способ извлечения эстрогенов из мочи кобылы

Формула изобретения

1. Способ получения природной смеси сопряженных эстрогенов, обедненной фенольными веществами, из мочи жеребых кобыл, отличающийся тем, что а) жидкость мочи, которая представляет собой очищенную от слизи и твердых веществ мочу, сконцентрированный концентрат этой мочи или полученный путем мембранной фильтрации этой мочи сконцентрированный ретентат мочи приводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов количеством неионогенной полуполярной полимерной адсорбционной смолы, и отделяют загруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу от остальной жидкости мочи, b) загруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу промывают промывочной водой с величиной рН по крайней мере 12,0, и с) промытую адсорбционную смолу приводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной на ней смеси сопряженных эстрогенов количеством элюирующей жидкости, которая представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель из группы смешиваемых с водой эфиров, низших алканолов и низших алифатических кетонов или смесь из смешиваемого с водой органического растворителя и при необходимости щелочной воды, и содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов, обедненную фенольными веществами, элюат отделяют от адсорбционной смолы и в случае необходимости концентрируют.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в стадии а) способа в качестве неионогенной полуполярной адсорбционной смолы используют макропористую смолу сложного эфира поликарбоновой кислоты.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве смолы сложного эфира поликарбоновой кислоты используют сшитую в сетчатый полимер, алифатическую смолу сложного эфира поликарбоновой кислоты, предпочтительно сшитую в сетчатый полимер смолу сложного полиакрилового эфира с предпочтительно макроретикулярной структурой.

4. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что в стадии а) способа 1 объемную часть неионогенной полуполярной адсорбционной смолы загружают количеством жидкости мочи, соответствующим 20-80, предпочтительно 30-50 об. ч. мочи.

5. Способ по одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что в стадии а) способа жидкость мочи пропускают через реактор, содержащий неионогенную полуполярную полимерную адсорбционную смолу, со скоростью протекания, которая соответствует протеканию от 3 до 10, предпочтительно 5-7 об. ч. мочи на 1 об. ч. адсорбционной смолы в час.

6. Способ по одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что используемая в стадии b) способа промывочная вода является водным раствором гидроокиси натрия с величиной рН, устанавливаемой примерно на 12,5-13,5.

7. Способ по одному из пп. 1-6, отличающийся тем, что в стадии с) способа в качестве элюирующей жидкости используют смесь из воды и смешиваемого с водой органического растворителя с соотношением объемов органического растворителя и воды в диапазоне от 20: 80 до 40: 60, в частности 30: 70.

8. Способ по одному из пп. 1-7, отличающийся тем, что в стадии с) способа используют содержащую этанол элюирующую жидкость.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к извлечению природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл.

Эстрогены применяют в медицине для гормонозаместительной терапии. В частности, смеси эстрогенов используют для лечения и профилактики возникающих у женщин жалоб климактерического периода после естественной или искусственной менопаузы. При этом оказались особенно эффективными и хорошо переносимыми природные смеси сопряженных эстрогенов, которые обнаружены в моче жеребых кобыл.

Содержание растворенного твердого вещества в моче жеребых кобыл (= pregnant mares urine, в последующем называемой также сокращенно "PMU") может естественным образом колебаться в широких пределах и обычно находится в диапазоне 40 - 90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и другими обычно содержащимися в моче веществами в твердом веществе мочи жеребых кобыл содержатся фенольные составные части в количестве около 2-5 мас. % в пересчете на сухое вещество. Среди этих фенольных составных частей находятся крезолы и известный как HPMF дигидро-3,4-бис[(3- гидроксифенил)метил] -2(3H)-фуранон. Он может находиться в свободной или сопряженной форме. В моче жеребых кобыл (PMU) содержится природная смесь эстрогенов, которые в большей части находятся в сопряженной форме, например, как натриевая соль сложного полуэфира серной кислоты (в последующем называемая кратко "сульфатная соль"). Содержание сопряженных эстрогенов (рассчитанное как эстрогенная сульфатная соль) может составлять между 0,3 и 1 мас. % в пересчете на сухое вещество.

