пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов

Классы МПК:C07K7/08 содержащие от 12 до 20 аминокислот
C07K14/54 интерлейкины (ИЛ)
A61K38/20 интерлейкины
A61P7/02 антитромботические средства; антикоагулянты; ингибиторы аггрегации тромбоцитов
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
Приоритеты:
подача заявки:
2000-11-22
публикация патента:

Изобретение относится к новому пептиду на основе молекулы интерлейкина-8 общей формулы

пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728

стимулирующему миграцию нейтрофилов. Предлагаемое соединение не только обладает хемоаттрактантной активностью, но его стимулирующее воздействие на миграцию нейтрофилов на 15-29% выше, чем у ИЛ-8. 3 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

Формула изобретения

Пептид на основе молекулы интерлейкина-8 общей формулы

пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728

стимулирующий миграцию нейтрофилов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пептидам, обладающим хемоаттрактантной активностью, в частности стимулирующим миграцию нейтрофилов.

В настоящее время наиболее изученным хемоттрактантом из числа природных соединений является интерлейкин-8 (ИЛ-8) (Wals A., Peveri P., Aschauer H. Et all, BBRC, 1987, 149, р. 755-759).

За последнее десятилетие влияние ИЛ-8 на активацию нейтрофилов, а также механизм проведения сигнала внутрь клетки были детально изучены. Проведено сравнение с такими хемоаттрактантами, как С5а, FMLP, PAF, LTB4.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что ИЛ-8 ведет себя как классический хемотактический агонист. Он усиливает хемотаксис, стимулирует выброс белков и ферментов, например желатиназы, B12 связывающего белка, эластазы, пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728-глюкуронидазы, миелопероксидазы из внутриклеточных органелл (экзоцитоз), через активацию NADPH-оксидазы вызывает респираторный взрыв, активируя 5-липооксигеназу, усиливает синтез биологически активных липидов, приводит к увеличению концентрации внутриклеточного несвязанного кальция ([Са2+]). Кроме того, ИЛ-8 является стимулятором ангиогенеза.

ИЛ-8 является полипептидом длиною 72 аминокислотных остатка, третичная структура которого стабилизирована двумя дисульфидными связями.

В настоящее время этот хемокин получают, как правило, методами генной инженерии (Lowman H.B. et all J. Biol. Chem., 1996, 271, р. 14344-14352).

Однако возможно получение его химическим синтезом. (Clark-Lewis et all, Proc. Nat1/ Acad. Sci USA, 1993, 90, 3574-3577). Указанный процесс достаточно сложен и трудоемок, а получаемый ИЛ-8, являющийся прототипом заявляемого изобретения, весьма лабилен, и его активность, в частности в отношении стимуляции миграции нейтрофилов, недостаточно высока.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание вещества, обладающего более высокой активностью и более простого в получении.

Указанная задача была решена созданием синтетического пептида, включающего в себя фрагмент (1) ИЛ-8 (29-38):

AcGluSerGlyProHisCysAlaAsnThrGluNH2

и модифицированный фрагмент (2) ИЛ-8 (2-10):

SerAlaLysGluLeuCitCysGlnAlaIleAcpTyrNH2, и имеющего соответственно следующий состав:

пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728

Синтез пептида IL8-SS-4 осуществлялся общепринятыми методами твердофазного синтеза и состоял из трех основных этапов: синтез фрагментов 1 и 2 и их сшивка.

Синтез фрагмента 1. Синтез осуществлялся традиционными методами твердофазного синтеза полипептидов на основе последовательного наращивания пептидной цепи на метилбензгидриламинополимере.

Для защиты боковых радикалов использовали следующие группы: для гистидина - тозильную; для цистеина - 3-нитро-2-пиридинсульфенильную; для глутаминовой кислоты, серина, треонина - соответствующие бензиновые эфиры; для аспарагина - тритильную.

Для проведения синтеза в реакционный сосуд загружали 0,3 г метилбензгидриламинополимера с емкостью 1,0 ммоль/г (Sigma).

