная смесь эстрогенов, которые в большей части находятся в сопряженной форме, например, как натриевая соль сложного полуэфира серной кислоты (в последующем называемая кратко "сульфатная соль"). Содержание сопряженных эстрогенов (рассчитанное как эстрогенная сульфатная соль) может составлять между 0,3 и 1 мас. % в пересчете на сухое вещество. Обычно содержащие сопряженные эстрогены экстракты извлекают из мочи жеребых кобыл путем экстракции с помощью полярного органического растворителя, который не смешивается или только незначительно смешивается с водой, например сложного этилового эфира уксусной кислоты, n-бутанола или циклогексанола. Однако при такой жидкость-жидкость-экстракции возникает множество проблем, например сильное образование пены, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Как правило, требуются несколько стадий экстракции, что приводит к потерям и лишь к частичному извлечению содержимого эстрогенов. В 1968 году H. L. Bradlow (Steroids II (1968), 265-272) предложил использовать для экстракции сопряженных эстрогенов из мочи Амберлит XAD-2![способ извлечения эстрогенов из мочи кобылы, патент № 2179028](/images/patents/291/2179028/174.gif)
а) жидкость мочи, которая представляет собой очищенную от слизи и твердых веществ мочу, сконцентрированный концентрат этой мочи или полученный путем мембранной фильтрации этой мочи сконцентрированный ретентат мочи, приводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов количеством полуполярной полимерной адсорбционной смолы и нагруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу отделяют от остальной жидкости мочи,
b) нагруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу промывают промывочной водой с величиной pH по меньшей мере 12,0, в частности 12,5 - 14,
с) промытую адсорбционную смолу приводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной на ней смеси сопряженных эстрогенов количеством элюирующей жидкости, которая представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель из группы смешиваемых с водой эфиров, низших алканолов и низших алифатических кетонов или смесь из смешиваемого с водой органического растворителя и при необходимости щелочной воды, и содержащий естественную смесь сопряженных эстрогенов элюат отделяют от адсорбционной смолы и при необходимости концентрируют. Для способа согласно изобретению можно использовать мочу жеребых кобыл как таковую, полученный из нее путем концентрирования концентрат или полученный из нее путем мембранной фильтрации ретентат. Собранную мочу прежде всего известным способом очищают от слизи и твердых веществ. Целесообразно дать осесть твердым веществам и слизи и затем отделить их с помощью известных методов, например, декантацией, сепарацией и/или фильтрацией. Таким образом, мочу жеребых кобыл можно, например, пропустить через известное разделительное устройство, например сепаратор, фильтрационную установку или седиментатор. В качестве разделительного устройства может служить песчаная постель, а также можно использовать предлагаемые в торговле сепараторы, например сопловые или камерные сепараторы. При желании можно использовать также микрофильтрационные установки или ультрафильтрационные установки, при применении которых можно одновременно достигать отсутствие микробов и вирусов в отфильтрованной моче жеребых кобыл. При желании в мочу могут быть добавлены консерванты, гербициды, бактерициды и/или антигельминтные средства. Если вместо мочи жеребых кобыл необходимо использовать сконцентрированный ретентат мочи жеребых кобыл, то его можно получить из мочи жеребых кобыл с помощью известной мембранной фильтрации. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут изменяться в зависимости от используемой мочи жеребых кобыл и применяемых для мембранной фильтрации мембран, например, от величины их пор, а также от условий фильтрации. Например, при применении нанофильтрационной мембраны можно достичь почти полностью без потерь содержания эстрогенов в ретентате мочи жеребых кобыл при одновременном удалении до 50 мас. % низкомолекулярных веществ, содержащихся в моче жеребых кобыл. Для способа согласно изобретению можно использовать ретентаты мочи жеребых кобыл, концентрация в которых повышена до соотношения около 1: 10, например до соотношения около 1: 7, и объем которых тем самым сконцентрирован до 1/10, например 1/7 первоначального объема мочи жеребых кобыл. Используемые в стадии а) способа полуполярные полимерные адсорбционные смолы являются пористыми органическими неионогенными полимерами, которые в противоположность неполярным гидрофобным полимерным адсорбционным смолам имеют промежуточную полярность (например, с дипольным моментом активной площади поверхности смолы в диапазоне от 1,0 до 3,0, в частности 1,5-2,0 Дебай, и слегка гидрофильную структуру, например смолы сложного эфира поликарбоновых кислот. Целесообразно использовать макропористые полуполярные смолы с предпочтительно макроретикулярной структурой и со средним диаметром пор в диапазоне от 50 до 150, предпочтительно 70-100 Ангстрем и удельной поверхностью в диапазоне от 300 до 900, предпочтительно 400-500 м2/г. Наиболее пригодными являются макропористые, сшитые в сетчатый полимер алифатические смолы сложных эфиров поликарбоновых кислот, в частности сшитые в сетчатый полимер смолы сложных эфиров полиакрила, как например, Амберлит XAD-7
![способ извлечения эстрогенов из мочи кобылы, патент № 2179028](/images/patents/291/2179028/174.gif)
Общая инструкция для извлечения из мочи жеребых кобыл экстракта, в значительной степени обедненного содержащимися в моче фенольными веществами и содержащего природную смесь сопряженных эстрогенов в моче жеребых кобыл. А) Адсорбция содержащихся в моче жеребых кобыл эстрогенов на полуполярной адсорбционной смоле сложного полиакрилового эфира
Колонну высотой 30 см с диаметром 2,4 см 65 мл наполняют набухшей в воде полуполярной адсорбционной смолой сложного полиакрилового эфира (Амберлит XAD-7 фирмы Rohm und Haas, величина зерна 0,3 - 1,2 мм, дипольный момент 1,8 Дебай, средний диаметр пор 80 Ангстрем, удельная поверхность около 450 м2/г в сухом виде). Через колонну пропускают 2 л отфильтрованной в микрофильтрационной установке или очищенной путем пропускания через сепаратор мочи жеребых кобыл (содержание сухого вещества= (TS), а также определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF приведены в таблице) при комнатной температуре со скоростью прохождения 6 мл/мин (около 5,5 объемов слоя в час). Содержащийся в моче жеребых кобыл эстроген полностью адсорбируется на загруженной таким образом колонне полуполярной адсорбционной смолы. Вытекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание сопряженных эстрогенов (в расчете на эстрон-сульфатную соль), и она оказывается практически не содержащей эстрогенов. Процесс останавливают. В) Промывание загруженной колонны адсорбционной смолы
Загруженную колонну адсорбционной смолы промывают 300 мл водного раствора гидроксида натрия с указанным в таблице значением pH. Для этого через колонну пропускают щелочную промывочную волу со скоростью прохождения 6 мл/мин (около 5,5 объемов слоя в час). Стекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Исследование показало, что во время фазы промывки вымывается менее чем 5 % всех введенных в колонну эстрогенов. С) Десорбция сопряженных эстрогенов из промытой колонны с адсорбционной смолой. 315 мл элюирующей жидкости (путем добавки гидроксида натрия щелочная смесь воды и растворителя, состав и pH смотри в таблице) пропускают со скоростью потока около 6 мл/мин через колонну, предварительно нагретую до указанной в таблице температуры элюирования. Стекающий элюат собирают в 6 фракций. Первая фракция составляет около 65 мл (примерно 1 объем слоя), остальные фракции составляют около 50 мл каждая. Отдельные фракции исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание в них эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Первую фракцию собирают, пока элюат кажется бесцветным до слабо желтого цвета. Эта фракция содержит лишь следы сульфатной соли эстрогенов. После того как пройдет первый объем слоя элюата, происходит изменение цвета элюата на интенсивный темно-коричневый тон. В последующих фракциях 2 - 4 содержится около 80-90% общего количества адсорбированных на колонне сопряженных эстрогенов. Остальные фракции содержат лишь незначительное количество сульфатной соли эстрогенов. Это можно наблюдать также по сильному уменьшению интенсивности цвета. При необходимости остаточные фракции после отделения дистилляцией растворителя можно еще раз подать в стадию А) способа. В таблице для фракций, содержащих основное количество сопряженных эстрогенов, указаны содержание сухого вещества TS в мас. % и определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Эти фракции представляют собой экстракты, пригодные для дальнейшей галеновой обработки. D) Регенерация колонны адсорбционной смолы
Для регенерации колонну прежде всего промывают 100 мл смеси этанола с водой, содержащей 5% этанола и имеющей pH 12, затем 150 мл 10%-ого водного раствора цитрата натрия и еще раз 150 мл смеси этанола с водой и, наконец, 100 мл дистиллированной воды. Всю регенерацию проводят при температуре 45oC. Колонну можно много раз, например до 40 раз, загружать и снова регенерировать.
Класс A61K35/22 моча; мочевая система
Класс A61K31/56 соединения, содержащие циклопента(а)гидрофенантреновые кольцевые системы; их производные, например стероиды