Обычно содержащие сопряженные эстрогены экстракты извлекают из мочи жеребых кобыл путем экстракции с помощью полярного органического растворителя, который не смешивается или только незначительно смешивается с водой, например сложного этилового эфира уксусной кислоты, n-бутанола или циклогексанола. Однако при такой жидкость-жидкость-экстракции возникает множество проблем, например сильное образование пены, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Как правило, требуются несколько стадий экстракции, что приводит к потерям и лишь к частичному извлечению содержимого эстрогенов.

В 1968 году H. L. Bradlow (Steroids II (1968), 265-272) предложил использовать для экстракции сопряженных эстрогенов из мочи Амберлит XAD-2, нейтральную неполярную гидрофобную полистирольную смолу фирмы "Rohm und Haas". Указанная адсорбционная емкость незначительна. Согласно методу Bradlow разбавленную при необходимости мочу с низкой скоростью потока пропускают через колонну, содержащую смолу. Эстрогены элюируются метанолом или этанолом. Однако не приводится никаких данных о других веществах, содержащихся в эстрогенсодержащем элюате.

Задачей настоящего изобретения является создание технического способа для извлечения природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл с устранением недостатков, известных из применяемой до настоящего времени жидкость-жидкость-экстракции, в котором получают продукт с пониженным содержанием содержащихся в моче фенольных веществ и в значительной степени свободный от крезола и HPMF.

Был найден, таким образом, способ, в котором с помощью твердофазной экстракции на неионогенной полуполярной полимерной адсорбционной смоле можно извлекать обедненную содержащимися в моче фенольными веществами, практически не содержащую крезол и HPMF, однако практически полностью сохраняющую содержание природных эстрогенов мочи жеребых кобыл в смеси, которая может служить исходным материалом для получения фармацевтических средств, содержащих в качестве активного компонента природную смесь сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл.

Способ согласно изобретению для извлечения обедненной содержащимися в моче фенольными веществами природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл отличается тем, что

а) жидкость мочи, которая представляет собой очищенную от слизи и твердых веществ мочу, сконцентрированный концентрат этой мочи или полученный путем мембранной фильтрации этой мочи сконцентрированный ретентат мочи, приводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов количеством полуполярной полимерной адсорбционной смолы и нагруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу отделяют от остальной жидкости мочи,

b) нагруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную полимерную адсорбционную смолу промывают промывочной водой с величиной pH по меньшей мере 12,0, в частности 12,5 - 14,

с) промытую адсорбционную смолу приводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной на ней смеси сопряженных эстрогенов количеством элюирующей жидкости, которая представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель из группы смешиваемых с водой эфиров, низших алканолов и низших алифатических кетонов или смесь из смешиваемого с водой органического растворителя и при необходимости щелочной воды, и содержащий естественную смесь сопряженных эстрогенов элюат отделяют от адсорбционной смолы и при необходимости концентрируют.

Для способа согласно изобретению можно использовать мочу жеребых кобыл как таковую, полученный из нее путем концентрирования концентрат или полученный из нее путем мембранной фильтрации ретентат. Собранную мочу прежде всего известным способом очищают от слизи и твердых веществ. Целесообразно дать осесть твердым веществам и слизи и затем отделить их с помощью известных методов, например, декантацией, сепарацией и/или фильтрацией. Таким образом, мочу жеребых кобыл можно, например, пропустить через известное разделительное устройство, например сепаратор, фильтрационную установку или седиментатор. В качестве разделительного устройства может служить песчаная постель, а также можно использовать предлагаемые в торговле сепараторы, например сопловые или камерные сепараторы. При желании можно использовать также микрофильтрационные установки или ультрафильтрационные установки, при применении которых можно одновременно достигать отсутствие микробов и вирусов в отфильтрованной моче жеребых кобыл.

