новые катионные и поликатионные амфифильные соединения, содержащие их реагенты и их применение

Формула изобретения

1. Соединения общей формулы (1)



причем R₁ означает насыщенную или ненасыщенную С(О)-С_1-23-цепь или насыщенную или ненасыщенную С_1-24-цепь;

А₁ означает О-R₂ - группу, причем R₂ имеет указанное для R₁ значение;

А₂ означает NR₃Х-остаток или -N⁺R₃R₄R₅Y^--остаток, причем R₃, R₄, которые могут быть одинаковыми или различными, при условии, что R₃ и R₄ одновременно не могут означать водород, означают водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)_n-ОН - группу, где n= 2 - 6;

R₅, который может быть таким же или отличаться от R₃ или R₄ означает водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)_n-ОН - группу, или группу [(CH₂)_mNH] _o-(СН₂)_n-NН₂, причем m означает целое число 2-6 и может быть таким же или отличаться от n или о, причем n может означать целое число 2-6; о может означать целое число 0-4;

Х дополнительно к значению для R₅ может иметь следующие значения: амидно-связанная аминокислота, -С(О)-СНR₆N(R₇)₂-группа, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₃-группа, -С(О)-CНR₆N⁺(R₇)₂R₈-группа или -С(О)-СНR₆NR₇R₈-группа при условии, что, когда R₃ означает водород, Х означает амидносвязанную аминокислоту, причем R₆ означает -(СН₂)_m-NR₇R₈- остаток, где m может означать число 1-5;

R₇ означает водород или алкильную группу с 1-4 атомами углерода;

R₈ означает -(СН₂)_n-N(R₇)₂- или -(СН₂)_n-N⁺(R₇)₃- группу, причем n означает целое число 2-4, R₇ может иметь вышеуказанное значение;

Y означает фармацевтически приемлемый анион;

В₁ означает NH[C(O)-(CH₂)_p-NH] _q-Z - остаток, причем р означает число 1-6, q означает число 0-2;

Z означает -С(О)-СНR₆N(R₇)₂-группу, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₃-группу, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₂R₈-группу или -С(О)-СНR₆NR₇R₈-группу и R₆-R₈ и m имеют вышеуказанные значения;

B₂ может иметь указанное для А₁ значение и значение А₁ используется только с В₁, а значение А₂ используется только с В₂.

2. Соединения по п. 1, отличающиеся тем, что остаток R₁ представляет собой насыщенную или ненасыщенную С_10-20- или С(О)С_10-20-группу.

3. Соединения по п. 1 или 2, отличающиеся тем, что А₂ представляет собой NR₃X, где R₃ означает водород и Х означает амидносвязанную аминокислоту.

4. Соединения общей формулы (1)



причем R₁ означает насыщенную или ненасыщенную С(О)-С_1-23-цепь или насыщенную или ненасыщенную С_1-24-цепь;

А₁ означает О-R₂-группу, причем R₂ имеет указанное для R₁ значение,

А₂ означает NR₃Х - остаток или -N⁺R₃R₄R₅Y^- - остаток, причем R₃, R₄, которые могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, означают водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)_n-ОН-группу, где n= 2-6;

R₅, который может быть таким же или отличаться от R₃ или R₄, означает водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)n-ОН-группу, или группу -[(CH₂)_mNH] _о-(СН₂)_n-NН₂, причем m означает целое число 2-6 и может быть таким же или отличаться от n или о, причем n может означать число 2-6; о может означать целое число 0-4;

Х дополнительно к значению для R₅ может иметь следующие значения: амидносвязанная аминокислота, -С(О)-СНR₆N(R₇)₂-группа, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₃-группа, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₂R₈-группа или -С(О)-СНR₆NR₇R₈-группа, причем R₆ означает -(СН₂)_m-NR₇R₈-остаток, -(СН₂)_m-N⁺(R₇)₂R₈-остаток или -(СН₂)_m-N⁺(R₇)₃-остаток, m означает число 1-5;

R₇ означает водород или алкильную группу с 1-4 атомами углерода;

