способ получения противоопухолевого средства

Формула изобретения

1. Способ получения противоопухолевого средства на основе тетрахлороплатината калия, отличающийся тем, что раствором тетрахлороплатината калия обрабатывают водный раствор, содержащий гуминовые вещества, при этом обработку проводят под действием ультразвука с мощностью излучения 40 Вт/см², с частотой 22 кГц в течение 4-8 мин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гуминовые вещества получают обработкой гумифицированного материала щелочными растворами при нормальных условиях.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что гумифицированный материал обрабатывают щелочным раствором в присутствии мочевины и комплексона.

4. Способ по п. 2 или 3, отличающийся тем, что в качестве гумифицированного материала используют торф из верховых или переходных болот или сапропель, или компосты, или гумусовые горизонты разных типов почв.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что обработку тетрахлороплатинатом проводят при температуре 405^oС.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гуминовые вещества получают из окисленного древесного лигнина.

7. Способ по п. 7, отличающийся тем, что гуминовые вещества получают окислением древесного лигнина в щелочной среде кислородсодержащим газом при температуре 17020^oС, давлении 1,9-2,5 МПа в течение 1-3 ч и последующими охлаждением реакционной массы, отделением твердой фазы от раствора и подкислением последнего до рН 2-3.

8. Способ по п. 8, отличающийся тем, что перед окислением древесного лигнина проводят обработку реакционной массы под действием ультразвука с мощностью излучения 4-6 Вт/см², с частотой 22 кГц в течение 6-10 мин.

9. Способ по п. 8 или 9, отличающийся тем, что обработку тетрахлороплатинатом проводят при температуре 405^oС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области получения лекарственных препаратов, в частности к получению противоопухолевых средств, представляющих собой комплексные соединения металлов, а конкретно к способу получения противоопухолевого средства, содержащего комплексоны платины.

Противоопухолевые препараты, содержащие комплексоны платины, вызывая нарушение генетического аппарата опухолевых клеток, отличаются сильным противоопухолевым действием, вследствие чего привлекают к себе внимание специалистов.

Платиновые препараты обладают широким спектром противоопухолевого действия. Наиболее изученный препарат этого класса противоопухолевых средств - цис-дихлородиамминплатина (ДДП) - активен против опухолей различного генезиса: спонтанных, перевивных, индуцированными вирусами и химическими канцерогенами. Основной недостаток ДДП его высокая токсичность. Испытания на животных и в клинике показали, что он действует в основном на почки, костный мозг и желудочно-кишечный тракт (Биологические аспекты координационной химии, ред. К.Б. Яцимирского, Киев, "Наукова думка". 1979 г., стр. 149-180).

Другое известное противоопухолевое средство, так называемый оксоплатин, содержит комплексное соединение четырехвалентной платины, цис-диамминодихлородигидроксиплатину, и обладает активностью при пероральном приеме, отсутствием нефротоксичности, торможением роста метастазов, высокой широтой терапевтического действия (пат. РФ 2086261, кл. А 61 К 45/05, опубл. Б.И. 22, 1997 г.).

Известный противоопухолевый препарат платин, относящийся к группе комплексных соединений двухвалентной платины, эффективен при лечении злокачественных опухолей яичка и яичников, рака молочной железы, диссемилированной меланомы. Платин получают из платинохористоводородной кислоты и гидроксиламина в три стадии путем образования промежуточного хлорплатинита щелочного металла, его взаимодействия с гидроксиламином в присутствии солей щелочного металла при комнатной температуре в слабокислой водной среде. Продукт очищают перекристаллизацией из разбавленной соляной кислоты. ("Платин", рекламный листок, НПО "Медбиоэкономика", заказ 2178).

Известен также способ получения противоопухолевого средства (авт. св. СССР 1701323, А 61 К 45/05, опубл. Б.И. 48, 1991 г.), в котором водный, содержащий ДНК (высокомолекулярное природное органическое соединение) и хлорид натрия, раствор смешивают с водным раствором тетрахлорплатината калия. Перед смешением в последний добавляют хлорид аммония, хлорид калия и ацетат калия, при этом каждый раствор нагревают до температуры плавления ДНК. В раствор, содержащий ДНК и хлорид натрия, добавляют цитрат натрия. Способ позволяет получить средство, сочетающее высокую противоопухолевую активность с выраженным иммуномодулирующим действием.