При желании в мочу могут быть добавлены консерванты, гербициды, бактерициды и/или антигельминтные средства.

Если вместо мочи жеребых кобыл необходимо использовать сконцентрированный ретентат мочи жеребых кобыл, то его можно получить из мочи жеребых кобыл с помощью известной мембранной фильтрации. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут изменяться в зависимости от используемой мочи жеребых кобыл и применяемых для мембранной фильтрации мембран, например, от величины их пор, а также от условий фильтрации. Например, при применении нанофильтрационной мембраны можно достичь почти полностью без потерь содержания эстрогенов в ретентате мочи жеребых кобыл при одновременном удалении до 50 мас. % низкомолекулярных веществ, содержащихся в моче жеребых кобыл. Для способа согласно изобретению можно использовать ретентаты мочи жеребых кобыл, концентрация в которых повышена до соотношения около 1: 10, например до соотношения около 1: 7, и объем которых тем самым сконцентрирован до 1/10, например 1/7 первоначального объема мочи жеребых кобыл.

Используемые в стадии а) способа полуполярные полимерные адсорбционные смолы являются пористыми органическими неионогенными полимерами, которые в противоположность неполярным гидрофобным полимерным адсорбционным смолам имеют промежуточную полярность (например, с дипольным моментом активной площади поверхности смолы в диапазоне от 1,0 до 3,0, в частности 1,5-2,0 Дебай, и слегка гидрофильную структуру, например смолы сложного эфира поликарбоновых кислот. Целесообразно использовать макропористые полуполярные смолы с предпочтительно макроретикулярной структурой и со средним диаметром пор в диапазоне от 50 до 150, предпочтительно 70-100 Ангстрем и удельной поверхностью в диапазоне от 300 до 900, предпочтительно 400-500 м²/г. Наиболее пригодными являются макропористые, сшитые в сетчатый полимер алифатические смолы сложных эфиров поликарбоновых кислот, в частности сшитые в сетчатый полимер смолы сложных эфиров полиакрила, как например, Амберлит XAD-7 фирмы Rohm und Haas.

Согласно изобретению адсорбция сопряженных эстрогенов на полуполярной адсорбционной смоле может происходить посредством контактирования мочи жеребых кобыл или ее ретентата с адсорбционной смолой, тем что жидкость мочи вводят в содержащий адсорбционную смолу реактор и там оставляют в контакте с адсорбционной смолой на время, достаточное для адсорбции содержания эстрогенов. После завершенной адсорбции сопряженных эстрогенов на полуполярной адсорбционной смоле загруженную смесью сопряженных эстрогенов адсорбционную смолу можно отделить от остальной жидкости мочи известным образом. Целесообразно пропускать жидкость мочи через содержащую адсорбционную смолу колонну с такой скоростью прохождения, чтобы время контакта было достаточным для адсорбции эстрогенов. Подходящими являются, например, скорости прохождения, которые соответствуют прохождению от 3 до 10, предпочтительно 5 - 7 объемных частей мочи жеребых кобыл на 1 объемную часть адсорбционной смолы в час. Адсорбцию проводят предпочтительно при комнатной температуре. Целесообразно управлять скоростью протекания жидкости мочи через реактор, работая при небольшом избыточном давлении или разрежении. Количество применяемой полуполярной адсорбционной смолы может изменяться в зависимости от вида используемой адсорбционной смолы и количества твердого вещества, содержащегося в жидкости мочи. При использовании мочи жеребых кобыл одна объемная часть адсорбционной смолы, например сшитой в сетчатый полимер алифатической адсорбционной смолы сложного эфира поликарбоновой кислоты, может быть загружена до 80 объемными частями предварительно обработанной мочи жеребых кобыл, так что можно едва обнаружить заметное количество эстрогенов в стекающей жидкости мочи. При применении концентрата мочи жеребых кобыл или ретентата мочи жеребых кобыл емкость загрузки адсорбционной смолы, естественно, понижается в степени, соответствующей концентрации. Так, например, 1 объемная часть сшитой в сетчатый полимер алифатической адсорбционной смолы сложного эфира поликарбоновой кислоты может быть загружена количеством жидкости мочи, соответствующим 20 - 80, предпочтительно 30 - 50 объемным частям мочи жеребых кобыл.