R₈ означает -(СН₂)_n-N(R₇)₂-группу- или -(СН₂)_n-N⁺(R₇)₃-группу, причем n означает число 2-4, R₇ может иметь вышеуказанное значение;

Y означает фармацевтически приемлемый анион;

В₁ означает NH[C(O)-(CH₂)_p-NH] _q-Z - остаток, причем р означает число 1-5, и q означает число 0-1;

Z - означает -С(О)-СНR₆N(R₇)₂-группу, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₃-группу, С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₂R₈-группу, и R₆-R₈ имеют вышеуказанные значения;

B₂ может иметь указанное для А₁ значение и значение А₁ используется только с В₁, а значение А₂ используется только с В₂.

5. Соединения по пп. 1, 2, 3 или 4, отличающиеся тем, что Y означает галоген, монометилсульфат, ацетат, трифторацетат или фосфат.

6. Соединение по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что оно представляет собой

2-(6-карбоксиспермил)-1,3-диолеоилоксипропиламид;

1-(6-карбоксиспермил)-2,3-диолеоилоксипропиламид;

2,3-диолеоилокси-N-(N-(6-карбоксиспермил)глицил)аминопропан;

2-(6-карбоксиспермил)-1,3-димиристоилоксипропиламид;

2-(1,1,1,5,5,10,10,14,14,14-декаметил-6-карбоксиспермил)-1,3-диолеоилоксипропиламид;

2-(N, N, N, N", N", N"-гексаметилорнитил)-1,3-диолеоилоксипропиламид; и/или

2-(N, N, N, N", N", N"-гексаметиллизил)-1,3-диолеоилоксипропиламид.

7. Реагент, обладающий способностью к трансфекции в виде раствора, состоящий, по меньшей мере, из одного соединения общей формулы (1), отличающийся тем, что раствор содержит смешивающийся с водой растворитель и формула (1) представляет собой следующую:



причем R₁ означает насыщенную или ненасыщенную С(О)-С_1-23-цепь или насыщенную или ненасыщенную С_1-24-цепь;

А₁ означает О-R₂-группу, причем R₂ имеет указанное для R₁ значение;

А₂ означает NR₃Х-остаток или -N⁺R₃R₄R₅Y^--остаток, причем R₃, R₄, которые могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, означают водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)_n-ОН - группу, где n означает 2-6;

R₅, который может быть таким же или отличаться от R₃ или R₄ означает водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)_n-ОН-группу, или группу [(CH₂)_mNH] _о-(СН₂)_n-NН₂, причем m означает целое число 2-6 и может быть таким же или отличаться от n или о, причем n может означать целое число 2-6; о может означать целое число 0-4;

Х дополнительно к значению для R₅ может иметь следующие значения: амидносвязанная аминокислота, -С(О)-СНR₆N(R₇)₂-группа, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₃-группа, С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₂R₈-группа или -С(О)-СНR₆NR₇R₈-группа, причем R₆ означает -(СН₂)_m-NR₇R₈-остаток, -(СН₂)_m-N⁺(R₇)₂R₈-остаток или -(СН₂)_m-N⁺(R₇)₃-остаток, где m может означать число 1-5;

R₇ означает водород или алкильную группу с 1-4 атомами углерода;

R₈ означает -(СН₂)_n-N(R₇)₂-группу- или -(СН₂)_n-N⁺(R₇)₃-группу, причем n означает целое число 2-4 и R₇ может иметь вышеуказанное значение;

Y означает фармацевтически приемлемый анион;

В₁ означает NH[C(O)-(CH₂)_p-NH] _q-Z-остаток, причем р означает число 1-6 и q означает число 0-2;

Z означает амидносвязанную аминокислоту, -С(О)-СНR₆N(R₇)₂-группу, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₃-группу, -С(О)-СНR₆N⁺(R₇)₂R₈-группу или -С(О)-СНR₆NR₇R₈-группу и R₆-R₈ и m имеют вышеуказанные значения;

B₂ может иметь указанное для А₁ значение и значение А₁ используется только с В₁, а значение А₂ используется только с В₂.

