способ определения хронического отторжения после пересадки почки

Формула изобретения

1. Способ обнаружения хронического отторжения после пересадки почки, отличающийся тем, что определяют содержание матриксной металлопротеиназы-2 (ММП-2) или ее предшественника в жидкостях организма и при возрастании содержания маркера относительно граничного уровня, который для, по крайней мере, 90% и более пациентов с близкой к норме функции органа после пересадки считается нормальным, определяют наличие процесса хронического отторжения.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве жидкостей организма исследуют мочу или кровь человека.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определяют содержание ММП-2 или ее предшественника в пробе мочи.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для определения наличия или отсутствия хронического отторжения после пересадки почки для концентрации предшественника ММП-2 в пробе мочи предварительно задают граничный уровень в диапазоне от 0,1 до 10,0 нг/мл.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный граничный уровень предварительно задают в диапазоне от 0,5 до 5,0 нг/мл.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для определения наличия или отсутствия хронического отторжения после пересадки почки в пробе мочи анализируют концентрацию предшественника ММП-2 и дополнительно концентрацию креатинина и предварительно задают граничный уровень индекса после коррекции делением концентрации предшественника ММП-2 на концентрацию креатинина в диапазоне от 0,1 до 20,0 мкг/г креатинина.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанный граничный уровень предварительно задают в диапазоне от 0,5 до 10,0 мкг/г креатинина.

8. Способ по любому из пп. 2-7, отличающийся тем, что определение содержания выполняют при помощи иммунологического анализа.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что иммунологический анализ является ферментативным иммунологическим анализом.

10. Способ по п. 8 или 9, отличающийся тем, что иммунологический анализ является анализом по способу "сандвича".

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к способам определения начала хронического отторжения после пересадки органа путем исследования жидкостей, забираемых из тела, и более конкретно, к способам выявления отторжения (хронического отторжения), возникающего на хронической стадии после пересадки органа, путем анализа матриксной металлопротеиназы (обозначаемой как "ММП-2") или ее предшественника в жидкостях организма, и к способу анализа ММП-2 или ее предшественника в моче.

Уровень техники

У больных с пересадкой почки хроническое отторжение обычно диагностируют путем биопсии почки. Однако, пациенты страдают от периодической биопсии почки, которая может попутно нарушить функцию почки. Более того, такое хроническое отторжение развивается медленно, как результат - со слабыми субъективными симптомами, и поэтому большинство пациентов отвергают болезненную биопсию почки.

Между тем, применялись исследования функции почек, дающие индикаторы развития хронического отторжения, поскольку хроническое отторжение нарушает функцию почек. В этих исследованиях белок в моче, альбумин в моче и трансферрин в моче и т.п. анализировали в качестве индикаторов увеличения проницаемости для белков, отражающей гломерулярную аномалию, а креатинин крови, азот мочевины в крови (АМК), ₂-микроглобулин в крови и ₁-микроглобулин в крови анализировали в качестве индикаторов снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ). Однако изменение тестируемых уровней при развитии хронического отторжения мало, а если обнаружены аномальные тестируемые уровни, хроническое отторжение имеет уже выраженные симптомы на конечной стадии. До сих пор неизвестен какой-либо способ тестирования, который мог бы обеспечить раннее выявление хронического отторжения путем анализа эндогенных веществ в жидкостях организма, таких, как моча и кровь. Так как в настоящее время не существует такого простого способа тестирования, пациенты со слабыми субъективными симптомами хронического отторжения переходят в конечную стадию, для которой нет подходящего лечения, так что пациенты часто теряют функцию почки.

Сущность изобретения

Задача данного изобретения - создать простые способы, способные обнаружить хроническое отторжение на ранней стадии после пересадки органа.

NО₃ и NO₂ являются конечными метаболитами радикала NO в биологических организмах. NО-радикал выделяется из гранулоцитов и макрофагов и тому подобных клеток во время воспаления и повреждения органа. Поэтому эти метаболиты клинически обнаруживаются во время воспаления, ишемических заболеваний сердца, обусловленных повреждением органа, шока, острого отторжения после трансплантации и бактериальной инфекции. Однако не было опубликовано сообщений о радикале NO во время хронического отторжения после трансплантации. Поэтому было исследовано, образуется ли NО₃ в организме при отторжении, которое прогрессирует хронически, и может ли NО₃ в жидкостях тела служить маркером при тестах на хроническое отторжение. В результате было обнаружено, что NО₃ в жидкостях тела может служить маркером при выявлении хронического отторжения.

Кроме того, ММП-2, фермент, разрушающий коллаген, входящий в состав базальной мембраны, действует во время восстановления и регенерации тканей. Считается, далее, что при раке фермент действует, разрушая коллаген во время инфильтрации раковых клеток в базальную мембрану. После интенсивных исследований в ходе создания изобретения обнаружено, что ММП-2 или ее предшественник либо не выделяются, а если и выделяются, то только в следовых количествах, в жидкости организма, таких, как моча, у нормальных людей или пациентов без начала хронического отторжения после пересадки почки, тогда как уровень ММП-2 или ее предшественника в таких жидкостях организма, как моча, у пациентов с хроническим отторжением после пересадки органа заметно увеличивается. В соответствии с настоящим изобретением, созданы способы выявления отторжения после пересадки органа путем анализа эндогенных веществ, таких, как NО₃ и ММП-2 или ее предшественника в жидкостях организма, таких, как кровь и моча, основанные на установленном факте, что концентрации этих эндогенных веществ, секретируемых в жидкости организма, такие, как кровь и моча, достоверно увеличиваются после начала хронического отторжения после пересадки органа; набор для тестирования для использования в соответствии со способом; и способ анализа ММП-2 или ее предшественника в моче.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к

(1) способу определения начала хронического отторжения на ранней стадии после пересадки органа путем исследования жидкостей организма, забираемых из тела;

(2) способу определения хронического отторжения после пересадки органа, характеризующемуся обнаружением NO₃, ММП-2 или ее предшественника в жидкостях организма;

(3) способу, описанному выше в (2), характеризующемуся обнаружением NО₃ в жидкостях организма;

(4) способу, описанному выше в (2), характеризующемуся обнаружением ММП-2 или ее предшественника в жидкостях организма;

(5) способу, описанному выше в (2), (3) или (4), в котором жидкости организма включают мочу или кровь человека;

(6) способу, описанному выше в (2), характеризующемуся обнаружением ММП-2 или ее предшественника в пробе мочи;

(7) способу, описанному выше в (2), (3), (4), (5) или (6), в котором пересадка органа представляет собой пересадку почки;

(8) способу, описанному выше в (6), характеризующемуся предварительным заданием граничного уровня для определения наличия или отсутствия хронического отторжения после пересадки почки в диапазоне от 0,1 до 10 нг/мл для концентрации предшественника ММП-2 в пробе мочи;

(9) способу, описанному выше в (8), характеризующемуся предварительным заданием граничного уровня в диапазоне от 0,5 до 5,0 нг/мл;

(10) способу, описанному выше в (6), характеризующемуся анализом концентрации предшественника ММП-2 и концентрации креатинина в пробе мочи, и предварительным заданием граничного уровня индекса после коррекции на основании концентрации креатинина для определения наличия или отсутствия хронического отторжения после пересадки почки в диапазоне от 0,1 до 20,0 мкг/г креатинина;

(11) способу, описанному выше в (10), характеризующемуся предварительным заданием граничного уровня в диапазоне от 0,5 до 10 мкг/г креатинина;

(12) способу, описанному в любом из п. (2) и от (4) до (11), в котором обнаружение осуществляется при помощи иммуннологического анализа;

(13) способу, описанному выше в (12), в котором иммуннологический анализ является иммуноферментным анализом;

(14) способу, описанному выше в (12) или (13), в котором иммунологический анализ является анализом по "способу сандвича";

(15) способу для анализа ММП-2 или ее предшественника в моче путем иммуннологического анализа;

(16) набору для выявления начала хронического отторжения на ранней стадии после пересадки органа путем исследования жидкостей организма, забираемых из тела;

(17) набору для выявления начала хронического отторжения после пересадки органа путем определения трехокиси азота (NО₃), или матриксной металлопротеиназы (ММП)-2 или ее предшественника в жидкостях организма;

(18) набору для выявления начала хронического отторжения после пересадки органа путем определения ММП-2 или ее предшественника в моче или крови;

(19) набору, описанному выше в (18), в котором определение осуществляется при помощи иммунологического анализа;

(20) способу диагностики хронического отторжения на ранней стадии после пересадки органа путем исследования жидкостей организма;

(21) способу диагностики хронического отторжения после пересадки органа, характеризующемуся выявлением трехокиси азота (NО₃), или матриксной металлопротеиназы (ММП)-2 или ее предшественника в жидкостях организма; и

(22) способу диагностики, описанному выше в (21), в котором жидкости организма включают мочу или кровь.