Загруженную смесью сопряженных эстрогенов полуполярную адсорбционную смолу в стадии b) способа промывают промывочной водой, имеющей величину pH по меньшей мере 12, в частности от 12,5 до 14, предпочтительно около 12,5 - 13,5. В качестве промывочной воды можно использовать водные растворы растворимых в жидкости мочи инертных основных веществ, которые достаточно сильны для достижения величины pH по меньшей мере 12,5. В качестве водорастворимых основных веществ, инертных по отношению к полуполярной полимерной адсорбционной смоле, пригодны предпочтительно водорастворимые неорганические основания, как, например, гидроксиды щелочных и щелочноземельных металлов, в частности гидроксид натрия. Промывочная вода содержит, целесообразно, только такое количество основных веществ, которое необходимо для достижения желаемой величины pH, предпочтительно около 13. Количество промывочной воды выбирают так, чтобы его было достаточно для удаления в значительной степени содержащихся в мочи фенольных веществ без вымывания при этом достойного упоминания количества сопряженных эстрогенов. Целесообразно использовать, например, от 2 до 10, в частности от 4 до 6 объемов слоя промывочной жидкости на 1 объем слоя адсорбционной смолы. При этом промывочную воду целесообразно пропускать через содержащий адсорбционную смолу реактор со скоростью прохождения от 3 до 10, предпочтительно 5-7 объемных частей промывочной воды на 1 объемную часть адсорбционной смолы в час.