Исследования различных комплексов платины на животных и клинических испытаний ДДП и некоторых его аналогов обнаружили разнообразие в биологических свойствах комплексов платины: противоопухолевой активности и побочного действия. Анализ имеющихся данных свидетельствует, что незначительные изменения в молекулярной структуре комплекса могут вызывать радикальные их изменения в биологической активности. Существование связи между структурой комплексного соединения и его противоопухолевой активностью стимулирует поиск новых, содержащих платину препаратов - высокоактивных и низкотоксичных.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего получать из доступного природного сырья новые эффективные средства, содержащие платину и обладающие противоопухолевой активностью.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения противоопухолевого средства на основе тетрахлорплатината калия. В соответствии с изобретением раствором тетрахлорплатината калия обрабатывают водный раствор, содержащий гуминовые вещества, при этом обработку проводят под действием ультразвука с мощностью излучения 40 Вт/см² с частотой 22 кГц в течение 4-8 мин. Гуминовые вещества могут быть получены обработков гумифицированного материала при нормальных условиях растворами щелочей, в которые могут быть добавлены мочевина и различные комплексоны, например трилон Б. В результате получается смесь солей гумусовых кислот, которая в дальнейшем и называется гуминовыми веществами.

В качестве гумифицированного материала могут быть использованы сапропели, гумусовые горизонты из различных типов почв, компосты, торф из верховых и переходных болот.

Гуминовые вещества также могут быть получены окислением древесного лигнина, при этом древесный лигнин в виде водно-щелочной суспензии окисляют кислородсодержащим газом при температуре 17020^oС и давлении 1,9-2,5 МПа в течение 1-3 ч. После охлаждения реакционный массы отделяют твердую фазу из раствора, представляющую собой неокисленные частицы исходного гумифицированного материала. В растворе остаются соли гумусовых кислот, т.е. гуминовые вещества. Затем из подкисленного раствора гуминовых веществ выделяют гуминовые кислоты, которые после нейтрализации обрабатывают тетрахлорплатинатом калия.

Обработку тетрахлорплатинатом калия целесообразно проводить при температуре 405^oС.

Возможна обработка тетрахлорплатинатом калия ультразвуком при мощности излучения 40,00,5 Вт, частоте звуковых колебаний 22,00,5 кГц в течение 1-25 мин. Выбор времени обработки ультразвуком зависит от состава гуминовых кислот и выбирается экспериментально.

Целесообразно водно-щелочную суспензию, содержащую древесный лигнин, перед окислением обрабатывать ультразвуком с мощностью излучения 4-6 Вт/см² и частотой 22 кГц в течение 6-10 мин. В этом случае увеличивается количество активных парамагнитных центров в веществе, что ведет к еще большему увеличению биологической активности конечного продукта.

Лигнин, входящий в состав древесины, является ценным лекарственным сырьем, запасы которого практически не ограничены. Лечебные свойства лигнина всесторонне рассмотрены в монографии (Леванова В.П., Лечебный лигнин. Под ред. Н. А. Белякова.: Сп(б) 1992 г.. стр. 136). Хотя лигнин и препараты на его основе в медицине до настоящего времени в основном рассматривались в качестве сорбентов, многие исследователи помимо сорбционных свойств отмечали антисептические, гипохолестеринемические и др. свойства.

В качестве древесного лигнина, продукта кислотного гидролиза древесины, могут быть использованы энтеросорбенты на основе лигнина, такие как "Полифепан", "Лигносорб" и т.д.

"Полифепан" - неспецифический энтеросорбент (Рег. 80/1211/3) представляет собой порошок коричневого цвета без запаха и вкуса, влажностью 65%, состоит в основном из лигнина и содержит не более 20% остаточных полисахаридов (гидроцеллюлозы).

"Лигносорб" (паста полифепана) ВФС 42-2203-93.

Все используемые в качестве исходного сырья вещества разрешены для приема внутрь организма.

Специальные исследования показали, что при окислении лигнина в условиях предлагаемого способа не происходит образования вредных для организма веществ, таких как полиароматические углеводороды, нитрозоамины и полихлорированные дицикло-п-диоксины.

Полученные продукты представляют собой концентрированные жидкости темно-коричневого цвета, содержащие от 0,05 до 1,00 % платины со специфическим вкусом и запахом.

Общеизвестно, что процесс гумификации (процесс образования гуминовых веществ) является общепланетарным и получаемые в результате гуминовые вещества (иначе гумусовые кислоты, представляющие собой смесь гуминовых кислот и фульвокислот) характеризуются сходными спектрами в инфракрасной области независимо от того, каким способом они получены.

Противоопухолевая активность предлагаемого средства обусловлена его природой. Органические соединения, входящие в его состав, характеризуются большим количеством ковалентно-активных связей. Вследствие чего оно реагирует с нуклеофильными центрами белковых молекул. В этом случае нарушается трансляция и транскрипция нуклеиновых кислот. Наличие ионов платины значительно усиливает антиопухолевое действие средства.

Механизм противоопухолевого действия предлагаемого вещества в настоящее время изучается. Авторы предполагают, что возможным механизмом противоопухолевого действия является его воздействие на гипоталамус и щитовидную железу и как следствие этого активация эндорфинной системы.

Противоопухолевая активность полученного продукта оценивалась по его влиянию на рост опухолей у крупного рогатого скота (коровы черно-пестрой породы). Последнее обусловлено тем, что обмен веществ (метаболизм) у крупного рогатого скота аналогичен по показателям обмену веществ человека и дает репрезентативные результаты.

Нижеследующие примеры поясняют предлагаемый способ получения противоопухолевого средства и иллюстрируют его противоопухолевую активность.

При проведении экспериментов, описанных в примерах 2-6, приведенных ниже, обработку гумифицированных материалов (сапропеля, торфа, почвы) водно-щелочным раствором проводили при нормальных условиях, т.е. при температуре 20^oС и давлении 760 мм рт. ст. В результате получали суспензию, содержащую гуминовые вещества в растворенном состоянии и нерастворимый остаток.

Тетрахлорплатинат калия для лучшего взаимодействия с гуминовыми веществами использовали в виде водного раствора.

ПРИМЕР 1

Исходную водно-щелочную суспензию лигнина (марки "Полифепан", рег. 80/1211/3) - неспецифического энтерального сорбента - окисляли кислородом воздуха.

Состав суспензии

Содержание полифепана - 1 кг

Содержание щелочи (гидроксид натрия) - 100 г

Вода - 8,1 кг

Окисление проводили в реакторе с механическим перемешиванием при температуре 1605^oС при давлении 2,5 МПа в течение 1 ч. Расход воздуха составлял 5 л/мин.

Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры и от раствора фильтрованием отделяют осадок. Фильтрат, представляющий собой щелочной раствор, содержащий гуминовые вещества, подкисляют серной кислотой до рН 2-3. Фильтрованием выделяют осадок в виде геля гуминовых кислот, промывают дистиллированной водой, а затем водно-спиртовой смесью до установления рН 6,0-6,5 и высушивают при 105^oС до однородной массы. Полученные гуминовые кислоты обрабатывают 5%-ным раствором аммиака из расчета 1 г гуминовых кислот на 80 мл указанного раствора, термостатируют в кипящей водяной бане до удаления избытка аммиака, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 30 об.% дистиллированной воды. В полученный раствор, представляющий собой соли гуминовых кислот, относящихся к гуминовым веществам, вносят, из расчета на 1 г солей гуминовых кислот, по 0,27 мас.% тетрахлорплатината калия и создают процесс развитой акустической кавитации под действием ультразвука с мощностью излучения 40 Вт/см² и частотой 22 кГц в течение 4 мин. Далее объем раствора доводят водой до 100 мл.

Полученный продукт представляет собой водный раствор солей гуминовых кислот, относящихся к гуминовым веществам, и комплексных соединений платины. Этот раствор использовали для испытаний на животных для определения его противоопухолевой активности. Результаты испытаний приведены ниже в примере 7. Для идентификации полученного вещества указанный выше раствор подвергали анализу.

Элементный состав сухого выделенного продукта в пересчете на органическое вещество, мас. %: С 54%, Н 12%, N 2%, (S+0) 32% (по разности). Вещество разлагается без плавления, начиная с 168^oС.

Результаты изучения инфракрасных Фурье-спектров показывают, что в полученном продукте присутствуют близкие по интенсивности полосы 1700 см^-1 и 1600 см^-1, характерные для карбоксильных групп, интенсивная полоса в области 1200 см^-1 , широкая по структуре полоса с локальными максимумами 3400, 3200, 3100 и 2600 см^-1, а также полосы 2926, 2815, 1460 см^-1 и полосы 2955 и 2870 см^-1, характерные для метиленовых групп.

Полученный продукт обладает парамагнетизмом. В продукте наблюдаются симметричные сигналы ЭПР с q-фактором 2,0000,001, близким к значению для свободного электрона (q=2,00) и шириной Н=6,10,1 эрстед. Концентрация ПМЦ находится на уровне (2,50,4)х10¹⁸ на один грамм,

Органическая часть продукта содержит 2,9-3,4 мг-экв СООН-групп в 1 г продукта и 6,0-6,4 мг-экв фенольных гидроксилов в 1 г продукта.

ПРИМЕР 2

Озерный сапропель с содержанием органического вещества 32% на сухое вещество подвергали щелочной обработке 0,1 М раствором едкого кали.

Для этого к 200 г озерного сапропеля с влажностью 95% добавляли 5,6 г едкого кали и доводили общий объем смеси до 1 л, после чего смесь взбалтывали в течение 5 мин и оставляли на 6 ч. Процесс осуществляли при нормальных условиях. По истечении указанного срока фильтрованием отделяли осадок. Фильтрат, представляющий собой щелочной раствор, содержащий гуминовые вещества, подкисляли ортофосфорной кислотой до рН 1-2. Выпавший осадок (гель гуминовых кислот) отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой, а затем водно-спиртовой смесью до установления рН 6,0-6,5 и высушивают при 105^oС до постоянной массы. Полученные гуминовые кислоты обрабатывают 5%-ным водным раствором аммиака из расчета 1 г гуминовых кислот на 80 мл указанного раствора, термостатируют в кипящей водяной бане до удаления избытка аммиака, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 30 об.% дистиллированной воды. В полученный раствор, представляющий собой раствор солей гуминовых кислот, относящихся к гуминовым веществам, вносят, из расчета на 1 г гуминовых кислот, по 0,2 мас. % тетрахлорплатината калия и создают процесс развитой акустической кавитации под действием ультразвука с мощностью излучения 40 Вт/см² и частотой 22 кГц в течение 8 мин. Далее объем раствора доводят водой до 100 мл.

Элементный состав сухого выделенного продукта в пересчете на органическое вещество, мас.%: С 60%, Н 6%, N 2%, (S+O) 32% (по разности). Вещество разлагается без плавления, начиная с 168^oС.

Результаты изучения инфракрасных Фурье-спектров показывают, что в полученном продукте присутствуют близкие по интенсивности полосы 1700 см^-1 и 1600 см^-1, характерные для карбоксильных групп, интенсивная полоса в области 1200 см^-1, широкая по структуре полоса с локальными максимумами 3400, 3200, 3100 и 2600 см^-1, а также полосы 2976, 2815, 1460 см^-1 и полосы 2955 и 2870 см^-1, характерные для метиленовых групп.

Полученный продукт обладает парамагнетизмом. В продукте наблюдаются симметричные сигналы ЭПР с q-фактором 2,0000,001, близким к значению для свободного электрона (q=2,00) и шириной Н=6,10,1 эрстед. Концентрация ПМЦ находится на уровне (2,50,4)10¹⁸ на один грамм.

Органическая часть продукта содержит 3,0-3,6 мг-экв СООН-групп в 1 г полученного продукта и 6,0-6,5 мг-экв фенольных гидроксилов в 1 г.

ПРИМЕР 3

Проводили аналогично примеру 2, при этом вермикомпост с содержанием органического вещества в количестве 23% на сухое вещество подвергли щелочной обработке 0,1 М раствора едкого натра. 10 г вермикомпоста (в пересчете на абсолютно сухую навеску) заливали 1 л 0,1 М раствора едкого натра, смесь взбалтывали в течение 1 ч, после чего фильтрованием отделяли осадок. Процесс осуществляли при нормальных условиях. Фильтрат, представляющий собой раствор, содержащий гуминовые вещества, подкисляли серной кислотой до рН 1-2 и выделяли гуминовые кислоты. Далее обработку производили аналогично тому, как показано в примерах 1 и 2, за исключением того, что в раствор солей гуминовых кислот вносили по 0,17 мас.% тетрахлорплатината калия из расчета на 1 г гуминовых кислот и нагревали до 40^oС.

Элементный состав сухого выделенного продукта в пересчете на органическое вещество, мас.%: С 57%, Н 7%, N 2%, (O+S) 34% (по разности).

