способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций
Классы МПК: | G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) C12Q1/70 использующие вирусы или бактериофаги G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого |
Автор(ы): | Мурина Е.А., Аксенов О.А. |
Патентообладатель(и): | Научно-исследовательский институт детских инфекций, г.Санкт- Петербург |
Приоритеты: |
подача заявки:
2000-01-26 публикация патента:
27.04.2002 |
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, в эпидемические и межэпидемические периоды. Сущность способа заключается в индикации репродукции вируса в тканевой культуре при 37oС и тестировании синтеза
-интерферона в лейкоцитах человека, при этом дополнительно используют Rct-маркеры , при 28 и 40oС определяют репродукционную активность с последующим выявлением синтезируемого альфа- и гамма-интерферона в крови доноров и определяют степень патоггенности выделенного штамма энтеровируса и по превалированию накопления вируса при 40oС по сравнению с 28oС и по 8-16-кратному увеличению синтеза альфа-интерферона над гамма-интерфероном. Преимущество изобретения заключается в повышении специфичности способа. 1 табл.
Рисунок 1
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/945.gif)
Формула изобретения
Способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных у детей, больных различными формами нейроинфекций, путем индикации репродукции вируса в тканевой культуре с использованием маркера Rct 40, отличающийся тем, что используют два маркера патогенности, сначала определяют дополнительно репродукционную активность вируса по маркеру Rсt 28 с последующим выявлением этими изолятами синтеза альфа- и гамма-интерферона в лейкоцитах крови человека и по превалированию репродукции вируса при 40oС по сравнению с 28oС, а также по 8-16-кратному увеличению синтеза альфа-интерферона над гамма-интерфероном считают выделенный штамм энтеровируса патогенным.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области медицины, а именно к определению патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, в эпидемические и межэпидемические периоды. По данным вирусологической лаборатории института детских инфекций в структуре всех обнаруженных сероваров энтеровирусов за 1995-1999 гг., до 15% составляли "новые", не встречающиеся в последние 20 лет в нашем регионе штаммы. Это обусловлено большими миграционными волнами, особенно из южных стран ближнего зарубежья. В связи с этим вирусологическим лабораториям принадлежит решающая роль не только в обнаружении таких штаммов, но и определении их патогенности для детей. Известно, что Rct-маркер является одним из основных маркеров вирусной патогенности, так как штаммы, размножающиеся в условиях повышенной температуры, более устойчивы и не только активнее репродуцируются в месте первичного размножения, но и имеют особенность диссеминировать по организму. Еще в 60-е годы Львовым и сотрудниками было показано, что аттенуация вирусов полиомиелита, относящихся к группе энтеровирусов, легко осуществляется путем пассирования их при пониженной температуре. Если же аттенуированные вирусы полиомиелита "приучить" к размножению в культуре ткани при +40oС, то происходит постепенное вытеснение патогенных вариантов и вирус приобретает нейропатогенные свойства. Связь между патогенностью и Rct-маркером известна у арбовирусов, миксовирусов и других. С другой стороны, одним из показателей вирулентности является отношение выделенных изолятов от больных к системе интерферона. Известно, что штаммы различных вирусов, выделенных от больных, обладали широкой вариабельностью в отношении продукции или интерферона и чувствительностью к интерферону (Came Paul E., Schafer Thomas N., Silver Gerald H. Sensitivity of rhinoviruseas to human leukocyte and fibroblast interferons. "J. Infect. Diseases", 1976, 133, 6, suppl. To, A.136-A.139). Trousdael et al. установили, что дикий вирус Коксаки В3 обладал большей репродукционной способностью у мышей по сравнению с ТС-мутантами (Rсt 28) и вырабатывал большие концентрации интерферона у этих животных. Работы, касающиеся изучения интерферонных характеристик энтероизолятов от больных, различающихся по температурочувствительности, отсутствуют. В то же время для более полной характеристики выделенных штаммов энтеровирусов, учитывая их многообразие, сочетанная характеристика температурочувствительности и продукции интерферона является чрезвычайно важной (Trousdael Melvin D., Poque Ronald E. , Nealon Timothy, Gauntt Charles J. Assessment of coxsackie virus В3 ts mutants for induction of myocarditis in a murine model. "Infec. and Immun.", 1979, 23, 2, 486-495). Все представленные выше аналоги изучают либо один из этих маркеров, либо изучаются на животных с вирусными штаммами, длительно пассируемыми в лабораториях, а не с первично выделенными изолятами. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ оценки изолята энтеровируса 71 типа в отношении его репродукции при 35 и 39,5oС (Hagiwara A. , Yoneyama Т., Takami S., Hashimoto I.Genetic and phenotypic characteristics of enterovirus 71 isolates from patients with encephalitis and with hand, foot and mouth disease. "Arch. Virol.", 1984, 79, 3-4, 273-283). Авторами показано, что 57,1% штаммов, выделенных от больных менингоэнцефалитом и ящуром, имели более высокий Rct-маркер (39,5o) и обладали большей нейровирулентностью для обезьян. В то же время существенных изменений в структуре РНК таких изолятов не обранужено. Фингер-принты этих РНК не отличались от аналогичных фингер-принтов температурочувствительных изолятов. Авторы делают достоверный вывод о том, что нейровирулентность энтеровирусных штаммов, главным образом, оценивается по Rct-маркеру. Более того, авторы заключают, что присутствует достоверная корреляция между нейровирулентностью и генетическими факторами, влияющими на репродукцию энтеровируса в культуре ткани почки обезьян при повышенной температуре. В то же время недостатками прототипа являются следующие моменты:- авторы используют очищенные энтеровирусы 71 типа, а не первично выделенные изоляты;
