средство для лечения глубоких кожных дефектов

Формула изобретения

1. Средство для лечения глубоких кожных дефектов на основе культивируемых клеток фибробластов диплоидного штамма человека, отличающееся тем, что содержит суспензию клеток или микроносителей с клетками и питательной средой для культур клеток и носителем в объемном соотношении

Суспензия клеток в питательной среде ИГЛА MEM с концентрацией клеток 2,5-5,010⁶ кл/мл или суспензия микроносителей в питательной среде ИГЛА MEM с выращенным клеточным монослоем, % - 3,0 - 25

Питательная среда для культур клеток, % - 10

Носитель, % - Остальное до 100

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве питательной среды для культур клеток используют среду ИГЛА MEM 10-кратную, а в качестве носителя - гель полиэтиленоксида.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к трансплантологии.

В последние годы в клинической практике широкое распространение получил метод восстановления поврежденного кожного покрова с помощью культивированных in vitro ауто- и аллофибробластов клеток человека [1, 2]. Известно, что фибробласты посредством синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса не только стимулируют адгезию, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов при культивировании, но и оказывают непосредственное влияние на заживление ран, стимулируют рост сохранившихся очагов эпителия, а также способствуют лучшему приживлению аутодермального расщепленного лоскута [3].

Фибробласты предварительно культивируют на различных подложках в виде пленок и на микроносителях, а затем, после образования монослоя, переносят на раневую поверхность [2, 5].

Однако используемые алло- и аутофибробласты взрослой кожи намного уступают фетальным фибробластам, как по ростовым свойствам, так и в отношении стимуляции роста кератиноцитов в ране. Кроме того, они быстро стареют в культуре и не могут длительно размножаться. В связи с этим диплоидные штаммы от взрослых доноров непригодны для приготовления и полной аттестации банков и, следовательно, являются потенциально опасными для использования в клинической медицине.

Для иммобилизации клеток в биотехнологии используют различные гели; некоторые из них способны поддерживать пролиферацию клеток, другие сохранять жизнеспособность длительное время при определенных условиях. В ряде работ по реконструкции дермы чаще всего применяются гели, основой которых служит коллаген [6, 7], в других случаях используют для временной иммобилизации клеток агар, агарозу, метилцеллюлозу и другие [8].

Вышеперечисленные гели могут создавать на ране дополнительную питательную среду для развития микрофлоры и нежелательны для использования в медицине.

В связи с этим гель полиэтиленоксида, благодаря своим качествам, является наиболее приемлемым для временной иммобилизации клеток с последующей трансплантацией на раневую поверхность [9].

Наиболее близким к заявленному изобретению является аллотрансплантат для восстановления кожного покрова и способ лечения кожных дефектов с помощью культивированных клеток диплоидного штамма [10, прототип]. Согласно данному способу аттестованные клетки диплоидного штамма Л-68 размораживают из рабочего банка, после чего подвергают 5-7 кратному пассированию. Последнее субкультивирование проводят в чашках Петри на целлофановой пленке в течение 3-5 суток до получения полного монослоя. Чашки Петри, стерильно упакованные, доставляют в операционную и клетки вместе с мембраной переносят на раневую поверхность.

Несмотря на то, что этот метод зарекомендовал себя как достаточно эффективный для восстановления кожного покрова, он имеет некоторые недостатки. Данный способ предполагает использование пленки, которая деформируется на неровных и глубоких раневых поверхностях, что препятствует миграции клеток на рану. Кроме того, пленки с выращенными фибробластами должны транспортироваться в чашках Петри в стерильном контейнере при соблюдении температурного режима, в строго горизонтальном положении с исключением грубого механического встряхивания.

Задачей изобретения является возможность сокращения сроков заживления ран, упрощение условий транспортировки, снижение трудоемкости получения и переноса клеточного материала, расширение сферы применения клеток аттестованного диплоидного штамма в виде гелевой формы, способных проникать в неровные и глубокие раны.

Поставленная задача решается применением средства, содержащего суспензию клеток в питательной среде ИГЛА MEM в концентрации 2,5-5,010⁶ кл/мл или суспензию микроносителей в питательной среде с выращенным клеточным монослоем, 10-кратную питательную среду для культур клеток и носитель в соотношении 3,0-25%, 1-12% и до 100% соответственно, которое наносится тонким слоем на рану. В качестве питательной среды для культур клеток используют среду ИГЛА MEM, а в качестве носителя - гель полиэтиленоксида. После чего рана покрывается неадгезивной повязкой.

Применение концентрации клеточной суспензии в средстве менее 3% приводит к снижению лечебного эффекта, а использование концентрации более 25% приводит к разжижению средства.

Гель полиэтиленоксида (ТУ 9154-004-11821987-93) является фармакопейным препаратом, нетоксичен, сохраняет влажность, предохраняет клетки от повреждения, имеет желеобразное состояние, иммобилизует клеточную суспензию и микроносители, обеспечивая свободный выход клеток на поверхность раны.

Для получения гелевой формы можно использовать как суспензию клеток, так и микроносители с выращенным клеточным монослоем, включенные в изотонический и нетоксический гель. Используют диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека, посевной и рабочие банки которых были аттестованы в соответствии с требованиями ВОЗ для производства иммунобиологических препаратов [4, 11]. Для культивирования ампулу из рабочего банка с клетками размораживают на водяной бане при температуре 37^oС, суспензию переносят в культуральный сосуд, инкубируют в питательной среде ИГЛА MEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37^oС и пассируют до получения необходимого объема клеток, затем клеточный монослой подвергают ферментативной обработке (смесь 0,02% раствора версена и 0,025% трипсина), собирают суспензию клеток, соединяют с гелем. Для выращивания фибробластов используют биодеградируемые коллагеновые микроносители [12]. В концентрированную суспензию микроносителей вносят суспензию фибробластов, инкубируют при 37^oС, периодически перемешивая для полного распределения и распластывания клеток на микроносителях, затем добавляют питательную среду до нужного объема. На 4-7 сутки культивирования микроносители с клеточным монослоем осаждают и соединяют с гелем. Полученный гель с клетками на микроносителях помещают в стерильный флакон и транспортируют в медицинское учреждение.

Далее на предварительно приготовленную раневую поверхность стерильным шпателем наносится тонким слоем заявляемое средство и закрывается неадгезивной повязкой. На 2-5 сутки после пересадки производится перевязка.

Существенным признаком данного изобретения является:

- использование гелевой формы для иммобилизации клеточног. материала в виде суспензии или выращенного на микроносителях.

По совокупности вышеуказанных признаков использование гелевой формы для иммобилизации клеточного материала в виде суспензии или выращенного на микроносителях с последующей трансплантацией на рану свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень".

Примеры осуществления предлагаемого изобретения.

Пример 1. Приготовление геля с суспензией клеток.

Для культивирования ампулу с клетками аттестованного диплоидного штамма размораживают на водяной бане при 37^oС, суспензию переносят в культуральный сосуд, инкубируют в питательной среде ИГЛА MEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37^oС и пассируют до получения необходимого количества клеток. Полученный монослой подвергают ферментативной (смесь 0,02% раствора версена и 0,025% раствора трипсина) или механической обработке, собирают суспензию клеток в небольшом объеме питательной среды, доводя концентрацию до 2,5-5,010⁶ кл./мл, соединяют с гелем и 10-кратной питательной средой, тщательно перемешивают, переносят в стерильный флакон и транспортируют в медицинское учреждение.

Предлагаемый состав содержит, %:

Суспензия клеток в питательной среде - 20

Среда ИГЛА MEM 10-кратная - 10

Гель полиэтиленоксида - 70

Пример 2. Приготовление геля с клетками, выращенными в виде монослоя на коллагеновых микроносителях.

Размораживание и культивирование клеток проводят аналогично примеру 1. При последнем субкультивировании используют коллагеновые микроносители.

К микроносителям добавляют выращенную клеточную суспензию, доводят концентрацию клеток до 3,010⁵ кл./мл, добавляя питательную среду ИГЛА MEM до нужного объема, инкубируют при 37^oС при постоянном перемешивании. На 3-4 сутки после образования монослоя микроносители осаждают, соединяют с гелем и 10-кратной питательной средой, осторожно перемешивают, переносят в стерильный флакон и транспортируют в медицинское учреждение.

Предлагаемый состав содержит, %:

Суспензия микроносителей с выращенным клеточным монослоем - 20

Среда ИГЛА MEM 10-кратная - 10

Гель полиэтиленоксида - 70

Пример 3. Способ лечения трофических язв.

Больному А. с диабетом, 44 года, с некротической язвой на пяточной области, не заживающей около года, была произведена трансплантация культивированных аллофибробластов, включенных в виде суспензии в гель полиэтиленоксида. На участках с поражением на 8-е сутки наблюдалась краевая эпителизация. Полная эпителизация произошла на 32-е сутки.

Пример 4. Способ лечения глубоких ожогов.

Больному В. с послеожоговой раной, не заживающей в течение 3 месяцев, трансплантировали суспензию микроносителей с клетками диплоидного штамма, включенными в гель. На 2-е сутки наблюдалась краевая эпителизация, на 7-е сутки появились островки эпителия, на 15-е сутки произошла полная эпителизация раны.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что данные средство и способ оказываются эффективными при лечении глубоких кожных ранах.

Список литературы

1. Саркисов Д. С., Глушенко Е.В., Гуруков Ш.Р. и др. Бюллетень экспер. биол. и мед. 1991. Т. 5, 542, с. 542-544.

2. Глушенко Е.В., Алексеев А.А., Морозов С.С. и др. Хирургия, 1993, 11, 26-29.

3. Саркисов Д.С., Алексеев А.А., Глушенко Е.В., и др. Вестн. РАМН, 1994, т. 6, с. 6-11.

4. Колокольцова Т. Д. , Юрченко Н.Д., Колосов Н.Г. и др. Вестник РАМН, 1998, 3, с. 32-35.

5. Заявка РФ 93037867/14 "Способ лечения длительно незаживающих ран и трофических язв кожных покровов". А 61 К 35/14.

6. Lubertret L. Skin Pharmacol 1990, 3, Р. 144-148.

7. Jeffry R, Yarmush M. Science 1997, 4, P. 6-15.

8. Freshney R.I. Culture of Animal Cells. Second Editor - 1987, Alan R. Liss, Inc., New York.

9. Патент РФ 2139044 "Средство для лечения гнойно-некротических ран и ожогов "коллагель". 6 А 61 К 9/06, 38/48, бюл. 28.

10. Патент РФ 2142820 "Аллотрансплантат для восстановления кожного покрова, способ его получения и способ восстановления кожного покрова при повреждениях различной этиологии". 6 А 61 L 27/00, бюл. 35.

11. Патент РФ 2112545 "Способ получения живой коревой вакцины". А 61 К 35/19, бюл. 16.

12. Патент РФ 2010028 "Способ восстановления кожного покрова у тяжелообожженных". С 12 N 5/00, бюл. 6.