Перечень фигур чертежей:

фиг.1 изображает гистограмму концентраций предшественника ММП-2 в моче у пациентов после пересадки почки;

фиг.2 изображает гистограмму концентраций предшественника ММП-2 в моче у пациентов после пересадки почки после коррекции на основе концентраций креатинина.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В соответствии с настоящим изобретением разработан способ определения хронического отторжения на его ранней стадии после трансплантации органа простым способом, путем анализа эндогенных веществ, специфически секретируемых в жидкости организма при хроническом отторжении после трансплантации органа. В соответствии с настоящим изобретением жидкости организма (пробы) включают жидкости организма человека и тому подобные, такие, как моча и компоненты крови, включая сыворотку и плазму. Любая проба мочи может быть удовлетворительной, если пробу отбирают или пробу отбирают и хранят так, что вещества, которые нужно обнаружить, такие, как ММП-2 или ее предшественник, могут сохранять стабильность. Выбор времени и способ отбора проб мочи не имеют специфических ограничений, если они не нарушают клинического значения ММП-2 или ее предшественника или тому подобных веществ. Может быть использована любая проба мочи, отобранная и хранящаяся обычным способом. Иногда мочу можно собирать в контейнер с добавлением, например, антибактериальных агентов, с тем, чтобы поддерживать стабильность во время хранения мочи, и такая проба мочи также может быть использована, если добавленные антибактериальные агенты не мешают анализу. Кроме того, пересадка органа включает пересадку почки, пересадку печени, пересадку сердца и пересадку поджелудочной железы без специфических ограничений, но случай пересадки почки является особенно предпочтительным.

Эндогенные вещества включают трехокись азота (NО₃), матриксную металлопротеиназу (ММП)-2 или ее предшественник и т.д.

Способ анализа (количественного определения и т.д.) уровня NО₃ в пробе известен (например, способ Грисса), и, в соответствии с настоящим изобретением, уровень NО₃ может быть определен известными способами. Например, NО₃ можно определять при помощи жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) с использованием имеющегося в продаже автоматического анализатора азота в форме нитратов и азота в форме нитритов. Анализ на NО₃ также может быть произведен в 96-ячеечной микропластинке с имеющимися в продаже колориметрическими наборами для NO и наборами для флуоресцентного анализа на NO при использовании аппарата для чтения микропластинок или аналогичного ему. Кроме того, может быть использована любая система, пригодная для определения NO₃.

NO₃ присутствует в сыворотках и тому подобном материале, полученном от нормальных людей или пациентов после пересадки органа, но без начала хронического отторжения, однако количество NO₃, присутствующей в сыворотке и тому подобном материале, у пациентов с хроническим отторжением после пересадки органа достоверно повышено. Поэтому путем предварительного задания соответствующего значения граничного уровня можно с высокой точностью определить, есть у этих пациентов хроническое отторжение или нет. Граничный уровень варьирует в зависимости от типа используемой пробы и типа пересаженного органа. Граничный уровень следует определять соответствующим образом, в зависимости от типов, но для проб сыворотки от пациентов после пересадки почки, предпочтительно, граничный уровень должен быть предварительно задан в диапазоне от 50 до 120 мкМ (концентрация NO₃ в сыворотке).

ММП-2 выделяется из клеток в форме предшественника, про-ММП-2, а затем предшественник конвертируется в ММП-2. В соответствии с настоящим изобретением термин "предшественник ММП-2" означает вещество, которое может потенциально превращаться в ММП-2, называемое в данном описании про-ММП-2. Про-ММП-2 может образовывать комплекс с ингибиторами, такими, как ТИМП (тканевой ингибитор металлопротеиназы)-2 и ТИМП-1, и предшественник по настоящему изобретению включает про-ММП-2, представленный в форме таких комплексов. Про-ММП-2 может быть представлен в любой форме, без специфических ограничений.