Пептидную цепь наращивали до цистеина по схеме, приведенной в таблице 1, а начиная с цистеина - по схеме, приведенной в таблице 2. На стадии конденсации были использованы 3-кратные избытки активированных производных аминокислот. Контроль полноты протекания реакции конденсации осуществляли с помощью нингидринового теста.

По завершении сборки полипептидной цепи на полимере Вос-защита с аминогруппы глутаминовой кислоты была удалена, и по схеме, приведенной в таблице 2 (п.2,3,4,5,6), альфа-аминогруппа пептида была ацетилирована уксусным ангидридом в течение 30 мин. Полученный пептидил-полимер был высушен в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянного веса.

0,7 г пептидил-полимера перенесли в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавили 0,5 мл м-крезола, охладили до -78oС и обработали 4,5 мл безводного фтористого водорода. Смесь выдерживали при 0oС 1 час, затем фтористый водород упаривали с помощью водоструйного насоса. Остаток перенесли на фильтр Шотта и промыли эфиром.

Полученный продукт растворили в 10 мл трифторуксусной кислоты и по каплям прилили к 100 мл эфира. Кристаллический осадок отфильтровали с помощью фильтра Шотта, промыли эфиром и высушили в вакуум-эксикаторе.

Индивидуальный продукт был получен с помощью высокоэффективной препаративной жидкостной хроматографии (ВПЖХ).

Однородность пептида определяли по данным ВЭЖХ на колонке Delta РАС С 18 100А 3,9пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728150 мм при скорости потока 1 мм/мин и элюции 0,1% трифторуксусной кислотой в градиенте 10-50% ацетонитрила. Время удерживания 10,45 мин, чистота по оптической плотности на 230 нм > 95%, выход составил 30 мг (8%).

Аминокислотный состав был подтвержден с помощью аминокислотного анализа гидролизата пептида на приборе Alpha Plus LKB.

Синтез фрагмента 2. Синтез проводился на автоматическом синтезаторе "Applied Biosystems 430A" с использованием модифицированного пакета программ. Для синтеза использовался метилбензгидриламинполимер.

В качестве временной защиты боковых радикалов аминокислот использовали следующие группы: для лизина-2 - хлорбензилоксикарбонильную; для серина и глутаминовой кислоты - соответствующие бензиловые эфиры; для цистеина - метоксибензильную; для тирозина-2,6 дихлорбензильную.

При синтезе фрагмента 2 были использованы неприродные аминокислоты: е-аминокапроновая кислота и цитруллин. Деблокирование в процессе синтеза осуществлялось неразбавленной трифторуксусной кислотой. Нейтрализацию проводили во время конденсации путем прибавления строго фиксированного количества диизопропилэтиламина непосредственно в реакционный сосуд (метод "in situ" - М. Schnolzer, R. Alewood, Int. J. Peptide Protein Res., 40, 1992, р. 180-193). Пептидная цепь наращивалась последовательным присоединением производных аминокислот с помощью 1-гидроксибензотриазоловых эфиров.

В реактор загрузили 0,15 г метил-бензгидриламин-полимера (Sigma) с емкостью 1,0 ммоль/г, и после сборки полипептидной цепи получили 0,52 г пептидил-полимера. Пептидил-полимер обработали 4,5 мл безводного фтористого водорода в присутствии 0,5 мл м-крезола, как описано выше при синтезе фрагмента 1. В результате получено 0,17 г грубого продукта, который далее очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Однородность полученного пептида подтверждали данными ВЭЖХ на колонке Delta РАС С18, 5ukm 100А, 3,9пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728150 мм, при скорости потока 1 мл/мин и элюции 0,1% трифторуксусной кислотой при градиенте 10-40% ацетонитрила.

Время удерживания составило 11,84 мин, чистота по оптической плотности на 230 нм > 95%, выход - 30 мг (14%). Аминокислотный состав был подтвержден с помощью аминокислотного анализа гидролизата пептида на приборе Alpha Plus LKB.

Сшивка фрагментов 1 и 2. 7 мг пептида 1 (5,6 ммоль) растворили в 1 мл 0,1 М Na2HPO4 при рН 4,5, а 12 мг пептида 2 (8,55 ммоль) растворили в 2 мл того же буфера. Растворы смешали в колбе на 10 мл и перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре. Через 1.5 часа с помощью контроля методом ВЭЖХ определили, что пептид 1 практически исчез и образовался новый продукт, который был выделен на препаративной ВЭЖХ колонке Waters Prep Nova РАК С18, 6ukm, 60 A, 19пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728300 mm.

