ингибирование протеасом 26s и 20s инданонами

Формула изобретения

1. Способ лечения млекопитающих с нарушениями клеточной пролиферации, нарушениями иммунной системы и инфекционными заболеваниями, включающий в себя введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения, имеющего формулу:



где каждый из R₁-R₄ в отдельности выбран из группы соединений, включающих в себя водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано; каждый из R₅-R₉ в отдельности выбран из группы соединений, включающих в себя водород, галоген, гидроксил, тиол, оксо, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано;

Х выбран из группы соединений, включающих в себя водород, -D₁, -D₂, Е, -D₁-D₂, -D₁-Е, -D₂-Е, или представляет собой соединение, имеющее формулу:



в которой каждое из D₁ и D₂ выбрано из группы соединений, включающих в себя



водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенное гетероциклическое соединение, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил или не включающих их; в которой Е представляет собой соединение, выбранное из группы, включающей в себя



водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил или алкилциклогетероалкил;

где R₁₀-R₁₄, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих в себя водород, галоген, гидроксил, тиол, оксо, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано;

J₁ и J₂ представляет собой N-R₁₅, CR₁₆R₁₇, О, S-(O)_0-2, Р-(O)_0-3;

R₁₅-R₁₇, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих в себя водород, галоген, гидроксил, оксо, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероциклическое соединение, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил или циано.

2. Способ по п. 1, где R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, арилокси, замещенного арила, амино, амидо, алкокси, тио, алкилтиола, гидроксила, циано, нитро, ацила, карбоксила и алкинила, а R₅-R₉, каждый в отдельности, выбран из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, арила, замещенного низшего алкила, замещенного арила, амидо, амидо, алкокси и алкинила.

3. Способ по п. 1, где Х выбран из группы, состоящей из -D₁-Е или -D₂-Е.

4. Способ по п. 3, где каждый из -D₁ и -D₂ представляет собой



5. Способ по п. 4, где J₁ представляет собой N-R₁₅, а R₅-R₁₁ и R₁₅, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила или замещенного арила, а Е выбрано из группы, состоящей из низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, замещенного арила, алкокси и амино.

6. Способ по п. 5, где R₅-R₁₁ и R₁₅, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила и замещенного низшего алкила, а Е выбрано из группы, состоящей из низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, замещенного арила, алкокси и амино.

7. Способ по п. 6, где Е выбрано из группы, состоящей из алкокси и амино, а R₁-R₄, выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, алкокси, амино, нитро, гидроксила, циано, алкинила, тио и алкилтио.

8. Способ по п. 7, где Е представляет собой NR"R"", где R" и R"", каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, замещенного арила и циклоалкила, а R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, нитро, низшего алкила, замещенного низшего алкила, амино, алкилтио, тио, гидрокси и алкокси.

9. Способ по п. 8, где R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, алкокси и низшего алкила, R₅-R₁₁ и R₁₅, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила и замещенного низшего алкила, а R" и R"", каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила и циклоалкила.

10. Способ по п. 2, где Х представляет собой



11. Способ по п. 10, где каждое из -D₁ из -D₂ представляет собой



12. Способ по п. 11, где Е представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, замещенного арила, амино, циклоалкила, замещенного циклоалкила, алкокси или алкилциклоалкила.

13. Способ по п. 11, где Е представляет собой



14. Способ по п. 13, где каждый из J₁ и J₂ представляет собой NR₁₅, в котором R₁₀-R₁₃ и R₁₅, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила и замещенного арила, а R₁₄ выбран из группы, состоящей из низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, замещенного арила, амино и алкокси.

15. Способ по п. 14, где R₅-R₁₃, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила и замещенного арила, R₁₄ выбран из группы соединений, состоящей из алкокси и амино, а R₁₅ выбран из группы соединений, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила и замещенного арила.

16. Способ по п. 15, где R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, состоящей из водорода, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, арилокси, замещенного арила, амино, алкилтио, нитро, гидрокси, тио и алкокси.

17. Способ по п. 16, где R₅-R₁₃ и R₁₅, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила и замещенного низшего алкила.

18. Способ по п. 17, где R₁₄ представляет собой NR"R"", где R" и R"", каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, замещенного арила и циклоалкила.

19. Способ по п. 18, где R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, алкокси и низшего алкила, R₅-R₁₃ и R₁₅, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, состоящей из водорода, низшего алкила и замещенного низшего алкила, а R" и R"", каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, состоящей из водорода, низшего аклила, циклоалкила и замещенного низшего алкила.

20. Способ по п. 12, где J₁ представляет собой -NR₁₅, где R₁₅ выбран из группы соединений, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила и замещенного арила.

21. Способ по п. 20, где R₅-R₁₁, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила и замещенного арила, Е выбрано из алкокси и амино, R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, состоящей из водорода, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, алкилтио, тио, алкокси, амино, нитро и гидроксила, а R₁₅ представляет собой соединение, выбранное из группы соединений, состоящей из водорода, низшего алкила и арила.

22. Способ по п. 21, где Е представляет собой NR"R"", где R" и R"", каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила, арила, замещенного арила и циклоалкила.

23. Способ по п. 21, где R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, алкокси и низшего алкила, R₅-R₁₁, каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила и замещенного низшего алкила, R" и R"", каждый в отдельности, выбраны из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, замещенного низшего алкила и циклоалкила, а R₁₅ выбран из группы соединений, выбранных из группы, состоящей из водорода и низшего алкила.

24. Способ по п. 10, где R₃ представляет собой метокси, -D₁ представляет собой лейцин и -D₂ представляет собой лейцин, а Е представляет собой NR"R"".

25. Способ по п. 24, где -D₁ представляет собой l-лейцин, а -D₂ представляет собой d-лейцин.

26. Способ по п. 25, где Е выбрано из группы соединений, состоящей из бензиламина, 1-инданиламина, N, N"-дибензиламина, 2,6-дифторбензиламина, 4-метоксибензиламина, пиперониламина и NH₂.

27. Способ по п. 24, где Е представляет собой глицинамид.

28. Способ по п. 1, где указанное млекопитающее представляет собой человека.