Наконец, в стадии с) способа промытую, загруженную смесью сопряженных эстрогенов адсорбционную смолу обрабатывают количеством элюирующей жидкости, достаточным для элюирования смеси сопряженных эстрогенов, и получают элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов мочи жеребых кобыл. Применяемая согласно изобретению элюирующая жидкость представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель из группы смешиваемых с водой эфиров, низших алканолов и низших алифатических кетонов или смесь из такого смешиваемого с водой растворителя и, при необходимости, щелочной воды. В качестве эфирных компонентов элюирующей жидкости пригодны смешиваемые с водой циклические эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан, а также смешиваемые с водой эфиры с открытой цепью, как, например, этиленгликольдиметиловые эфиры (моноглимы), диэтиленгликоль-диметиловые эфиры (диглимы) или этилоксиэтилоксиэтанол (карбитол). В качестве низших алканолов пригодны смешиваемые с водой алкиловые спирты с 1-4, предпочтительно 1-3 атомами углерода, в частности этанол или изопропанол. В качестве низших алифатических кетонов пригодны смешиваемые с водой кетоны с 3-5 атомами углерода, в частности ацетон. Особенно предпочтительными являются элюирующие жидкости, в которых органическим растворителем является этанол. Целесообразно использовать в качестве элюирующей жидкости смеси из указанных выше смешиваемых с водой органических растворителей и при необходимости щелочной воды. Величина pH таких водосодержащих элюентов находится в нейтральном до щелочного диапазоне до pH 13 и может предпочтительно составлять примерно 10 - 12. В качестве компонента растворителя в водосодержащей элюирующей жидкости выбирают растворитель, стабильный в используемом диапазоне pH. В водосодержащих щелочных элюирующих жидкостях с величиной pH около 10-12 в качестве компонента растворителя пригодными являются низшие алканолы, предпочтительно этанол. Желаемую величину pH водосодержащего элюента устанавливают путем добавления соответствующего количества водорастворимого инертного основного вещества, предпочтительно неорганического основания, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, в частности гидроксида натрия. В водосодержащей элюирующей жидкости соотношение объемов смешиваемого с водой органического растворителя и воды может составлять от 40: 60 до 20: 80, предпочтительно около 30: 70. Используемое количество элюента может составлять примерно 3 - 10, в частности около 4 - 6 объемов слоя на 1 объем слоя адсорбционной смолы. Целесообразно пропускать элюирующую жидкость через реактор, содержащий загруженную смесью эстрогенов адсорбционную смолу, с такой скоростью прохождения, чтобы время контакта было достаточным для полного элюирования смеси сопряженных эстрогенов. При использовании смеси этанола с водой с соотношением объемов 30: 70 подходит, например, скорость прохождения от 3 до 10, предпочтительно 5-7 объемных частей элюирующей жидкости на 1 объемную часть адсорбционной смолы в час. Целесообразно проводить элюирование в диапазоне температур от комнатной температуры до около 60^oC, предпочтительно при около 40-50^oC. При желании можно регулировать скорость прохождения, работая при слегка повышенном давлении, например при избыточном давлении до 0,2 бар, и улавливать элюат в нескольких фракциях. Содержание в отдельных фракциях элюата сопряженных эстрогенов и содержащихся в моче фенольных веществ, как, например, крезолов и HPMF, можно определять с помощью известного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (сокращенно "HPLC". При элюировании прежде всего получают слабо окрашенную, практически свободную от эстрогенов предварительную фракцию, количество которой соответствует обычно примерно одному объему слоя. Основное количество сопряженных эстрогенов, например, между 80 и 90% имеющихся в исходной моче жеребых кобыл сопряженных эстрогенов, находится в последующих темно желто-коричневых фракциях основного элюата, количество которых составляет обычно 2-4 объема слоя. В последующих фракциях хвостового погона содержатся обычно лишь следы сопряженных эстрогенов. Если получают фракции хвостового погона, которые еще имеют сопряженных эстрогенов более 10 мас. % в пересчете на сухое вещество и менее 0,6 мас. % крезолов и HPMF в пересчете на сухое вещество, то их можно объединить с основным элюатом для дальнейшей обработки.

Основной элюат, отделенный описанным выше образом от адсорбционной смолы, содержит имеющуюся в моче жеребых кобыл природную смесь сопряженных эстрогенов наряду с лишь незначительной долей имеющихся первоначально в моче жеребых кобыл фенольных веществ. Этот элюат можно использовать в качестве исходного материала для получения содержащих природную смесь сопряженных эстрогенов лекарственных средств. При желании элюат можно сконцентрировать далее известным образом для получения в значительной степени свободного от органического растворителя концентрата, пригодного для дальнейшей галеновой обработки. При желании можно получить не содержащую элюент смесь твердых веществ путем сушки распылением. Если природная смесь сопряженных эстрогенов должна использоваться в твердых лекарственных средствах, то может быть целесообразным подмешивать в содержащий сопряженные эстрогены элюат твердое вещество уже перед концентрацией или сушкой распылением, чтобы таким образом получать смесь твердых веществ, содержащую сопряженные эстрогены и носители. Как содержащий смесь эстрогенов элюат, так и изготовленный из него концентрат или высушенный распылением твердый продукт можно известным образом внести в твердые или жидкие галеновые препараты, как, например, таблетки, драже, капсулы или эмульсии. Эти галеновые препараты могут быть изготовлены с помощью известных методов с использованием обычных или жидких носителей, как, например, крахмал, целлюлоза, молочный сахар или тальк, или жидкие парафины и/или с использованием обычных фармацевтических вспомогательных веществ, например средств для разрушения таблеток, средств, улучшающих растворимость, или консервантов. Содержащий сопряженные эстрогены продукт можно смешивать известным образом с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами и переводить смесь в подходящую форму дозирования.

Последующие примеры должны пояснять более подробно изобретение, не ограничивая его объема.