Однородность пептида определяли по данным ВЭЖХ на колонке Delta РАС С18, 100А, 3,9пептид, стимулирующий миграцию нейтрофилов, патент № 2181728150 мм, при скорости потока 1 мл/мин и элюции 0,1% трифторуксусной кислотой при градиенте 10-50% ацетонитрила.

Время удерживания составило 10,50 мин, чистота по оптической плотности на 230 нм > 95%, выход - 7,7 мг (49%). Аминокислотный состав был подтвержден с помощью аминокислотного анализа гидролизата полученного соединения на приборе Alpha Plus LKB.

Хемотактическую активность пептидов изучали с помощью метода миграции нейтрофилов под агарозой.

Нейтрофильные клетки получали путем фракционирования свежей донорской крови на градиенте фиколл-пака (уд. плотность 1078) путем центрифугировании при 400 g. После центрифугирования собирали клетки из осадка, примесь эритроцитов удаляли с помощью гипотонического шока дистиллированной водой в течение 40 секунд. После двукратного отмывания физиологическим раствором клетки ресуспендировали в среде Игла с добавлением 10% телячьей фетальной сыворотки. Концентрация клеток, используемая в реакции - 30 млн клеток в 1 мл среды.

Агарозную среду готовили в день исследования. Для проведения реакции использовали 1% раствор агарозы (тип 11, ЕЕО, Sigma) в среде 199, содержащей 10% телячьей фетальной сыворотки.

В агарозном геле, разлитом в чашки Петри диаметром 40 мм, после застывания пробойником пробивали на одном уровне по три отверстия па расстоянии 3 мм. В левую лунку вносили по 10 мкл культуральной среды Игла для определения спонтанной миграции клеток, в центральную - 10 мкл клеточной взвеси нейтрофилов, в правую лунку по 10 мкл изучаемого пептида в соответствующих разведениях. Чашки Петри инкубировали полтора часа при температуре 37o.

После инкубации чашки Петри вынимали, заливали 10% раствором формалина на ночь, затем сливали раствор формалина, удаляли агарозный диск и проводили дофиксацию метанолом в течение 10 минут.

Окрашивание зон миграции производили красителем Романовского-Гимзе. Результат реакции учитывали с помощью линейки на аппарате для чтения микрофильмов.

Окончательный результат реакции выражали в индексах миграции, являющихся отношением длины пробега клеток в опыте (изучаемые препараты) к длине пробега клеток в контроле (культуральная среда).

Полученные результаты приведены в таблице 3.

Полученные данные свидетельствуют, что полученный пептид не только обладает хемоаттрактантной активностью, но его стимулирующее воздействие на миграцию нейтрофилов на 15-29% выше, чем у ИЛ-8.

Проведенные испытания пептидов при внутривенном введении в дозе до 5,0 мг/кг путем инъекции соединения в физиологическом растворе в хвостовую вену белых беспородных мышей и перрорально до 20 мг/мышь не выявили токсичность для заявляемого соединения.

Класс C07K7/08 содержащие от 12 до 20 аминокислот

проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
способ очистки липопептидов -  патент 2526391 (20.08.2014)
пептидные лиганды соматостатиновых рецепторов -  патент 2525468 (20.08.2014)
способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых продуктов -  патент 2517628 (27.05.2014)
композиции для лечения боли и/или воспаления -  патент 2515054 (10.05.2014)
пептиды со способностью связываться со скурфином и их применение -  патент 2502741 (27.12.2013)
пептиды с большим числом мостиковых связей, выделяемые из actinomadura namibiensis -  патент 2498995 (20.11.2013)
полипептиды, конкурентно ингибирующие gq- белок, способы их получения и применение -  патент 2487135 (10.07.2013)
эффективные аналоги компстатина -  патент 2474586 (10.02.2013)
антибиотические пептиды -  патент 2472805 (20.01.2013)

Класс C07K14/54 интерлейкины (ИЛ)

способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией -  патент 2520091 (20.06.2014)
гомогенные препараты il-28 и il-29 -  патент 2518324 (10.06.2014)
способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника -  патент 2508298 (27.02.2014)
пептид-антагонист активности интерлейкина-15 -  патент 2506270 (10.02.2014)
способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц -  патент 2468032 (27.11.2012)
собачий тимусный стромальный лимфопоэтический белок и его применение -  патент 2457217 (27.07.2012)
соединение, предназначенное для стимуляции пути передачи сигнала через il-15rбета/гамма, с целью индуцировать и/или стимулировать активацию и/или пролиферацию il-15rбета/гамма-положительных клеток, таких как nk-и/или t-клетки, нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, вектор экспрессии, клетка-хозяин, адъювант для иммунотерапевтической композиции, фармацевтическая композиция и лекарственное средство для лечения состояния или заболевания, при котором желательно повышение активности il-15, способ in vitro индукции и/или стимуляции пролиферации и/или активации il-15rбета/гамма-положительных клеток и способ получения in vitro активированных nk-и/или t-клеток -  патент 2454463 (27.06.2012)
гетеродимерные полипептиды il-17 a/f и возможности их лечебного применения -  патент 2440134 (20.01.2012)
варианты il-7 со сниженной иммуногенностью -  патент 2437893 (27.12.2011)
выделенный пептид, стимулирующий противоопухолевый иммунный ответ, фармацевтическая композиция на его основе, способ лечения млекопитающего и способ модуляции иммунного ответа -  патент 2425053 (27.07.2011)

Класс A61K38/20 интерлейкины

способ лечения больных с синдромом внутрипеченочной портальной гипертензии -  патент 2529414 (27.09.2014)
комбинированные препараты с антагонистом цитокина и кортикостероидом -  патент 2526161 (20.08.2014)
способ профилактики гнойно-септических осложнений у больных с острым гангренозным холециститом при операции из мини-доступа -  патент 2523629 (20.07.2014)
лечение болезни альцгеймера цитокинами -  патент 2519651 (20.06.2014)
гомогенные препараты il-28 и il-29 -  патент 2518324 (10.06.2014)
способ лечения больных с местно-распространенными формами рака матки -  патент 2514342 (27.04.2014)
способ терапии при маститах у собак -  патент 2513998 (27.04.2014)
пептид-антагонист активности интерлейкина-15 -  патент 2506270 (10.02.2014)
применение противомикробного полипептида для лечения микробных нарушений -  патент 2503460 (10.01.2014)
способ лечения больных раком легкого -  патент 2500435 (10.12.2013)

Класс A61P7/02 антитромботические средства; антикоагулянты; ингибиторы аггрегации тромбоцитов

способ получения лекарственных соединений, содержащих дабигатран -  патент 2529798 (27.09.2014)
способ профилактики тромбозов у лиц с сердечно-сосудистыми заболеваниями и хронической болью -  патент 2528904 (20.09.2014)
производное сложного эфира тиенопиридина, содержащее цианогруппу, способ его получения, его применение и композиция на его основе -  патент 2526624 (27.08.2014)
гетероциклические соединения и способы применения -  патент 2525116 (10.08.2014)
терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами -  патент 2524129 (27.07.2014)
2-(1s,2r,5s)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2ил]метил}сульфинил)этановая кислота, обладающая антиагрегационным действием -  патент 2522198 (10.07.2014)
фармацевтическая композиция, обладающая противотромботическим, тромболитическим, иммуномодулирующим, противовоспалительным действиями, нормализующая липидный и углеводный обмен -  патент 2519741 (20.06.2014)
предотвращение образования и/или стабилизации тромбов -  патент 2514878 (10.05.2014)
способ управляемого снижения агрегационной активности тромбоцитов мексидолом в эксперименте -  патент 2512788 (10.04.2014)
средство, обладающее противоопухолевой, антикоагулянтной, ранозаживляющей, противовоспалительной, антиоксидантной активностью, способностью ингибировать коллагеназу и ангиотензинпревращающий фермент (апф), и способ его получения -  патент 2509775 (20.03.2014)
Наверх