способ определения ингибирующего действия веществ на комплемент

Формула изобретения

Способ определения ингибирующего действия веществ на комплемент, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели иммунохимически чистый иммуноглобулин G, в лунки микропанелей вносят цельную сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, жидкое содержимое лунок удаляют, затем в серии лунок вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента С3 по продукту ферментативной реакции и сравнивают данные о количестве связавшегося компонента С3 в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствии тестируемого вещества определяют константу ингибирования этим веществом связывания активированного компонента С3.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности к способам определения ингибирующего действия веществ на компонент С3 комплемента в момент его активации.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения механизма действия лекарственных веществ, для поиска потенциальных лекарственных веществ, изучения побочного действия лекарственных препаратов и воздействия экологически вредных веществ на организм.

В литературе имеются сведения о прямом влиянии различных лекарственных или диагностических препаратов на систему комплемента в крови больного. Возможно, что такое взаимодействие с системой комплемента и является механизмом лечебного действия препарата. Наиболее яркими примерами в этом отношении является действие лекарственных препаратов бластолизина, МДП (N-ацетилмурамоилаланил-D-изоглутамина),ликопида(N-ацетилглюкозаминил-(1-->4)-N-ацетилмурамоил-D-изоглутамина) [1], адреналина [2, 3], интерферонов, этилового спирта [3] на компонент С3 комплемента человека. Помимо лекарственных средств, прямое действие на систему комплемента могут оказывать вещества эндогенной природы, собственные метаболиты организма, оказывающие регуляторное влияние, например серотонин, гистамин [3], также экзогенные вещества, в том числе загрязняющие окружающую среду, т.е. экологически вредные.

Для определения способности веществ взаимодействовать с компонентом С3 комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания компонента С3 с С3-конвертазой, сформированной на сенсибилизированных эритроцитах барана, т. е. ингибировании образования С5-конвертазы и последующего лизиса эритроцитов [1, 3]. Недостатком этого способа является трудность получения воспроизводимых результатов, связанная с необходимостью приготовления стандартной гемолитической системы на основе эритроцитов барана и сложных в получении реагентов, таких, например, как R3^оху - сыворотки человека, лишенной компонента С3, но содержащей окисленный компонент С2 с повышенной активностью. Поэтому на основе гемолитического метода трудно создать простую в обращении тест-систему, позволяющую характеризовать ингибирующие вещества в стандартных условиях.

Нами на основе иммуноферментного метода разработан способ, позволяющий определять ингибирование различными веществами функциональной активности компонента С3, состоящей в связывании активированного компонента С3 с естественной мишенью - иммуноглобулином и формируемой на его поверхности С3-конвертазой. Преимуществами предложенного метода является возможность получения индивидуальных констант ингибирования, простота определения и хорошая воспроизводимость результатов.

Способ осуществляется следующим образом: проводят сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем в лунки вносят сыворотку морской свинки и буферный раствор, содержащий ионы Са²⁺ и Ni²⁺, и проводят инкубацию для формирования на поверхности лунок стабильной С3-конвертазы классического пути комплемента, после чего, вылив содержимое, в лунки вносят сыворотку крови человека в качестве источника компонента С3, содержащую ряд определенных концентраций тестируемого ингибитора в серии экспериментов, и проводят инкубацию. Для контроля исходной активности компонента С3 проводят эксперимент без ингибитора. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом, и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента С3 в присутствии различных концентраций ингибитора и в контроле без ингибитора, определяют константу ингибирования связывания активированного компонента С3, характеризующую ингибирующую способность тестируемого вещества. Величина константы ингибирования, имеющая размерность концентрации, численно равна той концентрации тестируемого вещества; при которой функциональная активность компонента С3 - его способность ковалентно связываться с мишенью снижается вдвое. Эффективным ингибитором комплемента могут считаться вещества, для которых константа ингибирования, определенная этим способом, лежит в области реальных концентраций этих веществ в крови.

В качестве вещества, способного взаимодействовать с системой комплемента, выбран адреналин, для которого известна константа ингибирования образования С5-конвертазы [3]. Полученные по этому способу (двумя методами) константы ингибирования практически совпадают и соответствуют по порядку величин терапевтическим дозам препаратов.

Пример. Определение ингибирования связывания активированного С3b. Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрации 100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oС. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ (VBS-Ca²⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. Во все лунки планшета вносят по 75 мкл VBS-Ca²⁺, 15 мкл 0,1 М нитрата никеля (II) и 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 30 мин при 37^oС, двукратной отмывки VBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, (VBS-E) содержимое лунок удаляют вытряхиванием. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека в VBS-Е, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора адреналина в своей для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата С3 для каждой концентрации ингибитора рассчитывают по стандартной кривой. Константу ингибирования _i, определяют по линейному уравнению l/z = [I] /(z₀ K_i) + l/z [4], где [I] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность компонента С3, определенная при данной концентрации ингибитора, a z₀ - активность компонента С3 в отсутствие ингибитора, строя график зависимости l/z от [1]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению -К_i. Для адреналина получено значение К_i, равное 71,2 21,0 мкг/мл или 0,32 0,09 мМ, что совпадает с константой, полученной гемолитическим методом, 0,30 0,07 мМ [3]. Таким образом, адреналин успешно ингибирует активированный С3b и может обладать противовоспалительным действием благодаря блокированию образования анафилатоксина С5а. В офтальмологической и оториноларингологической практике употребляют адреналин как сосудосуживающее (и противовоспалительное) средство в составе капель и мазей. При этом возникающая локальная концентрация адреналина лежит в области концентраций, достаточных для ингибирования активированного С3b и может объяснять его местное противовоспалительное действие.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Ростовцева Л.И., Ломака Т.С., Сутовская Н.С., Сорокина И.Б., Баркова Т.И. //Биоорган. химия. 1985. Т. 11. С. 1510-1518.

2. Sim R.B., Twose T.M., Paterson D.S., Sim. E. // Biochem. J. 1981. V. 193.P. 115-127.

3. Козлов Л.В., Лебедева Т.В. // Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 350-355.