Примеры 1 - 3

Общая инструкция для извлечения из мочи жеребых кобыл экстракта, в значительной степени обедненного содержащимися в моче фенольными веществами и содержащего природную смесь сопряженных эстрогенов в моче жеребых кобыл.

А) Адсорбция содержащихся в моче жеребых кобыл эстрогенов на полуполярной адсорбционной смоле сложного полиакрилового эфира

Колонну высотой 30 см с диаметром 2,4 см 65 мл наполняют набухшей в воде полуполярной адсорбционной смолой сложного полиакрилового эфира (Амберлит XAD-7 фирмы Rohm und Haas, величина зерна 0,3 - 1,2 мм, дипольный момент 1,8 Дебай, средний диаметр пор 80 Ангстрем, удельная поверхность около 450 м²/г в сухом виде). Через колонну пропускают 2 л отфильтрованной в микрофильтрационной установке или очищенной путем пропускания через сепаратор мочи жеребых кобыл (содержание сухого вещества= (TS), а также определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF приведены в таблице) при комнатной температуре со скоростью прохождения 6 мл/мин (около 5,5 объемов слоя в час). Содержащийся в моче жеребых кобыл эстроген полностью адсорбируется на загруженной таким образом колонне полуполярной адсорбционной смолы. Вытекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание сопряженных эстрогенов (в расчете на эстрон-сульфатную соль), и она оказывается практически не содержащей эстрогенов. Процесс останавливают.

В) Промывание загруженной колонны адсорбционной смолы

Загруженную колонну адсорбционной смолы промывают 300 мл водного раствора гидроксида натрия с указанным в таблице значением pH. Для этого через колонну пропускают щелочную промывочную волу со скоростью прохождения 6 мл/мин (около 5,5 объемов слоя в час). Стекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Исследование показало, что во время фазы промывки вымывается менее чем 5 % всех введенных в колонну эстрогенов.

С) Десорбция сопряженных эстрогенов из промытой колонны с адсорбционной смолой.

315 мл элюирующей жидкости (путем добавки гидроксида натрия щелочная смесь воды и растворителя, состав и pH смотри в таблице) пропускают со скоростью потока около 6 мл/мин через колонну, предварительно нагретую до указанной в таблице температуры элюирования. Стекающий элюат собирают в 6 фракций. Первая фракция составляет около 65 мл (примерно 1 объем слоя), остальные фракции составляют около 50 мл каждая. Отдельные фракции исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание в них эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Первую фракцию собирают, пока элюат кажется бесцветным до слабо желтого цвета. Эта фракция содержит лишь следы сульфатной соли эстрогенов.

После того как пройдет первый объем слоя элюата, происходит изменение цвета элюата на интенсивный темно-коричневый тон. В последующих фракциях 2 - 4 содержится около 80-90% общего количества адсорбированных на колонне сопряженных эстрогенов. Остальные фракции содержат лишь незначительное количество сульфатной соли эстрогенов. Это можно наблюдать также по сильному уменьшению интенсивности цвета. При необходимости остаточные фракции после отделения дистилляцией растворителя можно еще раз подать в стадию А) способа.

В таблице для фракций, содержащих основное количество сопряженных эстрогенов, указаны содержание сухого вещества TS в мас. % и определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрон-сульфатной соли, крезола и HPMF. Эти фракции представляют собой экстракты, пригодные для дальнейшей галеновой обработки.

D) Регенерация колонны адсорбционной смолы

Для регенерации колонну прежде всего промывают 100 мл смеси этанола с водой, содержащей 5% этанола и имеющей pH 12, затем 150 мл 10%-ого водного раствора цитрата натрия и еще раз 150 мл смеси этанола с водой и, наконец, 100 мл дистиллированной воды. Всю регенерацию проводят при температуре 45^oC. Колонну можно много раз, например до 40 раз, загружать и снова регенерировать.