29. Способ по п. 1, где указанное терапевтически эффективное количество колеблется примерно 0,001-100 мг/кг веса указанного млекопитающего.

30. Способ по п. 1, где указанную композицию вводят млекопитающему, страдающему от нарушения клеточной пролиферации, выбранного из группы, состоящей из ревматоидного артрита, волчанки, диабета типа I, множественного склероза, рака, растеноза, реакции "трансплантат против хозяина" и подагры.

31. Способ по п. 30, где указанное нарушение клеточной пролиферации представляет собой рестеноз.

32. Способ по п. 30, где клеточная пролиферация является раковым заболеванием.

33. Способ по п. 30, где указанный терапевтический агент индуцирует апоптоз.

34. Способ по п. 30, где указанное нарушение клеточной пролиферации представляет собой поликистоз почек.

35. Способ по п. 1, где указанную композицию вводят млекопитающему, страдающему от инфекционного заболевания.

36. Способ по п. 33, где указанное инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из IBD, болезни Крона, AIDS, ARDS и грибковых заболеваний.

37. Способ по п. 1, где указанную композицию вводят млекопитающему, страдающему от иммунологического заболевания, такого, как ревматоидный артрит, аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата и псориаз.

38. Композиция в виде раствора, содержащая указанные соединения формулы по п. 1 в терапевтически эффективном количестве.

39. Композиция в виде таблетки, содержащая указанные соединения формулы по п. 1 в терапевтически эффективном количестве.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение представляет собой способ ингибирования клеточной пролиферации с использованием класса инданоновых композиций, никогда раньше не рассматривавшихся для этой цели. В качестве ингибиторов клеточной пролиферации данные композиции пригодны для лечения рака, сердечно-сосудистой болезни, например, рестеноза, отторжения трансплантата хозяином, подагры и других пролиферативных нарушений, а также являются потенциальными лечебными средствами при аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, волчанка, диабет типа I, множественный склероз и аналогичные нарушения, и заболевания.

Мультикаталитическая протеиназа, или протеасома, представляет собой консервативную клеточную структуру, которая ответственна за АТФ-зависимый протеолиз большинства клеточных белков. Протеасома 20S (700 кДа) содержит, как минимум, пять различных протеолитических активностей, которые обладают новым типом механизма, включающим остаток треонина в активный центр (Соих О., Tanaka К. and Goldberg A., 1966, Ann.Rev.Biochem. 65:801-847).

Протеасому 20S получили в кристаллической форме из архебактерии Thermoplasma acidophilum (Lowe J., Stock D., Jap В., Zwickl P., Bauminster W. and Huber R., 1995, Science 268:533-539). Архебактериальная протеасома 20S содержит четырнадцать копий двух различных типов субъединиц, и , которые образуют цилиндрическую структуру, состоящую из четырех сложенных в столбик колец. Верхнее и нижнее кольца содержат по семь субъединиц каждое, а внутренние кольца содержат семь субъединиц . Пора пронизывает середину этой структуры, которая содержит протеолитические активные центры, и белок, предназначенный для разрушения, проходит через данный канал. Эукариотическая протеасома 20S является более сложной, чем протеасома архебактерии, потому что в течение эволюции число отличающихся субъединиц увеличилось, хотя данные субъединицы все еще могут быть классифицированы согласно номенклатуре и архебактерий в соответствии с их гомологией. Таким образом, четвертичная структура эукариотического комплекса аналогична структуре архебактерии, которая включает два кольца и два кольца . Однако архебактериальная протеасома отличается, она исходно проявляет химотрипсиноподобную протеолитическую активность (Dahlmann В. , Корр F., Kuehn L., Niedel В., Pfeifer G., 1989, FEBS Lett., 251:125-131; Seemuller E., Lupas A., Zuhl F., Zwickl P. and Bauminster W., 1995, FEBS Lett., 359:173; и Lowe J., Stock D., Jap В., Zwickl P., Bauminster W. and Huber R., 1995, Science, 268:533-539). Эукариотическая протеасома содержит, как минимум, пять поддающихся идентификации протеазных активностей. Они называются химотрипсиноподобная, трипсиноподобная и пептидилглутамил-пептидгидролизующая. Описаны также две другие активности, одна проявляет предпочтение к разрушению пептидных связей на карбоксильной стороне разветвленной цепи аминокислот, а другая - к разрушению связей между небольшими нейтральными аминокислотами (Orlowski M., 1990, Biochemistry, 29:10289-10297).

Несмотря на то, что указанная протеасома 20S содержит протеолитическую сердцевину, она не может разрушать белки in vivo до тех пор, пока она образует комплекс с 19S кэп-группировкой на любом конце своей структуры, которая сама по себе содержит множественные АТФ-азные активности. Эта увеличенная структура известна в качестве протеасомы 26S и быстро разрушает белки, которые были предназначены для деградации при добавлении множества молекул 8,5 кДа полипептида-убиквитина.

Первая стадия на пути к убиквитинизации белка протекает путем активации молекулы убиквитина при добавлении АТФ по его карбокси-концевому остатку глицина, что создает высокоэнергетическое тиоэфирное промежуточное соединение. Данная стадия катализируется убиквитин-активирующим ферментом Е1. Затем убиквитин переносится к активному остатку цистеина убиквитин-конъюгирующим ферментом Е2. Фермент Е2 присоединяет убиквитин к Е-аминогруппам остатков лизина субстратного белка, предназначенного для деградации. В некоторых случаях данный процесс требует присутствия убиквитиновой лигазы Е3. Повторяемая конъюгация убиквитина с остатками лизина ранее связанных убиквитиновых составляющих приводит к образованию мультиубиквитиновых цепей и создает каркас из убиквитина вокруг данного субстратного белка. Мультиубиквитиновые субстратные белки распознаются протеасомой 26S и разрушаются, а мультиубиквитиновые цепи высвобождаются из этого комплекса и убиквитин возвращается в кругооборот.