Способ анализа (количественное определение и т.д.) ММП-2 или предшественника в пробе известен, и, в соответствии с настоящим изобретением, ММП-2 или предшественник могут быть проанализированы (количественно определены) известными способами. Например, способ выполняется путем анализа ММП-2 или предшественника в системе, которая специфична для ММП-2 или ее предшественника, путем определения концентрации ММП-2 или ее предшественника как концентрации белка или уровня активности фермента. Без каких-либо ограничений, любой способ, специфичный для ММП-2 или предшественника, может быть использован для определения концентрации ММП-2 или предшественника и тому подобного, но способ, высоко чувствительный, с хорошей воспроизводимостью, может быть предпочтительным.

Более конкретно, способ для определения концентрации белка включает иммунологический способ, использующий антитела со специфичностью к ММП-2 или предшественнику. Кроме того, способ для определения уровня активности фермента включает биохимический способ, использующий субстрат с высокой специфичностью к ММП-2.

В соответствии с биохимическим способом анализа активности фермента, субстраты с высокой селективностью к ММП-2 включают субстраты, с трудом гидролизуемые ферментами, содержащимися в пробах, например, такими ферментами, как сывороточная протеиназа, пептидаза и зстераза, за исключением ММП-2, и легко гидролизуемые ММП-2, и субстраты включают, например, желатин, коллаген или синтетические субстраты с этими характеристическими участками структуры, и предпочтительные субстраты включают амид (7-метоксикумарин-4-ил) -ацетил-L-пролил- L-лейцил-глицил-L-лейцил-L- [N-(2,4-динитрофенил)-L-2,3-диаминопропионитрил] -L-аланил-L-аргинина (МКА) или N-ацетил-L-пролил-L-лейцил-глицил-L-лейцил-L-лейцил-глицина этиловый эфир.

Что касается способа анализа ферментативной активности ММП-2, продукты гидролиза субстрата ММП-2 могут быть проанализированы непосредственно, или активность фермента может быть проанализирована непрямым способом в комбинации с системой, дающей возможность специфического анализа любого из продуктов гидролиза с высокой чувствительностью.

Анализ (количественное определение и т.д.) предшественника ММП-2 может быть выполнен путем деградации предшественника ММП-2 известными способами (например, обработкой трипсином или 4-аминофенилацетатом ртути) с образованием ММП-2 и анализом ферментативной активности образовавшейся ММП-2.

Могут быть использованы все способы, известные как способы иммунологического анализа. Могут быть применены обычные способы иммунологического анализа с использованием твердых фаз, включая анализ по способу "сандвича", а также конкурентный анализ и анализ с ингибированием связывания. Специфические способы включают способы с использованием аналитических систем, в которых субстраты иммобилизованы на твердых носителях вместо антител и используется потенциал связывания между ферментами и субстратами, или способы прямого определения связывания ММП-2 или предшественника с иммобилизованными антителами при помощи поверхностного плазмона без использования меченых антител. Сущность этих способов более подробно раскрыта в выложенной японской заявке 60-2187, японской патентной публикации 7-34014 и выложенных японских заявках 6-213888 и 7-159402. Кроме того, также можно включить способы, использующие реакцию агглютинации, или неферометрию с использованием латекса и клеток крови, и способы вестерн-блоттинга. Любой из этих способов с различными принципами исследования может быть использован для анализа. Обычно предпочтителен анализ по "способу сандвича" при помощи антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях, и меченых антител.

Антитела для использования в иммунологическом анализе могут удовлетворительно быть поликлональными антителами или моноклональными антителами. Любой вид животных может быть пригоден как источник антител. Если используются два типа антител, как в анализе по "способу сандвича", удовлетворительной является комбинация иммобилизованного антитела и меченого антитела с образованием комплекса в виде "сандвича", даже если иммобилизованное антитело и меченое антитело относятся к одному и тому же виду антител или являются различными видами антител. В качестве вещества для мечения антител могут быть использованы радиоактивные вещества, ферменты, флуоресцирующие вещества и биотин.

