способ получения трансгенных растений подсолнечника
Классы МПК: | C12N15/82 для клеток растений C12N5/10 клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом A01H1/04 способы селекции A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур |
Автор(ы): | Гапоненко А.К. |
Патентообладатель(и): | Гапоненко Александр Константинович |
Приоритеты: |
подача заявки:
2000-12-28 публикация патента:
10.02.2002 |
Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано для получения подсолнечника, устойчивого к стрессовым факторам, а также с измененным составом жирных кислот и запасных белков. Апикальные меристемы сегментов гипокотиля предварительно индуцируют в модифицированной среде MS, после чего клетки меристем подвергают бомбардировке твердыми микрочастицами. Обработка клеток Agrobacterium, несущей в составе рекомбинантной плазмиды желаемый чужеродный ген, обеспечивает придание им заданных полезных свойств. Регенерация целых растений из клеток позволяет получить подсолнечник, устойчивый к стрессовым факторам либо продуцирующий необходимые белки или жирные кислоты. 2 з. п. ф-лы, 3 табл. , 3 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6
Формула изобретения
1. Способ получения трансгенных растений подсолнечника, включающий обработку клеток меристематической ткани подсолнечника, способной к регенерации целых растений, бомбардированием их микрочастицами твердого вещества, трансформацию указанных клеток меристематической ткани сокультивированием с Agrobacterium, которая содержит вектор, несущий полезный или маркерный гены, а также ген устойчивости к антибиотику или гербициду, отбор трансформированных клеток и регенерацию из них целых растений, отличающийся тем, что бомбардировке микрочастицами подвергают клетки апикальных меристем, индуцированных воздействием модифицируемой среды MS в культивируемых in vitro сегментах гипокотиля. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модифицированная среда MS для индуцирования клеток апикальных меристем дополнительно содержит 5 г/л KNO3 и 500 мг/л гидролизата казеина, а также 0,5-1,0 мг БАП на 1 л среды в качестве цитокинина. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что клетки индуцированных апикальных меристем бомбардируют частицами вольфрама размером 0,7-2,5 мкм, при этом используют линии Agrobacterium, которые содержат вектор, несущий селективный ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам канамицину nptII или гигромицину hph, или ген bar, определяющий устойчивость к гербициду Basta, а также маркерный ген uidA (GUS) или GEP или какой-либо чужеродный ген, выделенный из растения, бактерии или другого организма, полезный для производства подсолнечника или получаемого из него продукта.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано для создания растений подсолнечника, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, а также с измененным составом жирных кислот или запасных белков. Подсолнечник принадлежит к четырем главным масличным культурам мира, а для России является главной масличной культурой, обеспечивающей в питании населения до 30% потребляемых энергокалорий в виде растительного масла, маргаринов и жиров, произведенных на основе подсолнечного масла. Высокоурожайные и высокомасличные сорта и линии подсолнечника в настоящее время могут быть созданы методами традиционной селекции. Однако потери урожая от неблагоприятных климатических факторов, поражения фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми все еще очень велики. Поэтому имеется настоятельная необходимость в радикальном улучшении созданных сортов подсолнечника, увеличении их продуктивности в условиях разнообразных биотических и абиотических стрессов. В отношении многих важных сельскохозяйственных культур задача получения растений, устойчивых к стрессовым факторам или с измененным качеством продукта, успешно решается путем использования генно-инженерных технологий. Например, в настоящее время трансгенные сорта картофеля, хлопка, риса, гибриды кукурузы, устойчивые к насекомым и гербицидам, а также сорта рапса и сои с измененным составом жирных кислот занимают десятки миллионов гектаров в США, Аргентине, Канаде и Китае. Трансгенные сорта кукурузы, устойчивые к насекомым, начинают распространяться в Европе. Хотя самые первые работы по генетической трансформации клеток растений были осуществлены именно на подсолнечнике, развитие генно-инженерных работ с подсолнечником отстает. Так, на сегодняшний день в США и странах Европы зарегистрировано 2870 полевых испытаний трансгенной кукурузы, а подсолнечника - только 29. Для России подсолнечник является наиболее рентабельной и основной масличной культурой, поэтому создание растений подсолнечника, устойчивых к разнообразным неблагоприятным условиям среды, представляется весьма важной экономической задачей. Ограниченность полевых испытаний, проводимых с подсолнечником, объясняется недостаточными успехами в разработке эффективных методов генетической трансформации этой масличной культуры. Воспроизводимая технология генетической трансформации подсолнечника была получена значительно позже, чем для других важнейших сельскохозяйственных культур, а первые полевые испытания его трансгенных линий были начаты только в 1991 г. Многочисленные попытки повторить первую методику трансформации