8. Реагент по п. 7, отличающийся тем, что раствор включает смесь, состоящую, по меньшей мере, из одного соединения общей формулы (1) и другого липидного соединения в смешивающихся с водой растворителях.

9. Реагент по п. 7 или 8, отличающийся тем, что смешивающийся с водой растворитель представляет собой низший спирт.

10. Реагент, обладающий способностью к трансфекции, отличающийся тем, что одно или несколько соединений по пп. 1-6 в случае необходимости в присутствии других липидных соединений находятся в форме липосом или других агрегатов.

11. Способ внедрения (био) молекул в клетки, отличающийся тем, что используют реагент по пп. 7-10 и его вводят в контакт сначала с анионной биомолекулой и затем с клетками для трансфекции.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в случае внедряемых молекул речь идет о ДНК или РНК.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что анионной биомолекулой является ДНК или соответствующий фрагмент.

14. Способ по пп. 11-13, отличающийся тем, что используют

2-(6-карбоксиспермил)-1,3-диолеоилоксипропиламид;

1-(6-карбоксиспермил)-2,3-диолеоилоксипропиламид;

2,3-диолеоилокси-N-(N-(6-карбоксиспермил)глицил)аминопропан;

2-(6-карбоксиспермил)-1,3-димиристоилоксипропиламид;

2-(1,1,1,5,5,10,10,14,14,14-декаметил-6-карбоксиспермил)-1,3-диолеоилоксипропиламид;

2-(N, N, N, N", N", N"-гексаметилорнитил)-1,3-диолеоилоксипропиламид; и/или

2-(N, N, N, N", N", N"-гексаметиллизил)-1,3-диолеоилоксипропиламид

индивидуально или в случае необходимости в присутствии одного или нескольких других липидных соединений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым катионным, соответственно поликатионным амфифильным соединениям, которые способны к образованию агрегатов с макромолекулами, в особенности с ДНК или РНК, и их внедрению в прокариотные или эукариотные клетки.

Амфифильные соединения (например, поверхностно-активные агенты, детергенты) вот уже некоторое время вообще имеют значение в повседневной жизни. Катионные амфифилы же привлекли большее внимание в последнее время лишь благодаря пионерским работам Фелгнера, так как с их помощью можно внедрять ДНК и РНК в клетки и таким образом трансфицировать их (P. L. Felgner и др. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 84, 7413-7417 (1987); P. Hawley-Nelson и др. , международная заявка WO 94/05624; J. P. Behr, европейский патент ЕР 0394111).

Используемые при этом реагенты, в частности, являются очень различными. Это преимущественно связано с тем, что они найдены эмпирически. Следовательно, целенаправленно нельзя предназначить никакое соединение для применения, о котором здесь идет речь. К тому же следует учитывать тот факт, что имеются соединения, которые только в смеси с другими реагентами обладают действием, позволяющим распознавать полную комплексность трансфекции. Обзор в отношении большинства обнаруженных до сих пор реагентов дан Бером (Bioconjugate Chem. , 5, 382-389 (1994) и указанные там ссылки). Вообще, однако, имеет значение, что преобладающее число реагентов может образовывать липосомы.

Механизм трансфекции с помощью катионных амфифильных соединений еще мало понятен. То что липосомы за счет своего положительного заряда образуют с ДНК положительно заряженный комплекс и он присоединяется к отрицательно поляризованной клеточной мембране, является еще правдоподобным (P. L. Felgner, Nature, 337, 387-388 (1989)). Однако неизвестно, как происходит проникновение через клеточную мембрану и транспортировка к ядру клетки.

Несмотря на это, к новым реагентам, наряду с эффективностью трансфекции, предъявляется еще ряд других требований:

- для эффективности не должны требоваться никакие предварительные обработки клеток, как, например, усиление проницаемости клеточной мембраны за счет диметилсульфоксида, детергента, как например, дигитонин, или крацевания;

- реагенты по возможности не должны обладать никакой токсичностью, в особенности они должны быть нетоксичны при эффективной концентрации и предпочтительно не должны биологически разрушаться;

- они должны быть равным образом применимы ко всем принимаемым во внимание клеткам;

- они не должны обладать никакой специфичностью по отношению к определенным молекулам ДНК;

- они должны быть также применимы ин виво.