В соответствии со способом определения хронического отторжения по настоящему изобретению измеренный уровень ММП-2 или предшественника (концентрация белка или уровень активности фермента и тому подобное) сам по себе или его возрастание могут быть непосредственно использованы для определения наличия хронического отторжения, однако, в качестве индекса ММП-2 или предшественника для выявления используется относительный уровень, определяемый путем расчета отношения их к другим маркерам. Например, если в качестве пробы используется моча, используется способ коррекции на основе концентрации креатинина в моче (способ, характеризующийся делением концентрации ММП-2 или предшественника на концентрацию креатинина в моче). Для применения на практике способов по данному изобретению, предпочтительно, предварительно задается граничный уровень в диапазоне, который для, по крайней мере, 90% или более пациентов с близкой к норме функцией органа после пересадки считается нормальным. Также можно периодически анализировать содержание NО₃ или ММП-2 или ее предшественника у пациентов после пересадки органа и определять начало хронического отторжения на основе измеренного уровня или повышения индекса.

В соответствии с настоящим изобретением, как показано в нижеследующих примерах, также может быть выполнен способ выявления наличия или отсутствия полос, обусловленных разрушением субстратов, таких, как желатин, путем электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем субстраты, такие, как желатин, без количественного определения ММП-2 или предшественника в пробах.

Настоящее изобретение далее будет описано более специфически со ссылкой на нижеследующие примеры, но изобретение не ограничивается только этими примерами.

Пример 1

В пробах сыворотки от пациентов с хроническим отторжением после пересадки почки, диагностированным при помощи биопсии почки (А), пациентов с диагнозом отсутствия начала хронического отторжения по данным биопсии почки и подобным, функция почек которых была близка к нормальной (уровни креатинина в сыворотке 1,2 мг/дл и менее) (В) и нормальных субъектов (С), определяли количество NО₃ при помощи автоматического анализатора азота в форме нитратов и азота в форме нитритов (TCI-NOX1000, Tokyo Chemical Industry, Co.). Соответственно, концентрация NО₃ в сыворотке пациентов с диагностированным хроническим отторжением после пересадки почки была достоверно выше, чем концентрация NО₃ в сыворотке у пациентов с нормальной функцией почек после пересадки почки и концентрация NО₃ в сыворотке у нормальных людей, как показано в таблице 1. Показано, что уровень NО₃ в крови служит эффективным маркером хронического отторжения.

Пример 2 (Энзимограмма; биохимическое обнаружение ММП-2)

К пробе мочи добавляли равный объем 0,5 М Трис буфера (рН 6,8), содержащего 8% ДСН и 40% глицерина, с последующим тщательным перемешиванием. После приготовления 8% полиакриламидного геля, содержащего 1 мг/мл желатина, образовавшуюся смесь подвергали в нем электрофорезу. После электрофореза гель дважды промывали 10 мМ Трис буфером (рН 8,0), содержащим 2,5% Тритона Х-100, при встряхивании при температуре окружающей среды в течение 30 мин. Затем буфер заменяли 50 мМ Трис буфером (рН 8,0), содержащим 0,5 мМ хлорида кальция и 10 мкМ хлорида цинка, для инкубации при 37^oС в течение 16 ч. Гель окрашивали 1% кумасси синим R-250, 5% уксусной кислотой и 10% метанолом в течение 30 мин с последующим обесцвечиванием 5% уксусной кислотой и 10% метанолом.

В положении желатина, разрушенного ферментом (ММП-2), наблюдалась прозрачная полоса на синем фоне.

Пример 3

В пробах мочи от пациентов с пересадкой почки, произведенной от года и более тому назад, в анамнезе и с диагностированным на основе биопсии почки и уровне креатинина в сыворотке (2,0 мг/дл или более) хроническим отторжением и от пациентов со сроком до года после пересадки почки и с диагностированным при помощи биопсии почки и тому подобного отсутствием начала хронического отторжения, у которых функция почки была близка к нормальной (контрольная группа) анализировали активность ММП-2 в соответствии со способом по примеру 2. Соответственно, ММП-2 с молекулярным весом 70 кД была обнаружена в 8 из 10 проб мочи от пациентов с хроническим отторжением, но ММП-2 была обнаружена только в 1 из 14 проб мочи от контрольной группы.

