способ получения эстрогенов из кобыльей мочи

Формула изобретения

1. Способ получения природной смеси сопряженных эстрогенов, обедненной фенольными веществами из мочи жеребых кобыл, отличающийся тем, что

А) жидкость мочи, представляющая собой очищенную от слизи и твердых веществ мочу, концентрат этой мочи или сконцентрированный ретентат мочи, полученный путем мембранной фильтрации этой мочи, обрабатывают водорастворимым основанием в количестве, достаточном для установления значения рН, равного по меньшей мере 12, и затем устанавливают значение рН мочи, обработанной основанием, посредством добавления достаточного количества водного кислотного раствора в диапазоне от 5 до 8,5;

Б) обработанную предварительно основанием жидкость мочи, имеющую значение рН от 5 до 8,5, приводят в контакт с гидрофобизированным силикагелем в количестве, достаточном для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов, и отделяют гидрофобизированный силикагель, загруженный смесью сопряженных эстрогенов, от остальной жидкости мочи;

В) гидрофобизированный силикагель, загруженный смесью сопряженных эстрогенов, промывают водным буферным раствором со значением рН в диапазоне от 5 до 7;

Г) промытый гидрофобизированный силикагель приводят в контакт с элюирующей жидкостью в количестве, достаточном для десорбции адсорбированной на нем смеси сопряженных эстрогенов, элюирующая жидкость представляет собой смесь воды со смешиваемым с водой органическим растворителем из группы смешиваемых с водой простых эфиров, низших спиртов и низших алифатических кетонов, и отделяют элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов, обедненную фенольными веществами, и в случае необходимости концентрируют.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии А) жидкость мочи смешивают с основанием, предпочтительно, с водным раствором основания и в течение времени, достаточного для расщепления лактоновых группировок, содержащихся в компонентах мочи, поддерживают значение рН, равное по меньшей мере 12.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве гидрофобизированного силикагеля используют силанизированный силикагель, включающий диметилгидроксисилилокси остатки.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что на стадии Б) 1 об. ч. гидрофобизированного силикагеля загружают количеством жидкости мочи, соответствующим от 30 до 80, предпочтительно от 40 до 50 об. ч. мочи.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что на стадии Б) жидкость мочи пропускают через реактор, содержащий гидрофобизированный силикагель, со скоростью, которая соответствует прохождению от 5 до 20 об. ч. мочи на 1 об. ч. гидрофобизированного силикагеля в час.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что используемый на стадии В) в качестве промывочной жидкости буферный раствор представляет собой водный буферный раствор уксусная кислота/ацетат с величиной рН около 5.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что на стадии Г) в качестве элюирующей жидкости используют смесь воды и смешиваемого с водой органического растворителя при объемном соотношении органического растворителя и воды в диапазоне от 20-80 до 40: 60, в особенности, 30: 70.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к получению природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл.

Эстрогены применяют в медицине для гормонозамещающей терапии. В частности, смеси эстрогенов используют для лечения и профилактики возникающих у женщин жалоб климактерического периода после естественной или искусственной менопаузы. Для этого оказались особенно эффективными и хорошо переносимыми природные смеси сопряженных эстрогенов, которые содержатся в моче жеребых кобыл.

Содержание растворенного твердого вещества в моче жеребых кобыл (в последующем называемой также сокращенно МЖК), может, естественно, колебаться в широких пределах и обычно находится в диапазоне 40-90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и другими обычными ингредиентами мочи в твердом остатке МЖК содержатся фенольные составляющие в количестве около 2-5 мас. % по отношению к сухому веществу. Среди этих фенольных составляющих находятся крезолы и известный как ГФМФ дигидро-3,4-бис[(3-гидроксифенил) метил] -2-(3H)-фуранон. Они могут находиться в свободной или сопряженной форме. В МЖК содержится природная смесь эстрогенов, которые в большей части находятся в сопряженной форме, например в виде натриевой соли сложного полуэфира серной кислоты (в последующем называемая кратко "сульфатная соль"). Содержание сопряженных эстрогенов (рассчитываемое как эстрогенсульфат соль) может составлять между 0,3 и 1 вес. % по отношению к сухому веществу.