Что заставляет белок становиться убиквитинированным и затем разрушаться - этот вопрос исследуется до сих пор. Ясно, что это должна быть четко регулируемая серия событий, поскольку предельная синхронизация специфического белкового разрушения является ключевой для многих функций клеточного цикла. Было высказано предположение о нескольких сигналах, которые, по большей части, располагаются в центре на внутренних структурных последовательностях в самом субстрате. Один из таких предполагаемых сигналов представляет собой "N-концевое правило", в котором аминоконцевой остаток белка определяет время его полужизни. Другие белки, такие, например, как циклины, содержат короткую последовательность высококонсервативных аминокислот, именуемую "рамкой деструкции", которые, по-видимому, нужны для деградации. Кроме того, "РЕЗТ"-последовательности, которые состоят из областей, богатых пролином, аспартатом, глутаматом, серином и треонином, также, видимо, действуют в качестве сигналов деградации. Предполагается, что такие внутренние последовательности действуют в качестве элементов распознавания между данным белковым субстратом и его специфическим убиквитиновым механизмом.

Были описаны два типа ингибиторов, которые подавляют протеолитическую активность протеасомы. Было сообщено о некоторых пептидных альдегидах, которые подавляют химотрипсиноподобную активность, связанную с протеасомой (Vinitsky A., Michaud С., Powers J. and Orlowski M., 1992, Biochemistry, 31: 9421-9428; Tsubuki S. , Hiroshi K., Saito Y., Miyashita N., Inomata M. and Kawashima S., 1993, Biochem.Biophys.Res. Commun., 196:1195-1201; Rock K.I., Gramm C. , Rothstein L., Clark K., Stein R., Dick L., Hwang D. and Goldberg A. L. , 1994, Cell, 78:761-771). Они включают N-ацетил-L-лейцинил-L-лейцинал-L-норлейцинал (ALLN) и близкородственное соединение, N-ацетил-L-лейцинил-L-лейцинил-метионал (LLM) с K_i"s 0,14 мкМ. Наиболее сильный ингибитор этого типа представляет собой структурно близкое соединение N-карбобензоксил-L-лейцинил-L-лейцинил -L-норвалинал МС 115, которое проявляет K_i, равное 0,021 мкМ. Хотя эти пептидные альдегиды наиболее эффективны против химотрипсиноподобной протеолитической активности протеасом, тщательные исследования показали, что они не являются специфическими протеазными ингибиторами. В недавних сообщениях описан ряд сильных дипептидных ингибиторов, которые обладают in vitro значениями IC₅₀ в диапазоне 10-100 нМ (Iqbal M., Chatterjee S., Kauer J. C., Das M., Messina P., Freed В., Biazzo W. and Siman R., 1995, J. Med. Chem., 38:2276-2277) и ряд аналогичных сильных in vitro дипептидных ингибиторов, производных -кетокарбонильного и борного эфира (Iqbal М., Chatterjee S., Kauer J.C., Mallamo J.P., Messina P.A., Reiboldt A. and Siman R., 1996, Bioorg. Med. Chem.Lett., 6:287-290).

В другом сообщении описан класс соединений, которые проявляют специфичность в ингибировании протеасомной активности (Fenteany G., Standaert R. F. , Lane W.S., Choi S., Corey E.J. and Schreiber S.L., 1995, Science, 268: 726-731). Лактацистин представляет собой метаболит Streptomyces, который специфически ингибирует протеолитическую активность данного протеасомного комплекса. Эта молекула, первоначально открытая как обладающая способностью индуцировать невритное разрастание в нейробластомной клеточной линии (Omura et al. , 1991, J.Antibiot. 44:113), впоследствии показала способность ингибировать пролиферацию некоторых типов клеток (Fenteany et al., 1994, Proc. Nat"1. Acad.Sci.USA, 91:3358). Благодаря использованию радиоактивно меченого лактацистина, в исследованиях по связыванию (Fenteany et al., 1995, Science 268:726-731) идентифицировали участок связывания и механизм действия. В этих исследованиях было показано, что лактацистин обратимо связывается с остатком треонина, расположенным на аминоконце -субъединицы протеасом. Был исследован ряд аналогов, основанных на структуре лактацистина (Fenteany et al., 1995, Science, 268:726-731). Эти исследования свидетельствуют, что структура -лактона была существенной для его ингибирующей активности.

В настоящее время хорошо обосновано, что протеасома представляет собой основную внелизосомную протеолитическую систему, которая участвует в путях расщепления, влияющих на многочисленные и разнообразные клеточные функции, такие как клеточное деление, процессинг антигена и деградация короткоживущих регуляторных белков, таких как факторы транскрипции, онкогенные продукты и циклины (обзор у Ciechanover A., 1994, Cell, 79:13-21). Первая функция протеасомы заключается в катализе протеолиза белков на небольшие пептиды. Однако было также продемонстрировано, что убиквитин-протеасомный путь может катализировать регулируемый протеолитический процессинг большого неактивного предшественника в активный белок. Наиболее хорошо документированный пример этого связан с активацией фактора транскрипции NF-кВ (Palombella V.J., Rando O.J., Goldberg A.L. and Maniatis T., 1994, Cell, 78:773-785). Активная форма NF-кВ представляет собой гетеродимер, состоящий из субъединицы р65 и субъединицы р50. Последняя представлена в цитозоле клетки в неактивной форме предшественника, а именно - р105, 105 кДа полипептидного предшественника р50. Протеолитический процессинг р105 с образованием р50 происходит через убиквитин-протеасомный путь. Кроме того, процессированные р50 и р65 поддерживаются в цитозоле в виде неактивного комплекса с ингибирующим белком IкВ. Сигналы воспаления активируют NF-кВ в результате инициации сигнального пути на полную деградацию IкВ и стимулируют также превращение р105 в р50. Таким образом, для сигнала, индуцирующего активацию NF-кВ, требуется два протеолитических события, оба определяемые убиквитин-протеасомным путем. Что вызывает терминацию протеолиза р105 после образования р50, остается неизвестным, но было предположено, что конформация р50 может придавать ему устойчивость для дальнейшего процессинга и обусловливать его диссоциацию от 268-комплекса.

Тот факт, что протеасома играет ключевую роль в активации NF-кВ, мог бы использоваться для клинических целей путем использования ингибиторов, управляющих протеасомным протеолизом. При некоторых заболеваниях нормальная функция активного NF-кВ может оказаться пагубной для здоровья человека, что наблюдается в виде воспалительных ответов после бактериальной, грибковой или вирусной инфекции. Таким образом, ингибиторы активации NF-кВ, связанные с их способностью предупреждать секрецию цитокинов, могут быть потенциально полезными для лечения ARDS (острый респираторный дистресс-синдром) и AIDS (СПИД). Так как активация NF-кВ существенна также для ангиогенеза, протеасомные ингибиторы могут быть полезными в лечении заболеваний, ассоциированных с аномальной неоваскуляризацией.