Это показывает, что возрастание концентрации ММП-2 служит эффективным маркером хронического отторжения.

Пример 4 (Анализ концентрации предшественника ММП-2 в моче путем иммунологического анализа)

Был использован набор для анализа ММП-2 в сыворотке с двумя типами моноклональных антител, распознающих различные участки молекулы предшественника ММП-2 (для обнаружения про-ММП-2 и комплекса про-ММП-2 с ТИМП-2, но не для обнаружения ММП-2) (произведенный Fuji Farmaceutical Industry, Co.). Поскольку концентрация про-ММП-2 в моче меньше, чем в сыворотке, условия для процедур с сывороткой были модифицированы для анализа предшественника в моче. Более конкретно, 150 мкл мочи или стандартного раствора, прилагаемого к набору, помещали в тестовую пробирку, а затем добавляли 30 мМ раствора фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 1% альбумина сыворотки быка и 10 мМ ЭДТА, с последующим тщательным перемешиванием, и к образующейся смеси добавляли связывающую антитело основу для реакции при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционный раствор удаляли путем отсасывания через аспиратор, затем добавляли 300 мкл раствора меченого антитела, прилагающегося к набору, для реакции при комнатной температуре в течение 1 ч. После реакции раствор вновь удаляли путем отсасывания, основу переносили в другую тестовую пробирку, затем добавляли 300 мкл красящего раствора для реакции при температуре внешней среды в течение 30 мин. Реакцию останавливали путем добавления 1500 мкл тормозящего раствора, прилагаемого к набору, к образующемуся реакционному раствору. Абсорбцию реакционного раствора измеряли на длине волны 492 нм, при использовании дистиллированной воды в качестве контроля, а затем концентрацию про-ММП-2 в пробе мочи определяли при помощи калибровочной кривой, полученной на основе абсорбции стандартного раствора. Одновременно традиционным способом анализировали концентрацию креатинина, чтобы рассчитать концентрацию про-ММП-2 в моче после коррекции по креатинину.

Пример 5

В пробах мочи от 8 пациентов с диагнозом хронического отторжения после пересадки почки, произведенной год и более тому назад, поставленного на основе биопсии почки и концентрации креатинина в сыворотке (группа начала отторжения), и 36 пациентов со сроком до года после пересадки почки и с диагнозом отсутствия начала хронического отторжения при помощи биопсии почки и тому подобного, функция почек у которых была близка к нормальной (с концентрацией креатинина 1,5 мг/дл или менее), (контрольная группа), определяли концентрацию про-ММП-2 при помощи способа по примеру 4. Гистограммы с коррекцией и без коррекции по креатинину показаны на фиг. 1 и 2. При предварительном задании граничного уровня 1 нг/мл в случае отсутствия коррекции по креатинину 92% контрольной группы были признаны отрицательными, тогда как 100% пациентов с диагностированным хроническим отторжением после трансплантации почки было признано положительными. При предварительном задании граничного уровня 5 мкг/г креатинина в случае коррекции по креатинину 95% контрольной группы было признано отрицательными, тогда как 100% пациентов с диагностированным хроническим отторжением после пересадки почки было признано положительными. При предварительном задании граничного уровня 1 мкг/г креатинина, 89% контрольной группы все еще признавались отрицательными.

Пример 6

В пробах мочи от 2 пациентов с пересадкой почки до начала хронического отторжения, вызванного пересадкой почки, и после его начала анализировали концентрацию про-ММП-2 (уровень, скорректированный по креатинину) в соответствии со способом по примеру 4. Результаты показаны в таблице 2. Концентрация про-ММП-2 значительно увеличивалась после начала отторжения, что показывает, что увеличение концентрации про-ММП-2 эффективно при выявлении начала хронического отторжения после пересадки почки.

Промышленная применимость

При применении на практике способа по данному изобретению увеличение концентрации NО₃, ММП-2 или ее предшественника в жидкостях организма (пробы), таких, как сыворотка и моча, может позволить выявление хронического отторжения на его ранней стадии.