Обычно экстракты, содержащие сопряженные эстрогены, получают из мочи жеребых кобыл путем экстракции полярным органическим растворителем, который не смешивается или только незначительно смешивается с водой, как, например, этилацетат, н-бутанол или циклогексанол. Однако при такой жидкостной экстракции возникает множество проблем, как, например, сильное пенообразование, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Как правило, требуется несколько стадий экстракции, что приводит к потерям и только к частичному извлечению эстрогенов.

Для подготовки малых количеств жидкостей мочи и плазмы для аналитического определения эстрогенов с помощью газовой хроматографии Хайккинен с сотр. (Clin. Chem. 27/7, (1981), 1186- 1189) и Шеклетон с сотр. (Clinica Chimica Acta 107 (1980), 231- 243) предложили твердофазную экстракцию эстрогенов с помощью патрона с силанизированным силикагелем, содержащим октадецилсилановые остатки (C₁₈-картридж Sep-Pak, , изготовитель Waters Ass. Inc. Milfold, Ma, США). При этом эстрогены элюируют из патрона с помощью метанола. Однако не приводится данных о других веществах, содержащихся в элюате, содержащем эстрогены.

Задачей настоящего изобретения является создание технического способа получения природной смеси сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл с устранением недостатков, известных из применяемой до настоящего времени жидкостной экстракции из жидкости, в котором получают продукт, обедненный фенольными компонентами мочи, и в значительной степени свободной от ГФМФ.

Был разработан способ, с помощью которого путем твердофазной экстракции на гидрофобизированном силикагеле можно получать смесь, обедненную фенольными компонентами мочи, в значительной мере свободную от ГФМФ, однако практически полностью содержащую природные экстрогены МЖК. Смесь может служить исходным материалом для получения фармацевтических средств, содержащих в качестве активного компонента природную смесь сопряженных эстрогенов из мочи жеребых кобыл.

Согласно изобретению способ получения обедненной фенольными компонентами природной смеси сопряженных эстрогенов из МЖК отличается тем, что

а) жидкость мочи, которая очищена от слизи и твердых веществ, сконцентрированный концентрат этой мочи или полученный путем ультрафильтрации этой мочи, сконцентрированный ретентат мочи обрабатывают водорастворимым основанием в количестве, достаточном для установления pH, равного, по меньшей мере, 12, и затем устанавливают значение pH в диапазоне от 5 до 8,5 жидкости мочи, обработанной основанием посредством добавления достаточного количества водного кислотного раствора;

б) обработанную предварительно основанием, имеющую величину pH 5-8,5 жидкость мочи приводят в контакт гидрофобизированным силикагелем в количестве, достаточном для адсорбции содержащейся в жидкости мочи смеси сопряженных эстрогенов, и отделяют загруженный смесью сопряженных эстрогенов гидрофобизированный силикагель от остальной жидкости мочи;

в) гидрофобизированный силикагель, загруженный смесью сопряженных эстрогенов, промывают водным буферным раствором со значением pH в диапазоне от 5 до 7, в особенности 5;

г) промытый гидрофобизированный силикагель приводят в контакт с элюирующей жидкостью, взятой в количестве, достаточном для десорбции адсорбированной на нем смеси сопряженных эстрогенов, жидкость представляет собой смесь воды со смешиваемым с водой органическим растворителем из группы смешиваемых с водой простых эфиров, низших спиртов и низших алифатических кетонов, и отделяют элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов от гидрофобизированного силикагеля и при необходимости концентрируют.

Для способа согласно изобретению можно использовать мочу жеребых кобыл как таковую, полученный из нее путем концентрирования концентрат или полученный из нее путем мембранной фильтрации ретентат. Собранную мочу сначала известным образом очищают от слизи и твердых веществ. Целесообразно сначала осадить твердые вещества и слизь и затем отделить их с помощью известных методов, например декантации, сепарации и/или фильтрации. Таким образом, мочу жеребых кобыл можно, например, пропустить через известное само по себе разделительное устройство, например сепаратор, фильтрационную установку или седиментатор. В качестве разделительного устройства может служить песчаная постель, а также можно использовать предлагаемые в торговле сепараторы, например сопловые или камерные сепараторы. При желании можно использовать также микрофильтрационные установки или ультрафильтрационные установки, при использовании которых можно одновременно обеспечить отсутствие микробов и вирусов в отфильтрованной моче жеребых кобыл.