Органическая часть продукта содержала 3,2-3,8 мг-экв СООН групп в 1 г и 6,2 -6,7 мг-экв фенольных гидроксилов в 1 г.

Исследования инфракрасных спектров и определение содержания СООН-групп и фенольных гидроксилов показали, что получены гуминовые вещества.

ПРИМЕР 4

Проводили аналогично примеру 2, при этом торф из верхового болота с содержанием органического вещества 73% на сухое вещество подвергался щелочной обработке 0,2 М раствором едкого кали. 5 г сухого торфа заливали 0,2 М раствором едкого кали, а затем оставляли на 6 ч, после чего фильтрованием отделяли осадок. Процесс осуществляли при нормальных условиях. Фильтрат, представляющий собой гуминовые вещества, подкисляли до рН 2-3 ортофосфорной кислотой. Далее обработку производили аналогично тому, как показано в примерах 1 и 2, за исключением того, что обработку солей гуминовых кислот тетрахлорплатинатом калия вели при 45^oС.

Элементный состав сухого выделенного продукта в расчете на органическое вещество, мас.% С 51%, Н 12%, N 2%, (O+S) 35% (по разности).

Органическая часть продукта содержит 3,4-4,0 мг-экв СООН-групп в 1 г и 6,3-6,9 мг-экв фенольных гидроксилов в 1 г.

Исследования инфракрасных спектров и определение содержания СООН-групп и фенольных гидроксилов показали, что получены гуминовые вещества.

ПРИМЕР 5

Проводили аналогично примеру 2, при этом к 500 мл озерного сапропеля с влажностью 90% и содержанием сухого остатка 31% добавляли 500 мл дистиллированной воды, 5,6 г едкого кали, 6 г мочевины и 37 г трилона Б. После перемешивания в течение 1 ч. Процесс осуществляли при нормальных условиях. Осадок отделяли фильтрованием. Фильтрат, представляющий собой раствор, содержащий гуминовые вещества, подкисляли серной кислотой до рН 1-2. Далее обработку производили аналогично тому, как показано в примерах 1 и 2, за исключением того, что в раствор гуминовых веществ вносили по 0,17 мас.% тетрахлорплатината калия на 1 г гуминовых кислот и нагревали до 40^oС.

Элементный состав сухого выделенного продукта в пересчете на органическое вещество, мас.%: С 52%, Н 16%, N 2%, (O+S) 30% (по разности).

Органическая часть продукта содержит 3,0-3,4 мг-экв СООН-групп в 1 г и 6,0-6,4 мг-экв фенольных гидроксилов в 1 г.

Исследования инфракрасных спектров и определение содержания СООН-групп и фенольных гидроксилов показали, что получены гуминовые вещества.

ПРИМЕР 6

Проводили аналогично примеру 2, при этом к 100 г гумусового горизонта почв (горизонт А из обыкновенного чернозема) с содержанием общего углерода 7% добавляли 500 мл дистиллированной воды, а затем 1,12 г едкого кали, 6 г мочевины и 7,4 г трилона Б.

После перемешивания в течение 10 мин смесь выдерживали при нормальных условиях 6 ч и осадок отделяли фильтрованием. Фильтрат, представляющий собой раствор гуминовых веществ, подкисляли серной кислотой до рН 1-2. Далее обработку производили аналогично тому, как показано в примерах 1 и 2, за исключением того, что в раствор солей гуминовых кислот вносили по 0,2 мас.% тетрахлорплатината калия из расчета на 1 г гуминовых кислот и нагревали до 40^oС.

Элементный состав сухого выделенного продукта в пересчете на органическое вещество, мас.%: С 56%, Н 8%, N 3%, (O+S) 33% (по разности).

Органическая часть продукта содержит 3,4-4,0 мг-экв СООН-групп в 1 г и 6,4 -7,0 мг-экв фенольных гидроксилов в 1 г.

Исследования инфракрасных спектров и определение содержания СООН-групп и фенольных гидроксилов показали, что получены гуминовые вещества.

ПРИМЕР 7

Препарат, полученный по примеру 1, испытывался для неспецифической иммунотерапии лейкоза крупного рогатого скота.

В опыте использовались коровы черно-пестрой породы в возрасте 5-7 лет одного из предприятий Ленинградской области. Все животные находились в стандартных условиях беспривязного содержания. Рацион и уход за животными был аналогичен общему стаду как в опыте, так и в контроле.

Препарат хранился в стеклянных флаконах емкостью 10, 20, 25, 30, 50, 100, 200 мл. При одновременной обработке большого количества крупного рогатого скота брались флаконы с препаратом до 500 мл. Флаконы герметично закрывались стерильными завинчивающимися пробками из нейтрального пластика или резиновыми пробками. Стерилизация препарата проводилась автоклавированием. Хранили препарат в защищенном от света месте. Срок хранения зависит от температуры окружающей среды, при температуре -5^oС...-10^oС составляет до 2-3 лет. Перед использованием ампулу с препаратом или флакон выдерживали в теплой воде с температурой 37^oС в течение 5-10 с. Затем с соблюдением стерильности ампулы вскрывали и набирали в шприц для инъекций.

Для неспецифической иммунотерапии крупного рогатого скота от лейкоза были выделены три группы коров по 12 коров каждая.

Первая группа (Опыт): 12 коров черно-пестрой породы с клинической формой лейкоза, положительно реагирующие по РИД-тесту и гематологическим исследованиям.

Вторая группа (Положительный контроль) 12 коров с клинической формой лейкоза. Все животные положительно реагировали по РИД-тесту и данным гематологических исследований. Данная группа не подвергалась неспецифической иммунотерапии.

Третья группа (Отрицательный контроль). 12 коров черно-пестрой породы клинически здоровых, отрицательно реагирующих по РИД-тесту и гематологическим исследованиям.

Все три группы животных находились на одном скотном дворе на беспривязном содержании с одинаковыми условиями кормления и ухода. В течение эксперимента животные в опыте и контроле проверялись по трем тестам:

установление наличия клинических признаков заболевания;

серологическая диагностика с помощью РИД-теста;

гематологическое обследование периферической крови у всех животных.

Клинический осмотр животных проводили в присутствии ветеринарных врачей хозяйства и сотрудников Санкт-Петербургского ветеринарного института.

У всех животных к опытной группе и в положительном контроле наблюдали увеличение объема поверхностных лимфатических узлов: паховых, надвыменных и предлопаточных. Особенно были увеличены паховые и надвыменные лимфоузлы, которые при пальпации были равномерно увеличены. Признаков болезненности при глубокой пальпации не наблюдали. При перкуссии селезенки отмечали расширение ее границ.

Основой для наблюдения за развитием лейкозного процесса была взята клиническая схема лейкозкого процесса по Рихе, 1975 г. По этой схеме при развитии метастазов в лимфатических узлах наступают пролиферативные гиперпластические процессы. Лимфатические узлы при этом увеличиваются в объеме, что хорошо заметно при клиническом обследовании. Этот симптом является основным клиническим признаком проявления заболевания. Поэтому процесс увеличения или уменьшения объема лимфатических узлов можно считать соответственно как ухудшение или улучшение характера заболевания лейкозом.

Неспецифическую иммунотерапию лейкоза проводили в несколько циклов по следующей схеме.

Как правило, испытуемый препарат вводили внутримышечно через каждые 6 суток по 20 мл в разведении 1:100 в течение 36 суток. Затем следовал перерыв 35-40 дней.

В процессе лечения определялась величина паховых и надвыменных лимфатических узлов каждой коровы. Замер величины лимфатических узлов показал, что после проведения 1-го цикла активной неспецифической иммунотерапии у всех животных наблюдали уменьшение объема лимфатических узлов до нормальных размеров. В параллельном положительном опыте у 12 коров с аналогичной клинической формой лейкоза увеличенные в объеме лимфатические узлы оставались без изменения. Через 35-40 дней после окончания первого цикла активной неспецифической иммунотеропии у отдельных животных первой опытной группы вновь наблюдалось увеличение лимфатических узлов.

Всем животным опытной группы через 30-35 дней был проведен 2-й повторный цикл активной неспецифической иммунотерапии: в течение 36 дней каждое животное через каждые 6 дней получало 20 мл препарата в разведении 1:100. После второго курса у всех животных опытной группы наступила стойкая ремиссия. У всех животных исчезли клинические симптомы, улучшилось общее состояние: коровы охотно поддали корм, увеличился надой. Отмечены характерные клинические признаки наступления ремиссии лейкоза. Животные стали активными, развился блеск кожных покровов, не стало исхудания.

При контрольном анализе крови на исследование по РИД-тесту у 60% животных наблюдался отрицательный результат.