подсолнечника, о которой сообщалось Everette с сотр. (Bio/Technology, 5: 1201; 1987), не увенчались успехом. Впервые воспроизводимый способ получения трансгенного подсолнечника был опубликован в 1990 г. (В. Schrammeijer et al. , Plant Cell Report, 9: 55-60, 1990), в котором использовалась методика агробактериального переноса генов в апикальную меристему проростков. Эффективность трансформации в этом методе составляла всего лишь сотые доли процента. В дальнейшем методика, основанная на агробактериальной инфекции, была улучшена (D. Bidney et al. , Plant Mol. Biol. , 18: 301-303, 1992) за счет того, что перед сокультивацией с агробактерией эксплант подвергался поранению бомбардированием микроскопическими частицами металла. Эффективность трансформации была доведена до 2-4%. В 1994 году были опубликованы данные о достижении в отдельном случае, при использовании метода D. Bidney до 7% эффективности трансформации, при невысокой химерности трансформантов (N. Knittel et al, Plant Cell Report, 14: 81-86, 1994). Такой эффективности не удалось повторить никому, даже в лаборатории, в которой была проделана эта работа. Также в начале девяностых годов R. Peerbolt из "Van der Have Research" была создана методика трансформации подсолнечника и получено несколько десятков трансгенных растений, устойчивых к гербицидам. Однако эта методика не запатентована, ее протокол сохранен авторами в тайне. Именно компаниями Van der Have и Pioneer в настоящее время ведется наиболее успешная работа по созданию трансгенных растений подсолнечника. Полевые испытания трансгенных линий, гибридов и сортов подсолнечника, устойчивых к глифосату и другим гербицидам, в течение нескольких лет проводятся этими компаниями, а в последние два года также компанией "Monsanto", в Аргентине и США. Над разработкой методов генно-инженерного улучшения подсолнечника также работают лаборатории в Страсбурге (Франция), Университете Северной Дакоты, Фарго (США), а также лаборатория клеточной инженерии растений Центра "Биоинженерия" Российской Академии Наук. Опубликованный в научной печати метод D. Bidney et al. , помимо его невысокой эффективности, имеет еще один существенный недостаток: вследствие многоклеточности апекса семянки, а также недостатков применяемых способов селекции и регенерации трансформантов, часть полученных этим способом трансформантов имеет химерную природу, что означает, что наряду с истинно трансформированными тканями, полученные растения имеют также ткани, не несущие вводимых гетеролочных генов, что существенно затрудняет отбор в потомстве истинных трансформантов. Как уже упоминалось выше, работа с подсолнечником как объектом культуры клеток связана со значительными трудностями и регенерация растений подсолнечника in vitro была осуществлена впервые в конце восьмидесятых - начале девяностых годов. Один из способов такой регенерации был разработан автором с сотр. в 1990 г. (SU 1720596 А1, МКИ 5 С 12 N 5/04, 1992). Согласно этому способу получение каллуса и регенерацию побегов осуществляют в один этап с использованием модифицированной среды MS (Murashige T. , Skoog F. , Phisiol Plant 15: 473-497, 1962). В предлагаемом по данному изобретению способе получения трансгенного растения подсолнечника решается задача снижения возможности формирования химерных трансформантов, а также увеличения частоты желаемой трансформации. Указанная задача решается тем, что в способе получения трансгенных растений подсолнечника, включающем обработку клеток меристематической ткани подсолнечника, способной к регенерации целых растений, бомбардированием их микрочастицами твердого вещества, трансформацию указанных клеток меристематической ткани сокультивированием с агробактерией, которая содержит вектор, несущий полезный или маркерный гены, а также ген устойчивости к антибиотику или гербициду, отбор трансформированных клеток и регенерацию из них целых растений, используют индукцию апикальных меристем, способных к регенерации целого растения, вызванную воздействием модифицированной среды MS (Murashige & Skoog) в культивируемых in vitro гипокотилях подсолнечника тем, что модифицированная среда MS для индуцирования клеток апикальных меристем дополнительно содержит 5 г на 1 л KNO3 и 500 мг на 1 л гидролизата казеина, а также 0,5-1,0 БАП на 1 л среды в качестве цитокинина. Указанная задача также решается тем, что бомбардирование клеток индуцированных апикальных меристем осуществляют частицами размером 0,7 - 2,5 мкм, при этом используют линии Agrobacterium, которые содержат вектор, несущий селективный ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам - канамицину nptll или к гигромицину hph, или ген bar, определяющий устойчивость к гербициду Basta, а также маркерный ген uidA (GUS) или GFP и какой-либо чужеродный ген, выделенный из растения, бактерии или другого организма, полезный для производства подсолнечника или получаемого из него продукта, например ген Gly 1 - глиоксалазы 1, который повышает устойчивость трансгенных растений к стрессам (Veena et al, 1999, Plant J. . 17, 385- 396![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
![способ получения трансгенных растений подсолнечника, патент № 2179187](/images/patents/291/2179187/9633.gif)