Это означает, что наряду с токсичностью также значительную роль играет совместимость с сывороткой. Как раз здесь зачастую обнаруживается резкое уменьшение эффективности трансфекции.

Таким образом, задачей изобретения является поиск соответствующих реагентов, которые в равной мере удовлетворяют этим требованиям.

Задача решается благодаря определенным катионным липидным амфифильным соединениям, с помощью которых анионные соединения, как, например, ДНК, могут внедряться в клетки и которые при этом неожиданно обладают улучшенными свойствами в отношении вышеуказанных требований.

В качестве амфифильных соединений в особенности служат соединения общей формулы (1):



причем R₁ означает насыщенную или ненасыщенную C(O)-C_1-23-группу или насыщенную или ненасыщенную C_1-24-группу;

A₁ означает O-R₂-группу, причем R₂ имеет указанное для R₁ значение, которое может быть таким же или отличаться от R₁;

А₂ означает NR₃X-остаток или N⁺R₃R₄R₅Y^--остаток, причем R₃, R₄, которые могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, означают водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)n-ОН-группу или (CH₂)n-NH₂-группу, где "n"= 2-6;

R₅, который может быть таким же или отличаться от R₃ или R₄, означает водород, алкильную группу с 1-4 атомами углерода, (СН₂)n-ОН-группу, (СН₂)n-галогенгруппу или группу -[(СН₂)_mNH] _o-(СН2)n-NH₂, причем "m" означает целое число от 2 до 6 и может быть таким же или отличаться от "n" или "о", причем "n" может означать число от 2 до 6 и "о" может означать число от 0 до 4;

Х дополнительно к значению для R₅ может иметь следующие значения: амидно-связанная аминокислота, амидно-связанный пептид, соответственно полипептид, -C(O)-CHR₆N(R₇)₂-группа, -C(О)-CHR₆N⁺(R₇)₃-гpyппa, C(O)-CHR₆N⁺(R₇)₂R₈-гpyппa или -C(O)-CHR₆NR₇R₈-группа при условии, что, если R₃ означает водород, Х означает амидно-связанную аминокислоту, производное аминокислоты, пептид или полипептид;

R₆ означает -(CН₂)_m-NR₇R₈-, -(CH₂)_m-N⁺(R₇)₂R₈- или -(CH₂)_m-N⁺(R₇)₃-ocтaтoк, где "m" может означать число от 1 до 5;

R₇ означает водород или алкильную группу с 1-4 атомами углерода;

R₈ означает -(CH₂)_n-N(R₇)₂- или (CH₂)_n-N⁺(R₇)₃-группу, причем "n" означает число от 2 до 4, и R₇ может иметь вышеуказанное значение;

Y означает фармацевтически приемлемый анион;

B₁ означает NH[C(O)-(CH₂)_p-NH] _q-Z-остаток, причем "р" означает число от 1 до 6, и "q" означает число от 0 до 2;

Z означает амидно-связанную аминокислоту, амидно-связанный пептид, соответственно полипептид, -С(O)-СНR₆N(R₇)₂-, -C(O)-CHR₆N⁺(R₇)₃-, C(O)-CHR₆N⁺(R₇)₂R₈- или -C(O)-CHR₆NR₇R₈-группу и R₆. . . R₈ и "m" имеют вышеуказанные значения;

В₂ может иметь указанное для A₁ значение, и значение A₁ используется только с B₁, а значение А₂ используется только с В₂.

При этом предпочтительны такие соединения, в случае которых остатки R₁ и A₁ означают алкильные остатки с 10-20 атомами углерода. Сверх того, предпочтительны такие соединения, в которых А₂ означает NR₃X, а именно в особенности такие, где R₃ означает водород и Х означает амидно-связанную аминокислоту, пригодное производное аминокислоты, пептид, соответственно полипептид.

В качестве фармацевтически приемлемого аниона Y используют в особенности галоген, монометилсульфат, ацетат, трифторацетат и фосфат.

В качестве особенно пригодных можно указать следующие соединения согласно изобретению:

2-(6-карбоксиспермил)-1,3-диолеоилокси-пропиламид;

2-(N, N, N, N", N", N", -гексаметилорнитил)-1,3- иолеоилоксипропиламид;

1-(6-карбоксиспермил)-2,3-диолеоилоксипропиламид и/или

2,3-диолеоилокси-N-(N-(спермил)глицил)аминопропан,

а также их соответствующие производные. Однако также оказались пригодными 2-(6-карбоксиспермил)-1,3-димиристоилоксипропиламид, 2-(1,1,1,5,5,10,10,14,14,14-декаметил-6-карбоксиспермил)-1,3-диолеоилоксипропиламид и/или 2-(N, N, N, N", N", N"-гексаметиллизил)-1,3-диолеоилоксипропиламид.

Подобные соединения, как, например, амино- и амидинопроизводные глицерина и пропандиолов, как, например, 2-аминопропановые соединения, уже описаны для других применений, однако, не рекомендованы для биологических применений (заявка на патент ФРГ 2835369; Woltrom и др. , Journal of the Am. Soc. , 73 (8), 3553 (1951); Chem. Abs. , 59 (8), столбец 8586, реферат 6 (1963)).

Далее настоящая заявка относится к получению реагентов, обладающих свойствами трансфекции. При этом равным образом новые реагенты можно использовать в виде раствора в смешиваемом с водой растворителе или в виде водной липосомальной композиции. При испытании их трансфекционной эффективности обнаруживают:

- что в среде, не содержащей сыворотки, они проявляют уже большею частью лучшую эффективность, чем другие, выпускаемые в продажу продукты;

- что в среде, не содержащей сыворотки, они неожиданно допускают более широкий диапазон соотношений ДНК/реагент при подобной трансфекционной эффективности;

- что неожиданно они обладают такой же или лучшей эффективностью в среде, содержащей сыворотку;

- что эффективность еще может повышаться за счет образования липосомальной композиции;

- что неожиданно соединения оказываются намного менее токсичными, чем соединения с подобной трансфекционной эффективностью в системе, не содержащей сыворотки.

На фиг. 2 и 3 представлены трансфекционные эффективности некоторых выбранных соединений по сравнению с известными реагентами.

Предлагаемые согласно изобретению соединения синтезируют обычными для специалиста способами (J. March: Advanced Organic Chemistry; John Wiley and Sons, 1985 и M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, изд. Springer, 1984), причем целевые продукты в случае необходимости очищают хроматографически, в особенности путем ионообменной хроматографии. Соответствующие реакционные схемы приводятся на фиг. 3-7.

Предпосылкой для получения новых трансфекционных реагентов является то, что соответствующие соединения являются катионными и пригодны для образования агрегатов, так как до сих пор такие заряженные реагенты прежде всего приводили к трансфекции (имеются примеры), при которой ДНК с помощью незаряженных реагентов могла транспортироваться в клетку. Для этой цели тогда, однако, их нужно включать в липосомы, при получении которых при известных условиях может повреждаться транспортируемая молекула (например, ДНК). Вообще благодаря таким комплексам не достигаются высокие эффективности (см. , например, A. Cudd, С. Nicolau в Liposome Technology (изд. Gregoriadis) (1984) CRC Press Inc. Boca Raton, Fl. ; S. F. Alino, M. Bobadilla, M. Garcia-Sanz, M. Lejarreta, F. Unda, E. Hilario в Blochem. Biophys. Res. Commun. , 192, 174 (1993)).

Дальнейшей отправной точкой является то, что соединения должны образовывать липосомы. При этом неясно, почему почти исключительно образующие липосомы соединения пригодны для трансфекции. Как показывают самые новейшие научные данные (Н. Gershon, R. Ghirlando, S. B. Guttman, A. Minsky в Biochemistry, 32, 7143 (1993) и В. Sternberg, F. L. Sorgi, L. Huang в FEBS Letters, 356, 361 (1994)), они способствуют образованию так называемых "фрикаделька-спагетти"-структур, которые необходимы для трансфекции. Имеет ли это равным образом значение для всех реагентов и в какой форме они способствуют прохождению клеточной мембраны, на сегодняшний день неясно.

Из этих соображений вытекают следующие новые синтезы, которые представлены в схемах на фиг. 3-7.

Для получения соответствующих реагентов, как, например, фармацевтических композиций, в уровне техники вообще описаны различные способы. В особенности используют липосомальные и этанольные композиции, причем уже различные виды липосом могут различаться по своей эффективности (в отношении получения липосом см. , например, H. Schreier, Pharmazle in unserer Zeit, 11, 97 (1982)).

Предлагаемые согласно изобретению соединения, однако, можно использовать не только в виде липосом, но и также в форме других агрегатов для трансфекции. Как в случае образования липосом, так и в случае образования агрегатов, наряду с предлагаемыми согласно изобретению соединениями дополнительно могут быть добавлены другие липидные соединения. В данном случае, например, пригодны соединения из класса фосфолипидов, однако, здесь также можно использовать другие сами по себе известные специалисту соединения.

Точно так же нужно рассматривать как неожиданное, что в случае предлагаемых согласно изобретению, впервые описанных в настоящем случае соединений типа 3, 6, 12 или 15 (см. примеры 3, 6, 12 и 15) могут образовываться липосомы.

Трансфекции осуществляют, например, в случае клеток линии HeLa с помощью рSV2-САТ-плазмиды (Gorman С. М. и др. , Mol. Cell. Blol. , 2, 1044-1051 (1982)). Трансфекционную эффективность определяют с помощью набора CAT-ELISA (Берингер Маннхайм Гмбх), и она представлена на фиг. 1 и 2 по сравнению с известными реагентами.

Из-за их незначительной токсичности эти соединения (индивидуально или в сочетании с другими липидными соединениями) также можно применять ин виво.

Примеры 1-24 поясняют далее изобретение.

Примеры 1-23 см. в конце текста.

Пример 24

Трансфекция адгезивных клеток линии HELA с помощью САТ-плазмиды

1. Исходный материал

1. Среда для культивирования клеток линии HELA (Американская коллекция тканевых культур. No CCL 2): минимальная поддерживающая среда (с солями Эрле), 10 % фетальной телячьей сыворотки, 2 ммоль пирувата, 2 ммоль глутамина, 1 x незаменимые (п. е. ) аминокислоты. Для трансфекции используют такую же среду с 5% фетальной телячьей сыворотки и такую же среду без фетальной телячьей сыворотки.

2. рSV2-САТ-плазмида в ТЕ-буфере; концентрация: 1 мг/мл; 5 тысяч нуклеотидов (Gorman C. M. и др. , Mol. Cell. Biol. 2, 1044-1051 (1982)).

3. Новые трансфекционные реагенты: в МЭС (2-морфолиноэтансульфокислота) (20 ммоль 2-морфолиноэтансульфокислоты, 150 ммоль NaCl, рН 6,2); концентрация: 1,0 мг/мл; обработана ультразвуком (аппарат для обработки ультразвуком Бренсона) и стерильно профильтрована; или в 99,8%-ном этаноле; концентрация 2,5 мг/мл (не обработан ультразвуком и стерильно не профильтрован).

4. HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота): 20 ммоль Hepes; 150 ммоль NaCl, рН 7,4; стерильно.

5. ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор), ВМ-идент. - No 210 331 (10 ммоль буфера, 150 ммоль соли), стерильный и не стерильный.

6. NaCl, 150 ммоль.

7. Буфер для лизиса: 10 ммоль морфолинопропансульфокислоты (MOPS); 10 ммоль NaCl; 1 ммоль этиленбис(оксиэтиленнитрило)тетрауксусной кислоты; 1% Тритон-Х-100, рН 6,5.