р53 был впервые описан в качестве онкопротеина, но впоследствии было показано, что он участвует во многих клеточных процессах (обзор Ко L.J. and Proves С., 1996, Genes Dev., 10, 1054-1072). Было показано, что р53 индуцирует апоптоз в некоторых гемопоэтических клеточных линиях (Oren M., 1994, Semin. Cancer Biol. , 5, 221-227) через воздействие многих разных стимулов, в том числе повреждение ДНК, вирусную инфекцию и удаление ростовых факторов. Однако важно отметить, что апоптоз может быть индуцирован способом, не зависящим от р53, например, путем действия глюкокортикоидов. Индукция р53 приводит к прекращению клеточного роста в G1-фазе клеточного цикла, а также к клеточной смерти в результате апоптоза. Обе эти функции позволяют р53 контролировать повреждение ДНК, снижая, таким образом, распространение ДНК-мутаций при клеточном делении. р53 останавливают клетки на Gl-фазе путем индукции циклин-зависимого киназного ингибитора р21, который, в свою очередь, вызывает накопление гипофосфорилированной формы продукта гена ретинобластомы. Предполагается, что р53 действует в качестве контрольной точки в клетке после повреждения ДНК, вызывая сперва остановку клеточного деления и апоптоз. Как известно, деградация р53 осуществляется через убиквитин-протеасомный путь, и прерывание деградации р53 представляет собой вероятный способ индукции апоптоза. Другая потенциальная выгода протеасомных ингибиторов может заключаться в лечении заболеваний, которые происходят при аномалии клеточной пролиферации.

Точно установлено, что убиквитин-протеасомный путь является решающим для регуляции деструкции циклинов, которые регулируют выход из митоза и позволяют клеткам переходить в следующую фазу клеточного цикла. Поэтому, ингибирование деградации циклинов с использованием протеасомных ингибиторов вызывает остановку роста. По этой причине еще одна потенциальная выгода протеасомных ингибиторов заключается в их использовании для лечения заболеваний, которые происходят от ускоренного клеточного деления. Они включают в себя рак, сердечно-сосудистые заболевания, такие как миокардит, рестеноз после ангиопластики, заболевания почек, такие как волчанка, поликистозное заболевание почек, грибковые инфекции, дерматологические заболевания, такие как псориаз, аномальное заживление ран, келоид, иммунологические заболевания, такие как аутоиммунные, астма и аллергия, острая и аллергическая реакция замедленного типа, реакция "трансплантат против хозяина", отторжение трансплантата и нейроиммунологические заболевания, такие как множественный склероз и острый рассеянный энцефаломиелит.

Цель настоящего изобретения - создать способ ингибирования клеточной пролиферации у млекопитающих, который использует терапевтически эффективное количество ранее неизвестной композиции со свойствами ингибирования у них клеточной пролиферации.

Цель настоящего изобретения - создание способа эффективного лечения заболеваний, которые приводят к ускоренному клеточному делению.

Еще одна цель настоящего изобретения - создание способа лечения пролиферативных заболеваний, который воздействует путем ингибирования деградации протеасомных ингибиторов.

Еще одна цель настоящего изобретения - использовать терапевтически эффективное количество данной композиции для ингибирования нарушений клеточной пролиферации у человека.

В первом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет собой способ ингибирования клеточной пролиферации у млекопитающих, включающий введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения, обладающего формулой:



В этом соединении R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано.

R₅-R₉, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих водород, галоген, гидроксил, тиол, оксо, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано;

Х выбран из группы соединений, включающих водород, -D₁, -D₂, -E, -D₁,-Е, -D₂-E, -D₁-D₂ или соединение, обладающее формулой:



где D₁ и D₂, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих соединение, обладающее формулой:



или водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил или алкилциклогетероалкил;

где Е выбрана из группы соединений, включающих:



или водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил или алкилциклогетероалкил.

Если D₁, D₂ и/или Е выбраны из соединений, включающих заместители R₁₀-R₁₄ J₁ и J₂, то R₁₀-R₁₄, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих водород, галоген, гидроксил, тиол, оксо, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано, а J₁ и J₂, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих N-R₁₅, CR₁₆R₁₇, О, S-(O)_0-2, Р-(O)_0-3, где R₁₅-R₁₇, каждый в отдельности, может быть выбран из группы соединений, включающих водород, галоген, гидроксил, оксо, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероциклическое соединение, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил или циано.

Данные композиции считаются пригодными, если назначаются в терапевтических количествах, для лечения млекопитающих, и предпочтительно для лечения людей, страдающих нарушениями клеточной пролиферации, инфекционными заболеваниями и иммунологическими заболеваниями.

Фиг. 1 представляет собой Вестерн-блот-анализ иммунореактивности с использованием антител к анти-IкВ клеточного экстракта RAW, которые были обработаны соединениями 173 и 187, которые описаны в табл. 1 и 2;

Фиг. 2 представляет собой Вестерн-блот-анализ иммунореактивности к анти-Р50-антителам клеточных экстрактов RAW, которые были обработаны соединением 187, которое описано в табл. 1 и 2, перед их выдерживанием с липополисахаридом (LPS);

Фиг. 3 представляет собой анализ изменения подвижности в геле ядерного экстракта, полученного из клеток RAW, которые были предварительно обработаны соединением 187, которое описано в табл. 1 и 2, перед выдерживанием с LPS.

Настоящее изобретение представляет собой способ ингибирования нарушений клеточной пролиферации, инфекционных заболеваний и иммунологических заболеваний у млекопитающих, и особенно у человека, с использованием композиций, имеющих нижеследующую общую формулу:



В этой композиции R₁-R₄, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано.

В этой композиции R₅-R₉, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих водород, галоген, гидроксил, тио, оксо, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано.

