способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы
Классы МПК: | A61K39/40 бактериальные A61K39/07 бациллы G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний |
Автор(ы): | Барков А.М., Липницкий А.В., Евтеева Е.В. |
Патентообладатель(и): | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, Барков Анатолий Макарович, Липницкий Анатолий Васильевич, Евтеева Елена Владимировна |
Приоритеты: |
подача заявки:
2001-06-29 публикация патента:
27.10.2002 |
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения сибиреязвенных сывороток, позволяющих дифференцировать Bacillus anthracis от близкородственных микроорганизмов. Бесклеточный культуральный фильтрат B. anthracis СТИ концентрируют на ультрафильтрах HLP-10 и РМ-10 в 150 раз, до содержания белка в фильтрате 8-10 мг/мл, затем выделение антигенных компонентов осуществляют гельхроматографией на сверхтонком сефакриле S-300, уравновешенном 0,3 М раствором NaCl с 0,025 М трис-HCL буфером рН 8,4, с регистрацией выхода фракций при
= 280 нм, для получения высокоспецифичной сыворотки используют антиген с м.м. более 150 кДа, что соответствует первому пику выхода фракций. Полученная по способу сыворотка к антигену реагирует в реакции иммунодиффузии в геле только с антигенами различных вариантов возбудителя сибирской язвы, что позволяет идентифицировать возбудитель сибирской язвы от близкородственных по антигенным свойствам бацилл. 2 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2
![способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы, патент № 2191603](/images/patents/279/2191003/955.gif)
Формула изобретения
Способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы, отличающийся тем, что животных иммунизируют возрастающими дозами антигена с м. м. более 150 кДа, содержащегося в первом пике, полученном путем гельхроматографии на сверхтонком сефакриле S-300, уравновешенном 0,3 М раствором NaCl с 0,025 М трис-HCL буфером рН 8,4, с регистрацией выхода фракций при![способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы, патент № 2191603](/images/patents/279/2191003/955.gif)
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения сывороток, позволяющих дифференцировать Bacillus anthracis от близкородственных микроорганизмов. Известная антигенная схожесть B.anthracis с близкородственными микроорганизмами, такими как B.cereus, B.megaterium, В.thuringiensis, B.mycoides B. subtilis, затрудняет получение видоспецифических препаратов для диагностики сибирской язвы. В настоящее время пригодные для идентификации диагностические препараты получают в большинстве случаев путем многократной адсорбции сибиреязвенных сывороток близкородственными микроорганизмами (авторское свидетельство (19) SU (II) 1637325 A1. Р.Н. Низамов, Д.Ш. Ахмеров, Р.Х. Шиганова и И.Н. Садыков. Способ получения флуоресцирующих антител для диагностики сибирской язвы; Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций. Докторская диссертация, Ставрополь, 2000), что усложняет и удорожает разработку диагностических препаратов. Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является "Identification of Bacillus anthracis by polyclonal antibodies against extracted vegetative cell antigens" A.P. Phillips, I.W. Ezzel; I. of Applied Bacteriology, 1989, 66, 419-432. Для получения сывороток эти авторы использовали легко экстрагируемые из клеток B. anthracis белковые антигены. Однако сыворотки против этих антигенов не позволяли в полной мере дифференцировать штаммы возбудителей сибирской язвы от близкородственных микроорганизмов даже с использованием моноклональных антител. Недостатком метода выделения этих антигенов является использование детергентов, прогревания препарата, что усложняет и удорожает получение антигена и не гарантирует нативности выделенных антигенов. Целью изобретения является получение сыворотки с использованием нативного сибиреязвенного антигена, позволяющей дифференцировать возбудителя сибирской язвы от близкородственных микроорганизмов. Поставленная цель достигается тем, что антиген выделяют гельхроматографией на сверхтонком сефакриле S-300 (Upsala, Sweden) культурального фильтрата B. anthracis СТИ-I, который выращивают в синтетической питательной среде при 37oС, с шуттелированием. Клетки B. anthracis отделяют фильтрованием, компоненты стерильного культурального фильтрата концентрируют на ультрафильтрах НLР-10 и PM-10 (фирма Amicon, Sweden) в 150 раз, до содержания белка 8-10 мг/мл. Для получения сывороток кроликов иммунизируют антигеном с м.м. более 150 кДа (1 пик), который элюируется в свободном объеме с регистрацией при![способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы, патент № 2191603](/images/patents/279/2191003/955.gif)
2 - B. anthracis 81/1 (tox+, cap-)
3 - B. anthracis 81/1 (tox-, cap-)
4 - B. anthracis 81/1 (tox+, cap+)
5 - B. anthracis 619/42 (tох+, сар+)
6 - B. anthracis 591/2 (tox+, cap+)
7 - B. anthracis Davies (tox-, cap+)
8 - B. cereus NP 569
9 - B. cereus АТСС 6464
10 - B. megaterium 216
11 - B. thuringiensis V. thuringiensis "Pasteur"
12 - B. thuringiensis V. tburingiensis "Galleria"
13 - B. subtilis 407
14 - B. subtilis BD 430
Из фиг. 2 видно, что сыворотка к антигену фракции 1 культурального сибиреязвенного фильтрата образует зону преципитата только с антигенами В. anthracis как содержащими плазмиды вирулентности (px01, px02), так и с антигенами бесплазмидных сибиреязвенных штаммов. В отличие от сыворотки к фракции 1 сыворотки к фракции 2 (а также к фракциям 3 и 4 - данные не приведены) и коммерческий сибиреязвенный глобулин образуют зоны преципитатов как с антигенами сибиреязвенных штаммов, так и с антигенами близкородственных микроорганизмов. Таким образом, сыворотка к высокомолекулярному антигенному комплексу B. anthracis в отличие от сывороток к другим внеклеточным антигенам B. anthracis и коммерческого сибиреязвенного глобулина является высокоспецифичной и может быть использована для идентификации штаммов B. anthracis как содержащих плазмиды вирулентности, так и бесплазмидных штаммов.
Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого
Класс G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний