применение опиоидного пептида dago для стимуляции репаративного остеогенеза у лабораторных животных

Формула изобретения

Применение опиоидного пептида DAGO, имеющего формулу Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH₂)₂OH, для стимуляции репаративного остеогенеза у лабораторных животных.

Описание изобретения к патенту

Область применения: изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, и может использоваться для стимуляции сращения перелома трубчатых костей у лабораторных животных (больных).

В литературе многими авторами описаны свойства опиоидного пептида DAGO. Показано, что DAGO является высокоселективным агонистом опиодных мю-рецепторов (Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н. Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. 1994. Томск. Изд-во Томского университета. 352 с., Kosterlitz H.W., Paterson S.J. Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH₂)₂ОH is a selective ligand for the -opiate binding site// Br. J. Pharmacol.- 1981. - Vol. 73, N 1. - P. 299. и др.). Многочисленными исследованиями подтверждено наличие у DAGO анальгетических (Судаков С.К., Люпина Ю.В., Медведева О.Ф. и др. Особенности действия -, - и -опиоидных агонистов и ингибитора энкефалиназ RB 101 у крыс двух инбредных линий // Бюл. эксперим. биол. и медиц. - 1998. - Т. 125, N 5. - С. 551-554), антиаритмических (Михайлова С.Д., Сторожаков Г. И. , Бебякова Н. А., Семушкина Т.М. О роли блуждающих нервов в антиаритмическом эффекте DAGO при острой ишемии миокарда// Бюл. эксперим. биол. и медиц. - 1997. - Т. 124, N 10. - С. 377-379), противогипоксических (Закусов В. В., Яснецов В.В., Островская Р.У. и др. Влияние агонистов и антагонистов опиатных рецепторов на устойчивость животных к гипоксической гипоксии// Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1984. - Т. 98, N 12. - С. 680-682), поведенческих (Судаков С.К., Люпина Ю.В., Медведева О.Ф. и др. Особенности действия -, - и -опиоидных агонистов и ингибитора энкефалиназ RB 101 у крыс двух инбредных линий // Бюл. эксперим. биол. и медиц. - 1998. - Т. 125, N 5. - С. 551-554) эффектов. В основе действия DAGO лежит его взаимодействие с опиоидными мю-рецепторами в различных органах и тканях, что вызывает изменение в клетках продукции вторичных мессенджеров, в частности, ц-АМФ и ц-ГМФ.

Задачей исследования является применение опиоидного пептида DAGO, имеющего формулу Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH₂)₂OH, для стимуляции репаративного остеогенеза.

Поставленная задача достигается путем применения опиоидного пептида DAGO для стимуляции репаративного остеогенеза. Опиоидный пептид DAGO вводят подкожно в дозе 6,3 мкг на 1 кг массы тела в 0,1 мл физиологического раствора ежедневно в течение 7 дней с момента перелома экспериментальным животным (мышам линии СВА).

Пример конкретного использования.

Мышам линии СВА моделировали перелом костей голени задней правой лапки. В течение 7 дней со дня перелома животным подкожно вводили высокоселективный агонист опиоидных мю-рецепторов DAGO в дозе 6,3 мкг на 1 кг массы тела в 0,1 мл физиологического раствора. Мышам контрольной группы вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени. Животных выводили из эксперимента на 4, 7, 10 и 14 сутки после перелома. Срезы образующейся в области перелома мозоли окрашивали гематоксилином-эозином и по Ван-Гизону. Окрашенные срезы изучали морфологически. Также на препаратах планиметрическим методом определяли удельные площади волокнистой соединительной, хрящевой и новообразованной (губчатой) костной тканей. О стимуляции репаративного остеогенеза в области перелома судили по увеличению удельного объема новообразованной (губчатой) костной ткани в структуре мозоли у животных, получавших DAGO, по сравнению с контрольными.

При гистологическом изучении структуры регенерата в области перелома у животных контрольной группы установлено, что на 4-е сутки эксперимента костные отломки окружены рыхлой соединительной тканью. Встречаются очаги тканевого детрита. Межклеточное вещество отечно, содержит набухшие коллагеновые волокна. Клеточный состав ткани разнообразен. В зоне, прилежащей к отломкам, рыхлая фиброзная ткань богата фибробластами, имеющими крупные ядра и выраженные многочисленные отростки. Отмечается значительное содержание макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов. На краях костных отломков происходит разрастание, утолщение надкостницы за счет пролиферации скелетогенных клеток.

К 7-м суткам область перелома заполнена фиброзной тканью, богатой фибробластами. Фибробласты полигональной формы, с крупными ядрами и множеством отростков. Межклеточное вещество однородное, содержит пучки коллагеновых волокон. В толще фиброзной ткани содержатся крупные зоны дифференцировки скелетогенных клеток. В периостальной области и по периферии мозоли отмечаются участки хрящевой ткани. Хондроциты молодые, округлой формы, расположены одиночно. Расположение в одной лакуне двух и более хондроцитов, т.е. образование изогенных групп встречается крайне редко. Межклеточное вещество однородное. В периостальной области встречаются очаги новообразованной костной ткани. Перекладины остеоида тонкие, ограничивают скопления остеобластических элементов. Надкостница активная, утолщена, содержит пролиферирующие клетки.