Х выбран из группы соединений, включающих водород, -D₁, -D₂, -E, D₁-D₂, -D₁-E₁, -D₂-E или соединение, имеющее формулу:



в которой D₁ и D₂, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих



водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенное гетероциклическое соединение, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил или алкилциклогетероалкил и

в которой Е выбрано из группы соединений, включающих:



водород, галоген, гидроксил, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил или алкилциклогетероалкил.

В вышеприведенных соединениях R₅-R₉, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих водород, галоген, гидроксил, тиол, оксо, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано.

Если D₁, D₂ и/или Е выбраны из соединений, включающих заместители R₁₀-R₁₄, J₁ и J₂, тогда: R₁₀-R₁₄, каждый в отдельности, выбраны из группы соединений, включающих водород, галоген, гидроксил, тиол, оксо, низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероцикл, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил, нитро или циано; a J₁ и J₂, каждый в отдельности, выбраны из группы, включающей N-R₁₅, CR₁₆R₁₇, О, S-(О)_0-2, Р-(O)_0-3, в которой R₁₅-R₁₇, каждый в отдельности, замещен компонентом, выбранным из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, оксо, тиол, низший алкил, замещенный низший алкил, алкинил, алкилалкенил, алкилалкинил, алкокси, алкилтио, ацил, арилокси, амино, амидо, карбоксил, арил, замещенный арил, гетероциклическое соединение, гетероарил, замещенный гетероцикл, гетероалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкилциклоалкил, алкилциклогетероалкил или циано.

Для описания различных заместителей химической композиции, пригодной для способа настоящего изобретения, используются нижеследующие термины. Данные термины определены следующим образом:

Термин "галоген" относится к атомам фтора, брома, хлора и йода.

Термин "гидроксил" относится к группе -ОН.

Термин "оксо" относится к группе =О.

Термин "тиол" или "меркапто" относится к группе -SH и -S(O)_0-2.

Термин "низший алкил" относится к циклической, разветвленной или неразветвленной цепи, алкильной группе из одного-десяти углеродных атомов. Данный термин дополнительно иллюстрируется такими группами как метильная, этильная, н-пропильная, 1-пропильная, н-бутильная, трет-бутильная, 1-бутильная (или 2-метилпропильная), циклопропилметильная, 1-амильная, н-амильная, гексильная и тому подобное.

Термин "замещенный низший алкил" относится к низшему алкилу, который только что описан, включающему одну или несколько групп, таких как гидроксильная, тиоловая, алкилтиоловая, галогеновая, алкокси, амино, амидо, карбоксильная, циклоалкильная, замещенная циклоалкильная, гетероциклическая, циклогетероалкильная, замещенная циклогетероалкильная, ацильная, карбоксильная, арильная, замещенная арильная, арилокси, гетарильная, замещенная гетарильная, аралкильная, гетероаралкильная, алкилалкенильная, алкилалкинильная, алкилциклоалкильная, алкилциклогетероалкильная, циано. Эти группы могут быть присоединены к любому атому углерода составляющей низшего алкила.

Термин "алкенил" относится к группе -СR"=СR"R"", где R", R", R"", каждый, выбран из водорода, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, ацила, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила или им подобным.

Термин "алкинил" относится к группе -CC-R, где R" выбран из водорода, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, ацила, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила или им подобным.

Термин "алкилалкенил" относится к группе -R-CR"=CR""R"", где R представляет собой низший алкил или замещенный низший алкил, R", R"", R"", каждый в отдельности, выбран из водорода, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, ацила, арила, замещенного арила, гетарила или замещенного гетарила, как указано ниже.

Термин "алкилалкинил" относится к группе -RCCR, где R представляет собой низший алкил или замещенный низший алкил, R" представляет собой водород, низший алкил, замещенный низший алкил, ацил, арил, замещенный арил, гетарил или замещенный гетарил, как указано ниже.

Термин "алкокси" относится к группе -OR, где R представляет собой низший алкил, замещенный низший алкил, ацил, арил, замещенный арил, аралкил, замещенный аралкил, гетероалкил, гетероарилалкил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, циклогетероалкил или замещенный циклогетероалкил, как указано ниже.

Термин "алкилтио" обозначает группу -SR, -S(О)n=_1-2-R, где R представляет собой низший алкил, замещенный низший алкил, арил, замещенный арил, аралкил или замещенный аралкил, как указано ниже.

Термин "ацил" относится к группам -C(O)R, где R представляет собой водород, низший алкил, замещенный низший алкил, арил, замещенный арил и тому подобное, как указано ниже.

Термин "арилокси" относится к группам -ОАr, где Аr представляет собой арил, замещенный арил, гетероарил или замещенную гетероарильную группу, как указано ниже.

Термин "амино" относится к группе NRR", где R и R" могут независимо представлять собой водород, низший алкил, замещенный низший алкил, арил, замещенный арил, гетарил, циклоалкил или замещенный гетарил, как указано ниже, или ацил.

Термин "амидо" относится к группе -С(О)NRR", где R и R" могут независимо представлять собой водород, низший алкил, замещенный низший алкил, арил, замещенный арил, гетарил, замещенный гетарил, как указано ниже.

Термин "карбоксил" относится к группе -С(О)OR, где R может независимо представлять собой водород, низший алкил, замещенный низший алкил, арил, замещенный арил, гетарил, замещенный гетарил и им подобное.

Термин "арил" или "Аr" относится к ароматической карбоциклической группе, обладающей, как минимум, одним ароматическим кольцом (например, фенильным или дифенильным) или множественными конденсированными кольцами, в которых, как минимум, одно кольцо является ароматическим (например, 1,2,3,4-тетрагидронафтильное, нафтильное, антрильное или фенантрильное кольцо).

Термин "замещенный арил" относится к арилу, необязательно замещенному одной или несколькими функциональными группами, например, группой галогена, низшего алкила, низшего алкокси, низшего алкилтио, трифторметила, амино, амидо, карбоксила, гидроксила, арила, арилокси, гетероцикла, гетарила, замещенного гетарила, нитро, циано, алкилтио, тиола, сульфамидо и тому подобное.

Термин "гетероцикл" относится к насыщенной, ненасыщенной или ароматической карбоциклической группе, обладающей единственным кольцом (например, морфолино, пиридильным или фурильным кольцом) или множественными конденсированными кольцами (например, нафтилпиридильным, хиноксалильным, хинолинильным, индолизинильным или бензо[b]тиенильным кольцом) и обладающей в данном кольце, как минимум, одним гетероатомом, таким как N, О или S, которое может быть необязательно незамещенным или замещенным, например, галогеном, низшим алкилом, низшим алкокси, низшим алкилтио, трифторметилом, амино, амидо, карбоксилом, гидроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, гетарилом, замещенным гетарилом, нитро, циано, алкилтио, тиолом, сульфамидо и тому подобное.

Термины "гетероарил" или "гетар" относятся к гетероциклу, в котором, как минимум, одно гетероциклическое кольцо является ароматическим.

Термин "замещенный гетероарил" относится к гетероциклу, необязательно моно- или полизамещенному одной или несколькими функциональными группами, например, группой галогена, низшего алкила, низшего алкокси, низшего алкилтио, трифторметила, амино, амидо, карбоксила, гидроксила, арила, арилокси, гетероцикла, гетарила, замещенного гетарила, нитро, циано, алкилтио, тиола, сульфамидо и тому подобное.

Термин "аралкил" относится к группе -R-Ar, где Аr представляет собой арильную группу, a R представляет собой низший алкил или замещенную низшую алкильную группу. Арильные группы могут быть необязательно незамещенными или замещенными, например, галогеном, низшим алкилом, алкокси, алкилтио, трифторметилом, амино, амидо, карбоксилом, гидроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, гетарилом, замещенным гетарилом, нитро, циано, алкилтио, тиолом, сульфамидо и тому подобным.

Термин "гетероалкил" относится к группе -R-Het, где Het представляет собой гетероциклическую группу, а R представляет собой низшую алкильную группу. Гетероалкильные группы могут быть необязательно незамещенными или замещенными, например, галогеном, низшим алкилом, низшим алкокси, низшим алкилтио, трифторметилом, амино, амидо, карбоксилом, гидроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, гетарилом, замещенным гетарилом, нитро, циано, алкилтио, тиолом, сульфамидо и тому подобным.

Термин "гетероарилалкил" относится к группе -R-HetAr, где HetAr представляет собой гетероарильную группу, а R - низший алкил или замещенный низший алкил. Гетероарилалкильные группы могут быть необязательно незамещенными или замещенными, например, галогеном, низшим алкилом, замещенным низшим алкилом, алкокси, алкилтио, арилом, арилокси, гетероциклом, гетарилом, замещенным гетарилом, нитро, циано, алкилтио, тиолом, сульфамидо и тому подобным.

Термин "циклоалкил" относится к двухвалентной циклической или полициклической алкильной группе, содержащей 3-15 углеродов. Что касается полициклических групп, они могут представлять собой множественные конденсированные кольца, среди которых одно из периферических колец может быть ароматическим (например, инданильное, тетрагидронафталиновое и т.д., и т.п.).

Термин "замещенный циклоалкил" относится к циклоалкильной группе, включающей один или несколько заместителей, например, галоген, низший алкил, замещенный низший алкил, алкокси, алкилтио, арил, арилокси, гетероцикл, гетарил, замещенный гетарил, нитро, циано, алкилтио, тиол, сульфамидо и тому подобное.

Термин "циклогетероалкил" относится к циклоалкильной группе, в которой один или несколько углеродных атомов замещены гетероатомом (например, N, О, S или Р).

Термин "замещенный циклогетероалкил" относится, как здесь указано, к циклогетероалкильной группе, которая содержит один или несколько заместителей, таких как галоген, низший алкил, низший алкокси, низший алкилтио, трифторметил, амино, амидо, карбоксил, гидроксил, арил, арилокси, гетероцикл, гетарил, замещенный гетарил, нитро, циано, алкилтио, тиол, сульфамидо и тому подобное.

Термин "алкил циклоалкил" относится к группе -R-циклоалкил, где циклоалкил представляет собой циклоалкильную группу, a R представляет собой низший алкил или замещенный низший алкил. Циклоалкильные группы могут быть необязательно незамещенными или замещенными, например, галогеном, низшим алкилом, низшим алкокси, низшим алкилтио, трифторметилом, амино, амидо, карбоксилом, гидроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, гетарилом, замещенным гетарилом, нитро, циано, алкилтио, тиолом, сульфамидо и тому подобное.

Термин "аминокислота" относится к D- или L-изомеру естественно встречающихся или синтетических альфа-аминокислот, предпочтительными аминокислотами являются естественно встречающиеся аминокислоты аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина или валина.

Обычно D₁, D₂ и Е, при наличии в данной композиции, могут представлять собой аминокислоты. Обычно предпочтительными являются липофильные аминокислоты. Вообще, аминокислотные сокращения следуют из Правил IUPAC-IUB Объединенной Комиссии по Биохимической Номенклатуре, приведенных в Eur. J.Biochem., 158, 9(1984).

Предпочтительно, когда R₃ представляет собой метокси, -D₁ представляет собой лейцин и -D₂ представляет собой лейцин, а Е представляет собой NR"R". Более предпочтительно, когда -D₁ представляет собой 1-лейцин, a -D₂ представляет собой d-лейцин, и когда Е выбран из группы соединений, состоящих из бензиламина, 1-инданиламина, N,N"-дибензиламина, 2,6-дифторбензиламина, 4-метоксибензиламина, пиперониламина, NH₂ и глицинамида.

В одной предпочтительной композиции R₃ представляет собой метокси, D₁ представляет собой лейцин, D₂ представляет собой лейцин, а Е представляет собой бензиламин. В другой предпочтительной композиции R₃ представляет собой метокси, D₁ представляет собой лейцин, D₂ представляет собой лейцин, а Е представляет собой 1-инданиламин. Еще в одной предпочтительной композиции R₃ представляет собой метокси, D₁ представляет собой лейцин, D₂ представляет собой лейцин, а Е представляет собой N,N-дибензиламин. В другой предпочтительной композиции R₃ представляет собой метокси, D₁ представляет собой лейцин, D₂ представляет собой лейцин, а Е представляет собой 2,6-дифторбензиламин.

В этих предпочтительных композициях предпочтительно, кроме того, когда D₁ представляет собой L-лейцин, a D₂ представляет собой D-лейцин. Известные соединения, которые могут быть пригодны для данного терапевтического способа настоящего изобретения, изложены в табл. 1.