2. Смесь для трансфекции

За один день до трансфекции клетки преобразуют в чашках Петри диаметром 6 см: для этой цели клетки обрабатывают трипсином и разбавляют в среде, содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки, до концентрации 210⁵ клеток/мл (определение числа клеток осуществляют с помощью счетной камеры Neubauer). Используют 5 мл на чашку; инкубацию проводят в инкубаторе (при 37^oС, 5 % диоксида углерода).

Смесь на чашку для водных растворов трансфекционного реагента (ТР):

1. 5 мкг плазмиды (= 5 мкл) смешивают с HEPES до общего объема 100 мкл, встряхивают;

2. 10-40 мкг ТР (= 10-40 мкл) смешивают с HEPES до общего объема 100 мкл, встряхивают;

3. растворы из п. п. 1 и 2 объединяют, осторожно встряхивают, выдерживают в течение 10-15 минут при комнатной температуре;

4. во время инкубации осуществляют замену среды в тест-чашках: прежнюю среду отсасывают и заменяют с помощью 3 мл среды (содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки или, при случае, без фетальной телячьей сыворотки; клетки промывают 2 раза с помощью ЗФР);

5. смесь плазмида-ТР из п. 3 (200 мкл) помещают непосредственно в свежую среду (с фетальной телячьей сывороткой или без нее) и равномерно распределяют путем осторожного поворачивания чашки;

6. инкубируют в течение 6 часов в инкубаторе (при 37^oС; 5% диоксида углерода);

7. затем в среде устанавливают конечную концентрацию фетальной телячьей сыворотки 5-10%; конечный объем среды составляет 6 мл;

8. инкубируют в течение 19 часов в инкубаторе;

9. затем смесь полностью отсасывают и заменяют с помощью 5 мл среды с 5-10% фетальной телячьей сыворотки.

Смесь на чашку для этанольных растворов ТР:

А. В среде без фетальной телячьей сыворотки

1. встряхивают 5 мкг плазмиды (= 5 мкл)+500 мкл среды без фетальной телячьей сыворотки;

2. встряхивают 10-40 мкг ТР (= 4-16 мкл)+500 мкл среды без фетальной телячьей сыворотки;

3. промывают клетки без фетальной телячьей сыворотки: отсасывают 5 мл среды и промывают 2 раза с помощью ЗФР; отсасывают;

4. растворы из п. п. 1 и 2 объединяют, осторожно встряхивают;

5. смесь плазмида-ТР из п. 4 (примерно 1020 мкл) помешают на промытые клетки и равномерно распределяют путем осторожного поворачивания чашки;

6. инкубируют в течение 6 часов в инкубаторе (при 37^oC; 5 % диоксида углерода);

7. затем в среде устанавливают конечную концентрацию фетальной телячьей сыворотки 5-10%; конечная среда;

8. инкубируют в течение 18 часов в инкубаторе;

9. после этого смесь полностью отсасывают и заменяют с помощью среды с 5-10% фетальной телячьей сыворотки.

Б. В среде с фетальной телячьей сывороткой

1. встряхивают 5 мкг плазмиды (= 5 мкл)+500 мкл раствора NaCl;

2. встряхивают 10-40 мкг ТР (= 4-16 мкл)+150 мкл раствора NaCl;

3. растворы из п. п. 1 и 2 объединяют, кратковременно осторожно встряхивают, выдерживают в течение 15 минут при комнатной температуре;

4. во время инкубации осуществляют замену среды в тест-чашках: прежнюю среду отсасывают и заменяют с помощью 1,5 мл среды, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки;

5. смесь плазмида-ТР из п. 3 (примерно 30 мкл) помещают в свежую среду и равномерно распределяют путем осторожного поворачивания чашки;

6. инкубируют в течение 6 часов в инкубаторе (при 37^oС; 5% диоксида углерода);

7. затем в среде устанавливают конечную концентрацию фетальной телячьей сыворотки 5-10%; конечный объем среды составляет 6 мл;

8. инкубируют в течение 18 часов в инкубаторе;

9. затем смесь полностью отсасывают и заменяют с помощью 5 мл среды с 5-10% фетальной телячьей сыворотки.