При желании в мочу могут быть добавлены консерванты, гермициды, бактерициды и/или противоглистные средства.

Если вместо мочи жеребых кобыл должен быть использован сконцентрированный ретентат мочи жеребых кобыл, то его можно получить из МЖК с помощью само по себе известной мембранной фильтрации. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут изменяться в зависимости от используемой МЖК и применяемых для фильтрации мембран, например, от размера их пор, а также от условий фильтрации. Например, при использовании нанофильтрационной мембраны можно достигать почти полной концентрации содержания эстрогенов в ретентате МЖК при одновременном удалении до 50 мас. % низкомолекулярных веществ, содержащихся в МЖК. Для способа согласно изобретению можно использовать ретентаты МЖК, которые сконцентрированы до соотношения около 1: 10, например до соотношения около 1: 7, и объем которых тем самым сконцентрирован до 1/10, например 1/7, первоначального объема МЖК.

На стадии а) в мочу добавляют достаточное для установления величины pH, по меньшей мере, 12, в частности от 13 до 14, количество водорастворимого основания. В качестве водорастворимого основания пригодны неорганические или органические, растворимые в моче инертные основания, которые являются достаточно сильными для достижения величины pH, по меньшей мере, 12. Так, например, пригодными являются гидроокиси щелочных или щелочноземельных металлов, в частности гидроокись натрия, или же органические основания, как четвертичные гидроокиси низшего алкиламмония. Основание добавляют предпочтительно в виде водного раствора с содержанием основания, по меньшей мере, 20 мас. %, предпочтительно от 40 до 60 мас. %. Наиболее целесообразно использовать 45-55%-ный водный раствор едкого натра. При этой предварительной щелочной обработке устанавливают значение pH жидкости мочи, равное, по меньшей мере, 12, например в диапазоне от 12 до 14, предпочтительно около 13, и это щелочное значение pH поддерживают в течение времени, достаточного для расщепления содержащихся в веществах мочи лактоновых группировок, которое обычно может составлять от 1/2 до 2 часов. Условия обработки необходимо выбирать так, чтобы при этом не происходило воздействия на сопряженные эстрогены. Обработку проводят предпочтительно при комнатной температуре при ограничении добавления основания количеством, необходимым для достижения желательного значения pH в области от 12 до 14. Необходимое для достижения pH в области от 12 до 14 количество основания может изменяться в зависимости от состава используемой мочи жеребых кобыл. При применении 50%-ного раствора едкого натра обычно достаточно около 100 - 700 мл 50%--ного раствора едкого натра на 10 л мочи жеребых кобыл. Затем за счет добавления в жидкость мочи водного кислотного раствора значение pH устанавливают в диапазоне от 5 до 8,5, предпочтительно от 7 до 8,5, в особенности от 8 до 8,5. В качестве кислоты пригодны растворимые в жидкости мочи инертные неорганические или органические кислоты, как, например, соляная кислота, серная кислота, фосфорная кислота или низшие карбоновые кислоты, как уксусная кислота. Целесообразно, например, использовать концентрированный водный раствор соляной кислоты. Необходимое для достижения указанного диапазона значения pH количество кислоты может изменяться в зависимости от состава МЖК и используемого для установки щелочного значения количества основания. При применении концентрированного раствора соляной кислоты можно достичь желаемого значения pH обычно путем добавления от около 25 до 100 г концентрированного раствора соляной кислоты на 1 л мочи жеребых кобыл.

Используемые на стадии б) способа гидрофобизированные силикагели являются само по себе известными фазообратимыми силикагелями, которые являются химически модифицированными силикагелями, которые включают гидрофобные группы или лиганды. Так, например, пригодными являются силанизированные фазообратимые силикагели, которые в качестве гидрофобных функциональных групп содержат н-октадецилдиметилсилилокси-, н- октилдиметилсилилокси- или диметилгидроксисилилокси остаток. Пригодными являются, например, силанизированные силикагели со средней величиной зерна от 15 до 500 мкм. Особенно целесообразно использовать силикагель, содержащий диметилгидроксисилилокси группы со средней величиной зерна от 0,05 до 0,3 мм, например "Силикагель 60/производное диметилсилана" фирмы Мерк.