На 10-е сутки регенерат состоит преимущественно из зрелой хрящевой ткани. Хондроциты, в основном, округлой формы, но встречаются и угловатые клетки. Межклеточное вещество плотное, однородное. Области хряща окружают участки фиброзной бессосудистой ткани. Вблизи костных отломков наблюдается разрушение хряща и образование молодой костной ткани. Местами костное вещество окружает островки пузырчатого хряща. Перекладины остеоида тонкие, пространства между ними окружены остеобластическими элементами. Первичные остеоциты, замурованные в межклеточное вещество, полиморфные, угловатые. Между перекладинами содержатся участки волокнистой ткани.

К 14-м суткам мозоль в области перелома содержит обширные участки новообразованной костной ткани, имеющей губчатое строение. Рост костных трабекул наблюдается как в периостальных областях, так и в эндостальных. Костные балочки окружены остеобластами, имеющими, как правило, вытянутую форму. Замурованные в матриксе остеоциты имеют, в основном, угловатую, отростчатую форму и плотные ядра. В очагах интенсивного остеогенеза встречаются остеокласты. Межбалочные пространства заполнены соединительной богато васкуляризованной тканью. Участки разрушающегося хряща еще достаточно объемны. В широких лакунах лежат хондроциты, многие из которых набухшие, отечные, подвержены деградации. Их ядра слабо, неравномерно окрашены. Межклеточное вещество гомогенное.

При введении пептида DAGO в дозе 6,3 мкг/кг массы тела отмечалась иная динамика изменений гистологической структуры мозоли в области перелома. На 4-е сутки костные отломки окружены отечной фиброзной тканью. Среди клеток преобладают активированные фибробласты, имеющие крупные ядра и многочисленные отростки. Определяются также макрофаги и нейтрофильные гранулоциты. Межклеточное вещество содержит пучки коллагеновых волокон. Надкостница утолщена, в толще ее отмечаются многочисленные скопления остеогенных клеток. Непосредственно к отломкам прилежат широкие участки, в которых определяются остеогенные клетки, активно синтезирующие межклеточное вещество.

К 7-м суткам регенерат в области перелома образован, в основном, зрелым и пузырчатым хрящом с крупными дифференцированными хондроцитами и плотным межклеточным веществом. Ядра хондроцитов крупные, иногда хорошо заметны ядрышки. Часто встречаются двуядерные клетки и мелкие изогенные группы хондроцитов. Фиброзная ткань окружает хрящевые и остеоидные участки. В толще фиброзной ткани отмечаются зоны пролиферации и дифференцировки скелетогенных клеток. Вблизи костных отломков наблюдается образование трабекул остеоидной ткани. Остеобласты выстилают лакуны между костными перекладинами, где часто встречаются остеокласты. В толще остеоида формируются первичные остеоциты, окруженные однородным, плотным межклеточным веществом. Образование остеоидной ткани наблюдается как в периостальных, так и в эндостальных областях.

На 10-е сутки в области перелома мозоль представлена обширными зонами хряща, на границе которого активно идут процессы оссификации. Костные трабекулы анастомозируют между собой, формируя участки губчатой кости. Трабекулы более широкие, чем в контроле и расположены более тесно. Остеобласты многочисленны, имеют вытянутую форму. В толще новообразованного межклеточного вещества лежат остеоциты, имеющую угловатую форму и небольшие размеры. Межклеточное вещество плотное, оксифильное. Межбалочные пространства содержат соединительную ткань, богатую сосудами.

На 14-е сутки регенерат представлен обширными разрастаниями костной ткани губчатого строения. Костные трабекулы анастомозируют между собой, окружая незначительные участки разрушающегося, дистрофически измененного хряща. В периостальных областях трабекулы достаточно широкие и содержат большое количество остеоцитов, расположенных в овальных лакунах. Эти клетки имеют угловатую, отростчатую форму, их размеры уменьшены. В толще балок в периваскулярных пространствах идут процессы ламеллярного отложения костной ткани с образованием первичных остеонов. Костные трабекулы окружены слоем остеобластов, который хорошо выражен. Большинство клеток имеют вытянутую форму. Пространства между костными балками заполнены богато васкуляризованной соединительной тканью. Отмечаются очаги заселения межбалочных пространств костномозговыми элементами.

Подкожное введение DAGO в дозе 6,3 мкг на 1 кг массы тела в течение 7 дней стимулирует развитие новообразованной (губчатой) костной ткани в мозоли в области перелома. Удельный объем новообразованной (губчатой) костной ткани у животных, получавших пептид DAGO, достоверно превышает аналогичный показатель у контрольных мышей на 7, 10 и 14 сутки после перелома (таблица).

Результаты проведенных экспериментов показывают, что подкожное введение DAGO в дозе 6,3 мкг на 1 кг массы тела стимулирует репаративный остеогенез у экспериментальных животных.

Таким образом, результаты исследований доказывают, что предлагаемый способ эффективно стимулирует репаративный остеогенез в области перелома, основан на применении синтетического агониста нового класса природных биологически активных веществ, обладающих выраженным модуляторным эффектом и полифункциональностью, не является трудоемким и не требует использования сложного оборудования.