3. Лизис клеток

1. Среду отсасывают и клетки промывают трехкратно с помощью очень холодного ЗФР.

2. Остаточную жидкость тщательно отсасывают и добавляют 1 мл буфера для лизиса на чашку. Проводят инкубацию в течение 30 минут при комнатной температуре. Чашки оставляют стоять без встряхивания.

3. Отбирают лизаты клеток с помощью пипетки и переносят в пробирки Эппендорфа емкостью 1,5 мл.

4. Лизаты подвергают центрифугированию в настольной центрифуге в течение трех минут.

5. Супернатант отбирают и переносят в чистый сосуд. Осадок после центрифугирования отбрасывают.

4. Определение протеинов в лизатах

Сразу после лизиса осуществляют определение протеинов. Анализ проводят по способу определения протеинов Бредфорда (М. Bradford, Anal. Biochem. , 72, 248 (1976)).

Для дальнейшего исследования в лизатах испытуемой смеси устанавливают одинаковую концентрацию протеинов (примерно 250 мкг/мл) с помощью буфера для образца (из CAT-ELISA-набора; Берингер Маннхайм, номер по каталогу 1363727).

5. Установление эффективности трансфекции

Лизаты исследуют с помощью CAT-ELISA-набора (Берингер Маннхайм, номер по каталогу 1363727). Для иммуноферментного анализа используют по 200 мкл лизатов, в которых установлена одинаковая концентрация протеинов. По сравнению экстинкций делают вывод об эффективности трансфекции.

Реконструкция составных частей набора и разбавление до рабочей концентрации

1. САТ-стандарт, склянка 1

В склянку с лиофилизатом добавляют 0,5 мл бидистиллированной воды и встряхивают до получения раствора. О концентрации (нг/мл) делают вывод по надписи на этикетке.

Рабочее разбавление

Растворенный лиофилизат (по поводу концентрации см. надпись на этикетке) разбавляют с помощью буфера для разбавления проб (склянка 7) до концентрации 1,0; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,0312; 0 нг/мл.

2. РАК <CAT> Dig, склянка Z

В склянку с лиофилизатом добавляют 0,5 мл бидистиллированной воды и встряхивают до получения раствора (концентрация= 0,2 мг/мл).

Рабочее разбавление

Растворенный лиофилизат (0,2 мг/мл) разбавляют с помощью буфера для разбавления проб (склянка 7) до концентрации 2 мкг/мл.

3. РАК <Dig> POD, склянка 3

В склянку с лиофилизатом добавляют 0,5 мл бидистиллированной воды и встряхивают до получения раствора (концентрация= 20 Ед. /мл).

Рабочее разбавление

Растворенный лиофилизат (20 Ед. /мл) разбавляют с помощью буфера для разбавления проб (склянка 7) до концентрации 150 мЕд. /мл.

4. Буфер для промывки, склянка 6

Готовый к употреблению буфер для промывки получают путем смешения 1 части 10 x буфера для промывки (склянка 6) с 9 частями бидистиллированной воды. Для всех стадий промывки требуется 1 x буфер для промывки.

5. Буфер для разбавления проб, склянка 7

На водяной бане склянку 7 доводят до комнатной температуры. Буфер готов для использования.

6. РОР-Субстрат, склянка 4

Готовый для использования ABTS-1-компонентный субстрат (склянка 4) доводят до комнатной температуры.

Осуществление трансфекции

Таблица (см. в конце текста) относится к вышеуказанным буферам и рабочим разбавлениям. МТР-модули выделяют (werden ausgeklopft) после каждой стадии промывки на многократных слоях целлюлозной бумаги. Для стадии инкубации при температуре 37^oС планшет оклеивают с помощью МТР-покрывной пленки.

Результаты представлены на фиг. 1 и 2.