Согласно изобретению адсорбция сопряженных эстрогенов на гидрофобизированном силикагеле может происходить посредством контактирования мочи жеребых кобыл, при необходимости сконцентрированной или ее ретентата с гидрофобизированным силикагелем, тем что предварительно обработанную на стадии а) жидкость мочи вводят в реактор, содержащий силикагель, и там осуществляют контакт с силикагелем в течение времени, достаточного для адсорбции эстрогенов. После завершенной адсорбции сопряженных эстрогенов на гидрофобизированном силикагеле можно отделить загруженный смесью сопряженных эстрогенов силикагель от остальной жидкости мочи известным образом. Целесообразно пропускать жидкость мочи через колонну, содержащую силикагель, с такой скоростью прохождения, что время контакта достаточно для адсорбции эстрогенов. Подходящими являются, например, скорости прохождения, которые соответствуют прохождению от 5 до 20 об. ч. МЖК на 1 об. ч. силикагеля в час. Адсорбцию проводят предпочтительно при комнатной температуре. Целесообразно управлять скоростью прохода мочи через реактор за счет работы при небольшом избыточном давлении или разрежении. Количество применяемого гидрофобизированного силикагеля может изменяться в зависимости от вида используемого силикагеля и количества твердого вещества, содержащегося в предварительно обработанной на стадии а) жидкости мочи. При применении предварительно обработанной МЖК одна объемная часть гидрофобизированного силикагеля может быть загружена до 80 об. ч. предварительно обработанной мочи жеребых кобыл, так что можно едва установить заметное количество эстрогенов в стекающей жидкости мочи. При применении предварительно обработанного концентрата МЖК или ретентата МЖК емкость загрузки гидрофобизированного силикагеля, естественно, понижается в степени, соответствующей концентрации. Так, например, 1 об. ч. гидрофобизированного силикагеля может быть загружена количеством жидкости мочи, соответствующим 30-80, предпочтительно 40-50 об. ч. мочи жеребых кобыл.

Загруженный смесью сопряженных эстрогенов гидрофобизированный силикагель на стадии в) промывают водным буферным раствором с величиной pH от 5 до 7, предпочтительно около 5. В качестве промывочной жидкости предпочтительно использовать водный буферный раствор уксусная кислота/ацетат с величиной pH около 5. Пригодными являются в особенности 0,1 - 1-молярные, предпочтительно 0,1 - 0,2-молярные буферные растворы уксусная кислота/ацетат. Количество промывочной жидкости выбирают так, что его достаточно для удаления фенольных составляющих без вымывания значимого количества сопряженных эстрогенов. Целесообразно использовать, например, от 8 до 15, в особенности от 9 до 10 объемов слоя промывочной жидкости на 1 объем слоя гидрофобизированного силикагеля. При этом промывочную жидкость пропускают, целесообразно, через реактор, содержащий гидрофобизированный силикагель, со скоростью пропускания от 5 до 20 об. ч. промывочной жидкости на 1 об. ч. силикагеля в час.

Затем на стадии г) промытый, загруженный смесью сопряженных эстрогенов гидрофобизированный силикагель обрабатывают элюирующей жидкостью в количестве, достаточном для элюирования смеси сопряженных эстрогенов, и получают элюат, содержащий природную смесь сопряженных эстрогенов мочи жеребых кобыл. Применяемая согласно изобретению элюирующая жидкость представляет собой смесь воды и смешиваемого с водой простого эфира, низшего спирта и/или низшего алифатического кетона. В качестве эфирных составляющих элюирующей жидкости пригодны смешиваемые с водой циклические простые эфиры, как тетрагидрофуран или диоксан, а также смешиваемые с водой простые эфиры с открытой цепью, как, например, этиленгликольдиметиловый эфир (моноглим), диэтиленгликольдиметиловый эфир (диглим) или этилоксиэтилоксиэтанол (карбитол). В качестве низших спиртов пригодны смешиваемые с водой алкиловые спирты с 1-4, предпочтительно 1-3 атомами углерода, в особенности этанол или изопропанол. В качестве низших алифатических кетонов пригодны смешиваемые с водой кетоны с 3-5 атомами углерода, в особенности ацетон. Особенно предпочтительными являются элюирующие жидкости, в которых органическим растворителем является этанол. В элюирующей жидкости соотношение объемов смешиваемого с водой органического растворителя и воды может составлять от 40: 60 до 20: 80, предпочтительно около 30: 70. Используемое количество элюента может составлять примерно 3-5 объемов слоя на 1 объем слоя гидрофобизированного силикагеля. Целесообразно пропускать элюирующую жидкость через реактор, содержащий загруженный смесью эстрогенов гидрофобизированный силикагель, с такой скоростью, что время контакта достаточно для полного элюирования смеси сопряженных эстрогенов. При использовании смеси тетрагидрофурана и/или этанола с водой в объемном соотношении 30: 70 пригодна, например, скорость пропускания от 5 до 20 об. ч. элюирующей жидкости на 1 об. ч. силикагеля в час. Целесообразно регулировать скорость пропускания посредством работы при слегка повышенном давлении, например при избыточном давлении до 0,2 бар, и улавливать элюат в нескольких фракциях. Содержание сопряженных эстрогенов и фенольных составляющих мочи, как, например, крезолов и ГФМФ, в отдельных фракциях элюата можно определять с помощью само по себе известного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (сокращенно "ВЭЖХ").

При элюировании сперва получают слабо окрашенную или почти бесцветную, практически свободную от эстрогенов предварительную фракцию, количество которой соответствует обычно примерно одному объему слоя. Основное количество сопряженных эстрогенов, например между 80 и 90% сопряженных эстрогенов, имеющихся в исходной моче жеребых кобыл, находится в последующих темных желто-коричневых основных фракциях элюата, количество которых составляет обычно 1-2 объема слоя. В последующих фракциях содержатся обычно лишь следы сопряженных эстрогенов. Если получают последующие фракции, которые еще содержат сопряженные эстрогены в количестве более 10 мас. % относительно сухого вещества и менее 0,6 мас. % крезолов и ГФМФ по отношению к сухому веществу, то их можно объединить с основным элюатом, обогащенным эстрогенами, для дальнейшей обработки.

Основной элюат, отделенный описанным выше образом от силикагеля, содержит природную смесь сопряженных эстрогенов, имеющуюся в моче жеребых кобыл, наряду с лишь незначительной долей фенольных составляющих, содержащихся первоначально в моче жеребых кобыл. Этот элюат можно использовать в качестве исходного материала для получения лекарственных средств, содержащих природную смесь сопряженных эстрогенов. При желании элюат можно сконцентрировать далее само по себе известным образом для получения концентрата, в значительной степени свободного от органического растворителя и пригодного для дальнейшей галеновой обработки. При желании посредством сушки распылением можно получить смесь твердых веществ, свободную от элюата. Если природная смесь сопряженных эстрогенов предназначена для получения твердых лекарственных средств, то может быть целесообразным подмешивать в элюат, содержащий сопряженные эстрогены, твердый носитель уже перед концентрированием или сушкой распылением, чтобы таким образом получать смесь твердых веществ, содержащую сопряженные эстрогены и носители. Также элюат, содержащий смесь эстрогенов, как и полученный из него концентрат или высушенный распылением твердый продукт, можно известным образом вносить в твердые или жидкие галеновые препараты, как, например, таблетки, драже, капсулы или эмульсии. Эти галеновые препараты могут быть изготовлены с помощью само по себе известных методов с использованием обычных твердых или жидких носителей, как, например, крахмал, целлюлоза, молочный сахар, или тальк, или жидкие парафины, и/или с использованием обычных фармацевтических вспомогательных веществ, например средств для разрушения таблеток, средств, улучшающих растворимость, или консервантов. Содержащий сопряженные эстрогены продукт можно само по себе известным образом смешивать с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами и переводить смесь в пригодную форму дозирования.

Последующие примеры поясняют изобретение, не ограничивая его объема.

Примеры 1 - 5

Общая методика получения из мочи жеребых кобыл экстракта, в значительной степени обедненного фенольными составляющими и содержащего природную смесь сопряженных эстрогенов, содержащихся в моче жеребых кобыл.

А) Предварительная обработка мочи жеребых кобыл

10 л мочи жеребых кобыл, отфильтрованной пропусканием через слой песка высотой 5 см или микрофильтрационную установку (содержащие сухого вещества (СВ), а также определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ приведены в нижеследующей таблице), при энергичном перемешивании путем добавления 50%-ного водного раствора гидроокиси натрия (плотность при 20^oC 1,52 г/мл) доводят до значения pH 13 (добавляемое количество раствора NaOH приведено в таблице) и перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем щелочную жидкость мочи путем добавления концентрированного водного раствора соляной кислоты (примерно 35%-ной) доводят до значения pH от 8 до 8,5.

Б) Адсорбция эстрогенов, содержащихся в моче жеребых кобыл, на фазообратимом силикагеле

Наполняют колонку высотой 50 см с диаметром 5 см 100 г (соответствует примерно объему около 193 мл, что равняется 1 объему слоя) фазообратимого силикагеля ("силикагель 60/производное диметилсилана" фирмы Мерк, номер заказа 7719, величина зерна 63 - 200 мкм). Сперва колонку промывают 0,5 л воды, затем 0,25 л метанола и еще раз 0,5 л воды.

Предварительно обработанную на стадии А) жидкость мочи при избыточном давлении 0,2 бар и со скоростью 60 мл/мин пропускают через колонку. Эстроген, содержащийся в моче жеребых кобыл, полностью адсорбируется на загруженной таким образом фазообратимым силикагелем колонке. Вытекающую жидкость мочи исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание сопряженных эстрогенов, и она оказывается практически свободной от эстрогенов. Процесс останавливают.

В) Промывание загруженной фазообратимым силикагелем колонки

Загруженную фазообратимым силикагелем колонку промывают 2 л 0,15-молярного буферного раствора уксусная кислота/ацетат натрия (примерно 10 объемов слоя). Буферный раствор получают добавлением в 0,15-молярный водный раствор уксусной кислоты твердого ацетата натрия (около 107 г) до достижения значения pH, равного 5. Стекающую промывочную жидкость исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ, и она содержит мерее 5% исходного количества эстрогенов в моче жеребых кобыл.

Г) Десорбция сопряженных эстрогенов из промытой колонки фазообратимого силикагеля и отделение фракции элюата, обогащенной эстрогенами

1 л элюирующей жидкости (смесь воды и растворителя, состав приведен в последующей таблице) пропускают через колонку при избыточном давлении 0,2 бар и со скоростью потока около 60 мл/мин. Стекающий элюат собирают в несколько фракций (объем каждой фракции около 200 мл, что соответствует примерно 1 объему слоя). Отдельные фракции исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание в них эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ. Первую фракцию собирают до тех пор, пока элюат будет бесцветным или слабо желтым. Объем этой фракции составляет 150-200 мл. Эта фракция содержит лишь следы эстрогенсульфатной соли.

Как только произойдет изменение цвета элюата на интенсивный темно-желтый или коричневый цвет, собирают следующую фракцию объемом около 200 мл. В этой фракции содержится около 80-90% от всего количества сопряженных эстрогенов, загруженных в колонку. Остальные фракции содержат лишь незначительное количество эстрогенсульфатной соли. При необходимости остаточные фракции после отделения путем дистилляции растворителя можно еще раз подать на стадию Б) способа.

В нижеследующей таблице для второй фракции, содержащей основное количество сопряженных эстрогенов, указаны содержание сухого вещества СВ в % масс. и определенное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание эстрогенсульфатной соли, крезола и ГФМФ. Эта фракция представляет собой экстракт, пригодный для дальнейшей галеновой обработки.

Д) Регенерация колонки фазообратимого силикагеля

Для регенерации колонки сначала промывают 2 л воды, затем 0,5 л метанола и еще раз 2 л воды. Затем колонку можно снова использовать. Колонку можно многократно, например до 10 раз, регенерировать и снова использовать.