- тестировался только один маркер - температурочувствительность, при выполнении способа не исследовалась способность штаммов продуцировать различные типы интерферонов в клетках-продуцентах. В то же время способность к продукции интерферона является одним из свойств патогенности энтеровирусов. Устранению данных недостатков может помочь предлагаемый авторами способ определения патогенности энтеровирусов. Поставленная цель достигается тем, что оценивают репродукционную активность при 40 и 28oС с последующим выявлением синтезируемого альфа- и гамма-интерферона в изучаемых изолятах в крови доноров и по превалированию накопления вируса при 40oC по сравнению с 28oС, а также 8-16-кратному увеличению синтеза альфа-интерферона над гамма-интерфероном устанавливают степень патогенности выделенного штамма энтеровируса. Отличительными признаками заявляемого способа является обязательное использование двух маркеров патогенности: температурорезистентного и интерферонного. Оценка вирулентности по одному фактору не правомочна, так как при наличии одного маркера патогенности (температурорезистентности Rсt 39-40) выделенный изолят может иметь высокую способность продуцировать
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/945.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/945.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/946.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181086/947.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/945.gif)
- эндогенную принадлежность штаммов, циркулирующих в регионе (доминантных и сопутствующих);
- "привнесенные" в регион штаммы:
a) южный вариант;
b) северный вариант;
- окончательную вирулентность штамма. Дифференцировка вирулентных и авирулентных штаммов проводится по разнице в активности выделенного штамма при 40oC по сравнению с 37oC (или 28oC), а также по большей продукции альфа-интерферона в клетках крови доноров при внесении в клетки штаммов, выделенных при 40oC, по сравнению со штаммами, выделенными при 37oC (или 28oC). В то же время уровень этого интерферона при вирулентных штаммах существенно снижен и не превышает 16-32 MЕ (международных единиц). В соответствии с этим концентрация гамма-интерферона у таких штаммов минимальна и не превышает 2-4 MЕ. Соотношение альфа-интерферона к гамма-интерферону должно быть у вирулентных вирусов в 8-16-кратным. Если уровень гамма-интерферона равен или превышает уровень альфа-интерферона, штаммы этеровирусов оказываются авирулентными и не вызывают острой энтеровирусной инфекции (в частности, серозного менингита). В то же время, если уровень альфа-интерфорона у испытуемого штамма достаточно высок (в пределах 64 MЕ и более), то выработка высоких концентраций интероферона в организме ребенка ограничивает репродукцию такого вируса и острого заболевания не происходит. В таблице приводятся примеры таких выделенных штаммов энтеровирусов с их характеристиками. Обосновываются эти варианты по Rct-маркированию и способностью этих штаммов вырабатывать интерферон. Оценка вышесказанных свойств основывается на следующем:
I. Эндогенные варианты энтеровирусов, циркулирующих в регионе, без связи с пейзажем в регионе характеризуются повышенным Rct-маркером, т.е. выделение вируса легче осуществляется и он накапливается в больших титрах с культивированием его в культуре при 37oС. Репродукция такого штамма при 40oС резко отстает или полностью отсутствует, тогда как при 28oС эти титры незначительно (в пределах 2-2,5 lg) снижены при сравнении с таковыми при 37oС. Если у этих штаммов продукция интерферона находится в пределах 32-128 МЕ/мл, то эти вирусы не отличаются значительной вирулентностью и до 72% выделяется от больных без клинических проявлений, осложненных энтеровирусной инфекцией (менингиты, менингоэнцефалиты, миокардиты и др.). При минимальной продукции интерферона (<8 МЕ/мл) такие штаммы с Rсt 37 являются основными возбудителями осложненных форм нейроинфекций в регионе. Соответственно частота обнаружения таких штаммов при осложненных формах составляет 81,4%. В то же время в популяции региона существуют эндогенные штаммы, изоляты которых имеют Rсt 28, т.е. они лучше размножаются при 28oС, чем при 37oС или 40oС, но продукция
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/945.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181086/947.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/945.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181086/947.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181007/945.gif)
![способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций, патент № 2181886](/images/patents/289/2181086/947.gif)
Класс G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры)
Класс C12Q1/70 использующие вирусы или бактериофаги
Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого