штамм бактерий bacillus subtilis, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д, используемый для получения пробиотического препарата "Субтилис", предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотического препарата, применяемого в ветеринарии при лечении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.

Известен штамм Bacillus subtilis 534 - продуцент пробиотика "Споро-бактерин", который предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечного тракта, дисбактериозов. SU 1708350, кл. А 61 К 35/66.

Недостатками являются небольшие сроки хранения, т.к. содержит живые бактерии, которые не могут длительное время сохранять свои свойства, низкая чистота препарата, что имеет узкую область применения - как кормовая добавка для животных. Штамм также чувствителен к антибиотикам за исключением полимиксина, что ограничивает сферу применения препарата.

Известен штамм Bacillus subtilis 3Н (ГИСК 248), несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения пробиотического препарата "Бактиспорин", который применяют совместно с антибиотиками для лечения и профилактики дисбактериоза, ферментной недостаточности органов пищеварения, гнойных инфекций, пищевой аллергии. RU 2067616 С1, кл. А 61 К 35/74, 10,10.1996.

Известен штамм Bacillus subtilis TPAXC-KM-117, проявляющий ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладающий множественной лекарственной устойчивостью. Штамм резистентен к тетратциклину, рифампицину, аленициллину, хлорамфениколу, апректомицину. На его основе готовят антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одноименной антибиотикотерапии (RU 2118364 С1, кл. С 12 N 1/20, 27.08.1988).

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является выявление нового эффективного штамма-продуцента пробиотического препарата "Субтилис" для ветеринарных целей и рыбного хозяйства.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении эффективности лечения, увеличения усвояемости кормов, продуктивности и привесов животных, птицы, рыб за счет использования "Субтилис", стабильности препарата при хранении в широком диапазоне температур внешней среды.

Штамм Bacillus subtilis В-1601Д депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ им. К.Г.Скрябина) под ВКМ В-2250Д.

Штамм Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д выделен из почвы.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой на основе мясопептонного бульона с обязательным пересевом не реже 1 раза в 2 месяца на эту же среду.

Характеристики штамма.

Культурально-морфологические признаки. Палочки. Величина клеток односуточной агаровой культуры 3-5 мкм. Клетки окрашиваются положительно по Грамму, образуют круглые споры, одиночные, центральные диаметры меньше диаметра клетки. Колонии на МПА белые, пигмент в среду не выделяют.

Физиологические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 37^oС и рН 4,0-8,0. Возможен рост в диапазоне температур 4-60^oС. Отношение к NaCl - рост при 2-5%.

Биохимические признаки. Расщепляет глюкозу, маннит. Несбраживаемые соединения углерода: сахароза, инозит, сорбит, мальтоза, лактоза. Утилизирует цитрат и ацетат. При сбраживании не образует газа. Продуцирует оксидазу, каталазу.

Антагонистические признаки. Подавляет рост стафилококков, протея, клебсиелл, кишечной палочки, энтеробактерий, нитробактерий, аэромонас, дрожжевых грибов.

Штамм не является патогенным для растений, животных, рыб и человека.

Данные таблицы показывают антагонистическую активность тестовых штаммов микроорганизмов (метод отсроченного антагонизма).

Для культивирования штамма Bacillus subtilis BKM В-2250Д используют жидкую питательную среду на основе 3% ФГМС, рН 6,8-7,0, содержащую 0,2% глюкозу (по сухому веществу), 0,005% аминопептидазу или 0,02% сыворотку крови.

Предварительно сухую биомассу микроорганизмов высевают в пробирку с бульоном. При появлении видимого роста колонии пересевают на мясопептонный агар в пробирки.

Отбирают типичные колонии, которые пересевают на жидкую среду во флаконах. Через 24 ч всю выросшую массу переносят в 15-литровую бутыль с 9 л питательной среды и культивируют 22 ч при 37-40^oС, получая посевной материал.

Питательную среду на основе ФГМС помещают в реактор, стерилизуют при 1 атм 60 мин, охлаждают до 39^oС и засевают посевным материалом из бутыли в соотношении 1:9.

В процессе аэробного культивирования рН среды поддерживают в пределах 6,8-7,2, подпитывая среду 40% глюкозой до конечной концентрации 0,1-0,2%. При достижении концентрации 20 млрд. бактериальных клеток прекращают добавление глюкозы до снижения рН 4,5 и отключают подачу воздуха. Затем отключают обогрев реактора, среду охлаждают до 20^oС. Полученную охлажденную культуру перекачивают в емкости или расфасовывают во флаконы.

При указанном способе культивирования получают препарат в виде жидкой лекарственной формы, названной "Субтилис", с содержанием 80-90% спор бактерий Bacillus subtilis BKM В-2250Д и живых вегетативных клеток.

Препарат "Субтилис" безвреден, не содержит посторонней микрофлоры. Безвредность проверена на белых мышах массой тела 18-20 г, которым перорально вводили препарат в объеме 1,0 мл.

"Субтилис" обладает специфической активностью: количество клеток в одной дозе препарата (15-20) млрд. кл/мл, антагонистическая активность - зона задержки роста тестовых микроорганизмов составляет от 6 до 34 мм.

Таким образом предлагаемый штамм Bacillus subtilis BKM В-2250Д может быть использован как производственный для получения препарата пробиотического действия, рекомендуемого для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыбы.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Бактериальная геморрагическая септицемия карпа.

В прудовом хозяйстве заболели двухлетки карпа с клиническими признаками бактериальной геморрагической септицемии. Количество больных рыб достигало 43%. Лабораторный анализ патматериала подтвердил наличие поливидовой патогенной микрофлоры во внутренних органах рыб. Назначено лечение с добавлением в корм путем его смачивания 2,5 млн. микробных клеток (спор) "Субтилис" на 1 кг живой массы тела рыбы. Корм с "Субтилис" давали рыбе 1 раз в день в течение 5 дней. Через 10 дней после окончания курса лечения установлено, что количество больных рыб уменьшилось до 4%, а признаки острого воспаления остались лишь у отдельных экземпляров. Поверхность тела рыб стала равномерно ослизнена.

Пример 2. Аэромоноз (краснуха) карпа.

В прудовом хозяйстве при резком изменении условий внешней среды трехлетки карпа заболели аэромонозом (краснухой) с наличием ярких признаков острой стадии болезни и гибелью рыбы. Ежедневная гибель рыб составила 5% от общего количества. Бактериологически установлено преобладание аэромонад, составивших более 80% от общего количества выделенных из рыбы патогенов. Назначен курс лечения кормом, смоченным "Субтилис", в дозировке 2,5 млн. спор на 1 кг живой массы тела рыбы. В связи с пониженной поедаемостью курс дачи корма был определен 1 раз в день в течение 7 суток. Уже на 5-е сутки кормления гибель рыбы уменьшилась до 0,3-06% от общего количества, на 20-е сутки после окончания курса наступило общее оздоровление стада.

Пример 3. Некроз плавников форели.

В форелевом хозяйстве наблюдалось поражение форелей острой формой некроза плавников. Микробиологическое исследование патматериала выявило наличие в нем патогенов кишечной палочки, энтеробактера, цитробактера и аэромонас (Aeromonas verenii, Aeromonas caviae). Совместное культивирование "Субтилис" с этой ассоциацией микроорганизмов показало его антагонистическую активность и вызвало полную гибель патогенов на 4-е сутки. Дозировка "Субтилис" составляла 1-2 млрд. спор.

Пример 4. Сохранность цыплят в первые недели.

На крупной птицефабрике проведены производственные испытания эффективности "Субтилис" на сохранность цыплят в первые две недели после их посадки. Программа испытаний предусматривала уточнение оптимальных дозировок "Субтилис", а также его применение в жидком и лиофильно высушенном видах. Отход цыплят контрольной группы составил 2,38%. Усредненный отход в опытных группах составил: при даче лиофильно высушенного "Субтилис" с кормом - 1,33%, при выпаивании жидкого "Субтилис" - 0,33%. В опытных группах цыплята более интенсивно набирали вес. Результаты взвешивания после первых трех дней дали для контрольной группы 61 г, для опытной - 70 г.

Пример 5. Заболевания новорожденных поросят.

На крупном комплексе по выращиванию свиней в течение продолжительного времени наблюдался значительный (до 70-80%) отход поросят в связи с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Проведенные микробиологические и патологоанатомические исследования выявили у поросят несколько видов заболеваний ЖКТ бактериальной этиологии, среди которых наиболее существенным были признаки гастроэнтерополита. Назначен курс лечения: применение "Субтилис" внутрь сразу после рождения из расчета 1 доза на 5 поросят на 10% глюкозе в течение 4-5 дней. Курс профилактики: применение "Субтилис" внутрь из расчета 1 доза на 10 новорожденных поросят на 10% глюкозе в течение 3 дней. Сохранность поросят поднялась до 92,5% и стабильно поддерживается профилактикой на этом уровне.

Проведенные исследования показали эффективность приведенных количеств пробиотического препарата, добавляемого в корм.