Семена подсолнечника (Helianthus annuus L. )помещают в марлевые мешочки. В нестерильных условиях семена тщательно промывают мыльной водой. Все дальнейшие операции выполняют в условиях ламинарного бокса, обеспечивающего асептические условия. Семена помещают в 70%-ный этанол на 3 мин. Промывают стерильной водой 3-5 мин. После этого семена помещают на 30 мин в 30%-ный раствор NaOCl, который приготовляют разбавлением 30 мл коммерческого отбеливателя 70 мл стерильной дистиллированной воды, добавляя 3-4 капли Twen-80. Далее 3 раза по 5 мин семена промывают стерильной водой. Семена оставляют на 30 мин в стерильной воде. Очищают семена. Очищенные семена стерилизуют в 20%-ном растворе гипохлорита в течение 3-5 мин. Трижды промывают стерильной водой, время промывок 5, 5 и 10 мин. Высаживают простерилизованные семена в пробирки, содержащие 1/2 по концентрации солей среду MS, содержащую 10% сахарозы и 0.8% агар-агара, среда имеет pH 5.7 до автоклавирования. Выращивают при освещении люминесцентными лампами, фотопериод 16/8 час при 27oC. Пример 2. Изоляция сегментов гипокотиля для культивирование in vitro
После 5-7 дней выращивания проростки, достигшие 4-6 см, используют для получения сегментов гипокотиля. Проростки помещают в чашку Петри и скальпелем отсекают апекс побега с семядолями, нарезая низлежащую область гипокотиля на 2-3 мм сегменты, по 3-4 сегмента от каждого проростка, помещают в чашки Петри, содержащую среду SIM. В каждую чашку помещают по 30-40 сегментов. Чашки помещают под люминесцентные лампы, культивируют при 27oC при фотопериоде 16/8 ч. Пример 3. Индукции апикальных меристем. Апикальные меристемы индуцировали из сегментов гипокотиля на среде SIM (Shoot Induction Media) следующего состава: макросоли, микросоли и витамины среды MS, 3% сахарозы, 0.7% агара, 500 мг/л гидролизата казеина, 6.95 г/л нитрата калия, 0.5-1.0 мг/л БАП (6фурфураминопурин). Перед автоклавированием доводили pH до 5.7 раствором NaOH. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при 1.11 атмосферы в течение 25 мин. После охлаждения среды добавляли витамины и гормоны, которые стерилизовали фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Среду разливали в чашки Петри диаметром 9 см по 25 мл в каждую. Затем в каждую чашку помещали по 36 сегментов гипокотиля и инкубировали при люминесцентном освещении, при фотопериоде 16/8 ч и температуре 26-28oC в течение 1-3 дней. В табл. 1 представлены данные частоты индукции апексов у различных генотипов подсолнечника, в зависимости от концентрации ВАП. Пример 4. Бомбардирование индуцированных апексов вольфрамовыми частицами
После 2-4 дней культивирования сегментов гипокотиля, когда визуально можно определить появление развивающихся апексов, последние рассекают на две части и помещают в чашки Петри на агаризированную среду MS. Апексы подвергают двукратному бомбардированию частицами вольфрама размера 0.7-2.5 мкм, используя PIG (Finer et al 1992). Для разгона частиц используются давление 6 атмосфер, вакуум в камере 0.1-0.3 атм, расстояние от источника частиц до поверхности апексов 12 см. Частицы предварительно стерилизуют 5 мин в 96%-ном этиловом спирте, трижды промывают в стерильной воде и ресуспензируют (50 мг на 500 мкл в среде SIM, используемой для индукции апексов). Пример 5. Сокультивирование эксплантов с Agrobacterium
Трансформацию осуществляли методом сокультивирования тканей апекса с ночной культурой штамма агробактерии ЕНА101, несущей вектор V035. Ночную культуру выращивали на среде LB с канамицином (50 мг/л) при 28oC, осаждали на центрифуге при 5000 об/мин, дважды промывали, рессуспендировали в жидкой безгормональной среде до плотности OD660= 0.8-1.0. На фиг. 3 представлена карта вектора V035. Пример 6. Селекция на среде с гигромицином
Селекцию трансформантов осуществляли в течение 3-4 недель на среде, содержащей 15 мг/л гигромицина В, пересаживая ткани на свежую среду каждые 7-10 дней. После селекции тканей с развивающимися побегами, устойчивых к гигромицину, последние переносили на среду SIM для регенерации проростков. Пример 7. Укоренение на среде для укоренения или методом прививки на побеги подсолнечника. У побегов, достигших размера 2-3 см, индуцировали образования корней на среде для укоренения, в состав которой входят макро- и микросоли среды В5 (Gamborg et al. , 1976), индолил масличная кислота (ИМК) в концентрации 2.0 мг/л, сахароза в концентрации 10 г/л. Культивируемые побеги в течение 1-2 недель подвергали холодному шоку, понижая температуру культивирования до 14oC. Данные, полученные для сорта Передовик представлены в табл. 2. Второй путь получения взрослых фертильных растений - это метод прививания 3-5 мм побегов на 7-дневные проростки подсолнечника в культуре in vitro. Частота выживания прививок достигает 80%. Пример 8. Частота трансформации
Частота трансформации, полученная при использовании разработанного метода, вычислялась как отношение количества использованных эксплантов к количеству полученных трансгенных побегов, экспрессирующих маркерный ген и для которых показано встраивание гетерологинного гена в геном методами PCR и Southern блотинга. Данные ряда независимых опытов представлены в табл. 3.
Класс C12N15/82 для клеток растений
Класс C12N5/10 клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом
Класс A01H1/04 способы селекции
Класс A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур