лечение остеопороза, связанного с нарушением уровня паратгормона, и упаковка, содержащая составы в дозированной форме для проведения указанного лечения

Формула изобретения

1. Способ лечения остеопороза, связанного с нарушением уровня паратгормона, включающий введение эффективного количества фосфата пациенту, нуждающемуся в лечении, отличающийся тем, что указанное количество фосфата вводят вечером или ночью при дополнительном введении вспомогательного агента, вызывающего уменьшение уровня паратгормона в течение дня.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что эффективное количество фосфата вводят человеку.

3. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что в качестве вспомогательного агента используют кальций.

4. Упаковка, содержащая составы в дозированной форме для лечения остеопороза, связанного с нарушением уровня паратгормона, отличающаяся тем, что она включает первый состав, содержащий эффективное количество фосфата, и второй состав, содержащий эффективное для уменьшения уровня паратгормона количество кальция.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области эндокринологии и лечения состояний, связанных с нарушением нормальных гормональных уровней. Более конкретно, настоящее изобретение касается способа и упаковки для лечения остеопороза, связанного с нарушением уровня паратгормона, посредством которых обеспечивается увеличение уровня паратгормона (ПТГ) у субъекта, нуждающегося в этом.

ПРЕДЫДУЩИЕ РАБОТЫ

Ниже приведен перечень работ, которые могут рассматриваться в качестве предпосылок настоящего изобретения:

1. Rodan G.A., Mechanical loading, estrogen deficiency and the coupling of bone formation to bone resoption. J. Bone Miner.Res., 3: 527-530, 1991.

2. Juppner H. , Abou-Samra A.B., Freeman M., et al. A G-protein-linked receptor for parathyroid hormone and parathyroid-related peptide. Science, 254: 1024-1026,1991.

3. Mosekilde Li, Danielsen С.С., Sogaard C.H., et al. The anabolic effects of pathyroid hormone on cortical bone mass, dimensions and strength-assessed in a sexually mature, ovariectomized rat model. Bone, 16.: 223-230. 1995.

4. Reeve J., Meunier P.J., Parsons J.A. et al. Anabolic effects of human parathyroid hormone fragment on trabecular bone in involutiоnal osteoporosis: A multicenter trial. Br. Mod. J., 280:1340-1344, 1980.

5. Dempster D.W., Cosman F., Parislen M. et al. Anabolic actions of parathyroid hormone on bone. Endocrine Rev., 14:690-709. 1993.

6. Finkelstein J. S., Klibanski A., Schaeffer E.H., et al. Parathyroid hormone for prevention of bone loss induced by estrogen deficiency. New Eng. J. Med., 331:1618-1623, 1994.

7. Prank S. , Nowlan S.J., Harms H.M. et al. Time series prediction of plasma hormone concentration. Evidence for differences in predictability of parathyroid hormone secretion between osteoporotic patients and normal controls. J. C1in. Invest., 95:2910-2919, 1995.

Ссылка на приведенные выше работы в дальнейшем будет обозначаться указанием их номера в данном перечне.

ПРЕДПОСЫЛКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Остеопороз является причиной переломов костей почти у 50% женщин в постмеиопаузальном периоде, и он представляет собой главную причину нетрудоспособности при старении. Современная терапия включает адекватное введение кальция и витамина D наряду со специфической терапией такими соединениями, как эстрогены, кальцитонин и бисфосфонаты [1]. Однако каждый из этих методов лечения имеет либо затрудняющие его побочные эффекты, либо ограниченную эффективность. Несмотря на значительное уменьшение инфарктов миокарда и уменьшение рассасывания костей женщины опасаются незначительного увеличения рака молочной железы, обусловленного эстрогенами. Кальцитонин имеет ограниченное воздействие и представляет собой протеин, а поэтому его необходимо вводить инъекционно или путем ингаляций, что неудобно. Новые бисфосфонаты, такие как алендронат. продемонстрировали обнадеживающие результаты по увеличению плотности кости и уменьшению переломов, притом при незначительных побочных эффектах. Современные исследования новых соединений были сконцентрированы на систематическом введении соединений, усиливающих синтез костной ткани, таких как паратгормон (ПТГ) или его фрагментов или факторов роста кости, таких как костные морфогенные протеины. Привлекательность ПТГ состоит в том, что в кости имеются специфические рецепторы ПТГ [2], и полностью установлено, как при изучении лабораторных животных [3], так и пациентов, что прерывистые дозы вводимого ПТГ являются наиболее эффективным средством, который, как известно, усиливает образование кости и увеличивает прочность костей [4-6]. Этот эффект дополняет воздействие эстрогенов. Проблема, связанная с введением ПТГ, состоит в том, что он представляет собой пептид и поэтому его следует вводить инъекционно. Женщины с остеопорозом имеют неповрежденную, но неадекватно функционирующую паращитовидную железу, и альтернативный подход состоит в стимулировании способности их собственных паращитовидных желез синтезировать и выделять больше ПТГ. На лабораторных животных было доказано, что это достижимо, и это составляет основу настоящего изобретения.

У женщин в постменопаузальном периоде при остеопорозе отсутствует характерное увеличение ночных уровней ПТГ в сыворотке. У женщин с остеопорозом тщательные и повторные измерения ПТГ в сыворотке и анализ во времени ряда предсказанных концентраций этого гормона в плазме показали, что возможность предсказания выделения ПТГ у пациентов в постменопаузальный период при наличии остеопороза и у контрольных пациентов в постменопаузальный период без остеопороза различна [7].

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предметом настоящего изобретения являются способ лечения остеопороза и упаковка с составами в дозированной форме для этого лечения, с помощью которых увеличиваются уровни ПТГ у людей, в этом нуждающихся.

В соответствии с предпочтительным воплощением данного изобретения предлагаемый способ позволяет восстанавливать циркадный ритм уровней ПТГ в сыворотке аналогично тому ритму, который обычно присущ людям.

Другим предпочтительным воплощением данного изобретения является упаковка с составами в дозированной форме для осуществления данного способа лечения остеопороза.

Эти и другие предметы настоящего изобретения станут ясными из приведенного ниже описания.

В связи с настоящим изобретением было обнаружено, что введение фосфатов приводит к увеличению уровней ПТГ. Более того, в соответствии с этим изобретением фосфаты предпочтительно вводятся людям вечером или ночью, что приводит к характерному для обычных людей увеличению уровней ПТГ в ночное время.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новые средства для лечения субъектов, страдающих от состояний, вызванных повреждением уровней ПТГ, путем введения им фосфата. Это лечение полезно как в медицине, так и в ветеринарии.

Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает метод лечения состояний, вызванных повреждением уровней паратгормона (ПТГ), включающий введение эффективного количества фосфата нуждающемуся субъекту.

Настоящее изобретение также обеспечивает состав для использования при лечении состояний, вызванных повреждением уровней паратгормона (ПТГ), таких как остеопороз, включающий введение эффективного количества фосфата вместе с физиологически приемлемым носителем.

Далее, настоящее изобретение обеспечивает использование фосфата при получении составов для лечения состояний, вызванных повреждением уровней ПТГ.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения эти фосфаты вводятся ночью, и такое введение составляет часть комплексного лечения, включающего также синхронное введение эффективного количества вспомогательного агента, например кальция, способного уменьшить уровень ПТГ в дневное время. Агент такого рода может быть введен субъекту утром, а затем еще раз в течение того же дня. В результате такого комплексного лечения в течение дня уровень ПТГ должен быть низким, а в течение ночи - более высоким, это дает циркадианные профили уровней ПТГ, аналогичные тем, которые существуют у обычных людей.

Термин "эффективное количество", использованный выше, следует понимать как обозначение количества активного ингредиента, например фосфата или вспомогательного средства, способного оказывать желаемый терапевтический эффект. Также должно быть ясно, что это эффективное количество может быть различным для разных групп лиц, являясь зависимым от таких факторов, как возраст, условия лечения и т.д., как, без сомнения, это должно быть понятно производителю.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает новые средства для лечения состояний, связанных с понижением уровней ПТГ. Такие состояния в основном включают остеопороз. В дальнейшем в настоящем изобретении будет сделана специальная ссылка на лечение остеопороза и станем понятным, что оно с оговорками применяется для лечения других состояний.

Остеопороз, как это было отмечено выше, представляет собой состояние, которое проявляется в основном у женщин в постменопаузальный период, а иногда и у мужчин, и которое приводит, прежде всего, к уменьшению уровня ПТГ. Помимо уменьшения уровня ПТГ остеопороз связан также с нарушением циркадианного ритма ПТГ - низкие уровни в течение дня и более высокие уровни ночью.

В соответствии с настоящим изобретением для повышения уровня ПТГ у лиц, нуждающихся в этом, используют фосфат. Эти фосфаты могут вводиться в виде соли, например натриевой или кальциевой, или в нейтральной форме, или в кислых формах. Этот фосфат можно вводить в форме таблеток, капсул, жидкости, раствора для питья и т.д. Иногда фосфат может быть вводим парентерально, например в составе физиологического раствора, хотя необходимо отметить, что такая форма введения является менее толерантной физиологически, в основном потому, что она требует суточной основы.

Эффективное количество фосфата составляет ~2-10 мг/кг веса тела, предпочтительно ~3-6 мг/кг веса тела.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения фосфат вводится субъектам, нуждающимся в нем, вечером или ночью, например перед отходом ко сну.

В соответствии с особенно предпочтительным воплощением такое лечение сопровождается введением вспомогательного агента, например кальция, в дневное время. Кальций можно вводить, например, один раз рано утром и один раз в середине дня. Такое введение кальция должно поддерживать относительно низкий уровень ПТГ в течение всего дня. Эффективное количество кальция может быть ~ 5-20 мг/кг веса тела, предпочтительно ~6-15 мг/кг веса тела, а наиболее желательно ~ 6-10 мг/кг веса. Кальций, как известно, можно вводить сам по себе, в форме таблетки, в форме напитка, предварительно приготовленного, например, из шипучего препарата кальция и т. д.

Кальциевые и фосфатные препараты можно вводить вместе в одной упаковке, в сроки, совпадающие с режимом введения по инструкции в соответствии с комплексным лечением по данному изобретению. Обычно такая упаковка должна содержать дневные дозы каждого из активных агентов. Например, эта упаковка может содержать две таблетки кальция и одну таблетку фосфата на каждый день. Причем эти две таблетки кальция помечены и предназначены для приема утром и а середине дня, а таблетка фосфата помечена и предназначена для приема субъектом до отхода ко сну.

Настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, описывающими опыты, проведенные в соответствии с данным изобретением. Иногда в этих примерах будут делаться ссылки на прилагаемые чертежи.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Показано влияние фосфатного и кальциевого рациона питания на уровни ПТГ мРНК. Приведены результаты питания крыс, недавно отнятых от материнского вскармливания, которые в течение 3 недель получали питание с низким содержанием фосфата (0,02%); контрольных крыс; высоким содержанием фосфата (1,2%); низким содержанием кальция (0,02%); что означает SEM для 4 крыс, и сравниваются с результатами для крыс, получавших стандартный рацион питания *Р<0,05; **Р<0,01.2D₃. Положительные ядра PCNA окрашены красным; (1) контрольные крысы спустя 10 дней после прекращения материнского вскармливания; (2) крысы, получающие рацион с низким содержанием кальция в течение 10 дней; (3) крысы, получающие рацион с низким содержанием фосфата в течение 21 дня; (4) крысы, получающие в инъекции 1,25(ОН)₂D₃ (25 pmol/день в течение 3 дней); и

Фиг.3. В поле зрения показан подсчет положительных клеток PCNA крыс, получавших стандартный рацион питания: низкое содержание кальция (0,02%); низкое содержание фосфата (0,02%); или рацион с высоким содержанием фосфата в течение 10 или 21 дня. Эти результаты выражены как положительные клетки PCNA в поле зрения микроскопа, что означает SE для 4 разных крыс и сравниваются с крысами, получающими стандартный рацион; *Р<0,05; **Р<0,01.
I. Животные

Мужские особи крыс родительской линии Hebrew University, отнятые от материнского вскармливания, в течение 3 недель получали следующие рационы (Teklad IL): низкое содержание фосфата, нормальное содержание кальция (0,2% фосфата, 0,6% кальция); нормальное содержание фосфата, нормальное содержание кальция (0,3% фосфата, 0,6% кальция); высокое содержание фосфата, высокое содержание кальция (1,2% фосфата, 1,2% кальция); рационы с дефицитом витамина D и низким содержанием кальция (0,02% кальция). Спустя 1-21 день ткань щитовидной и паращитовидной железы иссекали под пентобарбиталовым наркозом и отбирали образцы крови. Все хирургические действия над крысами проводились в 9-10 часов утра. Иссеченную ткань немедленно замораживали в жидком азоте и сохраняли при -70 ^oС.

II. Измерение клеточных уровней мРНК

РНК экстрагировали из ткани щитовидной и паращитовидной железы крысы, а уровни ПТГ мРНК измеряли после экстракции с TRI реагентом (Molecular research Center Inc., Cincinnati, Ohio). РНК была денатурирована и к каждому образцу добавили бромид этидия в концентрации 0,1 мг/мл. Эти образцы разделяли на фракции по размерам электрофорезом на 1,25% агарозовых гелях, содержащих формальдегид, и перенесли на фильтры Ну-bond (Amersham, England) при диффузном окрашивании. Целостность РНК и однородность РНК, перенесенной на мембрану, определяли с помощью УФ-визуализации полос рибосомной РНК на указанных гелях и фильтрах. Фильтры фиксировали УФ-сшиванием и гибридизировали, как это описано ранее (Naveh-Many et al.. J. Clln. Inves., 90:2434-2438 (1992); Silver et al. , J.Clln. Inves., 78:1296-1301 (1986). Гибридизация осуществлялась к кДНК, случайным образом снабженной информацией крысиного ПТГ (предоставлено H.Meyer, GBF, Braunschweig, Germany) и 18 S РНК (предоставлено Mr. A. Levine, Baltimore, MD).

III. Иммуногистохимия

Пролиферирующий клеточный нуклеарный антиген (PCNA). Парафиновые блоки ткани разрезали на части толщиной 4-6 мм, очистили от парафина в ксилоле и спиртах и поместили на 15 мин в спирт-Н₂O₂ (3%) для блокирования эндогенной пероксидазы. Для выявления в зафиксированных формалином и внедренных в парафин срезах ткани замаскированных антигенов предметные стекла поместили в цитратный буфер (рН 6,0) и в течение 10 мин обрабатывали при 92 ^oС в микроволновой печи. После извлечения контейнера из микроволновой печи и его охлаждения в течение 15 мин предметные стекла поместили в PBS (рН 7,6). Затем срезы обработали бычьим сывороточным альбумином (BSA), чтобы предотвратить окрашивание фона, а затем инкубировали в течение 1 часа с первичным антигеном PCNA-PC-10 (Zymed laboratories, Inc., San Francisco, CA) при комнатной температуре в увлажненной камере (Okazaki et al., J. Blol. Chem., 269: 27855-62 (1994); Peer et al., Ophthalmology- 101:56-62 (1994)). Предметные стекла промывали в течение 3-4 мин в PBS и инкубировали 30 мин с биотинилированным связанным антителом и 30 мин с метящим реагентом пероксидазы сопряженным стрептавидином (Bio Genex laboratories, San Ramon, CA). После промывания пероксидазная метка была обнаружена с помощью использования в течение 15 мин 3-амино-9-этилкарбазола (АЕС) и контрастно окрашена Майеровским гематоксилином. АЕС дает красный продукт, который растворим в спирте и который используют вместе с водной средой при подготовке препаратов к исследованию (Кайзеровский глицерольный желатин). Негативный контроль проводили, используя такую же методику, но при этом не включая первичное антитело и добавляя стрептавидин-биотиновый комплекс. Положительные клетки PCNA были подсчитаны в поле микроскопа в РТ срезах, полностью заполняющим это поле. Для каждой крысы были сделаны подсчеты в 4 полях микроскопа, и было использовано полученное при этом значение. Отклонения между срезами каждой крысы всегда были менее 10%. Для каждой группы значение SEM составляло 4-5 крыс.

IV. Мечение тонких концевых срезов ткани ДНК

В основном этот процесс осуществлялся так, как это описано Gavrieli et al. , J. Cell Biol., 119:493-501 (1992). Срезы ткани были обработаны протеиназой К, промыты 4 раза. обработаны 2% Н₂О₂, промыты и помещены в буфер с бионитированным dUTP и вновь промыты. Затем эти срезы покрыли Extra-avidin пероксидазой (BioMakor, Rehovot, Israel), промыты и в течение 30 мин окрашивались АЕС (Gavrieli et al., см. выше).

V. Измерения состава сыворотки

Сывороточный кальций и фосфат измерялись на анализаторе Roche. Сывороточные уровни 1,25(ОН)₂D₃ измерялись с помощью радиорецепторного анализа (Incstar, Minneapolis, MN). Сывороточные уровни iРТН измерялись с помощью иммунорадиометрического анализа крыс (Nichols, San Clemente, CA). Статистический анализ проводили по программе Macintosh Statview 512+, используя непарный "двуххвостовой" t-тест Стьюдента. Эти результаты представлены как значение SEM.

Пример 1: Биохимия сыворотки животных, получавших различный рацион питания

Биохимия сывороточного кальция, сывороточного фосфата и сывороточного 1,25(ОН)₂D₃ животных, получавших рацион с низким содержанием кальция, с низким содержанием фосфата и с высоким содержанием фосфата приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы, сывороточный кальций уменьшается у крыс, получавших рацион с низким содержанием кальция, и увеличивается у крыс, получавших рацион с низким содержанием фосфата. Сывороточный фосфат менялся только у тех крыс, которые получали рацион с низким содержанием фосфата в тех случаях, когда оно уменьшалось. Сывороточный 1,25(ОН)₂D₃ значительно увеличивался у крыс, получавших как рацион с низким содержанием кальция, так и рацион с низким содержанием фосфата, и уменьшался при рационе с высоким содержанием фосфата.

Пример 2: Уровни ПТГ мРНК животных, получавших различный рацион питания

В течение 3 недель животные, отнятые от материнского вскармливания, получали пищевой рацион с низким содержанием фосфата (0,02%), контрольный нормальный рацион, рацион с высоким содержанием фосфата (1,2%) и рацион с низким содержанием кальция. Результаты приведены на фиг.1. Можно видеть, что уровни ПТГ мРНК увеличиваются у крыс, получающих рацион с низким содержанием кальция и значительно уменьшается у крыс, получающих рацион питания с низким содержанием фосфата; при этом в контрольном гене 18 S РНК изменений не происходит (не показано).

Пример 3: PCNA ткани паращитовидной железы крыс, получавших различный пищевой рацион

Ткань паращитовидной железы получали от: 4 контрольных крыс, не подвергавшихся обработке (1 на фиг. 2); крыс, получавших питание с низким содержанием (0,02%) кальция в течение 10 дней (2 на фиг. 2); крыс, получавших питание с низким содержанием (0,02%) фосфатов в течение 21 дня (3 на фиг.2); или крыс, получавших в инъекциях в течение 3 дней 1,25(ОН)₂D₃ (25 pmol/d) (4 на фиг. 2). Пролиферирующий клеточный нуклеарный антиген (PCNA) определяли так, как это описано выше в разделе III.

Полученные результаты приведены на фиг. 2 (окрашивание PCNA) или на фиг. 3 (подсчет положительных клеток PCNA в поле зрения). Как видно, окрашивание ткани щитовидной и паращитовидной железы показало, что спустя 10 дней после отлучения от материнского вскармливания у контрольной крысы было 10 позитивных клеток PCNA в поле зрения микроскопа, а у крыс, отлученных от материнского вскармливания и получавших пищевой рацион с низким содержанием кальция а течение 10 дней, наблюдалось 6-кратное увеличение (фиг. 2 и 3). Спустя 21 день у контрольных крыс наблюдалось уменьшение числа позитивных клеток PCNA (P<0,05) по сравнению с крысами, находившимися 10 дней без материнского вскармливания, а у крыс, получавших пищевой рацион с низким содержанием кальция, имелось увеличение числа положительных клеток PCNA в 3,6 раз (фиг.2 и 3). После 21 дня пищевого рациона с низким содержанием фосфата не наблюдалось совсем никаких позитивных клеток PCNA (фиг.2 и 3), а также и заметного уменьшения уровней ПТГ мРНК (фиг.1 и 3). У крыс, получавших пищевой рацион с высоким содержанием фосфата, наблюдалось незначительное увеличение уровней ПТГ мРНК (фиг.1 и 3) и большее число позитивных клеток PCNA, чем у контрольных, но почти столько же, сколько у крыс, получавших пищевой рацион с низким содержанием кальция (фиг.3).