Специалисты в данной области знают, что стереоизомеры описанных здесь композиций, а также изомер и стереоизомеры компонентов, которые включают идентифицированные здесь композиции, все подпадают под объем этих композиций, которые пригодны для терапевтического способа данного изобретения.

Если данное соединение, пригодное для способа настоящего изобретения, содержит основную группу, можно получить кислую аддитивную соль. Кислые аддитивные соли данных соединений получали обычным образом с подходящим растворителем из данного исходного соединения и избытка кислоты, такой как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, фосфорная, уксусная, малеиновая, янтарная или метансульфоновая. Если конечное соединение содержит кислотную группу, можно получить катионные соли. Обычно исходное соединение обрабатывают избытком щелочного реагента, такого как гидроксид, карбонат или алкоксид, содержащий соответствующий катион. Катионы, такие как Na⁺, К^-, Са⁺² и NH⁴⁺, являются примерами катионов, присутствующих в фармацевтически приемлемых солях. Некоторые соединения формируют внутренние соли или цвиттерионы, которые также приемлемы.

Соединения, описанные выше, пригодны для лечения нарушений клеточной пролиферации, инфекционных заболеваний и иммунологических заболеваний у млекопитающих, и особенно у больных людей, которые нуждаются в таком лечении. Нарушения клеточной пролиферации, которые можно лечить с использованием вышеуказанной композиции, включают рак, сердечно-сосудистое заболевание, такое как миокардит и рестеноз после ангиопластики, почечные заболевания, такие как волчанка и поликистоз почек, отторжение "трансплантат против хозяина", подагру и другие пролиферативные нарушения. Аутоиммунные заболевания, которые можно лечить с помощью вышеуказанных композиций, включают ревматоидный артрит, волчанку, диабет типа I, множественный склероз и аналогичные нарушения, и заболевания. Инфекционные заболевания, которые можно лечить с использованием вышеописанных композиций, включают IBD (воспалительное заболевание кишечника), болезнь Крона, AIDS (СПИД), ARDS (острый респираторный дистресс-синдром) и аналогичные нарушения. Вышеописанные композиции могут также использоваться для лечения грибковых инфекций, дерматологических заболеваний, таких как псориаз, аномальное заживление ран, келоиды, иммунологические заболевания, такие как аутоиммунные, астма, аллергия, острая и замедленного типа аллергия, реакция "трансплантат против хозяина", отторжение трансплантата и нейроиммунологическое заболевание, такое как множественный склероз и острый рассеянный энцефаломиелит.

Способ лечения этих заболеваний и нарушений включает введение, парентерально или перорально, эффективного количества выбранного соединения или его сочетаний, диспергированного в фармацевтическом носителе. Дозовые единицы данного активного ингредиента обычно выбирали в диапазоне от 0,01 до 100 мг/кг, и специалисту в данной области ее будет легко определить в зависимости от пути введения, возраста и состояния данного пациента. Эти дозовые единицы могут быть введены 1-10 раз ежедневно во время острого или хронического заболевания. Когда соединения настоящего изобретения назначали в соответствии с настоящим изобретением, нежелательных токсикологических эффектов не наблюдали.

Фармацевтические композиции из числа соединений настоящего изобретения или их производных могут быть приготовлены в виде растворов или лиофилизированных порошков для парентерального введения. Перед использованием порошки могут быть воссозданы путем добавления подходящего разбавителя или иного фармацевтически приемлемого носителя. Данный жидкий препарат обычно представляет собой забуференный изотонический водный раствор. Примеры подходящих разбавителей представляют собой изотонический физиологический раствор, стандартная 5%-ная декстроза в воде или раствор, забуференный ацетатом натрия или ацетатом аммония. Такой препарат особенно подходит для парентерального введения, но может также использоваться и для перорального введения. Желательным может быть добавление наполнителей, таких как поливинилпирролидон, желатин, гидроксицеллюлоза, акация, полиэтиленгликоль, маннит, натрийхлорид или натрийцитрат. Или же эти соединения могут быть заключены в капсулу, таблетированы или приготовлены в виде эмульсии или сиропа для перорального введения. Для усиления или стабилизации данной композиции, или для облегчения приготовления данной композиции могут быть добавлены фармацевтически приемлемые твердые или жидкие носители. Жидкие носители включают сироп, арахисовое масло, оливковое масло, глицерин, физиологический раствор, спирты и воду. Твердые носители включают крахмал, лактозу, дегидратированный кальцийсульфат, магнезию, магнийстеарат или стеариновую кислоту, тальк, пектин, акацию, агар или желатин. Данный носитель может также включать укрепляющее вещество, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, отдельно или с воском. Количество данного твердого носителя варьирует, но, предпочтительно, чтобы оно было заключено примерно между 20 мг и примерно 1 г на дозовую единицу. Данные фармацевтические препараты готовили, придерживаясь традиционных методик фармации, охватывающих измельчение, смешивание, гранулирование и, при необходимости, прессование для таблеточных форм; или измельчение, смешивание и наполнение твердых желатиновых капсульных форм. При использовании жидкого носителя данный препарат готовили в виде сиропа, эликсира, эмульсии и либо водной, либо неводной суспензии. Такой жидкий препарат можно вводить непосредственно перорально или заключенным в мягкую желатиновую капсулу.

Пример 1.

Соединения, пригодные для терапевтического способа настоящего изобретения, готовили с помощью традиционных методов органической химии. Реагенты сочетания хорошо известны в данной области техники, такие как DCC и другие карбодиимиды, EDC, ВОР и РРА, и они могут необязательно использоваться с другими реагентами, такими как НОВТ, NММ и DMAP, которые могут способствовать данной реакции. Соединения формулы (1), в которой D₁, D₂ и Е представляют собой аминокислоты, хорошо известные в данной области техники, получали с использованием либо традиционного жидкофазного или твердофазного методов, как описано у Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, First Edition, 1984. Подходящими защитными группами для определенной аминогруппы являются такие защитные группы, которые описаны у Greene et al., "Protective Group in Organic Synthesis, " Second Edition, John Wiley and Sons, New York, 1991. Бензилоксикарбонильная, трет-бутоксикарбонильная и флуоренилметоксикарбонильная группы являются особенно пригодными аминозащищающими группами.

Твердофазный пептидный синтез осуществляли следующим образом. Катанную амидную смолу помещали в шприц, снабженный заплавленным фильтром. Удаляли защиту со смолы с использованием 20%-ного пиперидина в диметилформамиде (DMF). Через 20 минут эту смолу промывали пять раз в DMF, пять раз метанолом, а затем пять раз в DMF. Раствор аминокислоты (Е), карбодиимид и НОВТ в DMF натягивали в шприц и данную реакционную смесь перемешивали в течение 4-20 часов. Полученный реакционный раствор выталкивали и данную смесь промывали пять раз DMF, пять раз метанолом и затем пять раз DMF. Этот цикл повторяли до присоединения нужной последовательности. Для конечного присоединения использовали 5-метокси-1-инданон-3-уксусную кислоту, карбодиимид и НОВТ. После заключительных громывок этой смолы полученный пептидный фрагмент отщепляли от этой смолы с использованием 95% трифторуксусной кислоты (ТФУ)/5% воды. Концентрирование отщепленной смеси дает белое твердое вещество.

Пример 2.

Соединения настоящего изобретения, полученные в соответствии со способом из Примера 1, испытывали следующим образом. Каталитическую субъединицу протеасомы 20S (известную также в качестве мультикаталитического протеиназного комплекса) выделяли очисткой до гомогенности из мозга крупного рогатого скота, в соответствии с опубликованными способами (Wilk S. and Orlowski М., 40, 842, J.Neurochem. (1983)). Химотрипсиновую активность данного комплекса измеряли по увеличению флуоресценции после расщепления субстратного пептида сукцинил-лейцин-лейцин-валин-тирозин-7-амино-4-метилкумарина. Стандартный in vitro анализ состоит из 2 мкг протеасомы 20S, 0,1-100 мкг/мл протеасомного ингибитора в 200 мкл 50 мМ HEPES, содержащего 0,1% додецилсульфата натрия, рН 7,5. Протеолитическую реакцию инициировали добавлением 50 мкМ флуорогенного пептидного субстрата и позволяли развиваться в течение 15 минут при 37^oС. Эту реакцию останавливали добавлением 100 мМ ацетатного буфера, рН 4,0. Скорость протеолиза прямо пропорциональна количеству высвобожденного аминометилкумарина, который измеряли методом флуоресцентной спектроскопии (ЕХ 370 нм, ЕМ 430 нм). Структуры протестированных соединений, а также результаты данного опыта приведены в табл. 2.

Пример 3.

Соединения, полученные в соответствии со способом из Примера 1, анализировали в нескольких различных клеточных линиях. Клеточные монослои культивировали в присутствии тестируемого соединения в течение 18 часов, чтобы определить его способность ингибировать клеточную пролиферацию. Уровень клеточной пролиферации определяли колориметрически с использованием нерадиоактивного анализа клеточной пролиферации Celltiter 96 Aqueous (Promega), где клеточная пролиферация была прямо пропорциональна поглощению при 490 нм. Результаты приведены в виде IC₅₀ в мкг/мл ингибирования клеточной пролиферации в разных типах клеток (табл. 3).

Пример 4.

Соединения, полученные в соответствии со способом из Примера 1, тестировали на ингибирование TNF-синтеза, индуцируемого LPS. Клетки RAW предварительно обрабатывали разными концентрациями тестируемого соединения в течение 1 часа перед введением липополисахарида (100 нг/мл). Через 1 час собирали супернатанты клеточных культур и анализировали концентрацию TNF в ELISA (Biosource) (табл. 4)

Пример 5.

Данный Пример проверяет способность соединения 173 и особенно соединения 187, описанных в табл. 1 и 2, подавлять протеасомную активность, как указано, частично в присутствии IкВ и/или р105 в ингибируемых клетках. Для того чтобы транслоцировать NF-кВ в данное ядро в ответ на раздражитель, такой как липополисахарид (LPS), и активировать транскрипцию, необходимо, чтобы произошли два протеолитических события, а именно деградация ингибирующего белка IкВ и превращение р105 в р50. Эти протеолитические события служат для обнаружения сигнала NF-кВ, локализованного в ядре.

Ингибирование деградации IкB, индуцируемого LPS

Клетки RAW предварительно обрабатывали разными концентрациями тестируемого соединения в течение 1 часа перед введением липополисахарида (100 нг/мл). Через 1 час собирали лизаты целых клеток, методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) разделяли 10 мкг белка, переносили на нитроцеллюлозу и анализировали на иммунореактивность с помощью антитела анти-IкВ. Вестерн-блоты (см. фиг.1) визуализировали с использованием детекторного набора фирмы Boehringer Mannheim Chemiluminescent. Полученный блот показал, что IкВ присутствует в клетках, обработанных соединениями 173 и 187 в количестве 5 мкг/мл.

Ингибирование превращения р150 в р50, индуцируемого LPS

Соединение 187, которое описано в табл. 1 и 2, использовали для предварительной обработки клеток RAW, как описано выше, а лизаты целых клеток, полученных как описано выше, анализировали на иммунореактивность против антитела р50. Полученные результаты, представленные на фиг. 2, свидетельствуют, что и р50 и р150 присутствуют в клетках, обработанных соединением 187, до 5 мкг/мл, а в необработанных клетках большая часть Р105 была превращена в р50.

Ингибирование индуцированной LPS транслокации NF-кВ в ядерную фракцию указанных клеток

Клетки RAW предварительно обрабатывали в течение 1 часа соединением 187 (20 мкг/мл), а затем инкубировали с липополисахаридом (100 нг/мл) в течение еще одного часа. Ядерные фракции получали в соответствии со стандартными методиками. Реакции связывания во время анализов "задержки в геле" содержат 5 мкг белка, экстрагированного из ядра, 50000 cpm (импульсов в минуту) ³²Р-меченого NF-кВ универсального участка связывания олигонуклеотида в присутствии или в отсутствие пятидесятикратного избытка немеченого олигонуклеотида. Анализ "задержки в геле", приведенный на фиг. 3, показывает, что соединение 187 является эффективным в подавлении накопления NF-кВ в ядре клеток.